CN108291217A - 分子机器 - Google Patents

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Abstract

本公开涉及分离的酶复合物，其包含栓系的辅因子和至少两种配对的酶以催化酶促反应并再循环所述辅因子。

Description

分子机器
发明领域
本公开涉及分离的酶复合物，其包含栓系的辅因子和至少两种配对的酶以催化酶促反应并且再循环所述辅因子。
发明背景
生物催化剂具有在有机合成中显著减少产生的废物和能源成本的潜力。部分地，这是因为生物催化剂(其中有许多在低温和低压下操作)的精细选择性减少了不想要的副产物形成，这具有简化下游分离的额外益处。事实上，其中酶用作催化剂的有机合成的数量因其在温和的pH和温度条件下具有优异的立体和区域特异性(Leonidat等，2001)而正在迅速增加。
现在通过将酶催化剂固定在流动反应器中来进行各种工业过程。在流动反应器中固定酶催化剂具有许多有利方面，包括酶的再利用、酶的稳定化(特别是防止聚集)、连续反应过程以及防止酶对产物的污染。
此外，将低价值可再生原料转化成高价值产物的偶联级联酶反应代表了可再生绿色化学的要旨。
然而，当前酶系统应用于能量密集型合成反应的主要限制之一是提供可扩散辅因子或共底物的连续供应的成本(Zhao等，2003)。因此，迫切需要开发特别地用于工业过程和可再生绿色化学的改进的酶催化剂。
发明概述
本发明人已发现可从各种酶配对产生稳定的酶融合物。本发明人还发现可将各种辅因子栓系至这些融合物上以形成能够进行酶促反应和原位辅因子再生的酶复合物。
因此，在一个方面，本公开涉及分离的酶复合物，其包含：
a)辅因子，
b)需要辅因子进行酶促反应的第一酶，和
c)使辅因子再循环的第二酶，
其中所述第一酶、第二酶和辅因子通过共价附接形成所述酶复合物，并且其中所述辅因子经由系链共价附接，所述系链允许所述辅因子被所述第一酶使用并被所述第二酶再循环。
在一个实例中，辅因子选自由ATP/ADP、NAD+/NADH、NADP+/NADPH和FAD+/FADH2组成的组。
在一个实例中，辅因子具有核糖核苷酸核心。在一个实例中，系链经由至核糖核苷酸核心的碱基部分的C-N(碳至氮)键共价附接至所述核糖核苷酸核心。
在一个实例中，系链包括聚乙二醇(PEG)链、烃链、多肽、多核苷酸。在一个实例中，聚乙二醇链的长度是PEG2至PEG48(即(-CH2CH2O-)2至(-CH2CH2O-)48)。在一个实例中，聚乙二醇链的长度是PEG24(即(-CH2CH2O-)24)。在一个实例中，烃链的长度是C8-C18，在一个实例中，烃链的长度是C12-C18，在一个实例中，烃链的长度是C12。
在一个实例中，辅因子被栓系至所述酶之一。
在一个实例中，第一和第二酶通过接头共价附接。在一个实例中，辅因子被栓系至接头。
在一个实例中，接头是氨基酸接头。在一个实例中，接头包含Cys、Thr、Glu或Lys氨基酸残基。在一个实例中，接头包含GlySerSer氨基酸残基重复序列(GlySerSer)n。在一个实例中，接头包含(GlySerSer)3Cys(GlySerSer)3。
第一酶可以是能够将合适的底物转化成目标产物的任何蛋白质。合适的第一酶的实例包括但不限于激酶、脱氢酶、加氧酶、醛缩酶、还原酶和合酶。
第二酶可以是能够将第一酶的辅因子转化成可被第一酶用来将合适的底物转化成目标产物的形式的任何蛋白质。合适的第二酶的实例包括但不限于激酶、脱氢酶、氧化酶、还原酶和过氧化物酶。
在一个实例中，酶复合物还包含共价附接的缀合模块，用于将复合物缀合至固体支撑物。在一个实例中，缀合模块通过接头共价附接至第一酶或第二酶。在一个实例中，接头是上述实例中引用的接头。
在一个实例中，缀合模块是蛋白质。可用作缀合模块的一部分的蛋白质的实例包括但不一定限于酯酶、链霉亲和素、谷胱甘肽S-转移酶、金属结合蛋白、纤维素结合蛋白、麦芽糖结合蛋白和抗体或其抗原结合片段。
在一个实例中，酶复合物共价或非共价地附接至固体支撑物。
在一个实例中，固体支撑物是官能化的聚合物。在一个实例中，官能化的聚合物选自但不一定限于由以下组成的组：琼脂糖、棉、聚丙烯腈、聚酯、聚酰胺、蛋白质、核酸、多糖、碳纤维、石墨烯、玻璃、二氧化硅、聚氨酯和聚苯乙烯。
在一个实例中，固体支撑物呈珠粒、基质、编织纤维或凝胶形式。
另一方面，本公开涉及用于产生本发明的酶复合物的方法，所述方法包括：
i)在宿主细胞或无细胞表达系统中表达编码包含第一酶和第二酶的嵌合蛋白的多核苷酸；和
ii)经由系链将辅因子附接至嵌合蛋白。
在一个实例中，所述第一酶和所述第二酶通过接头分隔，并且步骤ii)包括将所述系链共价附接至所述接头。
在一个实例中，嵌合蛋白还可包含上面例举的缀合模块蛋白。在一个实例中，该方法还包括将酶复合物缀合至固体支撑物。
宿主细胞可以是任何细胞类型。实例包括但不限于细菌细胞、酵母细胞、植物细胞或动物细胞。
本发明的酶复合物可用于多种工业和非工业系统中，用于生产目标产品，其中合成需要可再循环的辅因子。本发明的酶复合物再循环辅因子的能力降低了与进行这些类型的反应相关的成本和工作负荷。因此，在另一方面，本发明提供了用于产生产物的方法，所述方法包括：
i)提供根据本公开的酶复合物和第一酶的底物，以及
ii)在足以使第一酶将底物转化成产物和足以使第二酶再循环辅因子以供第一酶使用的条件下，孵育酶复合物和底物一定时间。
所述产物可以适用于商业销售，或为合成所需最终产物所需的中间产物。
在一个实例中，该方法可包括两个或更多个酶促步骤，并且可使用本公开的两种不同的酶复合物进行所述酶促步骤中的至少两个步骤。
在一个实例中，所述方法在生物反应器中进行。在一个实例中，生物反应器是连续流动生物反应器。
在一个实例中，本公开涉及包含本公开内容的酶复合物的生物反应器。
在另一方面，本发明提供了包含至少一种本发明的酶复合物的组合物。此类组合物可包含合适的载体和/或赋形剂。此类组合物可适合用于本发明的用于产生产物的方法。
除非另有特别说明，否则本文的任何实施方案应被视为加以必要的变更地适用于任何其他实施方案。
本发明在范围上不受本文所述的具体实施方案的限制，所述实施方案旨在仅仅为了举例说明的目的。如本文所述，功能上等同的产品、组合物和方法显然在本发明的范围内。
在整个说明书中，除非另有特别说明或上下文另外要求，否则对单个步骤、物质组合物、步骤的组或物质组合物的组的提及应当被认为包括那些步骤、物质组合物、步骤的组或物质组合物的组中的一个或多个(即，一种或多种)。
在下文中通过以下非限制性实施例并参考附图来描述本发明。
附图简述
图1.双酶促融合蛋白TkGlpK:MsAK；BiF1(a)和EcG3PD::CaN OX；BiF2(b)的表达和纯化。
图2.利用BiF1和BiF2的组合分批反应：将甘油转化成DHAP。
图3.利用BiF1和BiF2的大规模组合双酶促分批反应的pH(a)和总产量(b)的作用。在室温下以1mL总体积利用100mM甘油、各500μM的ATP和NAD、100mM乙酰磷酸和400μg/mL(～4μM)的每种双酶促融合蛋白进行反应。
图4.A.使用三种不同的醛受体将甘油经由DHAP转化成糖和糖类似物的多酶反应方案。B.使用BiF1、BiF2和来自肉葡萄球菌I(S.carnosus I)(ScFruA)和嗜钙栖热菌(T.caldophilus)(TcFruA)的醛缩酶将甘油转化成甘油-3-磷酸、DHAP和手性糖的多酶分批反应。
图5.用于将甘油转化成果糖-1,6-二磷酸的多酶分批反应的pH的优化。误差棒显示平均值的标准误差(SEM；n＝3)。
图6.三磷酸腺苷(ATP，左)和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)的结构。
图7.描绘制备官能化的NAD(N6-(2-氨基乙基)-b-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(在本文中称为N6-2AE-NAD)的优化总体途径的方案。
图8.描绘制备功能性栓系的NAD构建体的实例的经优化的总途径的方案。
图9.制备适用于附接至接头的NAD-栓系基团的方案。该方案显示N6-2AE-NAD与马来酰亚胺-PEG-NHS接头产生终止于马来酰亚胺基团的NAD-系链基团的反应。
图10.通过在用含有0.1mM TCEP的PBS平衡的S200 2660柱上进行凝胶过滤来纯化BiF2，并监测在280nm、259nm和450nm处的吸光度。汇集以用于缀合的级分用红色箭头标示。在柱上运行凝胶过滤标准品(BioRad)；在色谱图下方标示每种蛋白质洗脱的体积。
图11.通过在用含有0.1mM TCEP的PBS平衡的S200 2660柱上进行凝胶过滤来纯化NAD-2AE-PEG24-BiF2缀合物，并监测在280nm、259nm和450nm处的吸光度。
图12.BiF2和NAD-2AE-PEG24-BiF2的紫外-可见光谱。
图13.BiF2和NAD-2AE-PEG24-BiF2的变性的高分子量和低分子量级分的紫外-可见光谱。
图14.醛缩酶偶联反应证明NAD-2AE-PEG24-BiF2融合蛋白生物催化剂在不添加外源辅因子的情况下产生DHAP。
图15.甘油-3-磷酸至DHAP的转化伴随栓系的NAD(TriF2)再循环。略语表：-未添加NAD；+添加1mM NAD；unc-未缀合的；conj-缀合至NAD-2AE-PEG24。
图16：在三酶促融合蛋白的双酶促融合组分与酯酶组分之间具有不同间隔子长度的TriF1的两种不同变型的比较活性。
图17.三酶促融合蛋白1(TkGlpK:MsAK::AaE2)的热稳定性。
图18.三酶促融合蛋白2(EcG3PD::CaNOX::AaE2)的热稳定性(A)和储存稳定性(B)。
图19.A.使用三种不同的醛受体将甘油经由DHAP转化成糖和糖类似物的多酶反应的方案。B.使用TriF1(具有和不具有栓系的ATP)、TriF2和来自肉葡萄球菌I(ScFruA)的醛缩酶将甘油转化成甘油-3-磷酸、DHAP和手性糖的多酶分批反应。*表示在这些情况下的DHAP的值仅仅是基于扣除已知量的添加的甘油醛-3-磷酸受体(其具有与DHAP相同的分子量和m/z)的估值。
图20.将ATP-CM-C6-PEG24-MAL(ATP-羧基甲基-己基-PEG24-马来酰亚胺)栓系至TriF1的反应的凝胶过滤图谱。
图21.添加和未添加ATP的栓系的ATP-CM-C6-PEG24-TriF1的活性。用2mM甘油底物在pH 8.0下以0.5mL反应体积进行反应，并在指示的地方加入100μM ATP。
图22.将NAD-2AE-PEG24-MAL辅因子栓系至TriF2的优化：添加和不添加100μM外源NAD+的活性说明辅因子的有效栓系。
图23.分级、模块化酶促流动反应器的概念。
图24.在TFK抑制剂存在的情况下CaNOX::AaE2和EcG3PD::CaNOX::AaE2(TriF2)的酯酶活性。
图25.在外源NAD+比较活性存在和不存在的情况下通过缀合固定至棉盘上的NAD-栓系的TriF2的比较活性。
图26.以1mL/分钟测量时，利用填充在柱中的3cm棉盘塞测量的停留时间分布。
图27.作为流速的函数的来自TriF1Reactor2的甘油-3-磷酸的转化产量。
图28.TriF1Reactor2流动反应器稳定性：在不存在外源ATP(顶线；圆圈)不存在的情况下和具有10μM外源ATP(底线；方形)的情况下，以最大产率从甘油连续产生甘油-3-磷酸超过30小时。
图29.添加和未添加NAD辅因子的TriF2Reactor2。
图30.将TriF2从纯化的蛋白质或粗制裂解物中固定至琼脂糖-三氟酮珠粒。
图31.将甘油-3-磷酸和CBZ-氨基丙二醇转化成CBZ保护的氨基己酮糖磷酸的三重纳米机器多酶反应器级联。针对两种不同流速：0.3mL/分钟(A和B)和0.2mL/分钟(C和D)的在累积的CBZ保护的氨基己酮糖磷酸产量(A和C)和活性速率(B和D)下的底物转化百分比。
图32.三重纳米机器反应器多酶级联将甘油-3-磷酸和CBZ-氨基丙二醇转化成CBZ保护的氨基己酮糖磷酸的效率。显示了每个反应器步骤的平均转化％。
图33.二乙烯砜活化的珠粒与己基-TFK抑制剂之间的偶联反应，随后TFK抑制剂-衍生的珠粒与融合酶酯酶活性位点中的丝氨酸残基(Ser155)的共价相互作用。
图34.将甘油-3-磷酸和CBZ-氨基丙二醇转化成CBZ-氨基己酮磷酸(或1-(磷酸二氢)6-(N-CBZ)-氨基-6-脱氧，-L-山梨糖)的三重纳米机器多酶反应器级联。针对两种不同流速：0.3mL/分钟(A和B)和0.2mL/分钟(C和D)的在累积的CBZ-氨基己酮糖磷酸产量(A和C)和活性速率(B和D)下的底物转化百分比。
图35.三重纳米机器反应器多酶级联将甘油-3-磷酸和CBZ-氨基丙二醇转化成CBZ-氨基己酮磷酸的效率。显示每个反应器步骤的平均转化％。
