CN102798689B

CN102798689B - 分离富集并检测水环境中痕量氟喹诺酮类抗生素的方法

Info

Publication number: CN102798689B
Application number: CN201210289863.6A
Authority: CN
Inventors: 徐勇鹏; 崔鹏; 王媛
Original assignee: Harbin Institute of Technology
Current assignee: Harbin Institute of Technology
Priority date: 2012-08-15
Filing date: 2012-08-15
Publication date: 2014-07-30
Anticipated expiration: 2032-08-15
Also published as: CN102798689A

Abstract

分离富集并检测水环境中痕量氟喹诺酮类抗生素的方法，涉及一种分离富集和检测水环境中痕量氟喹诺酮类抗生素残留的方法。本发明的分离富集和检测水环境中氟喹诺酮类抗生素残留的方法是将2.0-4.0L水样通过固相萃取后，用液质联用仪器进行分析检测。本发明能很好的分离检测多种氟喹诺酮类抗生素物质，具有低检测限、高回收率、高灵敏度、选择性好且操作简便等优点，对水环境中痕量氟喹诺酮类抗生素物质的检测研究效果显著。

Description

分离富集并检测水环境中痕量氟喹诺酮类抗生素的方法

技术领域

本发明涉及一种分离富集和检测水环境中痕量氟喹诺酮类抗生素残留的方法，尤其涉及一种以膜过滤及固相萃取作为前处理，基于液质联用法分离富集和检测水环境中氟喹诺酮类抗生素残留的方法。

背景技术

抗生素类药物在环境中残留所引发的环境污染问题，近年来备受人们的关注。在人禽的医疗中广泛使用的氟喹诺酮类（FQs）抗生素如：环丙沙星（CIP）、恩诺沙星（ENR）、诺氟沙星（NOR）和氧氟沙星（OFL），由于具有水溶性较好、动物体内代谢率较低，以及在环境中不易降解等特点，使其容易在水环境中不断富集和储存，是环境中主要抗生素污染源。由于其含量极低（纳克级），因此，建立相应的分离富集技术及检测方法十分必要。目前对水环境样品中的抗生素分析常用固相萃取分离富集作为前处理方法。虽然抗生素种类繁多，但其化学性质相似，检测方法总体可以归为3大类：化学测定法、色谱测定法和免疫测定法。其中，酶联免疫法试样预处理简单、特异性强，但由于抗体的批次不同，测定结果可能出现微小差异，灵敏度不高；其他微生物法易操作，费用低，可用于大量样品的筛选，但是灵敏度不高，且特异性差；HPLC-UV/FLU法仪器操作方便，样品前处理简单，灵敏度高；LC-MS/MS法样品前处理简单，选择性好，灵敏度高，检测限低，基本可应用于任何低含量物质的检测。

固相萃取技术是一种发展迅猛的样品前处理技术，Oasis HLB固相萃取小柱具有较好亲水亲油平衡性，在水体基质中对氟喹诺酮类抗生素物质具有较好的吸附能力。合理选择溶剂处理萃取小柱后可以实现对水样中氟喹诺酮类抗生素的富集与纯化。液质联用技术是当前使用较为广泛的仪器分析技术之一，具有液相色谱高分离能力和质谱精准定性定量的共同优势，通过对液相条件与质谱条件的优化，能够准确分析检测经过前处理后的水样中目标物的含量。

发明内容

本发明的目的是提供一种新的分离富集并检测水环境中痕量氟喹诺酮类抗生素的方法，该方法具有低检测限、高回收率、高灵敏度、选择性好且操作简便等优点。

本发明的目的是通过如下技术方案实现的：

一种分离富集和检测水环境中氟喹诺酮类抗生素残留的方法，是将2.0-4.0L水样通过固相萃取后，用液相质谱串联四级杆-飞行时间质谱仪（LC-MS/MS(Q-TOF)）进行分析检测。

上述所说的方法中，所述固相萃取方法为：用2-4ml甲醇、2-4ml超纯水依次活化固相萃取小柱，将2.0-4.0L水样以4.0-6.0mL/min的流速通过活化后的固相萃取小柱，用5-8mL磷酸、5-8mL超纯水依次淋洗小柱；然后真空干燥小柱5-10min，用2-4mL甲醇洗脱，洗脱液用氮气吹至1mL以下，倒入安捷伦小瓶后再用甲醇定容至1mL；加入0.5-1.0mL内标物。

上述所说的方法中，固相萃取小柱选用的是Oasis HLB。

上述所说的方法中，通过质谱图中离子强度值和内标法定量，内标物选用的是沙拉沙星、洛美沙星或左氧氟沙星。

其原理如下：

前处理部分：Oasis HLB固相萃取小柱具有较好亲水亲油平衡性，在水体基质中对氟喹诺酮类抗生素物质具有较好的吸附能力。通过选择性吸附目标物，使其保留在柱填料中得以纯化和富集，再通过淋洗去除同时保留的部分其它杂质，进一步纯化目标物，最后以有机溶剂将之从柱填料洗脱到溶剂中。

