CN109781920B - 一种坎格雷洛有关物质的hplc检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种坎格雷洛有关物质的高效液相色谱检测方法：采用反相色谱柱；填充剂为十八烷基键合硅胶；以磷酸盐高氯酸钠缓冲溶液为流动相A，乙腈为流动相B，梯度洗脱。该方法专属性强，灵敏度高，定量测定结果准确；分析方法简便快速，在较短时间内可以较好分离全部杂质，各色谱峰之间的分离度均大于1.5，可全面检测坎格雷洛及其制剂中的有关物质，提高药品安全性，为制定坎格雷洛原料药和制剂的质量标准提供依据。
Description
技术领域
本发明涉及药品分析领域，具体涉及一种坎格雷洛有关物质的高效液相色谱检测方法。
背景技术
坎格雷洛由阿斯利康公司研制开发，麦迪逊医药公司在2003年12月从阿斯利康公司获得坎格雷洛的许可权。2015年6月，FDA批准麦迪逊医药公司的抗血小板注射剂cangrelor(商品名为Kengreal)作为二线药物上市，国内尚未有厂家被批准上市。
坎格雷洛(cangrelor)是非噻吩并吡啶类嘌呤受体P2Y12的拮抗剂，来自于对ATP分子的结构修饰，用甲撑基团和卤素取代酸酐基团，使半衰期延长，拮抗活性提高。II期临床研究显示，坎格雷洛的抗血小板聚集作用强于氯吡格雷，且具有良好的安全性[2]。可用于治疗急性冠脉综合征，还可作为静脉注射用抗血栓药物。
坎格雷洛的药用形式为坎格雷洛四钠盐，由坎格雷洛水解成盐得到。杂质A、B、C和D均来自合成工艺，同时坎格雷洛在含水溶液状态中不稳定，亦可降解产生杂质D。
坎格雷洛及杂质结构如下所示：
为了保证药品的安全使用通常需要对药品进行质量控制，而有关物质是绝大多数药物必须检测的项目。目前，坎格雷洛的质量标准在现行版《欧洲药典》、《美国药典》和《中华人民共和国药典》(ChP)2015年版中均没有收载。因此开发有关物质A、B、C、D和其他未知杂质的有效的检测方法是非常必要的。
三磷酸腺苷二钠盐(如下图所示)具有与坎格雷洛相同的母核结构。三磷酸腺苷为不稳定物质，易受水分和温度等因素的影响，脱掉磷酸键生成二磷酸腺苷(ADP)，一磷酸腺苷(AMP)，影响制剂的质量。解放军药学学报公开了一种三磷酸腺苷二钠盐有关物质的检测方法，该检测方法为：色谱柱：ECOSIL C18色谱柱；流动相：0.2mol/L磷酸盐缓冲液(磷酸氢二钠35.8g，磷酸氢二钾13.6g，加水900mL溶解，用1mol/L氢氧化钠溶液调节pH至7.0，加入四丁基溴化铵1.61g，加水至1000mL，摇匀)；波长：259nm；柱温：35℃；进样量：10μL；等度洗脱。该方法的使用使得三磷酸腺苷二钠主峰与其有关物质较好的分离，且灵敏度高，专属性强(HPLC法测定三磷酸腺苷二钠片有关物质，宋新康，Pharm J Chin PLA,vol.31,NO.5,Oct20,2015.)。
然而，本发明的发明人发现，将上述检测方法应用于坎格雷洛有关物质检测，存在如下缺点：(1)主成分峰前延；(2)缓冲盐浓度为0.2mol/L，高浓度盐在高压流动相中将会析出更多的结晶，导致色谱柱，和泵头结构的损坏；(3)添加了0.005mol/L的四丁基溴化铵，为碱性离子对试剂，与固定相结合产生不可逆吸附，进而影响固定相活性位点，对色谱柱造成不可逆的伤害。
此外，现有技术还公开了与坎格雷洛结构相似的核苷磷酸盐的HPLC检测方法(A P(V)-N Activation Strategy for the synthesis of nucleoside polyphosphates,Qisun,Shanshan Gong,et al.J.Org.Chem.2013,78,8417-8426)：色谱柱：C18色谱柱(4.6×150mm,5μm)；流速：1.0mL/min,线性梯度：5％-80％甲醇-四乙基溴化铵缓冲溶液，20min。波长：230-254nm。本发明的发明人将上述检测方法应用于坎格雷洛有关物质的检测，结果表明：该检测方法达不到预期的分离效果，且洗脱分离时间长。