图36.用于合成商业上相关的氨基木糖醇抗糖尿病药物D-荞麦碱的串联纳米机器反应器设计。
图37.磷酸转移反应器TriF1R3：以0.25mL/分钟的流速运行的甘油和乙酰磷酸至G3P和乙酸盐的转化(通过柱(1.5cm内径，12cm)中固定化ADP-2AE-PEG24-TriF1进行的)。
图38.氧化反应器TriF2R2：在流动反应器中将G3P转化成D HAP。将在10μM TCEP存在的情况下制备的固定化NAD-2AE-PE G24-TriF2纳米机器珠粒填充至柱(1.5cm内径x16.5cm)中。将50μM TCEP pH 8中的10mM G3P以0.25mL/分钟的流速通过柱，并通过LCMS测定级分F1至F10的G3P剩余量和DHAP产生量。
图39.小规模分批反应中的BiF4(ScFruA-AaE2)至琼脂糖-DVS-己基-TFK珠粒的固定的优化。
图40.羟醛缩合反应器ScFru-AaE2R2：在流动反应器中将Cbz-醛和DHAP转化成手性二羟基酮基磷酸。将在10μM TCEP存在的情况下制备的固定化ScFru-AaE2纳米机器珠粒填充入柱(1.5cm内径x 16.5cm)中。将5mM Cbz-氨基丙醛和50mM柠檬酸盐缓冲液pH 7中的DHAP以0.1mL/分钟的流速通过柱，并通过LCMS定量级分F1和F10的DHAP和Cbz-氨基丙醛的剩余量。虽然预期的Cbz-二羟基酮基磷酸产物可通过LCMS从反应器级分中检测到，但其由于缺乏建立校准曲线的可用标准品而不可定量。
图41.纳米工厂1：用于手性(3S,4R)二羟基酮基磷酸前体至抗糖尿病药物D-荞麦碱的合成的串联纳米机器反应器。
图42.通过纳米工厂的操作的底物和产物的通量，所述纳米工厂包括用于手性(3S,4R)二羟基酮基磷酸前体至抗糖尿病药物D-荞麦碱的合成的串联磷酸转移反应器、氧化反应器和羟醛缩合反应器。将50mM于柠檬酸盐缓冲液pH 8.0中的5mM甘油和50μM TCEP以0.25mL/分钟提供给反应器，持续1200分钟(20小时)，并收集60个3mL体积的级分进行分析。
发明详述
一般技术
除非另外明确地定义，否则本文使用的所有技术和科学术语应当被认为具有与本领域(例如，在细胞培养、分子遗传学、酶学、蛋白质化学、生物化学和生物加工中)普通技术人员通常理解的相同的含义。
除非另外指出，否则本公开中使用的重组蛋白质、细胞培养物、化学官能化和生物加工技术是本领域技术人员公知的标准方法。此类技术在整个来源中的文献中都有描述和解释，诸如J.Perbal,A Practical Guide to Molecular Cloning,John Wiley and Sons(1984),J.Sambrook等，Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring HarbourLaboratory Press(1989),T.A.Brown(编辑),Essential Molecular Biology:APractical Approach，第1和2卷，IRL Press(1991),D.M.Glover和B.D.Hames(编辑),DNACloning:A Practical Approach，第1-4卷，IRL Press(1995 and 1996)和F.M.Ausubel等，(编辑),Current Protocols in Molecular Biology,Greene Pub.Associates andWiley-Interscience(1988，包括所有至现在的更新)，Ed Harlow和David Lane(编辑)Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbour Laboratory,(1988)，以及J.E.Coligan等(编辑)Current Protocols in Immunology,John Wiley&Sons(包括所有至现在的更新),J.E.Coligan等，(编辑)Current Protocols in Protein Science,JohnWiley&Sons(包括所有至现在的更新)和G.T Hermanson,Bioconjugate Techniques，第3版，Elsevier(2013)。
酶复合物
如本文中所用，“酶”是加速或催化化学反应的蛋白质。酶可具有结合底物或进行底物的选择的一个或多个活性位点。酶可以是天然存在的，或者可以是合成来源的。
术语“酶复合物”在本公开的上下文中用来指通过第一酶、第二酶和辅因子的共价附接形成的结构。附接可以是直接的，也可以是间接的(通过一个或多个间插部分诸如接头)。以下讨论共价附接的各种实例。
在本公开的上下文中使用术语“再循环(recycle)”、“再循环的(recycled)”和“再循环(recycling)”来定义将辅因子转化成可被第一酶用来催化酶促反应的形式的能力。
可将各种其他组分共价附接至本公开的“酶复合物”。例如，可将另外的酶共价附接至复合物。在一个实例中，可将第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九或第十酶共价附接至复合物。另外的酶可以催化与复合物的第一或第二酶的类似或不同的酶促反应。在另一个实例中，将缀合模块共价附接至复合物。
第一酶和第二酶
“第一酶”可以是使用辅因子来催化酶促反应的任何酶，且“第二酶”可以是再循环辅因子的任何酶。“第一酶”的选择不受酶类型或活性的特别限制。在各种实例中，第一酶可以是氧化还原酶(EC 1)、转移酶(EC 2)、水解酶(EC 3)、裂合酶(EC 4)或异构酶(EC 5)。在各种实例中，第一酶具有从表1中选择的活性。
表1.示例性酶活性
合适的第一酶的实例包括但不限于激酶、脱氢酶、加氧酶、醛缩酶、还原酶和合酶。
在一个实例中，激酶选自由由EC 2.7.1-EC 2.7.14组成的组。在另一个实例中，激酶选自由EC 2.7.1.1-EC 2.7.1.188组成的组。
在一个实例中，脱氢酶是NAD依赖性脱氢酶。在一个实例中，脱氢酶是NADP依赖性脱氢酶。在一个实例中，脱氢酶选自由EC 1.1.1.1-EC 1.1.1.386组成的组。在一个实例中，脱氢酶选自由以下组成的组：EC 1.1.2.1-EC 1.1.2.8、EC 1.1.3.1-EC 1.1.3.47、EC1.1.5.2-EC 1.1.5.10、EC 1.1.9.1、EC 1.1.98.1-EC 1.1.98.5、EC 1.1.99.1-EC1.1.99.39、EC 1.2.1.1-EC 1.2.1.92、EC 1.3.1.1-EC 1.3.1.107、EC 1.20.1.1。
在一个实例中，加氧酶是NAD依赖性加氧酶。在一个实例中，加氧酶是NADP依赖性加氧酶。在一个实例中，加氧酶选自由EC 1.14.12、EC 1.1.4.13、EC 1.14.21组成的组。在一个实例中，加氧酶是单加氧酶。在一个实例中，单加氧酶选自EC 1.14.13.1-EC1.14.13.203。
在一个实例中，醛缩酶选自由EC 4.1.2.1-EC 4.1.2.57组成的组。
在一个实例中，还原酶选自由以下组成的组：EC 1.7.1.1-EC 1.7.1.15、EC1.8.1.2-EC 1.8.1.19、EC 1.16.1.1-EC 1.16.1.10。
在一个实例中，合酶选自由EC 1.14.21.1-EC 1.14.21.10组成的组。
在一个实例中，第一酶是甘油激酶(EC 2.7.1.30)，诸如鹿儿岛热球菌(Thermococcus kodakarensis)甘油激酶(TkGlpk)。在另一个实例中，第一酶是甘油-3-磷酸脱氢酶(EC 1.1.1.8)，诸如大肠埃希氏菌(Escherichia coli)甘油-3-磷酸脱氢酶。在另一个实例中，第一酶是老黄酶诸如希瓦氏菌属(Shewanella)黄酶(SYE2)或枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)黄酶(YqjM)。在一个实例中，第一酶是醇脱氢酶(EC 1.1.1.1)，如嗜热脱氮地芽孢杆菌(Geobacillus thermodenitrificans)醇脱氢酶。
在各种实例中，第二酶也具有选自表1的活性。然而，第二酶的选择基于其具有催化被第一酶使用的辅因子再循环的能力。例如，合适的第二酶的实例包括但不限于激酶、脱氢酶、氧化酶、还原酶和过氧化物酶。
在第一酶将ATP转化成ADP以进行酶促反应的情况下，合适的第二酶是具有催化ADP再循环至ATP的能力的酶。例如，在第一酶是甘油激酶(EC 2.7.1.30)的情况下，本领域技术人员将会理解(至少从EC号数据库记录)第一酶将ATP转化成ADP以催化甘油的磷酸化，从而合适的第二酶是具有从ADP再循环ATP的能力的酶诸如丙酮酸激酶(EC 2.7.1.40)。
在第一酶将NAD转化成NADH以催化酶促反应的情况下，合适的第二酶是具有催化NADH再循环至NAD的能力的酶。例如，在第一酶是甘油-3-磷酸脱氢酶(EC 1.1.1.8)的情况下，本领域技术人员将理解，第一酶将NAD转化成NADH以催化甘油-3-磷酸至DHAP的代谢，因而合适的第二酶是具有从NADH再循环NAD的能力的酶，诸如NADH氧化酶(EC 1.6.3.4)。
在第一酶将NADPH转化成NADP以催化酶促反应的情况下，合适的第二酶是具有催化NADP再循环至NADPH的能力的酶。例如，在第一酶是NADPH脱氢酶(EC 1.6.99.1)诸如枯草芽孢杆菌黄酶的情况下，本领域技术人员将会理解，第一酶将NADPH转化成NADP以催化醛/酮的还原，因而合适的第二酶是具有从NADP再循环NADPH的能力的酶诸如甲酸脱氢酶(NADP)(EC 1.2.1.43)。
在一个实例中，激酶选自由EC 2.7.1.-EC 2.7.14组成的组。在一个实例中，激酶选自由EC 2.7.4.1-EC 2.7.4.28、EC 2.7.6.1-EC 2.7.6.5组成的组。在一个实例中，激酶是乙酸激酶。在一个实例中，乙酸激酶选自由EC 2.7.2.12组成的组。在一个实例中，激酶是丙酮酸激酶。在一个实例中，丙酮酸激酶选自由EC 2.7.1.40组成的组。
在一个实例中，脱氢酶选自由1.1.1.1-EC 1.1.1.386组成的组。在一个实例中，脱氢酶选自由以下组成的组：EC 1.1.2.1-EC 1.1.2.8、EC 1.1.3.1-EC 1.1.3.47、EC1.1.5.2-EC 1.1.5.10、EC 1.1.9.1、EC 1.1.98.1-EC 1.1.98.5、EC 1.1.99.1-EC1.1.99.39、EC 1.2.1.1-EC 1.2.1.92、EC 1.3.1.1-EC 1.3.1.107、EC 1.8.1.2-EC1.8.1.19、EC 1.12.1.2-EC 1.12.1.5。在一个实例中，脱氢酶是酰基CoA FAD脱氢酶。在一个实例中，酰基CoA FAD脱氢酶选自由由EC 1.3.8.1-EC 1.3.8.12组成的组。
在一个实例中，选自由EC 1.6.3组成的组的氧化酶。在一个实例中，氧化酶是NADH氧化酶。在一个实例中，NADH氧化酶选自由EC 1.6.3.3、EC 1.6.3.4组成的组。在一个实例中，氧化酶是NADPH氧化酶。在一个实例中，NADPH氧化酶选自由EC 1.6.3.1、EC 1.6.3.2组成的组。
在一个实例中，还原酶选自由EC 1.7.1.1-EC 1.7.1.15、EC 1.8.1.2-EC1.8.1.19组成的组。
在一个实例中，过氧化物酶是NADH过氧化物酶。在一个实例中，NADH过氧化物酶选自由EC 1.11.1.1组成的组。在一个实例中，过氧化物酶是NADPH过氧化物酶。在一个实例中，NADPH过氧化物酶选自由EC 1.11.1.2组成的组。
在一个实例中，第二酶是丙酮酸激酶(EC 2.7.1.40)，诸如耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis)ATP激酶(MsAK)。在一个实例中，第二酶是NADH氧化酶(EC1.6.3.4)，诸如Clostridium aminoverlaricum NADH氧化酶(CaNOX)。在一个实例中，第二酶是醇脱氢酶(EC 1.1.1.1)，如嗜热脱氮地芽孢杆菌(Geobacillusthermodenitrificans)醇脱氢酶(GtADH)。在另一个实例中，第二酶是甲酸脱氢酶(EC1.2.1.43)诸如博伊丁假丝酵母(C.boidinii)甲酸脱氢酶。
本领域技术人员将会理解，复合物的第一和第二酶可具有广泛重叠的酶促功能。例如，第一酶可以是：
i)氧化还原酶(EC 1)；
ii)转移酶(EC 2)；
iii)水解酶(EC 3)；
iv)裂合酶(EC 4)；或，
v)异构酶(EC 5)。
