CN109298086A - 一种同时测定鲜肉中多种呈味核苷酸的高效液相色谱方法与应用 - Google Patents

一种同时测定鲜肉中多种呈味核苷酸的高效液相色谱方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及鲜肉质量控制领域，主要涉及一种同时测定鲜肉中多种呈味核苷酸的高效液相色谱方法与应用。本发明公开了一种同时测定鲜肉中多种呈味核苷酸的高效液相色谱方法，主要包括：(1)样品前处理；(2)采用高效液相色谱方法测定待测样品中各呈味核苷酸的含量，高效液相色谱分离分析肉样中肌苷酸(IMP)、三磷酸腺苷(ATP)、二磷酸腺苷(ADP)、一磷酸腺苷(AMP)、肌苷(I)、次黄嘌呤(Hx)六种核苷酸的含量。本发明还公开了这种高效液相色谱检测方法在评定鲜肉新鲜度中的应用。这对冰鲜肉市场的发展具有重要意义，既能为消费者提供评价鲜肉新鲜度的参考，又能为冰鲜肉开发商提供生产指导，具有较强的理论价值和实践意义。

Description

一种同时测定鲜肉中多种呈味核苷酸的高效液相色谱方法与 应用
技术领域
本发明涉及鲜肉质量控制领域，主要涉及一种同时测定鲜肉中多种呈味核苷酸的高效液相色谱方法与应用。
背景技术
目前市场上销售的肉类一般分为热鲜肉、冰鲜肉和冷冻肉三种。冰鲜肉是一种新的产品形态，是指将屠宰后得畜胴体迅速冷却，然后在0-4℃保藏的生鲜肉。它具有安全、卫生及肉嫩味美的优点，但在我国上市后其市场占有率和知名度都不高。究其原因，主要是因为行业内缺少耳熟能详的产品品牌和企业品牌，缺乏冰鲜肉营养及风味的评价标准，因此消费者对冰鲜肉的风味存在疑虑，导致对冰鲜肉的接受度不够，在一定程度上限制了冰鲜肉市场的扩大。
现已明确鲜味氨基酸中谷氨酸钠和呈味核苷酸是动物组织中重要的鲜味物质，其中呈味核苷酸中的肌苷酸(IMP)增加鲜味的能力较谷氨酸钠强40倍。Hiromichi等人研究表明，新鲜鸡肉、猪肉和牛肉及各自的肉汤中，IMP含量是游离谷氨酸含量的10倍，可见畜禽肉中的鲜味物质主要是IMP。动物屠宰后，肌肉组织中IMP主要来自高能磷酸化合物的降解，其主要产生过程为：ATP在ATP酶作用下降解产生ADP，在腺苷酸激酶作用下ADP生成AMP，经脱氨酶作用下生产肌苷酸，肌苷酸降解产生肌苷和次黄嘌呤。
因此，亟需寻找一种对冰鲜肉所含的多种呈味核苷酸进行分析并对其鲜度进行评价的方法。
发明内容
鉴于现有技术中的不足之处，本发明的目的在于提供一种同时测定鲜肉中多种呈味核苷酸的高效液相色谱方法与应用，包括样品前处理、和高效液相色谱检测。该检测方法对各呈味核苷酸能很好的分离，能够同时检测肌苷酸(IMP)、三磷酸腺苷(ATP)、二磷酸腺苷(ADP)、一磷酸腺苷(AMP)、肌苷(I)和次黄嘌呤(Hx)的含量，具有操作方便，快速且精确度高的优点。将上述方法检测到的各种呈味核苷酸计算得到校正肌苷酸和K值用于评定鲜肉的新鲜度，能更加客观地对鲜肉中新鲜度进行判断。
为了达到上述目的，本发明采用的技术方案如下：
一种同时测定鲜肉中多种呈味核苷酸的高效液相色谱方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)样品前处理：在搅碎后的肉样中加入高氯酸溶液进行第一次提取，离心得上清液和固体残渣，固体残渣中加入高氯酸溶液进行第二次提取，离心，合并两次上清液，加入Na2CO3调节pH至5.0-7.0，然后加入磷酸缓冲液混匀得到待测样品；