发明内容
为解决上述现有技术中存在的技术问题，本发明提供了一种坎格雷洛有关物质的高效液相色谱检测方法。
具体而言，本发明提供：
一种坎格雷洛有关物质的HPLC检测方法，该检测方法的检测条件为：高效液相色谱仪；所用色谱柱为反相色谱柱：Waters Symmetry C18、CAPCELL PAK C18或InertsilODS-3色谱柱；填充剂为十八烷基键合硅胶；以磷酸盐高氯酸钠缓冲溶液为流动相A，乙腈为流动相B；缓冲溶液浓度为5-30mmol/L；检测波长为237-247nm；柱温为20-35℃；pH 5.5-7.5；流速为0.6-1.2mL·min-1；梯度洗脱：流动相A与流动相B的体积比为(80-25％)：(25-75％)或(85-45％)：(15-55％)。
进一步地，上述检测方法的梯度洗脱过程为
进一步地，上述检测方法的梯度洗脱过程为
进一步地，上述检测方法中，所用磷酸盐选自磷酸钠、磷酸钾、磷酸铵、磷酸二氢铵、磷酸二氢钾、磷酸二氢钠、磷酸氢二铵、磷酸氢二钾、磷酸氢二钠中的一种或几种，优选为磷酸氢二铵、磷酸氢二钾。
进一步地，上述检测方法中，缓冲盐浓度为10-20mmol/L，优选为15mmol/L。
进一步地，上述的检测方法，其特征在于：所述检测波长为242nm。
进一步地，上述检测方法，所述柱温为20-30℃，优选为30℃。
进一步地，上述检测方法中，所述pH为7.0-7.5，优选为7.0。
进一步地，上述检测方法中，所述流速为0.8-1.0mL·min-1，优选为1.0mL·min-1。
进一步地，上述检测方法中，所述色谱柱规格为4.6*250mm,5μm。
本发明方法针对坎格雷洛制备工艺中引入和降解生成的四个已知杂质建立了一种液相分析方法，该方法专属性强，灵敏度高，定量测定结果准确；分析方法简便快速，在较短时间内可以较好分离全部杂质，各色谱峰之间的分离度均大于1.5，可全面检测坎格雷洛及其制剂中的有关物质，提高药品安全性，为制定坎格雷洛原料药和制剂的质量标准提供依据。同时，本发明的方法容易实现，所用仪器设备及试剂均是常规用品，实验参数也是常规参数，无苛刻条件，成本低，大多数实验室的条件均能满足。
附图说明
图1：实施例1条件下，坎格雷洛与已知杂质混合进样高效液相色谱图。
图2：实施例4条件下，坎格雷洛与已知杂质混合进样高效液相色谱图。
图3：实施例5条件下，坎格雷洛与已知杂质混合进样高效液相色谱图。
图4：实施例7条件下，坎格雷洛与已知杂质混合进样高效液相色谱图。
图5：实施例9条件下，坎格雷洛与已知杂质混合进样高效液相色谱图。
图6：实施例10条件下，坎格雷洛与已知杂质混合进样高效液相色谱图。
图7：实施例11条件下，坎格雷洛与已知杂质混合进样高效液相色谱图。
图8：实施例13条件下，坎格雷洛与已知杂质混合进样高效液相色谱图。
图9：对比例1条件下，坎格雷洛与已知杂质混合进样高效液相色谱图。
图10：对比例2条件下，坎格雷洛与已知杂质混合进样高效液相色谱图。
图11：对比例3条件下，坎格雷洛与已知杂质混合进样高效液相色谱图。
图12：对比例4条件下，坎格雷洛与已知杂质混合进样高效液相色谱图。
具体实施方式
以下通过具体实施方式的描述并参照附图对本发明作进一步说明，但这并非是对本发明的限制，本领域技术人员根据本发明的基本思想，可以做出各种修改或改进，但是只要不脱离本发明的基本思想，均在本发明的范围之内。