并且第二酶也可以是：
i)氧化还原酶(EC 1)；
ii)转移酶(EC 2)；
iii)水解酶(EC 3)；
iv)裂合酶(EC 4)；或，
v)异构酶(EC 5)。
例如，第一和第二酶都可以是激酶、脱氢酶或还原酶。尽管如此，第一与第二酶可根据它们对栓系至复合物的辅因子的使用来区分，至少因为第一酶使用辅因子进行酶促反应而第二酶循环所述辅因子。
本领域技术人员将能够通过常规筛选来鉴定用于本公开的酶复合物的最佳酶。在一个实例中，最佳的第一酶对于进行所需的酶促反应具有最大的酶促活性。在一个实例中，最佳的第二酶对辅因子再循环具有最大的酶促活性。优选地，使第一酶与第二酶匹配，这样它们在相同或相似的条件(诸如温度和pH)下具有合适的活性。
例如，可以筛选各种甘油激酶以确定用于进行将甘油转化成甘油-3-磷酸的酶促反应的最佳第一酶。在另一个实例中，可筛选各种甘油-3-磷酸脱氢酶以确定用于进行将甘油-3-磷酸转化成磷酸二羟丙酮(DHAP)的酶促反应的最佳第一酶。在另一个实例中，可筛选各种醇脱氢酶以确定用于进行将2-戊酮转化成(+)-2S,3R-戊醇的酶促反应的最佳第一酶。在另一个实例中，可筛选各种酶以确定用于从ADP再循环ATP的最佳第二酶。在该实例中，可筛选各种ATP激酶。在另一个实例中，可筛选各种酶以确定用于从NADH再循环NAD的最佳第二酶。在该实例中，可筛选各种NADH氧化酶。在另一个实例中，可筛选各种酶以确定用于从NADPH再循环NADP的最佳第二酶。在该实例中，可筛选各种甲酸脱氢酶。
还可筛选最佳的第一和第二酶以确定用于本公开的酶复合物的最佳酶配对。例如，可使用最佳的第一和第二酶形成酶复合物，并评估酶活性。在一个实例中，最佳的酶配对为进行所需的酶促反应提供了最大酶活性。在一个实例中，最佳的酶配对为进行所需的酶促反应和辅因子再循环提供最大的酶促活性。
在一个实例中，形成本公开的酶复合物的酶当与其天然状态相比时具有基本上相似的酶活性。在其它实例中，与其天然状态相比，形成本公开的酶复合物的酶可具有降低的活性。
在一个实例中，第一酶相较于其天然状态具有至少约99％，至少约98％，至少约97％，至少约96％，至少约95％，至少约90％，至少约85％，至少约80％，至少约75％，至少约70％，至少约60％，至少约50％，至少约40％或至少约30％的活性。
在另一个实例中，第二酶与其天然状态相比具有至少约99％，至少约98％，至少约97％，至少约96％，至少约95％，至少约90％，至少约85％，至少约80％，至少约75％，至少约70％，至少约60％，至少约50％，至少约40％或至少约30％的活性。
本领域技术人员可以容易地确定形成本公开的酶复合物的附接的酶与天然状态相比时是否具有基本上相似的酶促活性或者它们的酶活性是否降低。例如，可使用酶促活性的各种量度诸如(KM)、Kcat(s-1)、Kcat/Km将附接的酶与它们的未附接的对应物进行比较。也可以在分隔例如数分钟、数小时或数天的不同时间点追踪这些量度，以监测酶促活性。
在一个实例中，可在包含底物和辅因子(例如ATP、NAD、NADP、FAD)的反应混合物中评估第一酶的酶促活性。动力学可通过改变底物或辅因子的浓度同时保持另一种过量来测定。可在包含用于再循环的辅因子(例如ADP、NADH、NADPH、FADH2)和底物的反应混合物中评估第二酶的酶促活性。可再次通过改变用于再循环的辅因子或底物的浓度同时保持另一种过量来确定动力学。辅因子的使用(例如，从ATP、NAD、NADP、FAD产生ADP、NADH、NADPH、FADH2)和再循环(例如，从ADP、NADH、NADPH、FADH2产生ATP、NAD、NADP、FAD)可使用标准技术诸如通过HPLC来测定。
作为一个实例，可在包含1mM甘油、10mM MgCl2、50mM NaHCO3缓冲液pH 9.0、1mMATP和约2μg/mL酶(35nM)的反应混合物中评估甘油激酶(第一酶)活性。动力学可通过改变ATP或甘油的浓度同时保持另一种过量来测定，并且使用Hyper软件(Easterby,J,Liverpool University)计算动力学决定因子。作为一个实例，底物和辅因子浓度可以从0.1变化至10X Km。
可经由用ADP替代ATP以及用乙酰磷酸或磷酸烯醇丙酮酸替代甘油的类似方法ATP来评估乙酸激酶(第二酶)活性。然后可通过改变ADP或乙酰磷酸或磷酸烯醇丙酮酸的浓度同时保持另一种过量来测定酶动力学。可通过HPLC来确定从ATP产生ADP，以及反之亦然。
其它酶的活性可以通过提供适当的底物和辅因子，使用类似的方法来进行评估。
辅因子
本公开的酶复合物包含栓系的辅因子。术语“辅因子”在本公开的上下文中用于涵盖酶进行酶促反应所需的化合物。在一个实例中，辅因子是有机辅因子。有机辅因子的实例包括但不限于辅酶、维生素、维生素衍生物、非维生素。示例性辅酶、维生素、维生素衍生物和非维生素示于下表2中。
表2.示例性维生素、维生素衍生物和非维生素辅因子
在一个实例中，辅因子是烟酰胺辅因子。在一个实例中，辅因子具有核糖核苷酸核心。例如，辅因子可选自由以下组成的组：ATP/ADP、NAD+/NADH、NADP+/NADPH、酰基CoA/CoA和FAD+/FADH2。在一个实例中，辅因子是ATP/ADP。在一个实例中，辅因子是NAD+/NADH。在一个实例中，辅因子是NADP+/NADPH。在一个实例中，辅因子是酰基CoA/CoA。在一个实例中，辅因子是FAD+/FADH2。
在其它实例中，辅因子是无机辅因子，诸如金属离子或铁-硫簇。例如，辅因子可以是铜、二价铁、三价铁、镁、锰、钼、镍或锌。
本领域技术人员将会理解，合适的辅因子由复合物中的第一酶决定。这是因为复合物的第一酶需要辅因子来进行酶促反应。例如，当第一酶是激酶诸如鹿儿岛热球菌甘油激酶时，合适的辅因子是ATP/ADP。在另一个实例中，当第一酶是NAD依赖性脱氢酶诸如大肠埃希氏菌甘油-3-磷酸脱氢酶或NAD依赖性黄酶诸如希瓦氏菌属黄酶时，合适的辅因子是NAD/NADH。在另一个实例中，当第一酶是NADP依赖性脱氢酶诸如嗜热脱氮地芽孢杆菌醇脱氢酶或NADP依赖性黄酶诸如枯草芽孢杆菌黄酶时，合适的辅因子是NADP/NADPH。在另一个实例中，当第一酶是果糖基氨基酸氧化酶(EC 1.5.3)时，合适的辅因子是FAD/FADH2。
在一个实例中，酶复合物包含：
i)鹿儿岛热球菌甘油激酶、耻垢分枝杆菌ATP激酶、ATP/ADP；
ii)大肠埃希氏菌甘油-3-磷酸脱氢酶、Clostridium aminoverlaricum NADH氧化酶、NAD/NADH；
iii)希瓦氏菌属黄酶、嗜热脱氮地芽孢杆菌醇脱氢酶、NAD/NADH；
iv)嗜热脱氮地芽孢杆菌醇脱氢酶、博伊丁假丝酵母甲酸脱氢酶、NADP/NADPH；或
v)枯草芽孢杆菌黄酶、博伊丁假丝酵母甲酸脱氢酶、NADP/NADPH。
本领域技术人员还应该理解，特定的酶可能需要不止一种辅因子来进行酶促反应。然而，酶复合物不需要包含由第一酶使用的每种辅因子。在一个实例中，酶复合物包含一种栓系的辅因子。在该实例中，可以根据需要在反应介质中提供额外的辅因子以供第一酶使用。
在一个实例中，酶复合物包含多种栓系的辅因子。例如，酶复合物可包含至少两种个、至少三种、至少四种辅因子。
辅因子官能化
当存在于酶复合物中时，辅因子经由系链共价连接。在一个实例中，将辅因子官能化以附接至系链。换句话说，使辅因子与促进辅因子附接至系链部分的化学部分(或辅因子加载基团)反应。将辅因子附接至系链的方法是本领域公知的(参见，例如，Buckman和Wray，1992)。在一个实例中，辅因子的核糖核苷酸核心可以用作官能化位点。例如，可以通过在N(1)-位处将NAD、NADP或FAD烷基化，然后使用水性介质通过Dimroth重排对烷基化产物进行重排来制备N6-取代的NAD、NADP或FAD。然后可将所得的官能化辅因子共价结合至酶复合物或在共价键合之前进行酶促氧化。示例性烷基化剂包括碘乙酸、丙内酯、3,4-环氧丁酸或乙烯亚胺。关于该方法的变型公开于(Buckmann等，1989)中，并且也适用于官能化辅因子。例如，可用乙烯亚胺将NAD或NADP烷基化以获得相应的N(1)-(2-氨基乙基)-NAD或N(1)-(2-氨基乙基)-NADP，随后在水性介质中重排以获得相应的N6-(2-氨基乙基)-NAD或N6-(2-氨基乙基)-NADP。还可用乙烯亚胺将FAD烷基化以获得N(1)-(2-氨基乙基)-FAD，随后在水性介质中重排以获得相应的N6-(2-氨基乙基)-FAD。
设想了其它辅因子加载基团。例如，官能化的辅因子可包含式-(CH2)nNH2的基团，其中n为2至20的整数，包含式-C2-6亚烷基-O-(CH2CH2O)o-C2-6亚烷基-NH2，其中o为1至10的整数，或包含式-O-(CH2CH2O)p-NH2的基团，其中p为1至10的整数。此类官能化的辅因子可以例如通过将合适的氯杂环-糖-磷酸化合物：
与适当的二胺化合物诸如H2N-O-(CH2CH2OCH2C H2OCH2CH2O-NH2或H2N-(CH2)3-O-(CH2CH2O)2-(CH2)3-NH2反应，然后使所得的产物与烟酰胺单核苷酸反应以产生官能化的辅因子来制备，参见例如，Cen等，Org Biomol Chem,2011,9)4)，第987-993页。
在一个实例中，辅因子通过6-AMX部分的添加而官能化。例如，6-AMX-NAD+：
在另一个实例中，辅因子官通过6-PEG-3部分的添加而官能化。例如，6-PEG3-NAD：
以下表3中显示了对辅因子的其它示例性修饰。
表3.对辅因子的示例性修饰。
各种辅因子诸如NAD/NADH、NADP/NADPH和ATP/ADP也可以经由其腺嘌呤核的卤化而官能化。在8-位处卤化的腺嘌呤衍生物与带有其它官能团诸如羧酸基团的合适的硫醇化合物(例如烟酰胺-8-(2-羧乙基硫代)腺嘌呤二核苷酸)反应，所述硫醇化合物可被偶联至各种大分子；参见，例如，U.S.4,336,188。
在另一个实例中，将可商购的辅因子栓系至本公开的酶复合物。例如，N6-2AE-NAD可从Biolog Life Science Institute,Germany购得；目录号：N 013.CAS No.:[59587-50-7]。
与辅因子反应或用于官能化辅因子的化学部分(或辅因子加载基团)可以是促进辅因子附接至系链并且不破坏其生物活性的任何部分。在一个实例中，官能化的辅因子包含含有氨基或羧酸基团的悬垂的反应性基团，由此促进通过常规化学步进行的接至系链部分的骤附。在一个实例中，官能化的辅因子是N6-2AE-NAD。
当存在于最终的酶复合物中时，辅因子加载基团可被认为形成系链的一部分。例如，在官能化的辅因子是N6-2AE-NAD(例如通过NAD与氮丙啶反应产生的)的情况下，酶复合物将包含由N6-2AE-NAD与系链部分反应产生的基团-CH2CH2-NH-。
在一些情况下，通过使具有能够与酶上或接头上的互补反应性基团反应的反应性基团的合适的辅因子-系链基团反应来制备酶复合物。此类辅因子-系链基团可通过使官能化的辅因子(例如N6-2AE-NAD)与含有多个正交反应性基团的栓系部分反应来制备。在那些实例中，系链部分上的第一反应性基团能够与官能化的辅因子反应，并且系链部分上的第二反应性基团能够与酶或接头上的反应性基团反应。在这些情况下，当存在于最终的酶复合物中时，系链可被理解为包含在辅因子与酶或接头上的附接点之间延伸的整个基团，包括辅因子加载基团的残基并且包括在酶复合物合成后系链部分的残基。
因此，官能化的辅因子中间体可通过与例如SATA(S-乙酰硫代乙酸N-琥珀酰亚胺酯)(例如SATA-PEG4-NHS)或马来酰亚胺-PEG24-NHS反应而栓系至构建体。官能化的辅因子中间体还可通过使用肽偶联剂例如8-壬烯酸经由CO2H基团栓系至构建体。聚乙二醇化的系链构建体可使用HPLC从未反应的辅因子容易地纯化，因为它们具有显著不同的滞留时间。在一个实例中，系链部分是马来酰亚胺-PEGx-NHS，即下式的基团
其中x为4至24的整数，例如，4、6、8、12、24。
下面论述各种其它合适的系链以及将它们共价附接至辅因子和/或酶复合物的实例。
在一些实例中，系链部分包含中央间隔子基团，以及包含不同反应性官能团的第一和第二反应性基团。在一个实例中，中央间隔子基团是疏水基团，例如烃基团诸如亚烷基基团。在一个实例中，中央间隔子基团是未支化的C2-18、C6-16或C8-14亚烷基基团，例如未支化的C12亚烷基基团。在一个实例中，中央间隔子基团是亲水性间隔子基团，例如PEG基团(即包含亚基-CH2CH2O-的基团)。在一个实例中，中央间隔子基团是PEG2-48、PEG2-24、PEG2-12或PEG2-6基团(即-(CH2CH2O)n-基团，其中n为在2至48、2至24、2至12或2至6的范围内的整数。存在于第一和第二反应性部分中的反应性基团的性质将取决于其各自反应伴侣的性质。例如，在官能化的辅因子包含含有氨基的悬垂的反应性基团的情况下，例如在任何酰胺偶联剂诸如铀试剂(例如TSTU)或碳二亚胺试剂(例如EDC)存在的情况下，其可与包含羧酸基团的系链部分反应。
