CN116735766A - 带杂环的甘氨酸产品手性纯度检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了带杂环的甘氨酸产品手性纯度检测方法，主要解决现有带杂环的甘氨酸产品在手性检测中很难分离同分异构体的技术问题。本发明测定方法包括以下步骤：一，准备测量的试剂，二，样品的前处理；三，进行高效液相色谱测定，色谱仪为安捷伦1260色谱仪，采用DAD紫外检测器，美国ASTEC系列手性柱，流动相为摩尔浓度为0.1mol/L碳酸氢钠水溶液（A）和质量百分浓度为100%甲醇（B），通过本发明为带杂环的甘基酸产品的手性纯度检测领域提供了可靠便捷的检测手段。
Description
技术领域
本发明涉及甘氨酸产品手性纯度检测方法，特别涉及一种带杂环的甘氨酸产品手性纯度检测方法。
背景技术
常规带杂环的甘氨酸产品手性测定，需要用到高效液相色谱方法，常规采用大赛璐正相手性柱，流动性用到正己烷，还需要用添加0.1%乙酸-乙醇流动相，环节复杂，对样品的要求比较高，样品中残留溶剂总和低于10ppm，水分要求低于0.5%，特别是该样品的同分异构体很难分离，在检测中消耗时间长，还出现严重拖尾，且峰对称度差。
发明内容
本发明提供了一种带杂环的甘氨酸产品手性纯度检测方法，主要解决现有正相手性方法存在的样品需要前处理，环节复杂、分析时间长、峰型拖尾等技术问题。
本发明采用了以下技术方案：带杂环的甘氨酸产品手性纯度检测方法，它包括以下步骤：
步骤一，准备测量的试剂：测量的试剂包括甲醇-色谱纯，超纯水，化学试剂-碳酸氢钠，分析纯碳酸氢钠。
步骤二：样品溶液的配制：称取试样置于容量瓶中，加入甲醇，室温条件下采用超声波溶解，再用水定容，最后试样用聚丙烯有机滤膜过滤后进行HPLC分析。
步骤三，进行高效液相色谱测定;色谱测定的的过程为：色谱条件为样品室温度为40℃，自动进样器进样体积为10 µL，手性色谱柱为：美国ASTEC CHIROBIOTIC T柱(4.6mm×250mm, 5.0μm)，柱温：40 ℃，流速：0.4 mL/min，流动相为摩尔浓度0.1mol/L碳酸氢钠水溶液（A）和质量百分浓度100%甲醇溶液（B）；采用等度洗脱程序，0～40min，V(A)为50%,V(B)为50%，平衡系统需要12min；即保留时间为D型：18.6min、L型：19.6min。
所述的液相色谱测定时采用的色谱仪为安捷伦 1260色谱仪，该色谱仪采用DAD二极管列阵检测器。
本发明具有以下有益效果：本发明测定带杂环的甘氨酸产品手性纯度检测方法，该方法操作简便、快速、准确，稳定性好，样品消耗少、峰对称度好；本发明采用了高效液相色谱仪的自动进样器的精准定量，利用DAD二极管列阵检测器的灵敏度可以对带杂环的甘氨酸产品有很好的响应值，申请人研究中发现美国ASTEC CHIROBIOTIC T柱对于多种类型的分子具有独特选择性，尤其是未衍生化的 α、β、γ 和环状氨基酸、N-衍生化的氨基酸、羟基-羧酸、包括羧酸和酚类等的酸性化合物以及环状芳香族和脂肪族胺类能有效分离同分异构体；同时结合以尔浓度0.1mpl/L碳酸氢钠水溶液作A流动相，在微碱流动相体系中使带杂环的甘氨酸产品的同分异构体能对称度分离，解决了峰拖尾现象。达到了低浓度，高响应、基线级分离的技术效果。
附图说明
图1 用安捷伦1260型DAD 检测器检测的混合样品图谱。
图2 用安捷伦1260型 DAD 检测器检测的带杂环的甘氨酸单样手性图谱。
图3用安捷伦1260型 DAD 检测器检测的带杂环的甘氨酸的对应异构体单样手性图谱。
具体实施方式
主要仪器：
安捷伦1260型高效液相色谱仪，配有DAD二极管列阵检测器，美国ASTECCHIROBIOTIC T手性柱，美国ASTEC CHIROBIOTIC T柱(4.6mm ×250mm, 5.0μm)；超声波提取仪(KQ5200E，郑州科泰实验设备有限公司)，0.22 μm聚丙烯有机滤膜（上海安谱科学仪器有限公司），电子分析天平（CPA225D，赛多利斯科学仪器（上海）有限公司）。
