CN110824074A

CN110824074A - 用高效液相色谱检测替格瑞洛有关物质的方法

Info

Publication number: CN110824074A
Application number: CN201810901412.0A
Authority: CN
Inventors: 沙薇; 牛利峰; 李晨希
Original assignee: Zhengzhou Taifeng Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Zhengzhou Taifeng Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2018-08-09
Filing date: 2018-08-09
Publication date: 2020-02-21

Abstract

本发明公开了一种用高效液相色谱法检测替格瑞洛及其有关物质的方法。该方法较进口注册标准和之前的文献方法相比，可有效将替格瑞洛及其有关物质(即杂质C与杂质N,杂质M与杂质G,杂质M与替格瑞洛，杂质G与替格瑞洛主峰)分离，从而实现了替格瑞洛及其杂质的有效检测，保证了替格瑞洛的质量控制。

Description

用高效液相色谱检测替格瑞洛有关物质的方法

技术领域

本发明属于药物分析领域，具体涉及一种用高效液相色谱检测替格瑞洛有关物质的方法。

背景技术

替格瑞洛片，用于急性冠脉综合征（不稳定性心绞痛、非ST段抬高心肌梗死或ST段抬高心肌梗死）患者，包括接受药物治疗和经皮冠状动脉介入（PCI）治疗的患者，降低血栓性心血管事件的发生率。其原料药替格瑞洛是一种新型的环戊基三唑嘧啶类（CPTP）口服抗血小板药物。替格瑞洛为非前体药，无须经肝脏代谢激活即可直接起效，与P2Y12 ADP受体可逆性结合。PLATO研究结果显示，替格瑞洛治疗12个月在不增加主要出血的情况下，较氯吡格雷进一步显著降低ACS患者的心血管死亡/心肌梗死/卒中复合终点事件风险达16%，同时显著降低心血管死亡达21%。替格瑞洛片是由英国阿斯利康(AstraZeneca) 制药公司研制开发，于2011 年7 月获美国FDA 批准上市，商品名为Brilinta。

替格瑞洛由于合成过程产生的杂质较多，可能产生的杂质包括关键起始物料、残留中间产品等多种杂质，而且替格瑞洛分子结构中有5个手性中心，杂质不易完全分离。目前关于替格瑞洛有关物质检测方法有替格瑞洛片的进口注册标准和文献方法，但由于原料药合成路线，工艺不同，采用进口注册标准和文献方法对其杂质进行控制时，部分杂质分离度不符合要求，达不到基线分离，不等对其进行有效的控制。

发明内容

本发明的目的是提供一种高效液相色谱检测替格瑞洛及其有关物质的方法。该方法较进口注册标准和之前的文献方法相比，可有效将替格瑞洛及其有关物质( 即杂质) 分离，从而实现了替格瑞洛及其杂质的有效检测，保证了替格瑞洛的质量控制。

在研究过程中，本发明发现，因为替格瑞洛含有多个手性中心，采用替格瑞洛片进口注册标准对其杂质进行研究时，杂质G和杂质M分离度不够，峰型较差，出现裂峰现象；采用文献报道的方法对其杂质进行控制时，由于杂质C含有手性中心，和杂质N达不到基线分离，换用不同柱子时，原料药主峰前后的杂质G和M分离度不符合要求且峰型较差，干扰对其本身质量的评估，造成检测结果不准确，数据不可靠。经过实验筛选，本发明最终采用高效液相色谱法检测替格瑞洛有关物质，以十八烷基硅烷键合硅胶为固定相，用水溶液（pH3.0）和乙腈为流动相，采用梯度洗脱程序测定，使其有关物质得到有效分离，该方法流动相配置简单，并且重现性好。

上述发明的方法，色谱柱优先选择C18柱，规格为4.6×250mm，5um，其中色谱柱的温度为25~35℃，优先选择30℃，用水溶液和乙腈作为流动相，所述水溶液的pH值范围为2.8~3.2，优先选用磷酸调节pH值为3.0，以紫外检测器作为检测器，所述紫外检测器的检测波长为250~260nm，优先选择波长为255nm。