或者，其可以直接与存在于系链部分中的活化酯基团诸如NHS酯或五氟苯基酯反应。在这种情况下，所得到的键联是酰胺键联。作为另一个实例，在官能化的辅因子包含含有羧酸基团的悬垂的反应性基团的情况下，其可以例如在酰胺偶联剂存在的情况下与包含胺基的系链部分反应。或者，官能化的辅因子可包含能够与作为系链部分的一部分存在的氨基反应的活化酯。同样地在这些情况下，所得的键联是酰胺键联。作为进一步的实例，当需要与存在于酶或接头上的巯基(例如半胱氨酸残基)反应时，存在于系链部分上的反应性基团之一可以是例如马来酰亚胺基团。
除非另有说明，否则酶复合物的组分的选择的附接点或附接至其上的附加组分不受特别的限制。然而，在一些实例中，酶和其它组分诸如辅因子和缀合模块在“选定的连接点”处附接。术语“选定的附接点”在本文中用于指复合物上的限定的反应点，其允许选择性放置和附接。
在一个实例中，系链的辅因子在酶复合物的酶上具有选择的附接点。在另一个实例中，系链的辅因子在连接酶复合物的第一与第二酶的共价附接上具有选择的附接点。在这些实例中，辅因子选择的附接点允许辅因子被第一酶使用，并且被第二酶再循环。
在一个实例中，所选择的附接点是半胱氨酸、苏氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、丝氨酸或赖氨酸氨基酸残基。在另一个实例中，所选择的附接点是可与辅因子栓系的非天然氨基酸类似物。在另一个实例中，所选择的附接点是半胱氨酸、苏氨酸、丝氨酸或赖氨酸残基。本领域已知用于选择性地将辅因子栓系至半胱氨酸、苏氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、丝氨酸或赖氨酸氨基酸残基的各种方法。最合适的方法将取决于系链的组成和目标氨基酸残基。系链残基的示例性附接点包括游离巯基基团诸如半胱氨酸的那些巯基、游离羟基基团诸如丝氨酸或苏氨酸的那些羟基，甘氨酸的胺基团或谷氨酰胺的酰胺基团。
在一个实例中，栓系的辅因子的选择的附接点是酶复合物的半胱氨酸残基。在一个实例中，第一和第二酶通过包含半胱氨酸残基的接头共价附接，并且所栓系的辅因子的选择的附接点是接头的半胱氨酸残基。可使用硫醇反应性化学物质诸如马来酰亚胺反应性化学物质将栓系的辅因子共价附接至半胱氨酸残基上。简言之，为栓系的辅因子提供游离马来酰亚胺基团，例如如上所述。然后使用还原剂诸如三(2-羧基乙基)膦(TCEP)切割酶复合物的天然二硫键以产生游离的巯基基团，其可通过硫醚键与游离的马来酰亚胺交联(在pH 6.5与7.5之间)。各种马来酰亚胺交联试剂盒可商购获得(例如ThermoFisherScientific)。
在另一个实例中，栓系的辅因子可经由O-连接的糖基化选择性地连接至丝氨酸或苏氨酸。在另一个实例中，可经由转谷氨酰胺酶(EC2.3.2.13)反应来选择性附接栓系的辅因子，其中转谷氨酰胺酶催化附接至“接头”或“系链”的游离胺基团(例如，蛋白质-或肽-结合的赖氨酸)与蛋白质-或肽-结合的谷氨酰胺的侧链末端的酰基之间的异肽键形成。本公开的系链与酶复合物的化学和/或酶促偶联的其它实例公开于例如在WO/1987/005330以及Aplin和Wriston(1981)中。
共价附接
术语“接头”和“系链”在本公开的上下文中用来指酶复合物的组分之间的共价附接。在一个实例中，酶复合物可包含不止一个接头。例如，酶复合物可具有用于连接各种组分的第一、第二、第三、第四或第五接头。例如，酶复合物可包含经由第一接头附接的第一和第二酶以及经由第二接头附接的缀合模块。在一个实例中，酶复合物还可包含不止一个系链。例如，酶复合物可具有用于附接多个辅因子的第一、第二、第三、第四或第五系链。
在一个实例中，第一酶与第二酶经由接头共价附接，并且辅因子经由系链共价附接。在一个实例中，缀合模块经由接头共价附接至酶复合物。
接头或系链基本上是含有官能团或可被官能化的基团的任何生物相容性分子。
在一个实例中，将辅因子共价附接至复合物的系链的长度允许辅因子被第一酶使用并被第二酶再循环。可使用实现上述功能的任何合适的系链。系链的实例包括包含烃链(例如，未支化的亚烷基部分)、肽链、PEG型或其它聚醚型基团以及其它聚合基团(诸如聚羟基酸)的那些系链。在一个实例中，系链由将辅因子连接至接头或酶的原子链组成，链由40至500个、40至400个、40至300个、40至200个、40至100个、40至50个、50至500个、50至400个、50至300个、50至200个或50至100个原子组成。例如，下式的系链：
例如其中使用的官能化的辅因子是N6-2AE-NAD，所使用的系链部分是马来酰亚胺-PEG4-NHS，并且系链通过半胱氨酸侧链巯基基团附接至接头，由将辅因子连接至接头的72个原子组成。
在一个实例中，接头或系链包含烃类(例如，中央间隔子基团可以是亚烷基基团)(支化或未支化的)，并且所述烃类具有在C2-C25、C2-C20、C2-C15、C2-C10、C2-C9、C2-C8、C2-C7、C2-C6、C2-C5、C2-C4或至少C2、至少C3、至少C4、至少C5、至少C6、至少C7、至少C8、至少C9、至少C10的范围内的链长度。在一个实例中，接头或系链包含支化或未支化的C10-C25、C10-C20或C10-C15烃基团。在一个实例中，接头或系链包含支化或未支化的C15-C50、C15-C25或C15-C20烃基团。在一个实例中，接头或系链包含支化或未支化的C20-C50或C20-C25烃基团。在一个实例中，接头或系链包含支化或未支化的C25-C50烃基团。在一个实例中，接头或系链包含醚或聚醚(例如聚环氧乙烷或聚环氧丙烷)，例如，中央间隔子基团可以是如上所述的PEG基团。在一个实例中，接头或系链可包含由1-10个、1-5个、1-3个或至少2个聚环氧乙烷单元或聚环氧丙烷单元组成的醚或聚醚。
在一个实例中，接头或系链是多元醇(支化或未支化的)诸如聚二醇或聚乙二醇(PEG)及其衍生物，诸如例如O,O'-双(2-氨基丙基)-聚乙二醇500和2,2'-(二氧化乙烯)-二乙基胺。例如，接头或系链可以包含PEGn，其中n为PEG单元的数目。如本文中所提及的，并且如上所示的，PEG基团是基于亚基-(CH2CH2O)-上的基团，即术语PEGn是指-(CH2CH2O)n-的基团。
例如，接头或系链可包含具有PEG2-PEG500,PEG2-PEG400,PEG2-PEG300,PEG2-PEG200,PEG2-PEG100,PEG2-PEG50,PEG2-PEG25,PEG2-PEG20,PEG2-PEG15,PEG2-PEG10,PEG2-PEG9,PEG2-PEG8,PEG2-PEG7,PEG2-PEG6,PEG2-PEG5,PEG2-PEG4或至少PEG2、至少PEG3、至少PEG4、至少PEG5、至少PEG6、至少PEG7、至少PEG8、至少PEG9、至少PEG10的链长度的PEGn。在另一个实例中，接头或系链是包含1-500个、1-400个、1-300个、1-200个、1-100个、1-50个、1-25个、1-20个、1-15个、1-10个、1-9个、1-8个、1-7个、1-6个、1-5个、1-4个、1-3个或至少2个单体单元的聚氨酯、多羟基酸、聚碳酸酯、聚酰亚胺、聚酰胺、聚酯、聚砜。
在另一个实例中，接头或系链包含氨基酸或氨基酸链或肽。例如，接头或系链可包含在1-100个、1-75个、1-50个、1-25或至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个、至少21个、至少22个、至少23个、至少24个、至少25个、至少26个、至少27个、至少28个、至少29个、至少30个、至少35个、至少40个、至少45个、至少50个、至少55个、至少60个、至少65个、至少70个、至少75个、至少80个、至少85个、至少90个、至少95个、至少100个氨基酸残基范围内的序列。
在一个实例中，接头或系链可包含二肽、三肽、四肽、五肽等。
在一个实例中，氨基酸接头或系链的组分是L氨基酸。例如，接头或系链可包含Cys、Thr、Glu、Gly、Ser或Lys氨基酸残基。
在一个实例中，接头或系链包含Gly和Ser。例如，接头或系链可包含GlySerSer或GlySerSer重复序列(GlySerSern)。例如，接头或系链可包含GlySerSern，其中n＝1，n＝2，n＝3，n＝4，n＝5，n＝6，n＝7，n＝8，n＝9，n＝10，n＝11，n＝12，n＝13，n＝14，n＝15，n＝16，n＝17，n＝18，n＝19，n＝20，n＝21，n＝22，n＝23，n＝24，n＝25，n＝26，n＝27，n＝28，n＝29，n＝30。
在另一个实例中，接头或系链可包含GlySerSern-X-GlySerSern，其中n＝1，n＝2，n＝3，n＝4，n＝5，n＝6，n＝7，n＝8，n＝9，n＝10，n＝11，n＝12，n＝13，n＝14，n＝15，n＝16，n＝17，n＝18，n＝19，n＝20，n＝21，n＝22，n＝23，n＝24，n＝25，n＝26，n＝27，n＝28，n＝29，n＝30，X是Cys、Thr、Glu或Lys。
在另一个实例中，接头或系链可包含GlySerSern-XY-GlySerSern，其中n＝1，n＝2，n＝3，n＝4，n＝5，n＝6，n＝7，n＝8，n＝9，n＝10，n＝11，n＝12，n＝13，n＝14，n＝15，n＝16，n＝17，n＝18，n＝19，n＝20，n＝21，n＝22，n＝23，n＝24，n＝25，n＝26，n＝27，n＝28，n＝29，n＝30，X为Cys、Thr、Glu或Lys，并且Y＝任意氨基酸。
在另一实例中，接头或系链可包含GlySerSern-X(Ya)-GlySerSern，其中n＝1，n＝2，n＝3，n＝4，n＝5，n＝6，n＝7，n＝8，n＝9，n＝10，n＝11，n＝12，n＝13，n＝14，n＝15，n＝16，n＝17，n＝18，n＝19，n＝20，n＝21，n＝22，n＝23，n＝24，n＝25，n＝26，n＝27，n＝28，n＝29，n＝30，X为Cys，Thr，Glu或Lys，Y＝任意氨基酸或氨基酸的组合，并且a＝2，a＝3，a＝4，a＝5，a＝6，a＝7，a＝8，a＝9，a＝10，a＝11，a＝12，a＝13，a＝14，a＝15，a＝16，a＝17，a＝18，a＝19，a＝20，a＝21，a＝22，a＝23，a＝24，a＝25，a＝26，a＝27，a＝28，a＝29，a＝30。
在一个实例中，缀合模块经由包含GlySer或GlySer重复序列(GlySern)的接头附接。例如，接头包含GlySern，其中n＝1，n＝2，n＝3，n＝4，n＝5，n＝6，n＝7，n＝8，n＝9，n＝10，n＝11，n＝12，n＝13，n＝14，n＝15，n＝16，n＝17，n＝18，n＝19，n＝20，n＝21，n＝22，n＝23，n＝24，n＝25，n＝26，n＝27，n＝28，n＝29，n＝30。
在另一个实例中，缀合模块经由包含GlySern-Xa-GlySern的接头附接，其中n＝1，n＝2，n＝3，n＝4，n＝5，n＝6，n＝7，n＝8，n＝9，n＝10，n＝11，n＝12，n＝13，n＝14，n＝15，n＝16，n＝17，n＝18，n＝19，n＝20，n＝21，n＝22，n＝23，n＝24，n＝25，n＝26，n＝27，n＝28，n＝29，n＝30，a＝2，a＝3，a＝4，a＝5，a＝6，a＝7，a＝8，a＝9，a＝10，a＝11，a＝12，a＝13，a＝14，a＝15，a＝16，a＝17，a＝18，a＝19，a＝20，a＝21，a＝22，a＝23，a＝24，a＝25，a＝26，a＝27，a＝28，a＝29，a＝30，并且X为任意氨基酸或氨基酸的组合。
在其它实例中，接头或系链可包含选自L-氨基酸、D-氨基酸或β-氨基酸的氨基酸。例如，接头或系链可以包含β-肽。
在一个实例中，接头或系链可包含选自由以下组成的组的分子：硫代氨基酸、羟基酸、巯基酸、二羧酸、二胺、二硫代碳酸、酸和胺。在另一个实例中，接头或系链包含衍生的氨基酸序列或肽核酸(PNA)。
在另一个实例中，接头或系链包含一个或多个核酸。例如，核酸接头或系链具有1-100个、1-75个、1-50个、1-25个或至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个、至少21个、至少22个、至少23个、至少24个、至少25个、至少26个、至少27个、至少28个、至少29个、至少30个、至少35个、至少40个、至少45个、至少50个、至少55个、至少60个、至少65个、至少70个、至少75个、至少80个、至少85个、至少90个、至少95个、至少100个核酸残基的长度。