(2)采用高效液相色谱方法测定待测样品中多种呈味核苷酸的含量：以流动相A和流动相B进行梯度洗脱，其中流动相A为甲醇，流动相B为磷酸缓冲液(PB)；流动相A与流动相B的体积之比为 (2-8)：(92-98)，采用外标法分别得到肌苷酸(IMP)、三磷酸腺苷 (ATP)、二磷酸腺苷(ADP)、一磷酸腺苷(AMP)、肌苷(I)和次黄嘌呤(Hx)的含量。
优选地，步骤(2)所述高效液相色谱的色谱柱为ZORBAX SB-C18，规格：4.6×250mm,5μm。
优选地，步骤(2)所述梯度洗脱的程序如下，其中流动相A和流动相B之间的比例为体积比：
0-2min：流动相A：流动相B＝2:98；
2-8min：流动相A：流动相B＝4:96；
8-12min：流动相A：流动相B＝6:94；
12-16min：流动相A：流动相B＝2:98。
采用这种梯度洗脱方式能在一个时间程序下就能分离分析多种呈味核苷酸，实现六种呈味核苷酸的同时测定。从本发明的一个实施例可以看出，在色谱图中相邻的核苷酸间的分离度大于1.5。
本发明中，步骤(2)所述高效液相色谱的检测参数为：
检测波长为254nm；
柱温为28-32℃；
流动相流速为0.5-1.5mL/min；
进样体积为8-12μL；
优选地，柱温为30℃；流动相流速为1.0ml/min；进样体积为10μL。
优选地，步骤(1)所述肉样为鸡肉冰鲜肉。
优选地，步骤(1)所述第一次提取中肉样的质量与高氯酸的体积比为1g：3-6mL；所述第二次提取中肉样的质量与高氯酸的体积比为1g：1.5-2.5mL；所述高氯酸的浓度为0.6mol/L。
优选地，步骤(1)所述第一次提取和第二次提取均是于超声波仪中超声10-20min。
本发明中，提取肉样中呈味核苷酸时，采用分两次加入高氯酸并进行两次超声提取，最后合并两次超声提取的提取液的方法，这样能使提取更加彻底，有效防止溶解平衡造成提取不彻底的问题。
优选地，步骤(1)所述离心时间为4-6min。
优选地，步骤(1)所述Na2CO3溶液的浓度为0.5-0.7mol/L。
本发明还提供了该高效液相检测方法在评定鲜肉新鲜度中的应用，所述应用的方法为：采用肌苷酸(IMP)、三磷酸腺苷(ATP)、二磷酸腺苷(ADP)、一磷酸腺苷(AMP)、肌苷(I)和次黄嘌呤(Hx) 的含量分别计算K值和校正肌苷酸量，通过所述K值和所述校正肌苷酸量综合评定鲜肉新鲜度；
其中，校正肌苷酸(IMPc)按以下公式计算：
对畜禽肉进行鲜味评价时，尤其是冰鲜或冰冻处理后的肉，需要综合考虑各种呈味核苷酸的含量，因此以校正肌苷酸含量为鲜味的判定标准更为准确可靠。一般而言，校正肌苷酸含量值越高，肉越新鲜。
K值是IMP的两种转化产物——次黄嘌呤和肌苷的含量占呈味核苷酸总量的比例，K值越低，肉越新鲜。K值的计算公式如下：
K＝(Hx+I)/(ATP+ADP+AMP+IMP+Hx+I)……(2)
在本发明的一个实施例中，发明人探讨了冷藏时间对鲜肉样品中的肌苷酸等呈味核苷酸的含量的影响，测定并计算相应的校正肌苷酸含量及K值，得到各呈味核苷酸的生产降解规律，为冰鲜肉市场的开发提供了重要的依据。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