在本发明中，所述的坎格雷洛有关物质是指来自于合成工艺的杂质A、B和C，以及来源于降解产生的杂质D(A、B、C、D的结构见背景技术部分)。
仪器
Agilent 1260型高效液相色谱仪(自动进样，UV检测器，OpenLAB EZChrom工作站)；Waters e2695高效液相色谱仪
材料
坎格雷洛(批号：20161015、20161110、20161117)、坎格雷洛对照品(纯度99.8％)、杂质A对照品(纯度99.7％)、杂质B对照品(纯度98.9％)；杂质C对照品(纯度98.2％)、杂质D对照品(纯度97.5％)、超纯水(均由石药集团中奇制药技术(石家庄)有限公司提供)。高氯酸钠、磷酸氢二铵、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、氢氧化钠(均为国药集团化学试剂有限公司生产，分析纯)；四丁基溴化铵(天津市科密欧化学试剂有限公司)；乙腈、甲醇(均为RCILabscan Limited，色谱纯)。
溶液配制
取坎格雷洛(批号：20161015、20161110、20161117)适量，精密称定，加稀释溶剂超纯水溶解并稀释成每1mL中含坎格雷洛1mg的溶液，作为供试品溶液；取杂质A、B、C和D的对照品各适量，精密称定，分别置于50mL量瓶中，加稀释溶剂(杂质A和杂质D用超纯水，杂质B和杂质C用乙腈)溶解并稀释制成每1mL中分别含杂质A、B、C和D 200μg的对照品储备液，精密移取各杂质的对照品储备液适量，置同一200mL量瓶中，加稀释溶剂稀释制成每1mL中分别含杂质A和D 5μg、B和C1μg的对照品混合溶液，待用。
具体实施例
实施例1：坎格雷洛有关物质的检测
仪器设备：高效液相色谱仪：Agilent 1260型高效液相色谱仪，色谱柱：WatersSymmetry C18(4.6mm×250mm,5μm)。
色谱条件：流动相：流动相A：15mmol·L-1磷酸氢二铵高氯酸钠溶液(取磷酸氢二铵1.98g和高氯酸钠2.11g，加纯化水稀释至1000mL，用磷酸调节pH至7.0)；流动相B：乙腈，采用梯度洗脱。检测波长：242nm，柱温：30℃；进样量：20μL；流速：1.0mL·min-1。
具体梯度洗脱过程如下：
实验方法：取1份待用混合溶液在上述色谱条件进样分析，记录色谱图(见图1)。
实验结果：各杂质与主峰均能完全分离，分离度≥2，峰形较好。
实施例2：坎格雷洛有关物质的检测
仪器设备：高效液相色谱仪：Agilent 1260型高效液相色谱仪，色谱柱：WatersSymmetry C18(4.6mm×250mm,5μm)。
色谱条件：流动相：流动相A：15mmol·L-1磷酸氢二钾高氯酸钠溶液(取磷酸氢二钾3.42g和高氯酸钠2.11g，加纯化水稀释至1000mL，用磷酸调节pH至7.0)；流动相B：乙腈，采用梯度洗脱。检测波长：242nm，柱温：30℃；进样量：20μL；流速：1.0mL·min-1。
具体梯度洗脱过程如下：
实验方法：取1份待用混合溶液在上述色谱条件进样分析，记录色谱图。
实验结果：各杂质与主峰均能完全分离，分离度≥2，峰形较好。
实施例3：坎格雷洛有关物质的检测
仪器设备：高效液相色谱仪：Agilent 1260型高效液相色谱仪，色谱柱：CAPCELLPAK C18(4.6mm×250mm,5μm)。
色谱条件：流动相：流动相A：15mmol·L-1磷酸氢二铵高氯酸钠溶液(取磷酸氢二铵1.98g和高氯酸钠2.11g，加纯化水稀释至1000mL，用磷酸调节pH至7.0)；流动相B：乙腈，采用梯度洗脱。检测波长：242nm，柱温：30℃；进样量：20μL；流速：1.0mL·min-1。
具体梯度洗脱过程如实施例1。
实验方法：取1份待用混合溶液在上述色谱条件进样分析，记录色谱图。