在一个实例中，接头或系链是上文引用的组分的组合。
在一个实例中，酶复合物包含各自共价附接至接头的第一酶和第二酶，以及经由本身附接至接头的系链共价附接的辅因子，其中接头包含氨基酸序列，系链包含选自由以下组成的组的系链部分：烃链(例如支化或未支化的亚烷基部分)、氨基酸序列或PEG或其它聚醚基团，并且将辅因子通过辅因子加载基团/辅因子官能化基团连接至系链部分。
用于制备上文提及的“接头”和“系链”并将其附接至多肽(诸如酶、化合物或辅因子)的许多方法是本领域已知的并且适用于本公开。
在一个实例中，使用合适的交联官能团将“接头”和“系链”附接到多肽。示例性多肽官能团包括伯胺(-NH2)、羧基(-COOH)、巯基(-SH)、羰基(-CHO)。用于使胺基基团与羧基基团反应的示例性试剂包括但不限于碳二亚胺试剂(例如EDC、HOSu/DCC)、鏻试剂(例如，PyBOP、PyBrOP、铀试剂(例如，TSTU、COMU)、咪唑鎓试剂(例如CDI)、经由混合的碳酸酐的氯甲酸酯、通过用氯化试剂活化羧酸产生的酰氯。在一些情况下，反应配伴侣之一可含有能够与胺反应形成酰胺(诸如NHS-酯、五氟苯基酯、对硝基苯基酯、羟甲基膦基团或亚氨基酯)的活化羧基。
能够与巯基基团反应的合适的交联官能团的实例包括马来酰亚胺、卤代乙酰(溴代或碘代)、乙烯砜、吡啶基二硫化物、硫代磺酸酯异氰酸酯和环氧化物基团。
能够与醛基反应的合适的交联官能团的实例包括胺、酰肼和烷氧基胺。反应性交联基团的其它实例包括双吖丙啶(diazirines)、芳基叠氮化物和异氰酸酯。
在另一个实例中，可使用各种“点击化学”策略(诸如Kolb等(2001)、WO 2003/101972、Malkoch等(2005)、Li等(2009)和Gundersen等(2014)中公开的那些策略)对“接头”和“系链”进行官能化和附接。
在另一个实例中，可通过如上所论述的转谷氨酰胺酶反应附接“接头”和“系链”。
缀合
可将本公开的酶复合物缀合至固体支撑物。可将缀合至固体支撑物的酶复合物共价附接、非共价附接和/或固定至支撑物。缀合的酶复合物相对于支撑物保持构象可移动。术语“构象可移动”用于指这样的酶复合物，其在支撑物上具有相对固定位置，但在此类固定位置中是可移动的，以能够围绕其固定位置旋转以采取进行酶促反应所需的栓系的辅因子和底物或底物的选择可接近的构象。
在一个实例中，可将本公开的酶复合物经由缀合模块缀合至支撑物。术语“缀合模块”在本公开的上下文中用于指可与支撑物反应或催化剂与支撑物的反应以将酶复合物缀合至支撑物的组分。
在一个实例中，缀合模块是蛋白质。例如，缀合模块可以是豆酯酶、链霉亲和素、生物素、金属结合蛋白、纤维素结合蛋白、麦芽糖结合蛋白、聚组氨酸、抗体或其抗原结合片段。
在一个实例中，缀合模块可以是酶。缀合模块可以是可与抑制剂形成共价中间体的任何酶(参见，例如Huang等，2007)。合适的抑制剂将取决于选择作为缀合模块的酶并且可通过常规筛选来鉴定。在(Williams和Morrison,1979；Murphy,2004)中综述了适用于筛选抑制剂的各种方法。在一个实例中，合适的抑制剂将紧密地结合于酶缀合模块。紧密结合的酶抑制剂是对于其的结合常数KI处于筛选测定中所用的酶的浓度[E]0或低于该浓度的那些抑制剂。紧密结合抑制剂的KI可使用各种方法来计算。例如，紧密结合抑制剂的KI可从由剂量-反应曲线的图形分析确定的IC50值直接计算(Copeland,1995)。
在一个实例中，缀合模块可以是脂肪酶、酯酶、谷胱甘肽S-转移酶或丝氨酸-水解酶。
在一个实例中，复合物包含：
i)鹿儿岛热球菌甘油激酶、耻垢分枝杆菌ATP激酶、ATP/ADP；或；
ii)大肠埃希氏菌甘油-3-磷酸脱氢酶、Clostridium aminoverlaricum NADH氧化酶、NAD/NADH；或；
iii)希瓦氏菌黄酶、嗜热脱氮地芽孢杆菌醇脱氢酶、NAD/NADH；或
iv)嗜热脱氮地芽孢杆菌醇脱氢酶、博伊丁假丝酵母甲酸脱氢酶、NADP/NADPH；或
v)枯草芽孢杆菌黄酶、博伊丁假丝酵母甲酸脱氢酶、NADP/NADPH；
和脂肪酶、酯酶、谷胱甘肽S-转移酶或丝氨酸-水解酶。因此，在该实例中，缀合模块可以是酯酶。
在一个实例中，缀合模块是使得能够进行至具有共价附接的三氟酮的支撑物的缀合的酶。
各种含三氟酮的分子是本领域已知的。在一个实例中，使1-己硫醇与1-溴-3,3,3-三氟丙酮反应，以提供己基三氟酮抑制剂。
在一个实例中，缀合模块是来自嗜酸脂环酸杆菌(Alicyclobacillusacidophilus)的酯酶2(参见，例如Manco等,1998)。
在一个实例中，复合物包含：
i)鹿儿岛热球菌甘油激酶、耻垢分枝杆菌ATP激酶、ATP/ADP、嗜酸脂环酸杆菌酯酶；或
ii)大肠埃希氏菌甘油-3-磷酸脱氢酶、Clostridium aminoverlaricum NADH氧化酶、NAD/NADH、嗜酸脂环酸杆菌酯酶；或；
iii)希瓦氏菌属黄酶、嗜热脱氮地芽孢杆菌醇脱氢酶、NAD/NADH；嗜酸脂环酸杆菌酯酶；或
iv)嗜热脱氮地芽孢杆菌醇脱氢酶、博伊丁假丝酵母甲酸脱氢酶、NADP/NADPH；嗜酸脂环酸杆菌酯酶；或
v)枯草芽孢杆菌黄酶、博伊丁假丝酵母甲酸脱氢酶、NADP/NADPH；嗜酸脂环酸杆菌酯酶。
在一个实例中，缀合模块是非蛋白质的。例如，缀合模块可包含具有游离反应性基团的各种有机或无机分子。例如，缀合模块可以是接头或系链上的功能性部分或基团。在一个实例中，缀合模块是酶抑制剂如三氟酮。
本领域技术人员将会理解，将基于支撑物的组成来选择缀合模块。例如，将选择麦芽糖结合蛋白作为用于将酶复合物缀合至包含麦芽糖的支撑物的缀合模块。在另一个实例中，将选择纤维素结合蛋白作为用于将酶复合物缀合至包含纤维素的支撑物的缀合模块。在另一个实例中，将选择酯酶作为用于将酶复合物缀合至包含酶抑制剂诸如三氟酮的支撑物的缀合模块。在另一个实例中，将选择酶抑制剂诸如三氟酮作为用于将酶复合物缀合至包含酯酶的支撑物的缀合模块。
在一个实例中，将缀合模块共价附接至酶复合物。在一个实例中，将缀合模块共价附接至第一或第二酶。
固体支撑物
可将本公开的酶复合物缀合至可用作支撑物的任何官能化或可官能化的材料。此类材料可以例如作为支撑物板(单块)、膜、薄膜或层压板在。在一个实例中，支撑物是多孔的或无孔的。
在一个实例中，支撑物包含无机或有机材料。用于支撑物的示例性材料包括聚烯烃，诸如，例如聚乙烯、聚丙烯、卤化聚烯烃(PVDF、PVC等)、聚四氟乙烯和聚丙烯腈。在其它实例中，用于支撑物的材料包括陶瓷、硅酸盐、硅和玻璃。在其它实例中，用于支撑物的材料包括金属材料，诸如金或金属氧化物，诸如氧化钛。
在一个实例中，本发明的酶复合物缀合至其上的反应性表面与支撑物材料不同。例如，形成(平面)反应性表面的材料以薄膜形式存在，然后将其涂至另外的基底支撑物材料(例如用于稳定化)。
在一个实例中，支撑物至少包含适合与本发明的酶复合物实现共价键合的第一官能化位点或基团。例如，支撑物可包含反应性氨基和/或羧基基团。例如，支撑物可包含游离的伯羟基基团。在一个实例中，可在支撑物上提供多个连续的官能化位点或基团。在该实例中，可将多个酶复合物附接至支撑物。
在另一个实例中，可将本公开的酶复合物经由不止一个官能化的位点或基团缀合至支撑物。在该实例中，支撑物包含第一官能化的位点或基团和另外官能化的位点或基团，诸如第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九或第十官能化的位点或组，以将单一酶复合物附接至支撑物。
在一个实例中，支撑物呈膜的形式，诸如混合的基质膜、中空纤维、编织纤维、颗粒床、纤维垫、珠粒或凝胶。例如，支撑物可呈琼脂糖、琼脂糖珠粒、棉、碳纤维、石墨烯或丙烯酰胺的形式。
支撑物的表面可通过本领域的各种方法官能化。最合适的方法将取决于支撑材料的组成或至少支撑物的表面。例如，具有可用于化学修饰的伯羟基的棉、琼脂糖或其它支撑物可使用商购可得的交联剂诸如乙烯砜(VS)，例如二乙烯砜(DVS)进行官能化。或者，加载有高密度反应性基团的支撑物是商购可得的。实例包括来自供应商诸如Sigma-Aldrich的DVS活化的珠粒或琼脂糖。利用羟基在表面上官能化支撑物的其它实例包括利用双亲电子试剂的反应，诸如，例如利用溴乙酸的直接羧甲基化；利用相应的氨基酸衍生物的酰化，诸如，例如二甲基氨基吡啶催化的碳二亚胺与芴基甲氧基羰基-3-氨基丙酸的偶联，或通过用相应的双-异(硫代)氰酸酯单次转化进行的异(硫代)氰酸酯的生成。在另一个实例中，从作为提供支撑表面的材料的聚烯烃开始，可通过利用铬酸的氧化或者，例如，通过利用草酰氯的高压反应、等离子体氧化或自由基或光诱导的丙烯酸的添加来提供羧基。
陶瓷、玻璃、氧化硅和氧化钛可使用商购可得的取代的硅烷类例如氨基丙基三乙氧基硅烷来简单地官能化。
在一个实例中，可将酶复合物非共价缀合至支撑物。例如可通过疏水性包埋其来非共价缀合酶复合物，使得所述酶相对于流动的含水底物流是静止。
在该实例中，合适的缀合的支撑物包含惰性颗粒材料，例如二氧化硅颗粒，每个颗粒具有多个膜元件。疏水性的酶优先使其本身位于膜元件的疏水部分之间，而不是迁移至流动的水流中。
US 4,927,879和4,931,498中描述了适用于根据本公开的酶复合物的非共价缀合的实例。可从二氧化硅、铝、二氧化钛或从具有必要的物理完整性的树脂形成用于非共价缀合的其它合适的支撑物结构。
产生酶复合物
本公开的酶复合物可包含各种“多肽”组分，包括例如酶、缀合模块和各种其它多肽附着物，诸如接头和系链。在一个实例中，可分别产生或从商业供应商获得酶复合物的组分，然后将其共价附接以形成酶复合物。
多肽组分可以以多种方式产生，包括天然多肽的产生和回收、重组多肽的产生和回收以及多肽的化学合成。在一个实例中，分离的多肽组分(例如酶)可通过在有效产生多肽的条件下培养能够表达所述多肽的细胞并回收所述多肽来产生。
在另一个实例中，可一起产生酶复合物的多个组分。例如，本公开的酶复合物可通过在宿主细胞或无细胞表达系统中表达编码包含第一酶和第二酶的嵌合蛋白的多核苷酸来产生。然后可经由系链将辅因子附接至嵌合蛋白。在另一个实例中，表达的多核苷酸也编码分离第一酶与第二酶的接头。在该实例中，随后可将辅因子栓系至接头。在另一个实例中，表达的多核苷酸也编码缀合模块。可将所得的酶复合物附接至固体支撑物。
在文中论述了能够表达多肽诸如嵌合蛋白的各种示例性细胞。在一个实例中，有能力的细胞已用编码多肽组分的多核苷酸转化。如本文所用，“转化的”或“转化”是通过多核苷酸的整合在细胞中获得新基因。
术语“多核苷酸”在本文中可与术语“核酸”可互换使用。“多核苷酸”是指寡核苷酸、核酸分子或其任何片段。其可以是基因组或合成来源的DNA或RNA(双链或单链的)。合适的多核苷酸也可以编码分泌信号，诸如信号肽(即信号区段核酸序列)，以使表达的多肽能够从产生多肽的细胞分泌。合适的信号区段的实例包括组织纤溶酶原激活子(t-PA)、干扰素、白细胞介素、生长激素、病毒包膜糖蛋白信号区段、烟草蜜蛋白(Nicotiana nectarin)信号肽(US 5,939,288)、烟草伸展蛋白信号、大豆油质蛋白油体结合蛋白信号、拟南芥(Arabidopsis thaliana)液泡碱性壳多糖酶信号肽以及天然信号序列。另外，多核苷酸可编码间插和/或非翻译序列。
术语“多肽”和“蛋白质”通常可互换使用，是指可以或不可以通过添加非氨基酸基团或其它组分(诸如栓系的辅因子)来修饰的单一多肽链。如本文中所用，术语“蛋白质”和“多肽”还包括如本文所述的本公开的多肽的变体、突变体、修饰、类似物和/或衍生物。例如，酶复合物可包含由本公开所涵盖的酶的变体、突变体、修饰、类似物和/或衍生物。在一个实例中，与其天然存在的对应物相比，这些酶可具有改变的活性。
可使用本领域已知的任何技术来制备突变体(改变的)多肽。例如，可将编码本公开所涵盖的酶的多核苷酸进行体外诱变。此类体外诱变技术包括将多核苷酸亚克隆至合适的载体中，将载体转化至“增变株”菌株，诸如大肠埃希氏菌XL-1红(Stratagene)，并使转化的细菌繁殖适当的代数。在另一个实例中，将本公开的多核苷酸经历如由Harayama(1998)广泛描述的DNA改组技术。可使用本文所述的技术容易地筛选衍生自突变/改变的DNA的产物，以确定它们是否可用于本公开的酶复合物中。
在设计氨基酸序列突变体时，突变位点的位置和突变的性质将取决于待修饰的一个或多个特征。可以例如通过(1)首先用保守氨基酸选择取代，然后根据所获得的结果用更激进的选择取代，(2)缺失靶残基，或者(3)在所在的位置相邻处插入其它残基来修饰用于突变的位点。
氨基酸序列缺失通常在约1至15个残基，更优选约1至10个残基，通常约1至5个连续残基的范围内。