本发明采用高效液相色谱方法测定鲜肉中各呈味核苷酸的含量时，以甲醇-PB为流动相，按梯度洗脱的洗脱方式(0-2min：0-2min：流动相A：流动相B＝2:98；2-8min：流动相A：流动相B＝4:96；8-12 min：流动相A：流动相B＝6:94；12-16min：流动相A：流动相B＝2:98)， 15min之内能将鲜肉样品中的IMP、ATP、ADP、AMP、Hx及I这六种呈味核苷酸完全分离，通过紫外检测器检测并结合单点定量法对各含量进行测定。这种检测方法能在较短时间内一次分离六个目标物，且相邻目标物间的分离度大于1.5，符合《中国药典》对高效液相色谱法的规定。该检测方法只需一次检测就能实现肉样中多种呈味核苷酸的检测，既节约了检测成本又能简化检测程序，是一种简便、快速且精确的检测方法。
本发明以呈味核苷酸的综合加权值即校正肌苷酸值(IMPc)和K 值作为评价肉类新鲜度的指标，综合考虑两者的数值对肉样的新鲜度进行综合评价。明确了鲜肉品质与其中呈味核苷酸的生产和降解密切相关，这对冰鲜肉市场的发展具有重要意义，既能为消费者提供评价鲜肉新鲜度的参考，又能为冰鲜肉开发商提供生产指导，具有较强的理论价值和实践意义。
附图说明
图1为梯度洗脱时标准溶液的色谱图；
图2为鸡肉中呈味核苷酸含量色谱图；
图3为猪肉中呈味核苷酸含量色谱图；
图4为等度洗脱时标准溶液的色谱图。
具体实施方案
为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合说明书附图和具体实施例进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。除非特别说明，本发明所用试剂和材料均为市购。
本发明的工作原理和过程为将鲜肉样品中呈味核苷酸的提取液注入高效液相色谱仪，甲醇-PB组成的流动相将样品载入碳十八烷基键合硅胶填充剂的色谱柱中，采用梯度洗脱的方式将各呈味核苷酸分离，使其依次到达紫外检测器并进行检测；以测定得到的标准工作液的峰面积对应的浓度作用标准浓度，然后采用单点定量法对未知样品的浓度进行定量，得到鲜肉样品中各呈味核苷酸的含量。
以下是各实施例中采用的仪器、药品及相关溶剂的配置方法：
仪器：分析天平(感量为0.1mg)；高效液相色谱仪(紫外检测器)；高速离心机(转速≤12000rpm)；超声波仪；15mL塑料离心管； 5mL医用注射器；0.45μm滤膜；pH计。
药品：甲醇(CH4O)，色谱纯；高氯酸(HClO4)，优级纯，含量 70％-72％；肌苷酸标准品：(含量99.4％)，肌酐标准品(含量99.6％)，次黄嘌呤标准品(含量99.6％)；碳酸钠(Na2CO3)；磷酸二氢钾 (KH2PO4)；磷酸氢二钾(K2HPO4)；。
各试剂溶液的配制方法如下：
(1)1L浓度为0.6mol/L的高氯酸溶液：量取48.2mL含量为71％的高氯酸，定容至1L。
(2)100mL浓度为0.6mol/L的Na2CO3溶液：称取6.36g无水碳酸钠固体于烧杯中加入80mL水溶解，定容至100mL。
(3)1L浓度为0.04mol/L磷酸二氢钾溶液：称取5.44g无水磷酸二氢钾固体于烧杯中，加入800mL水溶解完全，定容至1L。
(4)1L浓度为0.04mol/L磷酸氢二钾溶液：称取9.12g三水合磷酸氢二钾固体于烧杯中，加入800mL超纯水溶解完全，定容至1L。
(5)0.04mol/LPB缓冲液：将浓度为0.04mol/L的磷酸二氢钾溶液与浓度为0.04mol/L的磷酸氢二钾溶液以6:1的体积比例混合均匀，调至pH为6.0。
各标准溶液的配制方法如下：
A、0.2g/L的肌苷(I)标准储备液：准确称取2.0mg肌苷酸标准品(含量99.4％)，用5％甲醇水溶液定容至10mL，摇匀。
B、0.2g/L的肌苷酸(IMP)标准储备液：准确称取2.0mg肌酐标准品(含量99.6％)，用5％甲醇水溶液定容至10mL，摇匀。