本发明方法，采用梯度洗脱法，其中水溶液和乙腈的梯度洗脱比例如下表1：

时间（min）	流动相A（水，磷酸调pH至3.0）	流动相B（乙腈）
			0	72	28
7	65	35
			20	60	40
40	35	55
			50	30	70
55	30	70
			56	72	28
65	72	28

上述发明方法包裹如下步骤：

1）配置系统适用性溶液，包括杂质A,B,C,D,E,F,G,L,M,N和杂质O

2）配置替格瑞洛供试品溶液，稀释剂为35%的乙腈水溶液

3）用高效液相色谱检测系统适用性溶液、供试品溶液，色谱条件：使用C18色谱柱;采用双流动相，即流动相A和流动相B进行梯度洗脱，所述流动相A为水溶液，所述流动相B为乙腈溶液；

4）根据供试品溶液的色谱图和对照品溶液的色谱图，确定供试品溶液中有关物质的限度。

本发明用高效液相色谱法检测替格瑞洛有关物质，作为优选，高效液相色谱系统进行检测的进样体积为10~20μL，流动相流速为0.9~1.1ml/min，色谱柱的柱温为29~35℃

5）作为优选，上述步骤1）每1ml所述系统适用性溶液含杂质A 1ug/ml,B 2ug/ml ,C2ug/ml,D 1ug/ml,E 3ug/ml,F 1ug/ml,G 1ug/ml,L 2.5ug/ml,M 1ug/ml,N 1ug/ml和杂质O 2ug/ml，替格瑞洛0.5mg/ml

6）作为优选，上述步骤2）中，供试品溶液的浓度为0.5mg/ml，稀释剂为35%的乙腈水溶液。

根据本发明提供的高效液相色谱条件，本领域技术人员可以选择适宜的计算方法计算杂质含量，所述计算方法包括但不限于内标法、外标法和面积归一化法。

本发明的一些实施例采用杂质对照品外标法确定差向异构体限度，具体方法如下：

1）配制流动相：分别配制流动相A和流动相B,以水溶液（磷酸调pH值为3.0）为流动相A，以乙腈为流动相B;

2）系统适用性溶液的制备：精密称定一定量的杂质对照品和替格瑞洛至容量瓶中，用35%的乙腈水溶液稀释，制成含杂质A 1ug/ml,B 2ug/ml ,C 2ug/ml,D 1ug/ml,E 3ug/ml,F1ug/ml,G 1ug/ml,L 2.5ug/ml,M 1ug/ml,N 1ug/ml和杂质O 2ug/ml，替格瑞洛0.5mg/ml的系统适用性溶液。

3）供试品溶液的制备：取替格瑞洛样品，精密称定，加35%乙腈溶解，制成每1ml约含0.5mg的样品溶液。

4）分别取步骤2）所述的系统适用性溶液，步骤3）所述的供试品溶液10μL，注入分离检测系统中，完成替格瑞洛有关物质的检测。

其中所述高效液相色谱条件如下：

色谱柱：Zorbax SB-Aq 4.6*250mm，5um，流速1.0ml/min，柱温30℃，流动相A水溶液（pH值至3.0），流动相B 乙腈，所述梯度程序如下：

试验结果证明本发明选用的色谱条件能较好地分离主成分及杂质，方法简便易行；杂质与杂质，杂质与主峰的分离度均满足检测要求，与之前报道文献和注册标准相比，该方法对杂质C与N,杂质M与G的控制优于其他检测方法。

