CN104198643A - 一种同时测定三种芳香族氨基酸含量的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种同时测定三种芳香族氨基酸含量的液相色谱方法，步骤包括：a.选用色谱柱规格为4.6×250mmi.d,5μm的watersC18柱；b.以15%甲醇-85%磷酸盐溶液为流动相，流动相流速为0.9mL/min，待测样品经2%的高氯酸去蛋白后，采用超声提取，离心后调节pH为6.0，取30微升上清液直接进样测定，外标法定量；c.利用二极管阵列检测器对三种芳香族氨基酸的进行检测，一次进样可以同时得到这三种芳香族氨基酸的全波段扫描图谱，采集到三种氨基酸在每一个瞬间的光谱图，直观地鉴定色谱峰的纯度，对比标准品和待测样品的全波段扫描图谱进行定性。本发明操作简便、灵敏度高，定性准确。

Description

一种同时测定三种芳香族氨基酸含量的方法

技术领域

本发明属于分析化学领域，涉及检测三种芳香族氨基酸的方法，特别涉及用高效液相色谱法—二极管阵列法同时测定水产品中三种芳香族氨基酸含量的方法。

背景技术

芳香族氨基酸为含有芳香环侧链的氨基酸，包括苯丙氨酸（Phenylalanine，Phe）、酪氨酸（Tyrosine，Tyr）、色氨酸（Tryptophane，Trp）等三种氨基酸，其中Phe和Trp属于必需氨基酸，Tyr则属于半必需氨基酸。芳香族氨基酸在肝、肾、神经等疾病诊断中有很重要的作用，且它们对水产食品的营养风味也有重要的贡献。因此，准确测定芳香族氨基酸在蛋白质化学研究中有非常重要的意义。

目前国内外测定芳香族氨基酸的方法主要有高效液相色谱法、荧光分光光度计法、毛细管电泳法、质谱法等。如：陶玉贵等用毛细管电泳法测定发酵液中L-色氨酸的含量（食品与发酵工业，2008，34（9）：140-143），唐爱国发明了一种高效液相色谱-荧光法同时测定血清中芳香族氨基酸含量的方法（专利号：CN 102128893 A），陈舜胜等用HPLC 法快速测水产品中游离芳香族氨基酸含量的研究（上海海洋大学学报2013，22（4）:629-633）等；其中以HPLC衍生法为主，因其灵敏度高、设备要求适中以及操作简便。由于Phe、Tyr及Trp的荧光特性不一致，用荧光分光光度计法不能在同一波长下同时对其测定；毛细管电泳法和质谱法的分辨率较高，但也有仪器昂贵、重复性较差等不足之处。

 本发明利用Tyr、Phe和Trp含有不饱和共轭环状结构，可用二极管阵列检测器(Photo Diodearray，PDA)对被测物质进行测定并全波长扫描，一次进样可以得到三种芳香族氨基酸的全波段扫描图谱，包括三种芳香族氨基酸各自的最大吸收波长进行检测，比常规紫外可见吸收检测器的灵敏度更高，定量更准确。由于PDA 检测器具备随峰快速扫描的特性，在色谱分析同时能够采集色谱流出物在每一个瞬间的光谱图，因而可以直观地鉴定色谱峰的纯度，从而对检测数据作出合理取舍, 保证结果更准确，定性更可靠。

发明内容

本发明目的是针对以上现有技术的前处理复杂、灵敏度低、回收率不高、定性不准确等不足，提供一种操作简单，灵敏度高、分离速度快且定量定性准确，能够同时测定水产品中三种芳香族氨基酸的HPLC-PDA法，

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

一种用高效液相色谱—二极管阵列检测器同时测定水产品中三种芳香族氨基酸含量的方法，包括以下步骤：

流动相为A ：B = 15：85， A为甲醇溶液，B为0.05 mol/L磷酸氢二钾和磷酸二氢钾溶液，用磷酸调pH至6.0；等度洗脱；流速：0.9 mL/min；进样量为30微升；柱温为40℃。

流动相使用前用0.45μm的水相微孔滤膜过滤后，超声脱气10分钟。

色谱柱选用Waters Atlantis T3 C18（4.6×250mm，5μm）作为色谱固定相。

用二极管阵列检测器扫描确定检测三种氨基酸的最佳检测波长，确定Tyr、Phe和Trp的最佳紫外检测波长分别为274.5nm、256.7nm和279.3nm。

Tyr、Phe和Trp的标准溶液是用2%的高氯酸溶液溶解、混匀；分别配制浓度1000μg/mL、500μg/mL、250μg/mL。

用2%的高氯酸溶液提取三种芳香族氨基酸。

制作标准工作曲线，定性定量方法、评价精密度和考察回收率。

本发明的优选技术方案为：

配制流动相，由15%的甲醇和85%磷酸盐溶液组成，磷酸盐溶液由0.05 mol/L磷酸二氢钾及磷酸二氢钾（1：1）组成，pH范围为6.0～6.3。因采用15%的甲醇和85%磷酸盐溶液分离出的三种待测氨基酸峰型好，且柱压也不高，分离速度快、效率高；pH范围为6.0～6.3对三种氨基酸的分离效果好。