取代突变体在多肽分子中除去了至少有一个氨基酸残基，并在其位置插入不同的残基。对于取代诱变最感兴趣的位点包括被鉴定为功能上重要的位点。其它感兴趣的位点是其中获自各种菌株或物种的特定残基是相同的那些位点。这些位置对于生物活动可能是重要的。这些位点，尤其是落在具有至少三个其它相同保守位点的序列内的那些位点，优选以相对保守的方式取代。此类保守取代示于表4中的“示例性取代”的标题之下。
表4.示例性取代
原始残基 示例性取代
Ala(A) val；leu；ile；gly；cys；ser；thr
Arg(R) lys
Asn(N) gln；his
Asp(D) glu
Cys(C) Ser；thr；ala；gly；val
Gln(Q) asn；his
Glu(E) asp
Gly(G) pro；ala；ser；val；thr
His(H) asn；gln
Ile(I) leu；val；ala；met
Leu(L) ile；val；met；ala；phe
Lys(K) arg
Met(M) leu；phe
Phe(F) leu；val；ala
Pro(P) gly
Ser(S) thr；ala；gly；val；gln
Thr(T) ser；gln；ala
Trp(W) tyr
Tyr(Y) trp；phe
Val(V) ile；leu；met；phe；ala；ser；thr
多核苷酸可使用合适的重组表达载体来表达。例如，编码上述多肽组分的多核苷酸可以可操作地连接至表达载体。短语“可操作地连接的”是指以这样的方式将多核苷酸分子插入表达载体，使得分子能够在转化入宿主细胞中时被表达。通常，该短语是指转录调控元件与转录序列的功能性关系。例如，如果启动子在合适的宿主细胞中刺激或调控编码序列的转录，则其可操作地连接至编码序列。通常，与转录序列可操作地连接的启动子转录调控元件与转录的序列物理连续，即它们是顺式作用。然而，一些转录调控元件，诸如增强子，不必与它们可增强其转录的编码序列物理连续，或者位于所述编码序列附近。
如本文中所用，表达载体是能够转化宿主细胞并实现特定多核苷酸分子的表达的DNA或RNA载体。优选地，表达载体也能够在宿主细胞内复制。表达载体可以是原核生物或真核生物的，并且通常是病毒或质粒。合适的表达载体包括在重组细胞中(包括在细菌、真菌、内寄生物、节肢动物、动物和植物细胞中)发挥功能(即指导基因表达)的任何载体。本公开的载体也可用于在无细胞表达系统中产生多肽组分，此类系统在本领域是公知的。
合适的载体可含有异源多核苷酸序列，即并非天然地被发现与编码上述多肽的多核苷酸序列相邻的多核苷酸。载体可以是RNA或DNA(原核生物或真核生物)，并且通常是转座子(诸如US 5,792,294中所述)、病毒或质粒。
合适的表达载体还可含有调控序列，诸如转录控制序列、翻译控制序列、复制起始点以及与重组细胞相容并且控制指定的多核苷酸分子表达的其它调控序列。转录控制序列是控制转录起始、延伸和终止的序列。特别重要的转录控制序列是控制转录起始的那些序列，诸如启动子、增强子、操纵子和阻遏子序列。多种合适的转录控制序列是本领域技术人员已知的。实例包括在细菌、酵母、节肢动物、植物或哺乳动物细胞中起作用的转录控制序列，诸如但不限于tac、lac、trp、trc、oxy-pro、omp/lpp、rrnB、噬菌体λ、噬菌体T7、T7lac、噬菌体T3、噬菌体SP6、噬菌体SP01、金属硫蛋白、α-交配因子、毕赤酵母属(Pichia)醇氧化酶、甲病毒亚基因组启动子(诸如辛德毕斯病毒(Sindbis virus)亚基因组启动子、抗生素抗性基因、杆状病毒、谷实夜蛾(Heliothis zea)昆虫病毒、痘苗病毒(vaccinia virus)、疱疹病毒(herpesvirus)、浣熊痘病毒(raccoon poxvirus)、其它痘病毒(poxvirus)、腺病毒(adenovirus)、巨细胞病毒(cytomegalovirus)(例如中间早期启动子)、猿猴病毒40(simian virus 40)、逆转录病毒、肌动蛋白、逆转录病毒长末端重复序列、劳斯肉瘤病毒(Rous sarcoma virus)、热休克蛋白、磷酸盐和硝酸盐转录控制序列以及能够在原核或真核细胞中控制基因表达的其它序列。
适于制备本公开的酶复合物的组分的宿主细胞包括用编码所述酶复合物的组分的一种或多种多核苷酸转化的重组细胞或其后代细胞。多核苷酸分子至细胞内的转化可通过可籍以将多核苷酸分子插入细胞的任何方法来实现。转化技术包括但不限于转染、电穿孔、显微注射、脂转染、吸附和原生质体融合。转化的多核苷酸分子可保留在染色体外或可以以保留其被表达的能力的方式整合至转化的(即，重组的)细胞的染色体内的一个或多个位点中。
适合转化的宿主细胞包括可用编码酶复合物的多肽组分的多核苷酸转化的任何细胞。合适的宿主细胞可以内源地(即天然地)能够产生酶复合物的多肽组分，或者可以能够在用至少一个编码所述组分的多核苷酸分子转化后产生此类多肽。合适的宿主细胞包括细菌、真菌(包括酵母)、寄生虫、节肢动物、动物和植物细胞。宿主细胞的实例包括沙门氏菌属(Salmonella)、埃希氏菌属(Escherichia)、芽孢杆菌属(Bacillus)、李斯特菌属(Listeria)、酵母属(Saccharomyces)、斜纹夜蛾属(Spodoptera)、分枝杆菌属(Mycobacteria)、粉纹夜蛾属(Trichoplusia)、BHK(幼仓鼠肾)细胞、MDCK细胞、CRFK细胞、CV-1细胞、COS(例如，COS-7)细胞和Vero细胞。宿主细胞的其它实例是大肠埃希氏菌，包括大肠埃希氏菌K-12衍生物；伤寒沙门氏菌(Salmonella typhi)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)(包括减毒株)、草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)、粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)和非致瘤性小鼠成肌细胞G8细胞(例如，ATCC CRL 1246)。合适的哺乳动物宿主细胞包括其它肾细胞系、其它成纤维细胞系(例如，人、鼠或鸡胚成纤维细胞系)、骨髓瘤细胞系、中国仓鼠卵巢细胞、小鼠NIH/3T3细胞、LMTK细胞和/或HeLa细胞。
用于增加本公开的多核苷酸分子表达的重组技术包括但不限于将多核苷酸分子可操作地连接至高拷贝数质粒，多核苷酸分子至一个或多个宿主细胞染色体的整合、向质粒添加载体稳定性序列粒、转录控制信号(例如，启动子、操纵子、增强子)的取代或修饰、翻译控制信号(例如，核糖体结合位点，Shine-Dalgarno序列)的取代或修饰、本公开的多核苷酸分子的修饰(以对应于宿主细胞的密码子使用)，以及使转录物不稳定的序列的缺失。
有效的培养条件包括但不限于允许多肽产生的有效培养基、生物反应器、温度、pH和氧气条件。有效的培养基是指将细胞在其中细胞以产生本公开的多肽的任何培养基。此类培养基通常包含具有可同化的碳源、氮源和磷源以及适当的盐、矿物质、金属和其它营养物质诸如维生素的含水介质。可将细胞在常规发酵生物反应器、摇瓶、试管、微量滴定皿和陪替平皿中培养。培养可以在适合于重组细胞的温度、pH和氧含量下进行。此类培养条件在本领域普通技术人员的专业知识范围内。
用途
本公开的酶复合物可用于任何辅因子依赖性生物催化合成中。实例包括烯醇还原、手性胺合成，以及仲醇、DHAP和药物诸如米格列醇、其前体诸如CBZ保护的氨基己酮糖磷酸或抗糖尿病药物D-呋喃胺或其前体氨基环醇的产生。
在一个实例中，将本公开内容的酶复合物与第一酶的底物在足以使第一酶将底物转化成产物并且第二酶再循环辅因子的条件下一起孵育一定时间。
在一个实例中，包含激酶(诸如甘油激酶)和ATP再循环酶(诸如具有栓系的ATP/ADP的ATP激酶)的酶复合物用于催化甘油转化成甘油-3-磷酸。在另一个实例中，包含NAD依赖性脱氢酶(诸如甘油-3-磷酸脱氢酶)和NAD再循环酶(诸如具有栓系的NAD/NADH的NADH氧化酶)的酶复合物用于催化甘油-3-磷酸至DHAP的转化。在另一个实例中，包含括老黄酶诸如希瓦氏菌黄酶和NAD再循环酶诸如具有栓系的NAD/NADH的嗜热脱氮地芽孢杆菌醇脱氢酶的酶复合物，用于烯酸酯还原，催化酮基异佛尔酮至6R-左旋二酮的转化。在另一个实例中，使用包含NADP依赖性脱氢酶(诸如嗜热脱氮地芽孢杆菌醇脱氢酶)和NADP再循环酶(诸如具有栓系的NADP/NADPH的博伊丁假丝酵母甲酸脱氢酶)的酶复合物来产生手性仲醇，催化2-戊酮催化至(+)-2S,3R-戊醇的转化。在另一个实例中，包含老黄酶诸如枯草芽孢杆菌黄酶和NAD再循环酶诸如具有栓系的NAD/NADH的博伊丁假丝酵母甲酸脱氢酶的酶复合物用于手性胺产生，催化2-氧代酸的转化(例如2-氧代-甲基戊酸至D-BCAA(例如D-亮氨酸))。
在其它实例中，将本公开的酶复合物组合以进行多重反应。例如，可将酶复合物用于包含两个或更多个酶促步骤的方法中，其中所述酶促步骤中的至少两个步骤使用本公开的两种不同的酶复合物来进行。
例如，将包含甘油激酶和具有栓系的ATP/ADP的ATP激酶的第一酶复合物与另外的包含甘油-3-磷酸脱氢酶和具有栓系的NAD/NADH的NADH氧化酶的酶复合物偶联。在该实例中，第一酶复合物催化甘油至甘油-3-磷酸的转化，并且另一个酶复合物催化甘油-3-磷酸至DHAP的转化。
在其它实例中，将本公开的酶复合物与其它酶组合。
在各种实例中，另一种酶是半乳糖氧化酶，诸如半乳糖氧化酶变体(GOM3-5)和/或醛缩酶，诸如肉葡萄球菌(Staphylococcus carnosus)醛缩酶(ScFruA)或嗜钙栖热菌醛缩酶、大肠埃希氏菌塔格糖-二磷酸醛缩酶(EcTagA)、大肠埃希氏菌果糖-1-磷酸醛缩酶(EcFucA)或大肠埃希氏菌鼠李糖-1-磷酸醛缩酶(EcRhuA)。
例如，将包含甘油激酶和具有栓系的ATP/ADP的ATP激酶的第一酶复合物与另外的包含甘油-3-磷酸脱氢酶和具有栓系的NAD/NADH的NADH氧化酶以及醛缩酶(诸如ScFruA、EcTagA、EcFucA或EcRhuA)的酶复合物偶联。在该实施例中，第一酶复合物催化甘油至甘油-3-磷酸的转化，另外的酶复合物催化甘油-3-磷酸至DHAP的转化，并且醛缩酶催化(通过醛的添加)DHAP至各种手性糖的转化。在该实例中，DHAP可与例如甘油醛-3-磷酸、丙醛、乙酰醛或Cbz-氨基丙醛反应。
在另一个实例中，将包含甘油激酶和具有栓系的ATP/ADP的ATP激酶的第一酶复合物与另外的包含甘油-3-磷酸脱氢酶和具有栓系的NAD/NADH的NADH氧化酶以及半乳糖氧化酶诸如半乳糖氧化酶变体(GOM3-5)的酶复合物偶联。
在另一个实例中，将包含甘油-3-磷酸和具有栓系的NAD/NADH的NADH氧化酶的第一酶复合物与另外的酶诸如半乳糖氧化酶(诸如半乳糖氧化酶变体(GOM3-5))和/或醛缩酶(诸如ScFruA、EcTagA、EcFucA或EcRhuA)偶联。
在这些实例中，可将另一种酶共价附接至缀合模块。例如，另一种酶可包括共价附接至酯酶(诸如嗜酸脂环酸杆菌酯酶)的半乳糖氧化酶(诸如半乳糖氧化酶变体(GOM3-5))和/或共价附接至嗜酸脂环酸杆菌酯酶的醛缩酶(诸如肉葡萄球菌醛缩酶(ScFruA))、大肠埃希氏菌塔格糖-二磷酸醛缩酶(EcTagA)或大肠埃希氏菌鼠李糖-1-磷酸醛缩酶(EcRhuA)。例如，另一种酶可以是共价附接至嗜酸脂环酸杆菌酯酶(AaE2)的肉葡萄球菌醛缩酶(ScFruA)。在另一个实例中，另一种酶可以是共价附接至AaE2的嗜钙栖热菌醛缩酶。因此，在另一个实例中，将包含具有栓系的ATP/ADP的TkGlpK::MaAk::AaE2的酶复合物与另外的包含具有栓系的NAD/NADH的EgG3PD::CaNOX::AaE2和另一种酶诸如ScFruA::AaE2的酶复合物偶联。在该实例中，可从甘油和Cbz-氨基丙醛制备氨基环醇。
本领域技术人员将会意识到本公开的酶复合物的各种其它应用。实例包括通过NAD(P)H依赖性烯酸还原酶还原烯酮；通过辅因子依赖性醇脱氢酶生成手性仲醇以及通过氨基酸脱氢酶还原胺化以生成手性胺。可使用根据本发明的酶复合物产生的其它示例性糖类似物包括DNJ(1-脱氧野尻霉素)、DMJ(1-deoxymanojirimycin)、米格列醇、美格鲁特、DAB(1,4-二脱氧-1,4-亚氨基-D-阿拉伯糖醇)、5-DDAB(1,4,5-三脱氧-1,4-亚氨基-D-阿拉伯糖醇)、D-荞麦碱、DMDP(2,5-二脱氧-2,5-亚氨基-D-甘露糖醇)。
在另一个实例中，本公开的酶复合物可以用于生物反应器，诸如用于大规模辅因子依赖性生物催化合成的连续流动生物反应器。本领域已知各种合适的生物反应器(参见，例如Mazid等，1993)。