实验结果：各杂质与主峰均能完全分离，分离度≥1.5，峰形较好。
实施例4：坎格雷洛有关物质的检测
仪器设备：高效液相色谱仪：Agilent 1260型高效液相色谱仪，色谱柱：InertsilODS-3(4.6mm×250mm,5μm)。
色谱条件：流动相：流动相A：15mmol·L-1磷酸氢二铵高氯酸钠溶液(取磷酸氢二铵1.98g和高氯酸钠2.11g，加纯化水稀释至1000mL，用磷酸调节pH至7.0)；流动相B：乙腈，采用梯度洗脱。检测波长：242nm，柱温：30℃；进样量：20μL；流速：1.0mL·min-1。
具体梯度洗脱过程如实施例1。
实验方法：取1份待用混合溶液在上述色谱条件进样分析，记录色谱图(见图2)。
实验结果：各杂质与主峰均能完全分离，分离度≥1.5，峰形较好。
实施例5：坎格雷洛有关物质的检测
仪器设备：高效液相色谱仪：Agilent 1260型高效液相色谱仪，色谱柱：WatersSymmetry C18(4.6mm×250mm,5μm)。
色谱条件：流动相：流动相A：15mmol·L-1磷酸氢二铵高氯酸钠溶液(取磷酸氢二铵1.98g和高氯酸钠2.11g，加纯化水稀释至1000mL，用磷酸调节pH至7.0)；流动相B：乙腈，采用梯度洗脱。检测波长：242nm，柱温：30℃；进样量：20μL；流速：0.6mL·min-1。
具体梯度洗脱过程如实施例1。
实验方法：取1份待用混合溶液在上述色谱条件进样分析，记录色谱图(见图3)。
实验结果：各杂质与主峰均能完全分离，分离度≥1.5，峰形较好。
实施例6：坎格雷洛有关物质的检测
仪器设备：高效液相色谱仪：Agilent 1260型高效液相色谱仪，色谱柱：WatersSymme1ry C18(4.6mm×250mm,5μm)。
色谱条件：流动相：流动相A：15mmol·L-1磷酸氢二铵高氯酸钠溶液(取磷酸氢二铵1.98g和高氯酸钠2.11g，加纯化水稀释至1000mL，用磷酸调节pH至7.0)；流动相B：乙腈，采用梯度洗脱。检测波长：242nm，柱温：30℃；进样量：20μL；流速：1.2mL·min-1。
具体梯度洗脱过程如实施例1。
实验方法：取1份待用混合溶液在上述色谱条件进样分析，记录色谱图。
实验结果：各杂质与主峰均能完全分离，分离度≥1.5，峰形较好。
实施例7：坎格雷洛有关物质的检测
仪器设备：高效液相色谱仪：Agilent 1260型高效液相色谱仪，色谱柱：WatersSymmetry C18(4.6mm×250mm,5μm)。
色谱条件：流动相：流动相A：15mmol·L-1磷酸氢二铵高氯酸钠溶液(取磷酸氢二铵1.98g和高氯酸钠2.11g，加纯化水稀释至1000mL，用磷酸调节pH至5.5)；流动相B：乙腈，采用梯度洗脱。检测波长：242nm，柱温：30℃；进样量：20μL；流速：1.0mL·min-1。
具体梯度洗脱过程如实施例1。
实验方法：取1份待用混合溶液在上述色谱条件进样分析，记录色谱图(见图4)。
实验结果：各杂质与主峰均能完全分离，分离度≥1.5，峰形较好。
实施例8：坎格雷洛有关物质的检测
仪器设备：高效液相色谱仪：Agilent 1260型高效液相色谱仪，色谱柱：WatersSymmetry C18(4.6mm×250mm,5μm)。
色谱条件：流动相：流动相A：15mmol·L-1磷酸氢二铵高氯酸钠溶液(取磷酸氢二铵1.98g和高氯酸钠2.11g，加纯化水稀释至1000mL，用磷酸调节pH至7.5)；流动相B：乙腈，采用梯度洗脱。检测波长：242nm，柱温：30℃；进样量：20μL；流速：1.0mL·min-1。
具体梯度洗脱过程如实施例1。
实验方法：取1份待用混合溶液在上述色谱条件进样分析，记录色谱图。