仪器分析部分：用高精度分析仪器准确检测，其中通过液相的良好分离能力将多种目标物分离，再通过质谱的精准定性定量能力，通过内标法得到其准确含量值。

本发明融合了固相萃取良好富集提纯能力与液质联用仪器高分离定性定量能力，以及加入标准内标物精确定量的特点，使得分析河水、湖泊水甚至自来水中极其痕量的氟喹诺酮类抗生素效果显著。

总之，本发明能很好的分离检测多种氟喹诺酮类抗生素物质，具有低检测限、高回收率、高灵敏度、选择性好且操作简便等优点，对水环境中痕量氟喹诺酮类抗生素物质的检测研究效果显著。

附图说明

图1为过柱流速对回收率的影响；

图2为洗脱剂体积对回收率的影响；

图3为萃取体积对回收率的影响；

图4为四种氟喹诺酮类抗生素离子谱图。

具体实施方式

下面结合具体实施实例对本发明做进一步说明。

实施例1：固相萃取条件的选择

一、活化剂选择：

氟喹诺酮类抗生素物质通常使用甲醇或乙腈进行活化，本发明中初步采用甲醇进行试验，结果发现，2-4ml甲醇即可很好的使萃取柱达到完全润湿状态。此外，为去除甲醇残留在柱内给富集过程带来干扰，将小柱在2-4ml甲醇活化后用2-4ml水冲洗。

二、淋洗剂选择：

淋洗的作用是在填料保留目标物的前提下将固相萃取柱上的杂质去除，从而进一步纯化目标物。对氟喹诺酮类抗生素而言，通常使用弱酸性无机溶剂，本发明中选用5-8mL磷酸（调pH为3.0）+5-8mL超纯水作为淋洗剂。

三、过柱流速选择：

过柱流速对实验的影响意义重大，本发明中通过控制过柱流速分别为4mL/min、6mL/min、8mL/min和10mL/min，保持其他条件相同的情况下进行对比。流速对目标物回收率的影响见图1，由图1可知，流速为6mL/min时，目标物的回收率已达到饱和。故本发明过柱流速选用4.0-6.0mL/min。

四、洗脱剂与洗脱体积选择：

固相萃取的洗脱剂一般可与活化剂中的有机溶剂相同或类似。本发明通过实验发现，5mL甲醇即可将目标物完全洗脱，故采用甲醇作为固相萃取洗脱剂。为确定洗脱剂的体积，实验中在保证其他条件相同的情况下，分别使用了2mL、3mL、4mL和5mL的甲醇进行洗脱并对比分析，结果见图2。由图2可知，对于本发明中的Oasis HLB固相萃取小柱而言，洗脱体积在4mL时，目标物的回收率已经达到最大值，不再随洗脱剂体积的增大而发生明显变化。因此，本发明中固相萃取洗脱剂体积可选为2-4mL。

萃取小柱饱和吸附状态的体积亦称穿透体积 (Break throμgh volume )，可用来衡量固相萃取小柱的容量；穿透体积越大，萃取小柱对目标物的吸附能力越大，富集倍数也越大，萃取体积宜在保证固相萃取小柱穿透体积的前提下尽量提高富集倍数。本发明中分别采用水样体积为0.5L、1L、2L、3L和4L进行对比实验，得到各物质回收率见图3。因此，本发明中萃取体积可选为2.0-4.0L。

实施例2：

准确量取2.0-4.0L水样，静置后经0.45μm混合滤膜过滤待用；将supelco12管、固相萃取装置、Oasis HLB萃取小柱、缓冲装置和真空泵按顺序接好，用2-4ml甲醇、2-4ml超纯水依次活化小柱后，通过大容量采样管将其与水样连接；启动真空泵，调节真空压力以控制萃取流速在4.0-6.0mL/min，待水样全部过柱后，用5-8mL磷酸（调pH=3.0）、5-8mL超纯水依次淋洗小柱；然后真空干燥（45℃）小柱5-10min，用2-4mL甲醇洗脱，洗脱液用氮气在30℃下吹至1mL以下，倒入安捷伦小瓶后再用甲醇定容至1mL；加入0.5-1.0mL 100μg/L的标准沙拉沙星溶液作为内标物，放进4℃冰箱中避光储藏待用。

实施例3：检测方法的建立

一、液相条件优化：

对于质谱仪器来说，禁止使用磷酸作为流动相；而对于四级杆串联飞行时间类的质谱仪，其准进入的流动相中严格限制三乙胺；同时，液质联用的流动相流速也比单纯的液相色谱低得多。据此建立了表1中的液相检测条件。