C、0.2g/L次黄嘌呤(Hx)标准储备液：准确称取2.0mg次黄嘌呤标准品(含量99.6％)，用5％甲醇水溶液定容至10mL，摇匀。
D、0.2g/L一磷酸腺苷(AMP)标准储备液：准确称取2.0mg次黄嘌呤标准品(含量99.6％)，用5％甲醇水溶液定容至10mL，摇匀。
E、0.2g/L二磷酸腺苷(ADP)标准储备液：准确称取2.0mg次黄嘌呤标准品(含量99.6％)，用5％甲醇水溶液定容至10mL，摇匀。
F、0.2g/L三磷酸腺苷(ATP)标准储备液：准确称取2.0mg次黄嘌呤标准品(含量99.6％)，用5％甲醇水溶液定容至10mL，摇匀。
实施例1检测方法学的建立
首先，确定高效液相色谱的检测条件如下：
高效液相色谱的色谱柱：ZORBAX SB-C18(4.6×250mm,5μm)；
流动相：流动相A：甲醇和流动相B：0.04mol/L PB缓冲液；
洗脱的方式采用梯度洗脱，梯度洗脱程序见表1；
表1流动相梯度表
检测波长：254nm；
柱温：30℃；
流动相流速：1mL/min；
进样体积：10μL。
在上述色谱条件下，对肌苷(I)、肌苷酸(IMP)、次黄嘌呤(Hx)、一磷酸腺苷(AMP)、二磷酸腺苷(ADP)、三磷酸腺苷(ATP)这六个标准样品进行分离分析，得到该色谱条件下的标准样品的色谱出峰图，如图1所示。
由图1可知，在本实施例设定的色谱条件下，采用紫外检测器进行检测，以保留时间定性，在15min之内较好分离样品中的ATP、 ADP、AMP、IMP、Hx、I，各目标物对应的峰型都呈正态分布，且相邻两种物质之间的分离度大于1.5，符合《中国药典》对高效液相色谱的规定。
实施例2精密度实验
同一鸡胸肉组织样品取5份，对肌苷酸、次黄嘌呤、肌苷的保留时间及含量的重现性进行分析，检测方法包括如下步骤：
(1)样品前处理：用绞肉机绞碎混合均匀后各称取1g，于15mL 塑料离心管中，加入4mL 0.6mol/L的高氯酸，用振荡器震荡均匀，将震荡后的匀浆液放置于超声波仪中超声10min，然后在10000r/min 的转速下离心10min，转移上清液4mL至新的15mL离心管中；在下层沉淀中再次加入2mL 0.6mol/L的高氯酸，重复上一步，震荡均匀，超声10min，10000r/min的转速下离心10min，转移上清液2mL，合并两次上清液；加入2.5mL 0.6mol/L Na2CO3使pH接近6.0，然后加入1.5mLPB缓冲液混合，测定前用0.45μm滤膜过滤。
(2)将上述待测液按实施例1中确定的色谱条件条件进行高效液相色谱分离分析，对比呈味核苷酸的标准样品的色谱图，对肌苷酸、次黄嘌呤、肌苷的保留时间及含量的重现性进行分析，结果如表2所示。
待测样品中呈味核苷酸含量按式(3)计算：
X——样品中肌苷酸含量，单位为毫克每克(mg/g)；
Cs——采用单点定量法获得样品待测液中呈味核苷酸的含量，单位为毫克每升(mg/L)。
mi——样品的质量，单位为克(g)。
V——样品待测液的体积，单位为升(L)。
表2几种呈味核苷酸的精密度试验(n＝5)
结果表明肌苷酸、次黄嘌呤、肌苷得含量及保留时间的相对标准偏差均低于2％，说明该仪器准确可靠，本发明确定的检测条件是可用的。
实施例3回收率实验
采用与实施例2中一致的样品前处理方法制备样品提取液，从同一样品提取液中分别取两份1mL的待测液，其中一份用5％甲醇水溶液定容至10mL，另一份加入2.5mL的0.24mg/mL的肌苷酸、0.012 mg/mL的次黄嘌呤及0.12mg/mL的肌苷标准溶液，然后用5％甲醇水溶液定容至10mL。最后对加标前后溶液进行高效液相色谱分析检测。各呈味核苷酸含量按实施例2中公式(3)计算，并得到各成分的回收率，平行测定6次，结果如表3所示。