实验结果：各杂质与主峰均能完全分离，分离度≥1.5，峰形较好。
实施例9：坎格雷洛有关物质的检测
仪器设备：高效液相色谱仪：Agilent 1260型高效液相色谱仪，色谱柱：WatersSymmetry C18(4.6mm×250mm,5μm)。
色谱条件：流动相：流动相A：15mmol·L-1磷酸氢二铵高氯酸钠溶液(取磷酸氢二铵1.98g和高氯酸钠2.11g，加纯化水稀释至1000mL，用磷酸调节pH至7.0)；流动相B：乙腈，采用梯度洗脱。检测波长：242nm，柱温：20℃；进样量：20μL；流速：1.0mL·min-1。
具体梯度洗脱过程如实施例1。
实验方法：取1份待用混合溶液在上述色谱条件进样分析，记录色谱图(见图5)。
实验结果：各杂质与主峰均能完全分离，分离度≥1.5，峰形较好。
实施例10：坎格雷洛有关物质的检测
仪器设备：高效液相色谱仪：Agilent 1260型高效液相色谱仪，色谱柱：WatersSymmetry C18(4.6mm×250mm,5μm)。
色谱条件：流动相：流动相A：15mmol·L-1磷酸氢二铵高氯酸钠溶液(取磷酸氢二铵1.98g和高氯酸钠2.11g，加纯化水稀释至1000mL，用磷酸调节pH至7.0)；流动相B：乙腈，采用梯度洗脱。检测波长：242nm，柱温：35℃；进样量：20μL；流速：1.0mL·min-1。
具体梯度洗脱过程如下实施例1。
实验方法：取1份待用混合溶液在上述色谱条件进样分析，记录色谱图(见图6)。
实验结果：各杂质与主峰均能完全分离，分离度≥1.5，峰形较好。
实施例11：坎格雷洛有关物质的检测
仪器设备：高效液相色谱仪：Agilent 1260型高效液相色谱仪，色谱柱：WatersSymmetry C18(4.6mm×250mm,5μm)。
色谱条件：流动相：流动相A：5mmol·L-1磷酸氢二铵高氯酸钠溶液(取磷酸氢二铵1.98g和高氯酸钠2.11g，加纯化水稀释至1000mL，用磷酸调节pH至7.0)；流动相B：乙腈，采用梯度洗脱。检测波长：242nm，柱温：30℃；进样量：20μL；流速：1.0mL·min-1。
具体梯度洗脱过程如实施例1。
实验方法：取1份待用混合溶液在上述色谱条件进样分析，记录色谱图(见图7)。
实验结果：各杂质与主峰均能完全分离，分离度≥1.5，峰形较好。
实施例12：坎格雷洛有关物质的检测
仪器设备：高效液相色谱仪：Agilent 1260型高效液相色谱仪，色谱柱：WatersSymmetry C18(4.6mm×250mm,5μm)。
色谱条件：流动相：流动相A：10mmol·L-1磷酸氢二铵高氯酸钠溶液(取磷酸氢二铵1.98g和高氯酸钠2.11g，加纯化水稀释至1000mL，用磷酸调节pH至7.0)；流动相B：乙腈，采用梯度洗脱。检测波长：242nm，柱温：30℃；进样量：20μL；流速：1.0mL·min-1。
具体梯度洗脱过程如实施例1。
实验方法：取3份待用混合溶液在上述色谱条件进样分析，记录色谱图。实验结果：各杂质与主峰均能完全分离，分离度≥1.5。
实施例13：坎格雷洛有关物质的检测
仪器设备：高效液相色谱仪：Agilent 1260型高效液相色谱仪，色谱柱：WatersSymmetry C18(4.6mm×250mm,5μm)。
色谱条件：流动相：流动相A：30mmol·L-1磷酸氢二铵高氯酸钠溶液(取磷酸氢二铵1.98g和高氯酸钠2.11g，加纯化水稀释至1000mL，用磷酸调节pH至7.0)；流动相B：乙腈，采用梯度洗脱。检测波长：242nm，柱温：30℃；进样量：20μL；流速：1.0mL·min-1。
具体梯度洗脱过程如实施例1。
实验方法：取1份待用混合溶液在上述色谱条件下进样分析，记录色谱图(见图8)。