在一个实例中，本公开涵盖包含底物溶液储库和含有根据本公开的酶复合物的第一反应池的生物反应器，其中第一反应池与储库流体连通。在一个实例中，生物反应器还包含第二反应池，其包含本公开的酶复合物，其中第二反应池与第一反应池流体连通。在一个实例中，生物反应器还包含含有本公开的酶复合物的另外的反应池，其中每个另外的反应池与先前的反应池流体连通。在一个实例中，将循环游离辅因子添加至生物反应器中。在另一个实例中，将额外的底物添加至生物反应器中。本领域技术人员将会理解，可添加各种额外的底物来规定最终产物的产生。例如，可将另外的底物提供给含有DHAP和醛缩酶的反应混合物以产生各种手性糖。在一个实例中，另外的底物是Cbz-氨基丙醛。
在另一个实例中，反应池包含上面例举的固体支撑物。例如，反应池可包含具有可用于化学修饰的伯羟基基团的多糖，诸如琼脂糖珠粒或棉。在一个实例中，反应池包括棉盘。在一个实例中，生物反应器包含泵来提供从储库通过每个反应池的溶液的连续流动。
在另一个实例中，通过提供生成大量手性糖和其它相关分子的简单手段，本公开的酶复合物可用于药物开发中的筛选应用。
在另一个实例中，本公开的酶复合物可用于生物修复中，通过提供在生物修复的情况下利用辅因子依赖性酶而无大量辅因子的昂贵提供的成问题的问题的手段。
实施例
实施例1–双酶促融合蛋白的构建和示范
针对从甘油开始的DHAP的合成步骤(区域特异性磷酸化和氧化)和适当的辅因子再循环对22种酶进行评估。然后使用四种最好的酶组合来合成双酶促融合蛋白。产生的每种融合蛋白是编码两种功能性(DHAP合成步骤和同源辅因子再循环)的单个分子。
通过将编码相关酶的基因与编码包含GlySerSer重复序列(GSS)n的氨基酸接头(其中半胱氨酸在接头的中间以用于以后掺入经修饰的辅因子，即(GSS)3C(GSS)3)的DNA短合成区融合来产生双酶促融合蛋白。
双酶促融合物1(BiF1)含有用于甘油-3-磷酸产生和ATP再生的最佳酶(鹿儿岛热球菌甘油激酶[TkGlpK]和耻垢分枝杆菌ATP激酶[MsAK])。
双酶促融合物2(BiF2)含有从甘油-3-磷酸产生DHAP和再生NAD的最佳酶(大肠埃希氏菌甘油-3-磷酸脱氢酶[EcG3PD]和Clostridium aminoverlaricum NADH氧化酶[CaNOX])。
通过改变诱导温度、大肠埃希氏菌的菌株、诱导剂的量和诱导时间来优化可溶性双酶融合蛋白在大肠埃希氏菌细胞中的表达。两种构建体的最佳表达条件包括在15℃下用1mM IPTG在大肠埃希氏菌中诱导过夜；BiF表达和纯化的实例示于图1中。
评估纯化的双酶促融合蛋白BiF1和BiF2的功能性(表4和5)。BiF1经显示能够以与单独的甘油激酶组分酶相似的效率从甘油产生甘油-3-磷酸，并且还有效地将ADP再循环成ATP，尽管对于乙酰磷酸盐再生共底物具有更高的KM要求(表5)。将BiF2纯化，并其显示能够从甘油-3-磷酸产生DHAP。BiF2展示了NADH至NAD+的高效再循环，尽管以比单独的CaNOX辅因子再循环酶略慢的速率。然而，BiF2的EcG3PD组分的催化速率比单独的EcG3PD酶慢得多，并且甘油-3-磷酸的Km稍微增加，导致催化效率Kcat/Km的对数下降(表6)。
从含有BiF1和BiF2的分批反应进行的DHAP产生在多种条件下是成功的。组合的双酶促融合物能够在1小时内消耗2mM甘油并将其转化成甘油-3-磷酸和DHAP的混合物(图2)，并在按比例放大的分批反应中进行18小时后催化了～90％的100mM甘油至甘油-3-磷酸和DHAP的转化(图3)。
基于融合酶的分批反应与基于非融合酶的分批反应表现得一样好(表7和8)。然而，在双酶促分批反应中来自甘油的DHAP的总收率受限于DHAP对甘油-3-磷酸脱氢酶酶组分的产物抑制(Ki～0.1mM)。这导致从2mM和100mM甘油的分批反应分别得到～63％和～22％的DHAP收率(图2和3)。
表5.双酶促融合蛋白BiF1用于将甘油转化成甘油-3-磷酸(G3P)的效率
表6.双酶促融合蛋白BiF2用于将甘油-3-磷酸转化成DHAP的效率
表7.使用四种未融合的酶或BiF1与BiF2的组合的分批反应的甘油-3-磷酸和DHAP产生效率的比较
表8.具有经修饰的辅因子的甘油-3-磷酸脱氢酶和NADH氧化酶(NOX)的相对效率
表4-7#在室温下以1mL总体积利用10mM甘油(作为起始底物)，1至14nM的酶和各100μM的ATP和NAD进行反应。在各个时间点收集样品并通过LCMS(SIM监测G3P和DHAP)分析。
如下所述，向分批反应物中添加醛缩酶以将DHAP转化成糖或糖类似物提供了防止产物积累的机制，从而减少了DHAP介导的对甘油-3-磷酸脱氢酶的产物抑制。此外，将BiF1和BiF2掺入预期的流动反应器中也减轻了分批反应器中观察到的抑制作用。
还获得了辅因子的周转数(即每个辅因子分子被使用和回收多少次)。参与氧化还原反应的ATP辅因子的周转数是优异的，达到接近每批反应最大可能总共200次的ATP周转(从0.1mM ATP起始浓度开始的甘油至甘油-3-磷酸的90mM转化；～40/小时)。该水平正在接近每小时1000次的商业工业标准周转频率(TOF)(Rocha-Martin等，2012)。
由于G3P-脱氢酶反应的产物抑制限制了可能的周转，因此以包含的分批反应器形式不太容易评估NAD+辅因子的周转。尽管如此，可将NAD+周转的初始速率(每十分钟22次)推算为每小时～132次。
用100mM甘油底物评估5-10的pH对甘油至DHAP(BiF1+BiF2)的反应的影响。G3P形成的初始速率几乎没有差异，并在pH 8时DHAP形成的速率略有增加(图3)。这与所涉及的合成和辅因子再循环酶(EcG3PD，pH 9和CaNOX，pH 7)的最佳值的中点一致。然而，应该注意的是，当使反应运行至完成过夜时(图3)，改变pH在DHAP的总体转化和收率上未产生显著差异。
最后，将DHAP的BiF1+BiF2产生与两个立体特异性DHAP依赖性醛缩酶偶联以用于从甘油产生糖。将BiF1和BiF2融合酶与来自肉葡萄球菌I(Witke和Gotz，1993)和嗜钙栖热菌(热稳定的；(Lee等，2006))的醛缩酶组合，并且当与三种不同的醛受体组合时经由羟醛缩合成功地产生糖：乙醛和丙醛产生非天然糖且甘油醛-3-磷酸产生这些酶的天然产物(图4)。在添加醛缩酶之前，将BiF 1和2首先与甘油反应30分钟，然后再反应1小时。显示多酶分批反应的最佳pH在pH 7-8之间(图5)，与用于醛缩酶反应(pH 7，图5)和组合的BiF反应(pH8，图3a)的最佳pH一致。
辅因子官能化
将辅因子官能化以用于栓系至BiF融合物，以允许因子滞留在流动池中并靠近BiF融合物。各种辅因子诸如NAD和ATP含有共同的核糖核苷酸“核心”(图6)。核糖核苷酸核心可用作官能化的位点(图7)。
以下涉及NAD的官能化，但理论上适用于具有核糖核苷酸核心的其它辅因子的官能化。
将NAD烷基化(氮丙啶烷基化)以产生N1-2AE-NAD中间体。不必将未反应的NAD从N1-2AE-NAD/NAD混合物中分离出来，以便能够将其转化成N6-2AE-NAD/NAD混合物。因此，使该混合物直接与在一末端含有NHS酯或CO2H的交联剂反应。NAD的反应性的缺乏导致交联剂与N6-2AE-NAD完全反应。
为此目的，使N6-2AE-NAD与SATA-PEG4-NHS(图8A，SATA(S-乙酰硫代乙酸N-琥珀酰亚胺酯))或MAL-PEG24-NHS(图9)或8-壬烯酸(图8B，在酰胺偶联条件下)反应以产生所得的栓系的构建体，其两者均具有与NAD显著不同的滞留时间(通过HPLC)，因此通过HPLC进行的分离是直接的。
将PEG和烃接头附接至NAD。这证明了通过使用NHS活性酯或从CO2H和肽偶联剂原位形成的酯来安装亲水性(PEG)和疏水性(烃)接头的能力。所安装的两个系链均在相对的末端具有反应性官能团，用于进一步缀合至酶复合物或表面。
例如，当使用半胱氨酸作为酶中的固定点时，可将NAD-2AE-(CH2)6-CH＝CH2-经由硫醇烯化学安装在半胱氨酸硫醇残基处。或者，具有末端马来酰亚胺的PEG接头可容易地从可用材料制备(图9)，该NAD-2AE-PEGx-MAL构建体可用于经由迈克尔加成反应(Michaeladdition reaction)将NAD安装到酶融合复合物上的半胱氨酸酸硫醇残基上。
还产生了适当修饰的NAD-2AE-PEGx-MAL(图9)。
用经修饰的N6-2AE-NAD评估经鉴定用于DHAP合成的NAD依赖性甘油-3-磷酸脱氢酶酶的相对酶活性。还获得了EcG3PD和CaNOX的动力学数据。为了测定相对活性和动力学酶效率，将经修饰的N6-2AE-NAD酶促还原，使用超滤法将其与酶分离，并基于吸光度A340nm计算N6-2AE-NAD的量。这些数据指示，NAD的N6位置的修饰产生了仍具有生物活性的辅因子类似物(即其被酶接受并可参与氧化还原反应)。
完全动力学分析显示与未修饰的NAD相比，甘油-3-磷酸脱氢酶2(EcG3PD)利用经修饰的辅因子保留了78％的活性。结合亲和力(KM)略有增加，且催化效率(Kcat)略有下降，但催化常数总体上几乎没有显著差异。
然而，相较而言，与NADH相比以经修饰的N6-2AE-NADH作为底物，NOX1(CaNOX)酶的催化效率降低。然而，NOX1的高初始催化效率意味着该活性的降低在分子机器中不应当是限速的，因为降低的活性仍然大于甘油-3-磷酸脱氢酶2的催化效率。因此，辅因子氧化应当仍然比甘油-3-磷酸的催化转化和伴随的辅因子还原快得多。
功能性辅因子栓系的双酶促融合蛋白的构建与展示
BiF2(EcG3PD-CaNOX)的色谱图显示177mL处的蛋白洗脱物的峰，这与176kDa的二聚体分子量一致(图10)。NADH氧化酶具有结合的FAD，其贡献了450和259nm处的吸光度。为了防止不希望的副反应，通过脱盐从汇集物中去除TCEP，然后立即添加一个当量的NAD-2AE-PEG24-MAL。NAD-2AE-PEG24-BiF2缀合物的凝胶过滤曲线显示259nm处的吸光度相对于280nm处的蛋白质吸光度增加，与NAD的存在一致(图11)。在运行结束时没有证据表明未缀合的NAD-2AE-PEG24-MAL洗脱，与大部分NAD被栓系至BiF2一致。
BiF2和NAD-2AE-PEG24-BiF2缀合物的紫外-可见光谱在360nm和450nm处具有峰，与结合的NAD的存在一致(图12)。缀合物在273nm处具有高于BiF2在276nm处的峰的吸收峰，这与NAD在缀合物中的存在一致。
通过在GuHCl中变性和超滤将非共价连接的辅因子与复合物分离，以从蛋白质中分离低分子量的辅因子。对于BiF2和NAD-2AE-PEG24-BiF2两者来说，分离的低分子量材料的紫外-可见光谱非常相似，这与蛋白质和缀合物(具有非共价连接的NAD)两者一致(图13)。高分子量光谱显示缀合物在260nm处具有较高的吸光度，这与共价栓系的NAD辅因子的存在一致。
由于DHAP在溶液中的不稳定性质，通过辅因子栓系的BiF2反应产物与醛缩酶酶ScFruA和醛受体共底物的组合来进一步证实通过纳米机器生物催化剂产生DHAP，以证明羟醛糖的DHAP依赖性产生(图14)。这再一次证实了辅因子栓系的BiF2融合蛋白能够产生足够的DHAP以允许对于丙醛和甘油-3-磷酸醛受体，DHAP依赖性ScFruA羟醛缩合反应均可发生。
因此，本文所述的辅因子栓系的双酶促融合蛋白能够用作纳米机器生物催化剂，以将甘油-3-磷酸转化成DHAP而无需添加外源辅因子。另外，可将它们与例如醛缩酶酶偶联以产生各种手性分子。
功能性辅因子栓系的三酶促融合蛋白的构建和展示以及至固体表面上的缀合
经由与每种BiF的基因融合将“缀合模块”蛋白(来自嗜酸脂环酸杆菌的酯酶，称为嗜酸脂环酸杆菌酯酶)掺入BiF1和BiF2蛋白中以产生三酶促融合蛋白1(TkGlpK-MaAk-嗜酸脂环酸杆菌酯酶；TriF1，132kDa)和三酶促融合蛋白2(EcG3PD::CaNOX::嗜酸脂环酸杆菌酯酶；TriF2，124kDa)(图15)，表9)。
产生两种不同的TriF1变体，以评估双酶促融合蛋白与最终三酶促融合蛋白的酯酶组分之间不同接头长度的作用。在TriF1中，已显示非常短的接头区(gly-ser)对比较长的接头区(gly-ser-ser)4；TriF1)，产生略微更具活性的融合蛋白(TriF1-蛋白)(图16)，虽然在蛋白质表达上没有可检测的差异。TriF1-NS用于所有后续的实验，且为简单起见在下文中称为TriF1。
评估纯化的TriF1和TriF2的组分酶的功能性，并将其与这些酶的非融合的和双酶促融合活性进行比较(表3和表4)。
TriF1显示能够以与单独的甘油激酶组分酶相似的效率从甘油产生甘油-3-磷酸，并且还能够有效地将ADP再循环成ATP，虽然对于共底物的乙酰磷酸再生具有更高的KM要求(表9)。纯化TriF2，并其显示能够从甘油-3-磷酸产生DHAP。TriF2表现出有效的NADH至NAD+的再循环，虽然比单独的CaNOX辅因子再循环酶稍慢。然而，TriF2的EcG3PD组分的催化速率比单独的EcG3PD酶慢得多，并且甘油-3-磷酸的Km略微增加，导致催化效率Kcat/Km的对数下降(表10)。
