CN104237412A - 一种高效液相色谱-二极管阵列法同时测定水产品中多种atp关联产物的方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于分析化学领域，公开了一种用高效液相色谱—二极管阵列法同时测定水产品中多种ATP关联产物含量的方法。使用带有二极管阵列检测器的高效液相色谱仪进行检测，将待测样品提取后进样到高效液相色谱仪中，梯度洗脱；根据各ATP关联产物的保留时间及紫外吸收光谱，确定各色谱峰是哪一种ATP关联产物，检测相应ATP关联产物色谱峰面积，根据同样色谱条件下ATP关联物标准工作曲线或者回归方程计算待测样品提取液中ATP关联产物的含量。本方法的设备及分析条件要求简单，不用离子对试剂也可以同时测定水产品中多种ATP关联产物含量，可同时测10种，分离时间不超过25分钟。

Description

一种高效液相色谱-二极管阵列法同时测定水产品中多种ATP关联产物的方法

技术领域

本发明属于分析化学领域，涉及检测水产品中多种ATP关联产物的方法，特别涉及用高效液相色谱—二极管阵列法同时测定水产品中多种ATP关联产物含量的方法。

背景技术

ATP关联产物是由嘌呤碱基、嘧啶碱基、尼克酰胺等与糖磷酸酯组成的一类化合物，如三磷酸腺苷(adenosine triphosphate，ATP)、二磷酸腺苷(AdenosineDiphosphate，ADP)、腺苷酸(Adenosine Monophosphate，AMP)、肌苷酸(Inosinicacid，IMP)、次黄嘌呤核苷(Inosine，HxR)、次黄嘌呤(Hypoxanthine，Hx)、鸟苷酸(Guanylic acid，GMP)，腺苷(Adenosine，AdR)，腺嘌呤(Adenine，Ad)、黄嘌呤(Xanthine，Xt)等。它们是水产动物肌肉核苷酸的主要成分，与水产原料的风味和新鲜度紧密相关。在风味方面，如AMP有着压抑苦味的特性，能使食物产生良好的甜味和咸味，Hx会产生苦味，IMP是水产动物肌肉主要的呈味核苷酸，IMP增加食品鲜味的能力比谷氨酸钠强40倍。在鲜度方面，一般认为鱼死后鱼肉内ATP依次降解为ADP、AMP、IMP、HxR和HX，其中HxR、Hx量之和对ATP关联物总量的比值即为K值。K值作为鱼类鲜度指标已被公认。对于贝类，SaitoHuArai和wamoto嘲等对几种双壳动物的肌肉进行分析，发现在蛤蜊和扇贝中，ATP及其关联物的降解过程为ATP→ADP→AMP→AdR→HxR→Hx→Xt，而在舟贝、毛蚶和鲍鱼中按途径ATP→ADP→AMP→AdR→Ad进行。因此，快速准确检测出鱼体中的ATP及其关联产物对水产原料的风味和新鲜度有很重要的意义。

目前国内外测定ATP关联物含量的方法主要有离子交换液相色谱法、毛细管电泳法和反相液相色谱法等。离子交换色谱法对核苷酸等兼性离子化合物能很好的分离，但其需要对分离柱进行平衡(再生)，且分析时间较长；高效毛细管电泳法对各种呈味核苷酸的分辨率较高，但仪器昂贵；反相高效液相色谱法具有快速、操作简便的优点，是目前生物、食品等研究领域主要使用的方法，但以往的反相高效液相色谱法分离的核苷酸或种类有限，或采用离子对试剂法分离，造成待测核苷酸相互有干扰或分析时间过长。如：刘亚等用高效液相色谱法测定了马氏珠母贝肉中的ATP关联产物(食品与发酵工业，2008，36(6)：137-141)，该法只测定了6种ATP关联产物，可能存在其他核苷酸的干扰。杨文鸽、陈舜胜等采用离子对高效液相色谱法测定了水产品中ATP降解产物(农业工程学报,2007,(06).217-222)、(水产学报,2011,35(11).1745-1752)，离子对高效液相色谱法稳定时间过长，分离度不好，分析效率低，且对柱子污染大，暂时还没有一种设备要求低、不采用离子对试剂、分析效率高且定性稳定、能够同时测定水产品中该9种ATP关联产物的高效液相色谱法。