表3几种呈味核苷酸的回收率实验
实验结果表明，在实施例1所确定的色谱条件下，三种呈味核苷酸的回收率平均值分别为100.23％、98.28％、100.67％，结果理想，说明该色谱条件是符合本发明的检测要求。
实施例4鸡肉中呈味核苷酸含量的测定
取鸡胸肉进行样品前处理：用绞肉机绞碎混合均匀后各称取1g，于15mL塑料离心管中，加入4mL 0.6mol/L的高氯酸，用振荡器震荡均匀，将震荡后的匀浆液放置于超声波仪中超声10min，然后在10000r/min的转速下离心10min，转移上清液4mL至新的15mL离心管中；在下层沉淀中再次加入2mL 0.6mol/L的高氯酸，重复上一步，震荡均匀，超声10min，10000r/min的转速下离心10min，转移上清液2mL，合并两次上清液；加入2.5mL 0.6mol/LNa2CO3使 pH接近6.0，然后加入1.5mL PB缓冲液混合，测定前用0.45μm滤膜过滤。
采用实施例1中确定的色谱条件，对鸡肉样品中各种呈味核苷酸进行高效液相色谱检测，得到的色谱图如图2所示，各呈味核苷酸的含量按实施例2中公式(3)计算得到，结果如表4所示。
表4鸡肉中各种呈味核苷酸的高效液相色谱检测结果
由上表可知，通过高效液相色谱方法检测得到，本实施例检测的鸡肉中肌苷酸含量为0.486mg/g；二磷酸腺苷含量为0.195mg/g；一磷酸腺苷含量为0.011mg/g；次黄嘌呤含量为0.350mg/g；肌苷含量为 0.763mg/g；没有检测到三磷酸腺苷的信号，可能是此时鸡肉中三磷酸腺苷已降解完全。
实施例5猪肉中呈味核苷酸含量的测定
取猪背最长肌肉样品用绞肉机绞碎混合均匀后各称取1g，于15 mL塑料离心管中，加入4mL 0.6mol/L的高氯酸，用振荡器震荡均匀，将震荡后的匀浆液放置于超声波仪中超声10min，然后在10000 r/min的转速下离心10min，转移上清液4mL至新的15mL离心管中；在下层沉淀中再次加入2mL 0.6mol/L的高氯酸，重复上一步，震荡均匀，超声10min，10000r/min的转速下离心10min，转移上清液2mL，合并两次上清液；加入2.5mL 0.6mol/L Na2CO3使pH接近6.0，然后加入1.5mL PB缓冲液混合，测定前用0.45μm滤膜过滤。
采用实施例1中确定的色谱条件，对猪肉样品中各种呈味核苷酸进行高效液相色谱检测，得到的色谱图如图3所示，各呈味核苷酸的含量按实施例2中公式(3)计算得到，结果如表5所示。
表5猪肉中多种呈味核苷酸的高效液相色谱检测结果
由上表可知，通过高效液相色谱方法检测得到，本实施例检测的猪肉中肌苷酸含量为2.642mg/g；三磷酸腺苷含量为0.036mg/g；二磷酸腺苷含量为0.368mg/g；一磷酸腺苷含量为0.022mg/g；次黄嘌呤含量为0.059mg/g；肌苷含量为0.451mg/g。
实施例6不同冷藏天数的鸡肉中呈味核苷酸的测定
选择条件一致的70日龄的黄羽肉鸡60只，经屠宰消毒后迅速冷却至0-4℃，然后置于4℃冰柜中冷藏，待用。然后分别取冷藏0～4 小时之间、1天、2天、3天、5天、7天的公母鸡各5只，采集鸡胸肉样品，进行样品前处理，得到含各种呈味核苷酸的提取液，样品前处理方法与实施4中的样品前处理方法一致。
采用实施例1中确定的色谱条件，对鸡肉样品中各种呈味核苷酸进行高效液相色谱检测，对应的含量按实施例2中公式(3)计算得。结果如表6所示。