实验结果：各杂质与主峰均能完全分离，分离度≥1.5，峰形较好。
实施例14：坎格雷洛有关物质的检测
仪器设备：高效液相色谱仪：Agilent 1260型高效液相色谱仪，色谱柱：WatersSymmetry C18(4.6mm×250mm,5μm)。
色谱条件：流动相：流动相A：15mmol·L-1磷酸氢二铵高氯酸钠溶液(取磷酸氢二铵1.98g和高氯酸钠2.11g，加纯化水稀释至1000mL，用磷酸调节pH至7.0)；流动相B：乙腈，采用梯度洗脱。检测波长：237nm，柱温：30℃；进样量：20μL；流速：1.0mL·min-1。
具体梯度洗脱过程如实施例1。
实验方法：取1份待用混合溶液在上述色谱条件进样分析，记录色谱图。
实验结果：各杂质与主峰均能完全分离，分离度≥1.5，峰形较好。
实施例15：坎格雷洛有关物质的检测
仪器设备：高效液相色谱仪：Agilent 1260型高效液相色谱仪，色谱柱：WatersSymmetry C18(4.6mm×250mm,5μm)。
色谱条件：流动相：流动相A：15mmol·L-1磷酸氢二铵高氯酸钠溶液(取磷酸氢二铵1.98g和高氯酸钠2.11g，加纯化水稀释至1000mL，用磷酸调节pH至7.0)；流动相B：乙腈，采用梯度洗脱。检测波长：240nm，柱温：30℃；进样量：20μL；流速：1.0mL·min-1。
具体梯度洗脱过程如实施例1。
实验方法：取1份待用混合溶液在上述色谱条件进样分析，记录色谱图。
实验结果：各杂质与主峰均能完全分离，分离度≥1.5，峰形较好。
实施例16：坎格雷洛有关物质的检测
仪器设备：高效液相色谱仪：Agilent 1260型高效液相色谱仪，色谱柱：WatersSymmetry C18(4.6mm×250mm,5μm)。
色谱条件：流动相：流动相A：15mmol磷酸氢二铵高氯酸钠溶液(取磷酸氢二铵1.98g和高氯酸钠2.11g，加纯化水稀释至1000mL，用磷酸调节pH至7.0)；流动相B：乙腈，采用梯度洗脱。检测波长：247nm，柱温：30℃；进样量：20μL；流速：1.0mL·min-1。
具体梯度洗脱过程如实施例1。
实验方法：取1份待用混合溶液在上述色谱条件进样分析，记录色谱图。
实验结果：各杂质与主峰均能完全分离，分离度≥1.5，峰形较好。
对比例1：坎格雷洛有关物质的检测(参考文献1：HPLC法测定三磷酸腺苷二钠片有关物质，宋新康，Pharm J Chin PLA,vol.31,NO.5,Oct20,2015)
仪器设备：高效液相色谱仪：Agilent 1260型高效液相色谱仪，色谱柱：WatersSymmetry C18(4.6mm×250mm,5μm)。
色谱条件：流动相：流动相A：0.2mol/L磷酸盐缓冲液(取磷酸氢二钠35.8g，磷酸二氢钾13.6g，加水溶解，氢氧化钠调pH7.0，加四丁基溴化铵1.61g，加水至1000mL)；流动相B：甲醇，采用等度洗脱：A:B＝95:5。检测波长：259nm，柱温：35℃；进样量：10μL，流速：0.8mL·min-1。
实验方法：取1份待用混合溶液，上述色谱条件进样分析，记录色谱图(见图9)。
实验结果：洗脱60min，仍有色谱峰未出峰。
调整检测波长为242nm,洗脱60min，仍未出峰。
对比例1表明，文献中的检测方法不适于坎格雷洛有关物质检测。
对比例2：坎格雷洛有关物质的检测(结合文献1与文献2(A P(V)-N ActivationStrategy for the synthesis of nucleoside polyphosphates,Qi sun,Shanshan Gong,et al.J.Org.Chem.2013,78,8417-8426)的检测方法)