附图说明

图1为本发明实施例中进口注册标准的系统适用性溶液的高效液相色谱图。

图2为本发明实施例中报道文献方法的系统适用性溶液的高效液相色谱图。

图3为本发明实施例中报道文献方法采用不同色谱柱的高效液相色谱图。

图4为本发明实施例中本发明方法的系统适用性溶液的高效液相色谱图。

具体实施方式

以下将参照附图，对本发明的优选实施例进行详细描述。优选实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，所举实施例是为了更好地对本发明的内容进行说明，但并不是本发明的内容仅限于所举实施例。所以本领域常规技术人员根据上述发明内容对实施方案进行非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。

实施例1

仪器与色谱条件：

Thermo Ultimate 3000 高效液相色谱仪；色谱柱为Agilent ZORBAX SB-C18 4.6*150mm，1.8um；以磷酸盐缓冲液1{取0.1mol/l磷酸二氢钠溶液10ml（用磷酸调pH至3.0），加水至900ml，摇匀}-乙腈=90:10为流动相A，以磷酸盐缓冲液2{取0.1mol/l磷酸二氢钠溶液10ml（用磷酸调pH至3.0），加水至300ml，摇匀}-乙腈=30:70为流动相B；进行梯度洗脱。用高效液相色谱系统进行检测，进样体积为10μL；流速为1.0ml/min；采用紫外检测器；检测波长为242nm；柱温：55℃

用35%乙腈作稀释剂，洗脱程序如下：

实验步骤

系统适用性溶液的制备：精密称定一定量的杂质对照品，用35%乙腈溶解，制成每1ml含杂质A 1ug/ml,B 2ug/ml ,C 2ug/ml,D 1ug/ml,E 3ug/ml,F 1ug/ml,G 1ug/ml,L2.5ug/ml,M 1ug/ml,N 1ug/ml和杂质O 2ug/ml，替格瑞洛0.5mg/ml的系统适用性溶液。

供试品溶液的制备：取替格瑞洛样品，精密称定，加35%乙腈溶解，制成每1ml约含0.5mg的样品溶液。

分别精密量取空白溶剂、系统适用性溶液、样品溶液各10μL,进样测定，记录色谱图，代表图见图1。

试验结果表明，杂质M出峰时间为11.577min，杂质G出峰时间为11.663min，在此梯度洗脱条件下，杂质M与杂质G无法达到基线分离，两个杂质峰洗脱不完全，分离度不符合要求。

实施例2

仪器与色谱条件：

Thermo Ultimate 3000 高效液相色谱仪；色谱柱为Welch Xtimate C18 4.6*150mm，5um；色谱柱柱温30℃；以纯化水（磷酸调pH值至3.0）为流动相A，以乙腈为流动相B；进行梯度洗脱。用高效液相色谱系统进行检测，进样体积为10μL；流速为1.0ml/min；采用紫外检测器；检测波长为255nm；柱温：30℃

用35%乙腈作稀释剂，洗脱程序如下：

实验步骤

系统适用性溶液的制备：精密称定一定量的杂质对照品，用35%乙腈溶解，制成每1ml含杂质A 1ug/ml,B 2ug/ml ,C 2ug/ml,D 1ug/ml,E 3ug/ml,F 1ug/ml,G 1ug/ml,L 2.5ug/ml,M 1ug/ml,N 1ug/ml和杂质O 2ug/ml，替格瑞洛0.5mg/ml的系统适用性溶液。

分别精密量取空白溶剂、系统适用性溶液、样品溶液各10μL,进样测定，记录色谱图，代表图见图2。

试验结果表明，在此洗脱条件下，杂质C出峰时间为11.233,11.553min（对映异构体），杂质N出峰时间为11.787min，杂质C与杂质N 分离度为1.18，三个杂质峰洗脱不完全，分离度不符合要求。

实施例3

仪器与色谱条件：

Thermo Ultimate 3000 高效液相色谱仪；色谱柱为Zorbax SB-Aq C18 4.6*250mm，5um；色谱柱柱温30℃；以纯化水（磷酸调pH值至3.0）为流动相A，以乙腈为流动相B；进行梯度洗脱。用高效液相色谱系统进行检测，进样体积为10μL；流速为1.0ml/min；采用紫外检测器；检测波长为255nm；柱温：30℃