发明内容

本发明目的是提供一种操作简单、分离速度快、不使用离子对试剂且定量定性准确，能够同时测定水产品中多种ATP关联产物的高效液相色谱-二极管阵列法，解决以上现有技术中存在的分离效果不好、种类有限、分析时间过长、柱子污染严重及定性不准确等不足。

所测定的ATP关联产物为三磷酸腺苷(adenosine triphosphate，ATP)、二磷酸腺苷(Adenosine Diphosphate，ADP)、腺苷酸(Adenosine Monophosphate，AMP)、肌苷酸(Inosinic acid，IMP)、次黄嘌呤核苷(Inosine，HxR)、次黄嘌呤(Hypoxanthine，Hx)、鸟苷酸(Guanylic acid，GMP)，腺苷(Adenosine，AdR)，腺嘌呤(Adenine，Ad)和黄嘌呤(Xanthine，Xt)中的至少一种。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

使用带有DAD(二极管阵列)检测器的高效液相色谱仪进行检测，将待测样品提取液加入到高效液相色谱仪中，梯度洗脱。

用二极管阵列检测器扫描确定检测各ATP关联产物的最佳检测波长(紫外最大吸收波长和200～400nm下的紫外吸收光谱，根据特征光谱确定各色谱峰是哪一种ATP关联产物。

10种ATP关联产物的紫外最大吸收波长分别为：三磷酸腺苷259.1nm、二磷酸腺苷253.2nm、腺苷酸248.4nm、肌苷酸259.1nm、次黄嘌呤核苷248.4nm、次黄嘌呤259.1nm、鸟苷酸260.3nm、腺苷248.4nm、腺嘌呤259.1nm、黄嘌呤267.4nm。

检测相应ATP关联产物色谱峰面积，根据同样色谱条件下标准工作曲线或者回归方程计算ATP关联产物的含量。

液相色谱柱采用通用型，填料选自十八烷基键合相硅胶；流动相由甲醇(A相)和15mmol/L磷酸氢二钾缓冲液(B相)组成，磷酸氢二钾缓冲液pH调为5.9，梯度洗脱。

色谱条件为，分析柱：填料选自十八烷基键合相硅胶的通用型液相色谱柱；流速：0.5～1.5mL/min，优选为1.0mL/min；进样量为8～12μl，优选为10μl；柱温为30～35℃，优选为30～32℃。优选的，以规格为4.6×250mm i.d,5μm的watersC18色谱柱为固定相。

流动相由A相的有机溶剂和B相的缓冲液组成；A相为甲醇或乙腈，B相为pH5.8～6.0、浓度为15～60mmol/L的缓冲液，例如磷酸氢二钾缓冲液，磷酸二氢钾缓冲液、磷酸氢二钠缓冲液、柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液或乙酸-乙酸钠缓冲液。优选为pH5.8～6.0、浓度为15～60mmol/L的磷酸氢二钾缓冲液；更优选浓度pH5.8～5.9、浓度为15～25mmol/的磷酸氢二钾缓冲液。

梯度洗脱程序如下：

第一阶段：A相0％、B相100％；持续时间为5.5～6.5min；

第二阶段：瞬时调整为A相7％～9％、B相91％～93％，并以这个梯度洗脱；持续时间为8.5～10min；

第三阶段：两种流动相匀速变化到A相32％～40％，B相60％～68％；持续时间为4.5～6min；

第四阶段：两种流动相匀速变化到A相32％～40％，B相60％～68％；持续时间为1.5～3min；

第五阶段：两种流动相匀速变化到A相0％、B相100％；持续时间为2.5～4min。上述比例均为体积比。

或者，优选的梯度洗脱程序为：

第一阶段为第0.00～6.00min：A相0％、B相100％；

第二阶段为第6.00～15.00min，在第二阶段开始时(可以是第6.00～6.01min时)，瞬时调整为A相7％～9％、B相91％～93％(优选为A相8％，B相92％)并以这个梯度洗脱；

