CN113499761B - 一种固定化金属离子亲和色谱填料、色谱柱及其制备方法 - Google Patents
一种固定化金属离子亲和色谱填料、色谱柱及其制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种固定化金属离子亲和色谱填料、色谱柱及其制备方法。将钾水玻璃、γ‑缩水甘油醚氧丙基三甲氧基硅烷和水溶解的三磷酸腺苷二钠混合搅拌,然后加入用水溶解的甲酰胺搅拌获得反应液,反应固化获得固体材料,然后洗涤,获得固定化金属离子亲和色谱柱填料。本发明通过一步反应法制备的ATP修饰的固定化金属离子亲和毛细管整体柱,制备步骤简单快速、重复性和良品率高、制备成本低。仅需将原料混合均匀后经历一次烘烤反应便可得到,其物理化学稳定性好,多次使用后具有较好的重现性。
Description
技术领域
本发明属于色谱领域,具体涉及一种固定化金属离子亲和色谱填料、色谱柱及其制备方法。
背景技术
固定化金属离子亲和层析(IMAC)被用于亲和纯化与金属离子具有结合能力的蛋白质、酶、多肽和氨基酸等。其原理是利用固相载体上的金属离子与蛋白质/多肽暴露出的一些氨基酸或化学修饰基团之间的静电相互作用,对特定的蛋白质/多肽进行富集、纯化,经过三十年来的发展,已逐渐成为分离纯化蛋白质等生物分子最有效的技术之一。
固定化金属离子亲和层析(IMAC)的核心在于固相基质、配体和金属离子的选择和制备工艺,上样、洗涤和洗脱条件也会影响富集的效果,其性能参数主要包括选择性、灵敏度、重现性、上样量、使用寿命和应用范围等。
目前商品化IMAC产品的固相基质通常为树脂微球或者磁性颗粒,以便通过离心或者磁吸附的方式进行上样、洗涤、洗脱的流程,亚氨基二乙酸(IDA)、氨基三乙酸(NTA)和乙二胺(TED)是具代表性的用于固定金属离子的螯合配体,它们的羧基和胺基能将Al3+、 Fe3 +、Ga3+、Ni2+等金属离子螯合在固相基质表面,但是这些组合的螯合性能较差,选择性不高。目前无论是商品化还是文献报道的IMAC材料,通常都是微球或者磁性材料的形式,在离心管中完成对目标蛋白质\多肽的富集,其上样、洗涤、洗脱的流程均需手动进行,较为耗时耗力,另外,目前商品化IMAC材料受国外公司垄断,价格较为昂贵(如:赛默飞货号A32992,4629元30次)。
发明内容
本发明的第一个目的是提供一种具有疏松多孔、比表面积高、背压低、物理化学稳定性好、机械稳定性好、选择性高、灵敏度高、富集倍数高的固定化金属离子亲和色谱柱填料。
本发明的固定化金属离子亲和色谱柱填料,其是通过以下方法制备的:
将钾水玻璃、γ-缩水甘油醚氧丙基三甲氧基硅烷和水溶解的三磷酸腺苷二钠混合搅拌,然后加入用水溶解的甲酰胺搅拌获得反应液,反应固化获得固体材料,然后洗涤,获得固定化金属离子亲和色谱柱填料。
本发明的固定化金属离子亲和色谱柱填料的制备原理示意如下所示:
1、钾水玻璃的制备
mKOH+nSiO2→mK2O·(n-m)SiO2+mH2O
2、钾水玻璃在甲酰胺、加热条件下水解
3、与步骤2同时进行的硅偶联剂与ATPNa2的反应:
4、硅胶基底上的ATP修饰
5、填料发挥富集功能
优选,
S1、将钾水玻璃与γ-缩水甘油醚氧丙基三甲氧基硅烷混合均匀得到S1的混合液;
S2、将三磷酸腺苷二钠用水溶解后加入到S1的混合液中,得到S2的混合液;
S3、将甲酰胺用水溶解后加入到S2的混合液中,搅拌获得反应液,反应获得固体材料,然后洗涤,获得固定化金属离子亲和色谱柱填料。
优选,所述的钾水玻璃的模数范围2-4,波美度范围为20-50。进一步优选是钾水玻璃的模数3.3,波美度为40。
优选,所述的固化是在温度100℃下固化10小时。
优选,所述的洗涤是先后用1M硝酸铵、0.1M硝酸和水洗涤。
优选,所述的钾水玻璃、γ-缩水甘油醚氧丙基三甲氧基硅烷、三磷酸腺苷二钠盐和甲酰胺的用量质量比是500-2000:1-10:2-50:20-130。进一步优选为1000:6:7.5:68。
本发明的第二个目的是提供一种固定化金属离子亲和色谱柱的制备方法,其是通过以下方法制备的:
是将色谱柱插入上述反应液中,使反应液注满色谱柱,然后注满的色谱柱的反应液反应固化,再经洗涤,获得ATP修饰的固定化金属离子亲和色谱柱。
所述的色谱柱是毛细管,如弹性石英毛细管(外径360微米,内径150微米,长度15厘米),制得ATP修饰的固定化金属离子亲和毛细管整体柱。