表6不同冰鲜时间的鸡肉样品中呈味核苷酸含量
由上表可知，宰杀的黄羽肉鸡中，冷藏时间为0-4h内的鸡肉中肌苷酸(IMP)含量最高，能达到3.628mg/g；随着冷藏时间的延长，冰鲜鸡肉中肌苷酸含量呈下降趋势，且冰鲜时间越长，肌苷酸含量的下降趋势越明显；鸡肉中的ATP和ADP随冷藏时间延长逐渐减少；实验中鸡肉的AMP含量变化受时间影响不大；鸡肉中Hx和I随着冷藏时间增加而增多，这是由鸡肉中肌苷酸的降解导致，而鲜肉中次黄嘌呤含量的提高将有利于微生物的繁殖，从而造成鲜肉变质。
实施例7鸡肉的冰鲜时间对呈味核苷酸的影响
在本实施例中，主要采用两种鲜肉的新鲜度评价指标对实施例6 中不同冰鲜时间的黄羽鸡进行新鲜度评价。这两种鲜度评价指标分别为校正核苷酸含量——IPMc值和K值。IMPc值是样品的校正肌苷酸含量，IMPc值越大肉越新鲜，计算方法是ATP、ADP、AMP、IMP、Hx、I的含量值除以各自的分子量之和再乘以IMP的分子量，如公式(2)所示；K值是IMP的两种转化产物——次黄嘌呤和肌苷的含量占呈味核苷酸总量的比例，K值越低肉越新鲜，其计算方法按公式(3) 计算。
由实施例6中检测得到不同冰鲜时间的鸡肉样品中各呈味核苷酸含量，计算不同冰鲜时间下鸡肉的K值和IPMc值。
得到结果如表7所示：
表7不同冰鲜时间下的鸡肉鲜度
由上表可知，冰鲜鸡肉的呈味核苷酸综合含量及K值都具有时间依赖性，IMPc值随冷藏时间增加而降低，K值随冷藏时间增加而升高。对这两组数据进行相关性分析，结果表明K值与IMPc值的相关系数r为-0.948，P为0.001，P值小于0.01，则说明两者存在极显著的线性负相关关系。K值和IMPc值都可以用于比较肉质的新鲜度。但是，IMPc是一个绝对值，可以比较不同品种、不同产地以及不同养殖方式下鲜肉产品中鲜味物质的含量。因此综合考虑K值与IMPc 值能更好地反应肉质新鲜度和鲜味物质总含量变化，是一种更科学的分析方法。
实验结果表明，4℃条件下冷藏保存时，冰鲜1天后，IMPc值下降了16.3％，K值可达到17.03％；冷藏2天后与冷藏3天后，IMPc 值均下降了26％左右，K值达到20％；而冷藏5天后，IMPc值下降了34.3％，K值已经达到25.73％，鸡肉的新鲜度已经显著下降。因此，当消费者对肉质新鲜度要求较高时，应该购买冷藏时间不超过3天的冰鲜肉；冰鲜肉厂商应当按照市场需求规划由禽畜类活物到可以投放市场的鲜肉数量。
对比例1
本对比例中，色谱条件的洗脱方式由实施例1中梯度洗脱改为等度洗脱，其流动相A：甲醇和流动相B：0.04mol/L PB缓冲液之间的体积比为4:96，其余检测条件与实施例1一致。采用上述条件对肌苷 (I)、肌苷酸(IMP)、次黄嘌呤(Hx)、一磷酸腺苷(AMP)、二磷酸腺苷(ADP)、三磷酸腺苷(ATP)这六个标准样品进行分离分析，得到该色谱条件下的标准样品的色谱出峰图，如图4所示。
由图4可知，在本实施例设定的色谱条件下，采用紫外检测器进行检测，以保留时间定性，图谱中出现一个三重峰和两个单峰，说明在本实施例的色谱条件下，不能实现六种目标物的分离，不符合《中国药典》对高液相色谱的规定。