第三阶段为第15.00～20.00min：两种流动相匀速变化到A相32％～40％，B相60％～68％(优选为A相35％，B相65％)；

第四阶段为第20.00～22.00min：两种流动相匀速变化到A相36％～43％，B相57％～62％％(优选为A相35％，B相65％)；

第五阶段为第22.00～25.00min：两种流动相匀速变化到A相0％、B相100％。

优选的，流动相在使用前用0.22～0.5μm(优选为0.45μm)的水相微孔滤膜过滤后，超声脱气3～10分钟。

优选的，检测相应ATP关联产物色谱峰面积，根据标准工作曲线或者回归方程计算ATP关联产物的含量。用二极管阵列检测器扫描确定检测各ATP关联产物的最佳检测波长(紫外最大吸收波长)，并根据三维色谱图对样品中的10种ATP关联产物进行进一步定性，确定各色谱峰是哪一种ATP关联产物。

待测样品提取液的制备方法为：

a.取水产品样品，按照1g：1～3ml的的用量比，与预冷到0～4℃、质量浓度为3％～6％的高氯酸溶液混合均质进行浸提，0～4℃下2000～8000rpm离心5～20min，收集上清液；

b.取沉淀按上述步骤a的方法操作重复1～3次，合并上清液；

c.加入KOH或NaOH将pH中和至5.5～6.0(优选为5.8～6.0，更优选5.9)，过滤去除高氯酸钾或高氯酸钠结晶固体，再用流动相B相中的缓冲液定容；

d.用孔径为0.22～0.5μm的滤膜(优选为0.45μm)过滤，即获得待测样品提取液。

标准工作曲线或回归方程的建立方法为：分别称取ATP关联物标准品，用流动相的B相配制成不同浓度的标准溶液，进行液相色谱测定，根据保留时间和二极管阵列检测器扫描图谱定性，以核苷酸浓度为横坐标，所测相应核苷酸色谱峰面积为纵坐标作图，并绘制标准工作曲线或者拟合回归方程。

上述方法可用外标法定量分析水产品中多种ATP关联产物的含量。

水产品样品前处理的具体方案为：

(1)新鲜水产品肉与0～10℃的5wt％～8wt％的高氯酸匀浆1～2min，两者比例为1g：1.3～3ml；超声提取3～8min后，低温离心；分离上清液和沉淀；

(2)步骤(1)的沉淀用0～10℃的5wt％～8wt％的高氯酸再次匀浆，超声提取3～8min后，低温离心；分离上清液和沉淀；并重复1～3次；

(3)合并步骤(1)和步骤(2)的上清液，加入KOH或NaOH中和至pH＝5.8～6.0(优选5.9)，去除高氯酸盐结晶，加入流动相B相溶解定容，再用孔径为0.4～0.6μm滤膜过滤。

本发明的创新在于用常规的液相色谱仪及C18色谱柱即可进行检测，设备及分析条件要求简单，通过选择合适的流动相条件、合适的pH以及梯度洗脱程序，不用离子对试剂也可以同时测定水产品中多种ATP关联产物含量，最多可同时测10种；分离时间不超过25分钟。本方法不使用离子对试剂，可大大提高检测效率，延长色谱柱的使用寿命；具有污染柱子少、操作快速简便、灵敏度高等优点，同时采用二极管阵列检测器对样品进行扫描，定性更准确，明显优于已公开的技术，因此是一项非常值得广泛应用和推广的技术。

附图说明

图1实施例1的10种ATP关联物(100μg/mL浓度的溶液)的紫外210-400nm的扫描光谱图

图2为实施例1的10种ATP关联产物的三维色谱图

图3为实施例1的10种ATP关联产物标准品混合溶液(每种物质浓度为50μg/mL)液相色谱图(柱温32℃)

图4为实施例2中华绒螯蟹肉样品的液相色谱图

图5为实施例2斑节对虾肉样品的液相色谱图

图6为实施例3的10种ATP关联产物标准品混合溶液(每种物质浓度为100μg/mL)液相色谱图(柱温30℃)