本发明的固定化金属离子亲和色谱柱填料,其具有疏松多孔、比表面积高、背压低、物理化学稳定性好、机械稳定性好、选择性高、灵敏度高、富集倍数高的优点。
本发明通过一步反应法制备的ATP修饰的固定化金属离子亲和毛细管整体柱,制备步骤简单快速、重复性和良品率高、制备成本低。仅需将原料混合均匀后经历一次烘烤反应便可得到,其物理化学稳定性好,多次使用后具有较好的重现性。与本领域常用的微球或者磁性材料形式的富集材料相比,本发明的ATP修饰的固定化金属离子亲和毛细管整体柱具备与纳升级液相系统联用的潜力,结合自动进样系统,可使劳动密集的上金属离子、上样、洗涤、洗脱等操作自动化进行,同时本发明对磷酸化肽的位点覆盖率、检出限、选择性也达到业界一流的水平。
附图说明
图1是ATP修饰的固定化金属离子亲和毛细管整体柱的横切面电镜图,分别为200μm及5μm 尺度。
图2是ATP修饰的固定化金属离子亲和毛细管整体柱富集α-casein酶切产物中磷酸化肽的一级质谱图。
图3是ATP修饰的固定化金属离子亲和毛细管整体柱富集0.2ng和2ngα-casein酶切产物中磷酸化肽的一级质谱图。
图4是ATP修饰的固定化金属离子亲和毛细管整体柱富集2ngα-casein及2μg BSA酶切产物中磷酸化肽的一级质谱图。
具体实施方式
下面将结合具体实施例来进一步说明本发明,应该说明的是,下述实施例仅是为了解释本发明,并不对其内容进行任何形式的限定。本发明的设计思想或同类物质的简单替代,均应包含在本发明的保护范围之内。除非特别说明,本发明采用的试剂、材料、方法和设备均为本技术领域现有常规的试剂、材料、方法和设备。
实施例1 ATP修饰的固定化金属离子亲和毛细管整体柱的制备
本发明通过一步反应法制备的ATP修饰的固定化金属离子亲和毛细管整体柱,具体包括以下步骤:
S1.在微型反应瓶中加入740微升(约1000mg)钾水玻璃(模数3.3,波美度40),在室温搅拌条件下缓慢加入6微升(约6mg)γ-缩水甘油醚氧丙基三甲氧基硅烷(GLYMO,Cas号:2530-83-8),持续在室温条件下充分搅拌30分钟。
S2.称取7.5mg三磷酸腺苷二钠,用160微升去离子水溶解后,缓慢加入S1步骤中的反应液中,继续持续在室温条件下充分搅拌30分钟。
S3.取60微升(约68mg)甲酰胺,与40微升去离子水混匀后,缓慢加入S2步骤中的反应液中,室温下继续搅拌1分钟,得到反应液。
S4.切取一批外径360微米、内径150微米、长度15厘米的弹性石英毛细管,插入S3所得反应液中,利用毛细现象使反应液注满毛细管。
S5.将注满的毛细管放入100℃烘箱中固化10小时,所得整体柱两端分别切去2厘米。
S6.利用压力注射池,先后用1M硝酸铵、0.1M硝酸、去离子水各200微升洗涤上述整体柱,由此得到成品的ATP修饰的固定化金属离子亲和毛细管整体柱。
ATP修饰的固定化金属离子亲和毛细管整体柱的截面如附图1的电镜图所示,在5微米的视野尺度下,可观察到该材料呈疏松多孔状,平均孔径约为1微米,证明材料具有较大的比表面积,这是其具有高富集效率的基础,同时这种多孔结构能避免上样过程中出现较高的背压,能够在较高的流速下完成上样。
实施例2 综合考察本发明实施例1制得的ATP修饰的固定化金属离子亲和毛细管整体柱对磷酸化肽的富集能力。
将本发明实施例1制得的ATP修饰的固定化金属离子亲和毛细管整体柱用于对标准磷酸化蛋白α-casein或BSA经胰蛋白酶处理所得磷酸化肽的富集。从位点覆盖度、检测限、选择性等方面考察其富集性能。
溶解于50mM碳酸氢铵溶液的2mg/ml BSA加入DTT至10mM于56℃加热30min,加入碘代乙酰胺至40mM于暗处孵育40min,以断开二硫键。取1mg标准磷酸化蛋白α-casein 及1mg断开二硫键的BSA,溶解于1ml的50mM碳酸氢铵,分别用20μg胰蛋白酶处理8 小时,获得两种1mg/mL的蛋白酶切液。(标准磷酸化蛋白α-casein含有α-S1-casein和α-S2-casein两种磷酸化蛋白,分别有9和10个磷酸化位点被报道,经胰蛋白酶处理后,能产生一系列的单磷酸化肽、多磷酸化肽和非磷酸化肽,未经特异性富集时在质谱中主要观察到非磷酸化肽的信号;牛血清白蛋白BSA是一种常见的蛋白,没有磷酸化位点,经胰蛋白酶处理后,产生多种非磷酸化肽)
具体步骤如下:
S1.利用微量注射泵推动100微升体积分数80%乙腈、1%TFA溶液流经ATP修饰的固定化金属离子亲和毛细管整体柱(下称整体柱),完成清洗。
S2.利用微量注射泵推动100微升0.1M氯化锆溶液流经整体柱,完成对Zr4+的固定。
S3.取一定量的蛋白酶切物(位点覆盖率实验为2μgα-casein酶切物\100pmol,检测限实验为0.2ngα-casein酶切物\10fmol或2ngα-casein酶切物\100fmol,选择性实验为2ng α-casein酶切物与2μg BSA酶切物)溶于100微升体积分数80%乙腈、1%TFA溶液,利用微量注射泵推动该溶液流经整体柱,完成对磷酸化肽的富集。
S4.利用微量注射泵推动100微升体积分数80%乙腈、1%TFA溶液流经整体柱,完成对非特异性结合多肽的清洗。
S5.将整体柱末端与弹性石英毛细管、nano喷针、nanoESI离子源及OrbitrapFusion质谱组成连接,利用微量注射泵按照0.5微升/分钟的流速持续推动5%氨水,对被整体柱富集的磷酸化肽进行洗脱,用质谱实时检测洗脱产物。
表1.ATP修饰的固定化金属离子亲和毛细管整体柱富集α-casein酶切物磷酸化肽的鉴定结果
实验结果表明本发明制备的ATP修饰的固定化金属离子亲和毛细管整体柱对单、多磷酸化肽均有富集效果(图2),对α-casein-S1和α-casein-S2(这个标准品中就包含了这两种α-casein蛋白)的位点覆盖率分别高达100%和90%(表1),对磷酸化肽富集的检测限达到 10fmol(图3),对磷酸化肽的选择性达到1:1000(α-casein:BSA)(1ugα-casein和1mgBSA 混合)(图4),均达到了业界一流的水平。
Claims (10)
1.一种固定化金属离子亲和色谱柱填料的制备方法,其特征在于,将钾水玻璃、γ-缩水甘油醚氧丙基三甲氧基硅烷和水溶解的三磷酸腺苷二钠混合搅拌,然后加入用水溶解的甲酰胺搅拌获得反应液,反应固化获得固体材料,然后洗涤,获得固定化金属离子亲和色谱柱填料。
2.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于,所述的钾水玻璃、γ-缩水甘油醚氧丙基三甲氧基硅烷、三磷酸腺苷二钠和甲酰胺的用量质量比是500-2000:1-10:2-50:20-130。
3.根据权利要求2所述的制备方法,其特征在于,所述的钾水玻璃、γ-缩水甘油醚氧丙基三甲氧基硅烷、三磷酸腺苷二钠和甲酰胺的用量质量比是1000:6:7.5:68。
4.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于,所述的钾水玻璃的模数范围2-4,波美度范围为20-50。
5.根据权利要求4所述的制备方法,其特征在于,所述的钾水玻璃的模数3.3,波美度为40。
6.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于,所述的固化是在温度100℃下固化10小时;所述的洗涤是先后用1M硝酸铵、0.1M硝酸和水洗涤。
7.一种按照权利要求1-6任一项所述的制备方法制备得到的固定化金属离子亲和色谱柱填料。
8.一种固定化金属离子亲和色谱柱的制备方法,其特征在于,是将色谱柱插入权利要求1-6任一项中的反应液中,使反应液注满色谱柱,然后注满的色谱柱的反应液反应固化,再经洗涤,获得ATP修饰的固定化金属离子亲和色谱柱。
9.根据权利要求8所述的制备方法,其特征在于,所述的色谱柱是弹性石英毛细管。
10.一种按照权利要求8或9所述的制备方法制备得到的ATP修饰的固定化金属离子亲和色谱柱。
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Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
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SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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GR01 | Patent grant | ||
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