主要试剂：
测量的试剂包括甲醇-色谱纯，化学试剂-碳酸氢钠，电阻率为18.2 MΩ.cm的超纯水；甲醇（色谱纯，德国Merck公司），碳酸氢钠(分析纯，上海国药公司)；超纯水( 电阻率18.2 MΩ.cm，美国 屈层氏)。
样品的前处理：称取带杂环的甘氨酸产品及对应异构体试样各约2mg，置于10 mL容量瓶中，加入8 mL甲醇，室温条件下超声波溶解3 min，再用水定容至10 mL，最后试样用0.22 µm聚丙烯有机滤膜过滤后进行手性分析。
色谱条件：
样品室温度为30 ℃，自动进样器进样体积为10 µL，色谱柱为：美国ASTECCHIROBIOTIC T柱(4.6mm ×250mm, 5.0μm)，柱温：40 ℃，流速：0.4mL/min，流动相为摩尔浓度0.1mol/L碳酸氢钠水溶液（A）和质量百分浓度100%甲醇（B）；采用等度洗脱程序，0～40min， V(A)50%；V(B)50% 平衡系统需要12min。
样品前处理方法的选择与优化：
目前在市场上带杂环的甘氨酸产品为粉末状固体，本发明所测定的样品是吉尔生化（上海）有限公司生产的产品。
色谱条件的优化：
本发明在选择时分别对质量百分浓度0.1%TFA水-质量百分浓度100%乙腈、质量百分浓度0.025%甲酸水-质量百分浓度0.025%甲酸乙腈作为流动相时的分离效果进行了比较。采用质量百分浓度0.025%甲酸水-质量百分浓度0.025%甲酸体系时发现，色谱峰形不对称，容易拖尾；采用摩尔浓度0.1mol/L碳酸氢钠水-质量百分浓度100%甲醇作为淋洗液体系时带杂环的甘氨酸产品的峰型对称度达到标准，无论是分离度、灵敏度还是目标化合物的峰型都优于其他淋洗体系。故本实验采用摩尔浓度0.1mol/L碳酸氢钠水溶液-质量百分浓度100%甲醇作为淋洗液，等度淋洗进行色谱分离。
本发明的样品室温度设定为室温，有利于样品室中甲醇溶剂的保存，本发明中设定柱温箱温度为40℃。
实际样品的测定：带杂环的甘氨酸产品混合样品图谱见图1，带杂环的甘氨酸产品单样手性图谱见图2，带杂环的甘氨酸产品的对应异构体单样手性图谱见图3。
采用本方法对带杂环的甘基酸产品进行手性检测结果表明，本方法快速、准确、灵敏度高、被检样品用量少，具有实际应用价值。
本发明建立了一种测定带杂环的甘氨酸产品的手性检测方法。该方法操作简便、快速、准确，检测用量少，稳定性好，适用于带杂环的甘氨酸产品的手性分离检测提供一种新的方法。
Claims (5)
1.带杂环的甘氨酸产品手性纯度检测方法；其特征是：包括以下步骤：
步骤一，准备测量的试剂：甲醇-色谱纯，超纯水，化学试剂-碳酸氢钠，分析纯碳酸氢钠；
步骤二、样品溶液的配制：称取试样置于容量瓶中，加入甲醇，室温条件下采用超声波溶解，再加超纯水定容 ，最后试样用聚丙烯有机滤膜过滤后进行手性检测；
步骤三，进行高效液相色谱测定：色谱测定的过程为：色谱条件为样品室温度为常温，自动进样器，色谱柱为：美国ASTEC系列手性柱，流动相A为摩尔浓度0.1mol/L碳酸氢钠水溶液；流动相B相为质量百分浓度100%甲醇溶液，采用等度洗脱程序。
2. 根据权利要求1所述的带杂环的甘氨酸产品手性纯度检测方法，其特征是：所述色谱柱的柱温：40 ℃，流速：0.4 mL/min。
3.根据权利要求1所述的带杂环的甘氨酸产品手性纯度检测方法，其特征是：所述的液相色谱测定时采用的色谱仪为Agilent 1260 液相色谱仪，该仪器采用DAD二极管阵列检测器。
4. 根据权利要求1所述的带杂环的甘氨酸产品手性纯度检测方法，其特征是：所述美国ASTEC系列手性柱为CHIROBIOTIC T柱，色谱柱尺寸为4.6mm ×250mm, 5.0μm。
5. 根据权利要求1所述的带杂环的甘氨酸产品手性纯度检测方法，其特征是：所述的等度洗脱程序为：0～40min，V(A)为50%,V(B)为50%， 平衡系统12min。
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