以规格为4.6×250mm i.d, 5μm的waters C18色谱柱为固定相。

用2%的高氯酸溶液配制三种芳香族氨基酸标准混合储备液。

取新鲜水产品肉，用2%的高氯酸溶液匀浆、超声、离心提取，采用2%的高氯酸溶液作为提取剂，对提取水产品中的三种氨基酸回收率高，特别对色氨酸提取效果好。

设置流动相流速为1.0mL/min，进样量为30微升。

将芳香族氨基酸经色谱柱分离后，用二极管阵列检测器进行分析，选择Tyr、Phe和Trp的最佳紫外检测波长进行测定。

通过外标法进行定量，并通过对比样品和标准品中三种芳香族氨基酸的全波段色谱扫描图谱的相似程度，鉴定色谱峰的纯度。

流动相的具体配制方案为：调节流动相中的磷酸盐溶液pH为6.0，甲醇和磷酸盐溶液使用前用0.45μm的微孔滤膜过滤，超声脱气10min。

标准溶液的具体配制方案为：用2%的高氯酸溶液配制三种芳香族氨基酸标准混合储备液，使Phe、Tyr及Trp的浓度分别为1000μg/mL、500μg/mL、250μg/mL，并用2%的高氯酸溶液将氨基酸标准混合储备液依次稀释2、5、10、20、50倍。

样品前处理的具体方案为：取新鲜水产品肉5.0g于离心管中，加入10mL预冷5%的高氯酸匀浆2min，用玻璃棒搅拌均匀，超声提取5min后，在冷冻离心机4℃下10000rpm离心20min，取上清液过滤，过滤后所剩的沉淀物加入预冷的2% PCA溶液再进行浸提、离心，重复2次后合并上清液。用KOH溶液中和上清液至pH为6.0。中和时先加5mol/L的KOH溶液调节，待接近至所需pH=6.0时，改用1mol/L的KOH溶液调节。

芳香族氨基酸经Waters Atlantis T3 C18分离后，进入二极管阵列检测器检测，Tyr、Phe及Trp三种物质的检测波长设定分别为274.5、256.7和279.3nm。

本发明的创新在于可以同时测定水产品中芳香族氨基酸含量，且本方法具有操作简便、灵敏度高、无需柱前衍生等优点。

本发明巧妙利用芳香族氨基酸含有不饱和共轭环状结构，建立了一种同时测定水产品中芳香族氨基酸含量的HPLC-PAD法。水产品去蛋白后取上清液直接进样，Tyr、Phe和Trp通过色谱柱分离后，采用PAD检测器进行检测，本发明明显优于已公开的技术，操作快速、简便、灵敏度高，又能达到同时测定水产品中三种芳香族氨基酸含量的要求，因此是一项非常值得广泛应用和推广的技术。

附图说明

图1 为Tyr、Phe及Trp的紫外210～400nm的扫描光谱图。

图2为混合标准品芳香族氨基酸的色谱图。

图3为虾肉样品的液相色谱图。

图 4 为标准添加后的液相色谱图。

 

具体实施方式

以下结合实施例旨在进一步说明本发明，而非限制本发明。

实施例1

用2%的高氯酸溶液配制三种芳香族氨基酸标准混合储备液，使Phe、Tyr及Trp的浓度分别为1000μg/mL、500μg/mL、250μg/mL，并用2%的高氯酸溶液将氨基酸标准混合储备液依次稀释2、5、10、20、50倍，分别取上述30μL混合标准溶液进行上机测定，根据保留时间定性，以所测峰面积与其相应的浓度作图，并绘制标准曲线。

取新鲜虾肉5.0g于离心管中，加入10mL预冷2%的高氯酸匀浆2min，用玻璃棒搅拌均匀，超声5min后，在冷冻离心机4℃下10000rpm离心20min，取上清液过滤，过滤后所剩的沉淀物加入预冷的2% 高氯酸溶液再进行浸提、离心，重复2次后合并上清液，用KOH溶液中和上清液至pH为6.0。中和时先加5mol/L的KOH溶液调节，待接近至所需pH=6.0时，改用1mol/L的KOH溶液调节。用超纯水定容至50 mL容量瓶中。取上述样液2mL，经孔径为0.45μm的水相微孔滤膜过滤后，上机进样分析，完成三种芳香族氨基酸的分离与测定。