仪器设备：高效液相色谱仪：Agilent 1260型高效液相色谱仪，色谱柱：WatersSymmetry C18(4.6mm×250mm,5μm)。
色谱条件：流动相：流动相A：0.2mol/L磷酸盐缓冲液(取磷酸氢二钠35.8g，磷酸二氢钾13.6g，加水溶解，氢氧化钠调pH7.0，加四丁基溴化铵1.61g，加水至1000mL)；流动相B：甲醇；流速：0.8mL·min-1，检测波长：259nm，柱温：35℃；进样量：10μL，梯度洗脱，程序如下：
实验方法：取1份待用混合溶液，在上述色谱条件进样分析，记录色谱图(见图10)。
实验结果：分离效果差，峰形差。
对比例1表明，结合文献1与文献2的检测方法，仍不适于坎格雷洛有关物质的检测。
对比例3：坎格雷洛有关物质的检测
仪器设备：高效液相色谱仪：Agilent 1260型高效液相色谱仪，色谱柱：WatersSymmetry C18(4.6mm×250mm,5μm)。
色谱条件：流动相：流动相A：15mmol·L-1磷酸氢二铵四丁基溴化铵(取磷酸氢二铵1.98g和四丁基溴化铵1.61g，加纯化水稀释至1000mL，用磷酸调节pH至7.0)；流动相B：乙腈，采用梯度洗脱。检测波长：242nm，柱温：30℃；进样量：20μL；流速：1.0mL·min-1。
具体梯度洗脱过程如下：
实验方法：取1份待用混合溶液，在上述色谱条件进样分析，记录色谱图(见附图11)。
实验结果：主峰两杂质分不开。
对比例4：坎格雷洛有关物质的检测
仪器设备：高效液相色谱仪：Agilent 1260型高效液相色谱仪，色谱柱：WatersSymmetry C18(4.6mm×250mm,5μm)。
色谱条件：流动相：流动相A：15mmol·L-1磷酸氢二铵四丁基溴化铵(取磷酸氢二铵1.98g和四丁基溴化铵1.61g，加纯化水稀释至1000mL，用磷酸调节pH至7.0)；流动相B：甲醇，采用梯度洗脱。检测波长：242nm，柱温：30℃；进样量：20μL；流速：1.0mL·min-1。
具体梯度洗脱过程如下：
实验方法：取1份待用混合溶液，在上述色谱条件进样分析，记录色谱图(见附图12)。
实验结果：主峰拖尾，有一杂质未洗出。
由对比例3、4可知，若将高氯酸钠替换为四丁基溴化铵，则不符合检测标准。对比例5：坎格雷洛有关物质的检测
仪器设备：高效液相色谱仪：Agilent 1260型高效液相色谱仪，色谱柱：WatersSymmetry C18(4.6mm×250mm,5μm)。
色谱条件：流动相：流动相A：30mmol·L-1醋酸钠高氯酸钠溶液(取醋酸钠4.08g和高氯酸钠4.22g，加纯化水稀释至1000mL，用磷酸调节pH至7.0)；流动相B：甲醇，采用梯度洗脱。检测波长：242nm，柱温：30℃；进样量：20μL；流速：1.0mL·min-1。
具体梯度洗脱过程如实施例1。
实验方法：取1份待用混合溶液在上述色谱条件进样分析，记录色谱图。
实验结果：各峰相应均较差。
对比例6：坎格雷洛有关物质的检测
仪器设备：高效液相色谱仪：Agilent 1260型高效液相色谱仪，色谱柱：WatersSymmetry C18(4.6mm×250mm,5μm)。
色谱条件：流动相：流动相A：15mmol·L-1磷酸氢二铵高氯酸钠溶液(取磷酸氢二铵1.98g和高氯酸钠2.11g，加纯化水稀释至1000mL，用磷酸调节pH至7.0)；流动相B：甲醇，采用梯度洗脱。检测波长：242nm，柱温：30℃；进样量：20μL；流速：1.0mL·min-1。
溶剂：坎格雷洛及杂质A、D用纯化水、杂质B、C用甲醇溶解；其他配制过程同待用溶液，作为本实施例待用溶液。
具体梯度洗脱过程如实施例1。
实验方法：取1份待用混合溶液在上述色谱条件进样分析，记录色谱图。