用35%乙腈作稀释剂，洗脱程序如下：

实验步骤

分别精密量取空白溶剂、系统适用性溶液、样品溶液各10μL,进样测定，记录色谱图，代表图见图3。

试验结果表明，在此洗脱条件下，杂质C出峰时间为12.420,12.577min（对映异构体），杂质N出峰时间为12.857min，杂质C与杂质N分离度不符合要求；杂质M出峰时间为23.060，杂质G出峰时间为23.283min，杂质L出峰时间为28.037min，替格瑞洛出峰时间为25.607min，此条件下，杂质M与杂质G分离度不符合要求，杂质G与主峰，杂质L与主峰分离度均不符合要求。

实施例4

仪器与色谱条件：

用35%乙腈作稀释剂，洗脱程序如下：

实验步骤

分别精密量取空白溶剂、系统适用性溶液、样品溶液各10μL,进样测定，记录色谱图，代表图见图4。

试验结果表明，此洗脱条件下，杂质C出峰时间为12.420,12.577min（对映异构体），杂质N出峰时间为12.857min，杂质M出峰时间为23.060，杂质G出峰时间为23.283min，杂质L出峰时间为28.037min，替格瑞洛出峰时间为25.607min，此条件下，杂质C与杂质N,杂质M与杂质G，杂质G与主峰，杂质L与主峰分离度均符合要求,满足检测要求。

实施例5

仪器与色谱条件：

用35%乙腈作稀释剂，洗脱程序如下：

实验步骤

分别精密量取空白溶剂、系统适用性溶液各10μL,进样测定，其中，系统适用性溶液连续进样6针，考察仪器精密度，结果如下图：

试验结果表明，此洗脱条件下，对系统适用性溶液连续进样6针，各杂质峰的峰面积RSD均小于2%，满足检测要求。

Claims

1.一种用高效液相色谱检测替格瑞洛有关物质的方法，包括如下步骤：

配制系统适用性溶液和供试品溶液；

用高效液相色谱检测系统适用性溶液、供试品溶液，色谱条件：使用C18色谱柱，采用双流动相，即流动相A和流动相B进行梯度洗脱，所述流动相A为水溶液，所述流动相B为有机相溶液。

2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤( 1 )系统适应性溶液的制备：每1ml所述系统适用性溶液含杂质A 1ug/ml、B 2ug/ml 、C 2ug/ml、D 1ug/ml、E 3ug/ml、F1ug/ml、G 1ug/ml、L 2.5ug/ml、M 1ug/ml、N 1ug/ml和杂质O 2ug/ml，替格瑞洛0.5mg/ml。

3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤( 2 )中供试品溶液的制备：取替格瑞洛样品，精密称定，加35%乙腈溶解，制成每1ml约含0.5mg的样品溶液。

4.根据权利要求1 所述的方法，其中，所述流动相流速为0.8 ～ 1.2ml/min，优选1.0ml/min。

5.根据权利要求1 所述的方法，其中，所述紫外检测器波长为253-257nm，优选255nm。

6.根据权利要求1 所述的方法，其中色谱住的温度为25-35℃，优先选择30℃。

7.根据权利要求1 所述的方法，所述梯度洗脱方法，其中以水溶液（磷酸调pH值为3.0）为流动相A，以乙腈为流动相B，梯度洗脱程序如下：

其中水溶液的pH值范围为2.8~3.2，优先选择3.0。

8.根据权利要求1 所述的方法，包括取替格瑞洛适量，称重，用稀释液超声溶解，配成每1ml 含替格瑞洛0.5mg 的样品溶液，流速为1.0ml/ml，检测波长为255nm，柱温30℃ ；精密量取样品溶液10μl 注入液相色谱仪，完成替格瑞洛中活性组分及有关物质检测。