工作原理和工作过程：

用自动进样器吸取30μL待测物质进入流动相中，待测物质随着流动相甲醇和磷酸盐缓冲液一起流入色谱柱中，Waters Atlantis T3 C18色谱柱将Tyr、Phe及Trp分离，使Tyr、Phe及Trp依次到达二极管阵列检测器进行检测。

通过二极管阵列检测器扫描确定Tyr、Phe和Trp的最佳紫外检测波长分别为274.5nm、256.7nm和279.3nm。本发明样品处理简单，在进样12min内即可完成检测。

本发明方法的建立过程：

1仪器和试剂

仪器：Waters e2695高效液相色谱仪（美国Waters），配有Waters 2996二极管阵列检测器及Empower2色谱软件；0.45μm滤膜及其抽滤器。

试剂：Phe、Tyr、Trp标准品购于Sigma公司；甲醇为色谱级，磷酸氢二钾；磷酸二氢钾，氢氧化钾，磷酸等为优级纯；实验用水为超纯水。

2  三种芳香族氨基酸含量测定条件的选择

2.1检测波长的选择：

2.2分别取浓度为500μg/mL、1000μg/mL、250μg/mL的L-Tyr、L-Phe及L-Trp标准溶液进行210～400nm的紫外波段扫描，因构成蛋白质的20多种氨基酸在远紫外区（波长小于220nm）均有紫外光吸收，其他氨基酸对芳香族氨基酸的测定会有干扰，而在近紫外区（220～320nm）只有芳香族氨基酸有紫外光吸收，故在近紫外区选择最佳检测波长。实验发现Tyr、Phe及Trp三种物质在近紫外区的最大吸收波长分别为274.5、256.7和279.3nm，如图1所示。因此选择256.7nm为检测波长。

2.3流动相中缓冲溶液的选择：

2.4 本发明分别比较了乙酸铵和磷酸盐两种缓冲溶液对芳香族氨基酸含量测定的影响，通过试验发现，用乙酸铵缓冲液作流动相，基线波动较大，稳定时间较长，且色谱峰型不好。而选用0.05 mol/L的磷酸盐缓冲液不但可将目标物完全分离，且三种芳香族氨基酸的峰型很好，如图2，能满足芳香族氨基酸分析的要求。

2.5流动相中甲醇浓度的选择：

因色氨酸在波长为256.7nm处测定时保留时间较长，有文献报道用乙睛来缩短，但乙腈的价格昂贵而且毒性大，本发明用甲醇替代。结果表明，适当浓度的甲醇完全能达到乙睛所得到的理想结果。本发明分别比较了比例为5:95、10:90、15:85、20:80的甲醇与磷酸盐缓冲液，对三种芳香族氨基酸含量测定的影响。结果发现，随着甲醇比例的增加，氨基酸的保留时间越小，但同时仪器系统的压力也会相应升高。因此考虑到检测的效率及防止仪器的压力过高，本实验选择甲醇与0.05 mol/L磷酸二氢钾及磷酸二氢钾（1：1）的体积比例为15:85，三种芳香族氨基酸出峰时间快，柱压适中，同时分离度及峰型也满足要求。

2.5流动相中 pH的选择：

本发明发现Trp、Phe、Tyr的等电点分别为5.89、5.48、5.66，在pH大于6时Trp、Phe、Tyr都远离其等电点，可以避免该三种氨基酸因在等电点处有最小溶解度而容易析出的问题，且此时三者都携带负电荷，故选择pH在6.0～6.3之间分析。通过实验发现，在磷酸盐与甲醇的体积比例不变的情况下，改变流动相的pH测定三种芳香族氨基酸，当pH为6.0时，三种芳香族氨基酸保留时间最小，并且各个峰都达到了完全分离。因此，选择流动相的pH为6.0。通过上述实验结果，用所确定的色谱条件上机测定三种芳香族氨基酸标样的混合溶液，三种芳香族氨基酸达到基线分离，峰型对称。如图2所示：

2.6蛋白质沉淀剂的选择：

本发明比较了磺基水杨酸、三氯乙酸、高氯酸和甲醇等提取剂的提取效果，结果表明：用高氯酸作为提取剂时，三种芳香族氨基酸的回收率最高。试验同时又比较了浓度为1%、2%、5%及10%高氯酸提取效果，结果发现2%的高氯酸溶液回收率最高。可能因为色氨酸上有一个吲哚环（苯并呋喃环），在高浓度的强酸下呋喃环可能会质子化开环并形成呋喃树脂，导致色氨酸含量减少。而高氯酸浓度过低则会影响蛋白质的沉淀效果，因此本文选择2%的高氯酸溶液作为提取溶剂。