图7为实施例4秀丽白虾肉样品的液相色谱图

图8为实施例4凡纳滨对虾肉样品的液相色谱图

图9为实施例4哈氏仿对虾肉样品的液相色谱图

图10为实施例4文蛤肉样品的液相色谱图

图11为实施例4白蛤肉样品的液相色谱图

图12为对比例1(A)10种ATP关联产物标准品混合溶液的液相色谱图(柱温32℃)

图13为对比例1(B)10种ATP关联产物标准品混合溶液的液相色谱图

图14为对比例2(A)10种ATP关联产物标准品混合溶液的液相色谱图

图15为对比例2(B)10种ATP关联产物标准品混合溶液的液相色谱图

具体实施方式

以下结合实施例旨在进一步说明本发明，而非限制本发明。

实施例1分离检测10种ATP关联物

(1)标准样品溶液的制备：用pH＝5.9、浓度为15mmol/L的磷酸氢二钾缓冲溶液(流动相B相)为溶剂，分别称取10种ATP关联物标准品ATP、GMP、IMP、ADP、Hx、AMP、Ad、HxR、AdR和Xt，配制浓度液分别为0.01～750μg/mL的ATP关联物系列标准溶液。

(2)最佳紫外检测波长的确定：取浓度为100μg/mL的标准溶液，用二极管阵列检测器扫描确定检测10种ATP关联产物的210～440nm下的紫外吸收光谱和最佳检测波长(紫外最大吸收波长)，确定ATP、GMP、IMP、ADP、Hx、AMP、Ad、HxR、AdR和Xt的最佳紫外检测波长分别为259.1、253.2、248.4、259.1、248.4、259.1、260.3、248.4、259.1、267.4nm，结果图1。

(3)将10种ATP关联物标准品用pH＝5.9、浓度为15mmol/L磷酸氢二钾缓冲液制成混合溶液，每种ATP关联物浓度为100μg/mL，进行液相色谱测定，使用Waters e2695高效液相色谱仪进行检测(美国Waters)，并且配有Waters 2996二极管阵列检测器及Empower2色谱软件。液相色谱柱采用通用型，填料选自十八烷基键合相硅胶，Waters Atlantis T3C18(4.6×250mm，5μm)。

色谱条件为：Waters Atlantis T3C18(4.6×250mm，5μm)色谱柱，流速1.0mL/min；进样量为10μl；柱温为30℃。进样量10μL，流速1ml/min。

10种ATP关联产物经自动进样器进样后到达色谱柱分离，用二极管阵列检测器进行检测分析。

用二极管阵列检测器扫描确定检测各ATP关联产物洗脱色谱峰的最佳检测波长和210～440nm下的紫外吸收光谱，对样品中的10种ATP关联产物进行进一步定性，确定各色谱峰是哪一种ATP关联产物。三维色谱图和液相色谱图结果如图2和图3。

流动相由甲醇(A相)和pH＝5.9、浓度为15mmol/L磷酸氢二钾缓冲液(B相)组成，磷酸氢二钾缓冲液pH调为5.9，按表1的程序梯度洗脱。A相和B相先用0.45μm的水相微孔滤膜过滤并超声脱气5分钟。

表1 梯度洗脱程序

时间(min)	0.00	6.00	6.01	15.00	20.00	22.00	25.00
								A相(体积％)	0	0	8	8	35	35	0
B相(体积％)	100	100	92	92	65	65	100

第6.01min～第15min、第15min～第20min、和第22.00～第25.00min各阶段，A相和B相的体积比均为匀速变化。分别确定各ATP关联产物的保留时间。

再将浓度为50μg/mL的上述10种ATP关联物标准溶液(用pH＝5.9、浓度为15mmol/L磷酸氢二钾缓冲液配制)分别采用相同的方法进行液相色谱测定，保留时间与混合溶液的测定结果相同。