通过实施例1与对比例1的实验结果可知在用于高效液相色谱分离复杂成分时，采用梯度洗脱的方式能提高分离能力，并且通过改变流动相比例能有效缩短分析周期，节约分析检测成本。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用于限制本发明。对于本领域的技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种同时测定鲜肉中多种呈味核苷酸的高效液相色谱方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)样品前处理：在搅碎后的肉样中加入高氯酸溶液进行第一次提取，离心得上清液和固体残渣，固体残渣中加入高氯酸溶液进行第二次提取，离心，合并两次上清液，加入Na2CO3调节pH至5.0-7.0，然后加入磷酸缓冲液混匀得到待测样品；
(2)采用高效液相色谱方法测定待测样品中多种呈味核苷酸的含量：以流动相A和流动相B进行梯度洗脱，其中流动相A为甲醇，流动相B为磷酸缓冲液(PB)；流动相A与流动相B的体积之比为(2-8)：(92-98)，采用外标法分别得到肌苷酸(IMP)、三磷酸腺苷(ATP)、二磷酸腺苷(ADP)、一磷酸腺苷(AMP)、肌苷(I)和次黄嘌呤(Hx)的含量。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述高效液相色谱的色谱柱为ZORBAXSB-C18，规格：4.6×250mm,5μm。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述梯度洗脱的程序如下，其中流动相A和流动相B之间的比例为体积比：
0-2min：流动相A：流动相B＝2:98；
2-8min：流动相A：流动相B＝4:96；
8-12min：流动相A：流动相B＝6:94；
12-16min：流动相A：流动相B＝2:98。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述高效液相色谱的检测参数为：
检测波长为254nm；
柱温为28-32℃；
流动相流速为0.5-1.5mL/min；
进样体积为8-12μL；
优选地，柱温为30℃；流动相流速为1.0ml/min；进样体积为10μL。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述肉样为鸡肉冰鲜肉。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述第一次提取中肉样的质量与高氯酸的体积比为1g：3-6mL；所述第二次提取中肉样的质量与高氯酸的体积比为1g：1.5-2.5mL；所述高氯酸的浓度为0.6mol/L。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述第一次提取和第二次提取均是于超声波仪中超声10-20min。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述离心时间为4-6min。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述Na2CO3溶液的浓度为0.5-0.7mol/L。
10.权利要求1-9任一项所述的方法在评定鲜肉新鲜度中的应用，其特征在于，所述应用的方法为：
采用肌苷酸(IMP)、三磷酸腺苷(ATP)、二磷酸腺苷(ADP)、一磷酸腺苷(AMP)、肌苷(I)和次黄嘌呤(Hx)的含量分别计算K值和校正肌苷酸量，通过所述K值和所述校正肌苷酸量(IMPc)来评定鲜肉新鲜度；
其中，校正肌苷酸(IMPc)按以下公式计算：
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