表1 LC-MS/MS检测条件

表2 流动相梯度设置

时间/min	B%
		0	19
30	47
		32	19

（注：后运行时间2min）

二、质谱条件优化：

对标准目标混合物采用液质联用仪进行检测分析，以确定最适破碎电压值，使后续的实际水样检测分析更加简洁和精确。质朴条件的优化以能使目标物质电离为基本，以尽可能减少其破碎离子的种类及比例为原则，表3中列出了目标物质的破碎离子分布。质谱条件最终确定结果见表1。

表3 抗生素的保留时间、分子离子和破碎离子

三、定量方法：

本发明中采用内标法定量。水样中氟喹诺酮类抗生素物质的含量十分痕量，因此定量方法亦需足够准确。沙拉沙星（SAR）、洛美沙星（LOM）和左氧氟沙星（LOV）同属氟喹诺酮类抗生素的一种，其性质与结构均与目标研究物质十分类似，这就提供了它们的质谱峰与目标物质靠近的可能性，而且在中国的抗生素药谱中，它们作为使用对象的时间较短，在我国河流湖泊的有关检测报道中还未发现这些物质的存在，保证了其作为内标物质的基本条件。因此，它们是本发明中十分理想的内标物质。目标物离子谱图见图4。另外，液质联用的优势在于液相分离与质谱离子定向分析，因此，本发明中的仪器定量指标采用选择离子监测中的离子丰度。同时，各物质的离子响应强度最高，最为直观且不易相互混淆。因此，选择各物质对应的离子作为定量离子，几种物质定量离子见表4。

表4 几种物质的定量离子

化合物名称	CIP	OFL	ENR	NOR	SAR	LOM	LOV
								[M+H]⁺	332.34	362.37	360.40	320.24	386.36	352.35	371.38

四、回收率及线性相关参数：

采用实施例2的前处理方法和实施例3的检测条件，得到对松花江水样的加标（加标浓度为100ng/L）回收率在81%~108%之间，相对标准偏差（RSD，n=3）在1.9%~6.7%之间；对去离子水的加标（加标浓度为50ng/L）回收率在77%~112%之间，相对标准偏差（RSD，n=3）在2.1%~7.1%之间。方法对四种目标物的检测限在2~5ng/L之间，线性范围为2~500ng/L，线性相关系数在0.98~0.99之间。

实施例4：

准确量取2.0L水样，静置后经0.45μm混合滤膜过滤待用；将supelco12管、固相萃取装置、Oasis HLB萃取小柱、缓冲装置和真空泵按顺序接好，用2ml甲醇、2ml超纯水依次活化小柱后，通过大容量采样管将其与水样连接；启动真空泵，调节真空压力以控制萃取流速在6.0mL/min，待水样全部过柱后，用5mL磷酸（调pH=3.0）、5mL超纯水依次淋洗小柱；然后真空干燥（45℃）小柱5min，用4mL甲醇洗脱，洗脱液用氮气在30℃下吹至1mL以下，倒入安捷伦小瓶后再用甲醇定容至1mL；加入0.5mL100μg /L的标准沙拉沙星溶液作为内标物；采用3M乙酸（含13.2v.%乙腈）作为A相，超纯水为B相，流动相初始比例为V（A）：V（B）=81:19，30min后为V（A）：V（B）=53:47，32min后变为初始比例，30℃柱温条件下进样10μL以0.4mL/min的流速通过色谱柱，采用紫外检测器（波长280nm）进行检测；质谱仪分别设置干燥器温度3500℃，气体流速9L/min，喷雾压力30psig，毛细管电压3500V，检测破碎电压85V，即完成了分离富集和检测。

实施例5：样品测定

分别取长江、太湖、大溪水库和松花江水样各2.0L，按实施例4的方法进行分析，结果见表5。

表5 水体中目标物检测值

Claims

1.分离富集并检测水环境中痕量氟喹诺酮类抗生素的方法，其特征在于所述方法为：

准确量取2.0L水样，静置后经0.45μm混合滤膜过滤待用；将supelco12管、固相萃取装置、Oasis HLB萃取小柱、缓冲装置和真空泵按顺序接好，用2ml甲醇、2ml超纯水依次活化小柱后，通过大容量采样管将其与水样连接；启动真空泵，调节真空压力以控制萃取流速在6.0mL/min，待水样全部过柱后，用5mL、pH＝3.0磷酸、5mL超纯水依次淋洗小柱；然后45℃真空干燥小柱5min，用4mL甲醇洗脱，洗脱液用氮气在30℃下吹至1mL以下，倒入安捷伦小瓶后再用甲醇定容至1mL；加入0.5mL100μg/L的标准沙拉沙星溶液作为内标物；采用3M、含13.2v.％乙腈的乙酸作为A相，超纯水为B相，流动相初始比例为V_A：V_B＝81:19，30min后为V_A：V_B＝53:47，32min后变为初始比例，30℃柱温条件下进样10μL以0.4mL/min的流速通过色谱柱，采用波长280nm的紫外检测器进行检测；质谱仪分别设置干燥器温度3500℃，气体流速9L/min，喷雾压力30psig，毛细管电压3500V，检测破碎电压85V，即完成了分离富集和检测。