(4)标准工作曲线：分别取不同浓度的ATP关联产物标准溶液，用相同条件进行液相色谱测定，根据保留时间和二极管阵列检测器扫描图谱定性，以核苷酸浓度为横坐标，所测相应核苷酸色谱峰面积为纵坐标作图，并绘制标准工作曲线，得到相应ATP关联产物的回归方程。结果如表2。

表2 10种ATP关联产物的最低检测限、回归方程、线性范围以及最大吸收波长

在洗脱梯度不变的情况下，将流动相B相的pH值调整为5.8或6.0，或者将流动相B相改为pH＝5.9的同浓度磷酸二氢钾缓冲液、磷酸氢二钠缓冲液、柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液或乙酸-乙酸钠缓冲液洗过分离效果相似，与实施例1结果一样。

在洗脱梯度不变的情况下，将流动相B相的pH值调整为3.5-5.5、6.5-6.8，在这两个pH区间范围内，因所测10种ATP关联产物的ATP、GMP、IMP和ADP四种物质的出峰时间非常接近，特别是GMP和IMP，很难分离。

将流动相B相替换为0.02mol/L乙酸铵缓冲溶液时，只可分离出部分物质，有几种物质相互重叠，，如IMP和GMP、Hx和Xt并未完全分离，且峰型不好。

流动相B相磷酸氢二钾缓冲液浓度在0.01mol/L时，基线容易波动，峰形较差,有的峰还有拖尾现象。缓冲液浓度在0.02mol/L、0.03mol/L、0.04mol/L、0.05mol/L、0.06mol/L时10种标准物可以得到较好的分离，峰型很好，出峰时间稳定，保留时间变短，取得与实施例1一样的效果。

采用乙腈时，洗脱分离效果和甲醇相似，10种ATP关联产物都可以达到完全分离。

实施例2测定水产品(1)

测定的水产品有斑节对虾和中华绒螯蟹。

待测液的制备：取新鲜水产品(虾肉或蟹肉)5.0g于离心管中，加入10mL预冷到4℃的10％的高氯酸匀浆1min，用玻璃棒搅拌均匀，在冷冻离心机4℃下10000rpm离心10min，取上清液过滤，过滤后所剩的沉淀物加入预冷的5％高氯酸溶液再进行浸提、离心，重复2次后合并上清液，用KOH溶液中和上清液至pH为5.9。过滤去除高氯酸钾，用pH＝5.9、浓度为15mmol/L磷酸氢二钾缓冲液(流动相的B相)定容至50mL容量瓶中。

取上述样液2mL，经孔径为0.45μm的水相微孔滤膜过滤后，上机进样分析，完成ATP关联产物的分离与测定。色谱条件、洗脱程序和测试方法同实施例1的步骤(3)和(4)。通过外标法进行定量，并通过对比样品和标准品中9种ATP关联产物的全波段色谱扫描图谱的相似程度，鉴定色谱峰的纯度。

各样品的检测图谱如图4、图5所示。然后根据外标法定量，由回归方程分析其中ATP关联产物的含量。样品中ATP关联产物含量如表3。

表3 样品中的ATP关联产物的含量(μmol/g)

样品	ATP	GMP	IMP	ADP	Hx	Xt	AMP	Ad	HxR	AdR
											斑节对虾	0.16	0	3.22	0.89	0.18	0.58	7.27	0	0.53	0.06
中华绒螯蟹	0.12	0.30	0.29	0.77	0.12	1.5	6.29	2.50	0.87	0.62

实施例3

取ATP、GMP、IMP、ADP、Hx、Xt、AMP、Ad、HxR和AdR等10种ATP关联物标准品，用pH＝5.9、浓度为15mmol/L磷酸氢二钾缓冲液制成混合溶液，每种ATP关联物浓度为100μg/mL。

上述混合溶液用Waters e2695高效液相色谱仪(美国Waters)检测(配有Waters 2996二极管阵列检测器及Empower2色谱软件)。

色谱条件为：液相色谱柱采用通用型，填料选自十八烷基键合相硅胶，如Waters Atlantis T3C18(4.6×250mm，5μm)。流速1.0mL/min；进样量为10μl；柱温为32℃。其余检测方法和条件同实施例1，液相色谱图结果如图6。