实验结果：各杂质与主峰均能完全分离，分离度≥1.5，但峰形较差。
对比列7：坎格雷洛有关物质的检测
仪器设备：高效液相色谱仪：Agilent 1260型高效液相色谱仪，色谱柱：WatersSymmetry C18(4.6mm×250mm,5μm)。
色谱条件：流动相：流动相A：30mmol·L-1醋酸钠高氯酸钠溶液(取醋酸钠4.08g和高氯酸钠4.22g，加纯化水稀释至1000mL，用磷酸调节pH至7.0)；流动相B：乙腈，采用梯度洗脱。检测波长：242nm，柱温：30℃；进样量：20μL；流速：1.0mL·min-1。
具体梯度洗脱过程如实施例1。
实验方法：取1份待用混合溶液在上述色谱条件进样分析，记录色谱图。
实验结果：响应强，基本分开，但峰形较差。
Claims (13)
1.一种坎格雷洛有关物质的检测方法，其特征在于：检测条件为高效液相色谱仪；所用色谱柱为反相色谱柱：Waters Symmetry C18、CAPCELL PAK C18或Inertsil ODS-3色谱柱；填充剂为十八烷基键合硅胶；以磷酸盐高氯酸钠缓冲溶液为流动相A，乙腈为流动相B；缓冲溶液浓度为5-30mmol/L；检测波长为237-247nm；柱温为20-35℃；流动相A的pH 5.5-7.5；流速为0.6-1.2mL·min-1；梯度洗脱程序选自表1、表2：
表1
表2
2.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于：所述磷酸盐选自磷酸钠、磷酸钾、磷酸铵、磷酸二氢铵、磷酸二氢钾、磷酸二氢钠、磷酸氢二铵、磷酸氢二钾、磷酸氢二钠中的一种或几种。
3.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于：所述磷酸盐选自磷酸氢二铵、磷酸氢二钾。
4.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于：缓冲溶液浓度为10-20mmol/L。
5.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于：缓冲溶液浓度为15mmol/L。
6.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于：所述检测波长为242nm。
7.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于：所述柱温为25-30℃。
8.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于：所述柱温为30℃。
9.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于：所述流动相A的pH为7.0-7.5。
10.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于：所述流动相A的pH为7.0。
11.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于：所述流速为0.8-1.0mL·min-1。
12.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于：所述流速为1.0mL·min-1。
13.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于：所述色谱柱规格为4.6*250mm，5μm。
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