3三种芳香族氨基酸的定性与定量分析

三种芳香族氨基酸采用峰保留值比较法和标准叠加法进行定性分析，即比对混合标准品和样品在相同条件下的色谱峰和相对保留时间。实验结果表明，在样品中加入标准品前后，三种芳香族氨基酸的出峰位置是一致的，用外标法测定峰面积进行定量分析，计算公式表示为：

X=（C×V）/1000m

X为样品中氨基酸的含量（g/kg）；

C为由工作曲线上查出的样品中芳香族氨基酸的浓度（μg/mL）；

V为样品提取液的体积(mL)；

m为样品的质量（g）。

方法学评价

线性范围与检测限

将浓度为500μg/mL、1000μg/mL、250μg/mL的Tyr、Phe及Trp标准混合液，用2%的高氯酸溶液将其依次稀释2、5、10、20、50倍，按色谱条件检测，以峰面积y与浓度x做标准曲线。经回归分析， Tyr、Phe、Trp分别在6～500μg/mL、3～1000μg/mL和30～250μg/mL范围内有良好的线性关系，其线性相关系数（R2）在0.9986～0.9995之间。根据信噪比，当色谱峰的峰高为噪音3倍时（s/n=3），确定最低检测限，由实验结果：Tyr、Phe、Trp的最低检测限分别为2μg/mL、10μg/mL和1μg/mL，其线性范围及检测限都能满足检测要求。如表1所示。

表1 回归方程、线性相关系数和检测限

精密度实验

对同一三种芳香族氨基酸混合标准品分别进行六次重复性试验，得三种芳香族氨基酸的标准品的峰面积和保留时间。由表2可知，进样6次所测得峰面积的RSD在0.42%～0.57%之间，保留时间的RSD在0.15%～0.30%之间，表明仪器精密度良好，所用测定方法的重现性好。

表2 精密度

回收率实验

本实验以水产品（南美白对虾可食部分）作为样本。取不同量的标准品加入到5.0g样品中，每个样品添加3个水平，每个添加水平做3个平行，按“1.5”节所述的步骤进行样品前处理，以标准曲线法计算其实际含量及平均回收率。结果如表3所示：Tyr、Phe及Trp加标样后检测分析出的平均回收率分别为92.0%、88.0%和105.2%，RSD分别为6.4%、2.5%和3.0%，表明该方法结果稳定，可应用于水产品中游离芳香族氨基酸的分析测定。

 

 表3 回收率试验

Claims (5)

1.一种同时测定三种芳香族氨基酸含量的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

（1） 配制流动相，由15%的甲醇和85%磷酸盐溶液组成，磷酸盐溶液由0.05 mol/L磷酸二氢钾及磷酸氢二钾（1：1）组成，pH范围为6.0～6.3； 

（2）以规格为4.6×250mm i.d, 5μm的waters C18色谱柱为固定相，i.d为内径； 

（3）用2%的高氯酸溶液配制三种芳香族氨基酸标准混合储备液；

（4）取新鲜水产品肉，用2%的高氯酸匀浆、超声、离心提取；

（5）设置流动相流速为1.0mL/min，进样量为30微升；

（6）将芳香族氨基酸经色谱柱分离后，用二极管阵列检测器进行分析，选择Tyr、Phe和Trp的最佳紫外检测波长进行测定；

（7）通过外标法进行定量，以标准品峰面积与浓度做标准曲线，待测样品进样后可得到样品峰面积，通过标准曲线可计算出样品浓度；并通过对比样品和标准品中三种芳香族氨基酸的全波段色谱扫描图谱的相似程度，鉴定色谱峰的纯度。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：调节流动相中的磷酸盐溶液pH为6.0，甲醇和磷酸盐溶液使用前用0.45μm的微孔滤膜过滤，超声脱气10min。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：用2%的高氯酸溶液配制三种芳香族氨基酸标准混合储备液，使Phe、Tyr及Trp的浓度分别为1000μg/mL、500μg/mL、250μg/mL，并用2%的高氯酸溶液将氨基酸标准混合储备液依次稀释2、5、10、20、50倍。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：取新鲜水产品肉5.0g于离心管中，加入10mL预冷5%的高氯酸匀浆2min，用玻璃棒搅拌均匀，超声提取5min后，在冷冻离心机4℃下10000rpm离心20min，取上清液过滤，过滤后所剩的沉淀物加入预冷的2% PCA溶液再进行浸提、离心，重复2次后合并上清液；用KOH溶液中和上清液至pH为6.0；中和时先加5mol/L的KOH溶液调节，待接近至所需pH=6.0时，改用1mol/L的KOH溶液调节。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：芳香族氨基酸经Waters Atlantis T3 C18分离后，进入二极管阵列检测器检测，Tyr、Phe及Trp三种物质的检测波长设定分别为274.5、256.7和279.3nm。