最低检测限、回归方程、线性范围以及最大吸收波长同实施例1。

实施例4测定水产品(2)

测定的水产品有凡纳滨对虾、秀丽白虾、哈氏仿对虾、文蛤和白蛤。

待测液的制备方法同实施例2，色谱的柱温为32℃，其他检测方法和条件同实施例2。

各样品的检测图谱如图7至图11所示。然后根据外标法定量，由回归方程分析其中ATP关联产物的含量。样品中ATP关联产物含量如表4。

表4 样品中的ATP关联产物的含量(μg/g)

对比例1

(A)取ATP、GMP、IMP、ADP、Hx、Xt、AMP、Ad、HxR和AdR 10种ATP关联物标准品混合溶液检测(每一种ATP关联物浓度为50μg/mL)，色谱条件为：液相色谱柱Waters Atlantis T3C18(4.6×250mm，5μm)，流速1.0mL/min；进样量为10μl；柱温为30℃。流动相由甲醇(A相)和pH＝5.5、浓度为15mmol/L磷酸氢二钾缓冲液(B相)组成，A相和B相使用前先用0.45μm的水相微孔滤膜过滤并超声脱气5分钟，按表5的程序梯度洗脱，结果如图12，分离效果不好，不能将各种物质分离开。

表5

时间(第min)	0.00	6.00	6.01	15.00	35.00
						A相(体积％)	0	0	10	35	35
B相(体积％)	100	100	90	65	65

(B)取取ATP、GMP、IMP、ADP、Hx、AMP、Ad、HxR、AdR和Xt 10种ATP关联物标准品混合溶液检测(每一种ATP关联物浓度为50μg/mL)，色谱条件的柱温为32℃，流动相B相的pH＝5.0，其余同(A)，结果如图13，分离效果不好，特别是前几个峰粘在一起无法分离。

对比例2

(A)取10种ATP关联物标准品混合溶液检测(每一种ATP关联物浓度为50μg/mL)，色谱条件同对比例1(B)，流动相由甲醇(A相)和pH＝5.5、浓度为15mmol/L磷酸氢二钾缓冲液(B相)组成，按表6的程序梯度洗脱，结果如图14，只出现7个峰，有几个峰相互重叠，没有分离开。

表6

时间(第/min)	0.00	6.00	6.01	25.00
					A相(体积％)	0	0	15	15
B相(体积％)	100	100	85	85

(B)流动相B相选用15mmol/L、pH＝5.5的乙酸-乙酸钠缓冲液，第6.01min开始以A相15％、B相85％的体积比洗脱至第45min，其余同(A)，结果如图15，分离时间长，而且有几个峰重叠。

Claims (10)

1.一种高效液相色谱-二极管阵列法同时测定水产品中多种ATP关联产物的方法，其特征在于，包括如下步骤：

使用带有二极管阵列检测器的高效液相色谱仪进行检测，将待测样品提取液加入到高效液相色谱仪中，梯度洗脱；根据各ATP关联产物的保留时间和210～400nm下的紫外吸收光谱，确定各色谱峰是哪一种ATP关联产物；

色谱条件为，分析柱：填料选自十八烷基键合相硅胶的通用型液相色谱柱；流速：0.5～1.5mL/min；进样量为8～12μl；柱温为30～35℃；

洗脱程序为：

第一阶段：A相0％、B相100％；持续时间为5.5～6.5min；

第二阶段：瞬时调整为A相7％～9％、B相91％～93％，并以这个梯度洗脱；持续时间为8.5～10min；

第三阶段：两种流动相匀速变化到A相32％～40％，B相60％～68％；持续时间为4.5～6min；

第四阶段：两种流动相匀速变化到A相32％～40％，B相60％～68％；持续时间为1.5～3min；

第五阶段：两种流动相匀速变化到A相0％、B相100％；持续时间为2.5～4min；上述比例均为体积比；

所述流动相由A相的有机溶剂和B相的缓冲液组成；A相为甲醇或乙腈，B相为pH5.8～6.0、浓度为15～60mmol/L的磷酸氢二钾缓冲液，磷酸二氢钾缓冲液、磷酸氢二钠缓冲液、柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液或乙酸-乙酸钠缓冲液；

检测相应ATP关联产物色谱峰面积，根据同样色谱条件下ATP关联物标准工作曲线或者回归方程计算待测样品提取液中ATP关联产物的含量。

2.权利要求1所述高效液相色谱-二极管阵列法同时测定水产品中多种ATP关联产物的方法，其特征在于，所测定的ATP关联物为三磷酸腺苷、二磷酸腺苷、腺苷酸、肌苷酸、次黄嘌呤核苷、次黄嘌呤、鸟苷酸、腺苷、腺嘌呤和黄嘌呤中的至少一种。

3.权利要求1所述高效液相色谱-二极管阵列法同时测定水产品中多种ATP关联产物的方法，其特征在于，所述的流动相A相为甲醇。

4.权利要求1所述高效液相色谱-二极管阵列法同时测定水产品中多种ATP关联产物的方法，其特征在于，所述的流动相B相为pH5.8～6.0、浓度为15～60mmol/L的磷酸氢二钾缓冲液。

5.权利要求1所述高效液相色谱-二极管阵列法同时测定水产品中多种ATP关联产物含量的方法，其特征在于，色谱条件为：分析柱选自十八烷基键合相硅胶的通用型液相色谱柱；流速0.5～1.5mL/min；进样量为8～12μl；柱温为30～35℃。

6.权利要求5所述高效液相色谱-二极管阵列法同时测定水产品中多种ATP关联产物含量的方法，其特征在于，流速为1.0mL/min；进样量为10μl；柱温选为30～32℃。

7.权利要求1所述高效液相色谱-二极管阵列法同时测定水产品中多种ATP关联产物含量的方法，其特征在于，梯度洗脱程序为：

第一阶段为第0.00～6.00min：A相0％、B相100％；

第二阶段为第6.00～15.00min，在第二阶段开始时(可以是第6.00～6.01min时)，瞬时调整为A相7％～9％、B相91％～93％，并以这个梯度洗脱；持续时间为8.5～10min；

第三阶段为第15.00～20.00min：两种流动相匀速变化到A相32％～40％，B相60％～68％；

第四阶段为第20.00～22.00min：两种流动相匀速变化到A相36％～43％，B相57％～62％％；

第五阶段为第22.00～25.00min：两种流动相匀速变化到A相0％、B相100％。

8.权利要求1所述高效液相色谱-二极管阵列法同时测定水产品中多种ATP关联产物含量的方法，其特征在于，梯度洗脱程序为：

第一阶段为第0.00～6.00min：A相0％、B相100％；

第二阶段为第6.00～15.00min，在第二阶段开始时瞬时调整为A相8％，B相92％并以这个梯度洗脱；

第三阶段为第15.00～20.00min：两种流动相匀速变化到A相35％，B相65％；

第四阶段为第20.00～22.00min：两种流动相匀速变化到A相35％，B相65％；

第五阶段为第22.00～25.00min：两种流动相匀速变化到A相0％、B相100％。

9.权利要求1所述高效液相色谱-二极管阵列法同时测定水产品中多种ATP关联产物含量的方法，其特征在于，所述流动相在使用前用0.22～0.5μm的水相微孔滤膜过滤后，超声脱气3～10分钟。

10.权利要求1所述高效液相色谱-二极管阵列法同时测定水产品中多种ATP关联产物含量的方法，其特征在于，水产品待测样品提取液的制备方法为：

a.取水产品样品，按照1g：1～3ml的的用量比，与预冷到0～4℃、质量浓度为3％～6％的高氯酸溶液混合均质进行浸提，0～4℃下2000～8000rpm离心5～20min，收集上清液；

b.取沉淀按上述步骤a的方法操作重复1～3次，合并上清液；

c.加入KOH或NaOH将pH中和至5.8～6.0，过滤去除高氯酸钾或高氯酸钠结晶固体，再用流动相B相中的缓冲液定容；

d.用孔径为0.22～0.5μm的滤膜过滤，即获得待测样品提取液。