表9.三酶促融合蛋白TriF1用于将甘油转化成甘油-3-磷酸的效率。
表10.三-酶促融合蛋白TriF2用于将甘油-3-磷酸转化成DHAP的效率。
在40℃至100℃的温度范围内检查了TriF1和TriF2与其天然酶和双酶促融合蛋白相比的热稳定性。
用于BiF1和TriF1的甘油激酶[TkGlpK](来自鹿儿岛热球菌)具有高的热稳定性。然而，当与来自耻垢分枝杆菌的ATP激酶酶[MsAK]融合时，TkGlpK去稳定。BiF1的稳定性与MsAK的稳定性相似，在温度高于50℃时残留活性略有增加。TriF1遵循相似的模式，但实际上在温度高达60℃时会略微更稳定(图17)。
BiF2和TriF2中的NADH氧化酶和甘油-3-磷酸脱氢酶活性两者作为融合蛋白均比它们未融合的对应物稍微更稳定(图18)。
在多种条件下成功地证明了来自含有TriF1和TriF2的分批反应的DHAP产生。组合的三酶促融合物能够在1小时内消耗2mM甘油并将其转化成甘油-3-磷酸和DHAP的混合物(表11)，并在于按比例放大的分批反应中进行1小时后，催化了～50％的10mM甘油至甘油-3磷酸和DHAP的转化(图19)。
然而，双酶促分批反应中由甘油得到的DHAP的总收率仍受到DHAP(Ki～0.1mM)对甘油-3-磷酸脱氢酶酶组分的产物抑制的限制。这导致从2mM和10mM甘油分批反应分别得到～68％和～20％的DHAP收率(图19)。基于融合酶的分批反应表现得与基于非融合酶的分批反应一样好(表10)。
还获得了辅因子的周转数(即每种辅因子分子被使用和回收了多少次)。参与氧化还原反应的ATP辅因子的周转数是优异的，达到接近每批反应最大可能总共450次的ATP周转(从0.01mM ATP起始浓度开始的甘油至甘油-3-磷酸的4.5mM转化)。
如果产物抑制不起作用，则可将初始NAD+周转速率(每10分钟22次)外推至～132次/小时。
表11.使用四种未融合的酶(BiF1与BiF2的组合)或者TriF1与TriF2的组合的分批反应的G3P和DHAP产生效率的比较
#反应在室温下以1mL总体积用2mM甘油(作为起始底物)、1至14nM酶和各100μM的ATP和NAD进行。60分钟后收集样品并通过LCMS(SIM监测G3P和DHAP)分析。
最后，将DHAP的TriF1+TriF2产生与上文针对从甘油产生糖所述的醛缩酶中的两种偶联。将TriF1和TriF2融合酶与来自肉葡萄球菌I和嗜钙栖热菌(热稳定的)的醛缩酶组合，并且当与三种不同的醛受体(乙醛和丙醛产生非天然糖，且甘油醛-3磷酸产生这些酶的天然产物)组合时经由羟醛缩合成功地产生糖。所使用的酶系统为非天然糖和糖类似物的产生提供了广泛的平台。
首先将TriF 1和2与甘油反应30分钟，然后添加醛缩酶酶，然后再反应1小时(图19)。
将ATP-CM-C6-PEG24-马来酰亚胺栓系至TkGlpK:MsAK::嗜酸脂环酸杆菌酯酶(TriF1)
TriF1的凝胶过滤分析显示，酶在溶液中主要形成可溶性聚集物，对于单体三功能融合物，只有一小部分以预期的洗脱体积(10.5mL)运行(图20)。在0.1mM TCEP存在或不存在的情况下，使酶与10当量的ATP-CM-C6-PEG24-马来酰亚胺反应(图20)。对于在TCEP存在下的栓系，单体TriF1的A280(实线)相对于A259(虚线)增加，这表明ATP-CM-C6-PEG24-马来酰亚胺与TriF1的栓系是成功的。
在0.1mM TCEP存在的情况下，在相同的条件下，使TriF1的剩余物(20mL，34mg，0.26μmol)与10当量的ATP-CM-C6-PEG24-马来酰亚胺(2.6μmol)反应，并且不经进一步纯化即可使用。
在不添加ATP的情况下通过ATP-CM-C6-PEG24-MAL-TriF1L-Tri F1进行甘油-3-磷酸的产生
在ATP存在和不存在的情况下，滴定栓系的TriF1-PEG-ATP活性以测定栓系的效率。栓系的ATP在无外源性ATP时具有约40％的添加了ATP时的酶活性，表明经修饰的辅因子与所有融合蛋白分子的不完全栓系(图21)。稀释的酶的滴定证实，在两倍稀释后，20％的活性得以保留，并且在4倍稀释后栓系的ATP活性未得以保留，表明栓系实际上具有～40％的效率。
尽管如此，栓系的酶生物催化剂在分批反应条件下仍具有足够的活性，在所述反应条件下，其可与TriF2和醛缩酶偶联以有效地产生与利用未栓系的TriF1酶和添加的ATP的类似偶联反应一样多的果糖-1,6-二磷酸。
基于上述部分有效的栓系，栓系的辅因子能够非常有效地周转。假定在33.3μM(即13.32μM ATP-PEG-TriF1，在酶反应中稀释250倍至～50nM)的酶制剂中具有40％的效率，栓系的ATP分子在1小时的孵育过程中已经周转～40,000次，产生2mM的甘油-3-磷酸。
将NAD-2AE-PEG24-MAL拴系至TriF2
在已证明成功地将经修饰的NAD栓系至双酶促融合蛋白BiF2后，有必要进一步证实经修饰的NAD成功地栓系至三酶促融合蛋白TriF2。使用与上述方法类似的方法将具有聚乙二醇尾的经修饰的NAD附接至TriF2的接头区域内的半胱氨酸残基。融合蛋白以接近100％的效率被栓系至经修饰的NAD，并且所得的TriF2纳米机器生物催化剂能够成功地将G3P转化成DHAP而无需添加外源性NAD辅因子(图22)，并且还可将其与醛缩酶酶ScFruA偶联以产生几种不同的手性羟醛糖。
实施例2-流动池系统开发
流动池系统的开发需要将酶融合物栓系至固体支撑物。(图23)中显示了示例性流动反应器概念。
使用与醇脱氢酶酶交联的琼脂糖珠粒产生简单的模型流动反应器，并且证明其成功地发挥功能。将流速优化在～0.7mL/分钟。
棉的活化
由于棉与琼脂糖一样是具有可用于化学修饰的伯羟基基团的多糖，因此评估织物棉的为固定化酶提供纤维基支撑物的能力。
将25mL的0.5M Na2CO3溶液(pH 12)，然后250μl二乙烯砜(DVS)添加至1g棉盘(直径14mm)中。然后将混悬液在室温下混合60分钟。从棉中倒出DVS溶液并加入25mL水，并混合以进行漂洗。重复漂洗10次(2-20分钟范围内的孵育)。然后将样品悬浮在水中过夜，排干，然后在250mL水中漂洗30分钟。
将酯酶抑制剂缀合至棉
向5μl酶(CaNOX::AaE2或EcG3PDH:CaNOX::AaE2，TriF2)中添加1μl的0.2M于DMSO中的TFK抑制剂(1-溴-3,3,3-三氟丙酮和1,1,1-三氟-3-(硫代己基)丙-2-酮)，并将溶液在冰上孵育5分钟，然后测定残余酯酶活性。酯酶活性由对-硝基苯基乙酸酯的水解来测定，在405nm处进行监测。
在与这些酯酶抑制剂孵育5分钟后，发现融合物CaNOX::AaE2和EcG3PD::CaNOX::AaE2(TriF2)的酯酶活性被大大降低(1-溴-3,3,3-三氟丙酮)或被完全消除(1,1,1-三氟-3-(硫代己基)丙-2-酮)(图24)。这些数据指示可使用酯酶抑制剂将融合蛋白缀合至固体支撑物。
棉-DVS-TFK盘的产生
过夜浸泡和洗涤后，将DVS活化棉印迹至干燥。向棉中添加10mL 0.1M NaPi pH 8和10mL 50％乙醇。还加入200μl的0.1M于DMSO中的硫代己基-TFA。使混合物在转轮上反应4小时。将286μl的0.2M 2-巯基乙醇等分试样添加到混合物中并使其在转轮上反应过夜。
将棉用50％乙醇洗涤10次，包括印迹至干燥。将棉用水洗10分钟，进行5次，直至DMSO的气味可以忽略不计。将样品印迹至干燥并保存在4℃的密封袋中。
将ATP-CM-C6-PEG24-MAL-TriF1固定到棉-DVS-TFK盘上
将ATP-CM-C6-PEG24-MAL-TriF1(12mL，20mg，150nmol)添加至1g棉-DVS-TFK盘中。过夜孵育后，上清液中的酯酶活性从11U/mL降至2U/mL，表明大约80％的酯酶被固定在载体上。
将TriF2固定在棉-DVS-TFK盘上
将TriF2直接固定至棉-DVS-TFK盘上。通过在含有0.1mM TCEP的PBS中进行凝胶过滤来进一步分级分离通过IMAC纯化的TriF2。汇集针对三功能性融合物的二聚体(NOX酶形成非二硫化物键合的同二聚体)以预期的体积洗脱的物质，并将28mL(0.3mg/mL，8.4mg，112U酯酶)添加至1.6g潮湿棉-DVS-TFK盘(相当于1g干棉)。将混合物在4℃下在轮上旋转75分钟，然后除去上清液，并将盘用50mL含有0.1mM TCEP的PBS洗涤4次。在最后的洗涤中没有检测到活性。
测定固定后原料和上清液中的蛋白质和酯酶的活性(表12)。
表12.固定后原料和上清液中的蛋白质和酯酶活性。
原料 固定后 固定的量
A280 0.269 0.145
[蛋白质](mg/mL) 0.33 0.18
体积 28 28
蛋白质(mg) 9.12 4.92 4.20
酯酶活性(U/mL) 4.16 1.02
酯酶活性(U) 116.48 28.56 87.92
栓系至NAD-2AE-PEG24-MAL的固定化TriF2的制备
向悬浮于10mL缓冲液中的盘的一半(0.5g干棉，2.1mg固定化蛋白质，44个单位的酯酶)中添加1个当量的NAD-2AE-PEG24-MAL(基于固定化蛋白质的量的估计)(批次B1)。向另一半添加10当量的NAD-2AE-PEG24-MAL(批次B2)。将盘悬浮液在4℃下于轮上旋转过夜。
将TriF2缀合至TFK处理的棉盘上，然后栓系经修饰的NAD是成功的。在不添加外源NAD+的情况下，批次B2比批次B1更具活性，说明增加用于栓系的经修饰的NAD+的摩尔当量提高了栓系的效率(图25)。在外源NAD+不存在的情况下反应的批次B2盘产生～50％的融合酶在添加NAD+时的DHAP产量，表明～50％的融合蛋白栓系。
棉在生物反应器作为材料的适合性
已显示，棉可使用不同的化学物质，利用许多酶来进行官能化(Albayrak等，2002)，(Edwards等，2011)，(Kim等，2007)。
将针织棉布冲压成直径为11mm的盘。然后将盘紧紧地填充至低压液相色谱(LC)柱(Omnifit D＝10mm，L＝100，床体积＝5.5mL mm)中，成为15或30mm长的塞子。将盘的直径选择为大于柱的内径以使沟道效应最小化。然后将柱子连接至配备有样品注入回路和背压传感器的Vapourtec流动反应器系统。
使用0.5mL/分钟和1.0mL/分钟的流速。将食品染料泵动通过柱，持续5分钟，并监测背压。发现对于填充长度和流速来说，没有背压，这意味着即使进行了紧密填充和形成了长盘塞，对试剂流几乎没有阻力(Cybulski和Moulijn,2005)。实验后，取出盘并目视检查。发现染料均匀分布在整个盘表面上，且没有沟道效应(Butt,2000)。这两个发现表明，紧密填充的棉是作为用于流动反应器的支撑物材料的良好候选物。
平均停留时间和停留时间分布是反应器设计过程中的两个重要参数。平均停留时间在理想情况下应高于特征反应时间以避免产物分解和不需要的副反应。这也有助于提高反应收率并减小反应器尺寸。另一方面，狭窄的停留时间分布是优选的，以便化学物质种类在反应器中花费的时间尽可能接近，从而导致产物均一性(Hessel等，2015)。
在填充有3cm棉盘塞的反应器中评估停留时间分布(RTD)和平均停留时间测量结果。将作为示踪剂的1mL食品染料的塞子注入以1mL/分钟运行的反应器中。每30秒，将食品染料的不同稀释物收集至20个小瓶中。在小瓶上于632nm处进行UV/VIS测量以获得可使用比尔朗伯定律(Beer’s Lambert law)转换成浓度的吸光度(图26)。平均停留时间经计算为6.7分钟，该时间似乎大于反应特征时间。
TriF1流动反应器(步骤1：甘油转化成甘油-3-磷酸)
将具有固定和栓系的TriF1的棉盘填充至XK 16/20柱(GE Healthcare)中，其中安装适配件以最小化生物反应器的死体积。
流速从0.1mL/分钟变化至5mL/分钟，并通过LC-MS分析随时间推移评估每个级分中产生的甘油-3-磷酸的收率(图27)。流速在0.25mL/分钟时为最佳，并在流速超过1mL/分钟时显著降低。
将500mL含有10mM甘油底物的反应混合物以0.25mL/分钟的速率供给T1R2，进行33小时，每20分钟收集5mL级分。如图28所示，反应器在～100分钟后达到最大产量(级分5)，并在33小时的剩余时间内以最大产率(～60％的甘油至甘油-3-磷酸的转化)连续地稳定运行。
向反应器中添加少量外源性ATP达到最大产量。然而，值得注意的是，一旦T1R2流动反应器达到稳定状态，运行7中添加的少量外源性ATP持续保持33个小时的每分子600次总周转的周转数。
TriF2流动反应器(步骤2：甘油-3-磷酸转化成DHAP)
将具有固定和栓系的TriF2的棉盘填充至XK 16/20柱(GE Healthcare)中，其中安装适配件以最小化生物反应器的死体积。
NAD-栓系的TriF2流动反应器能够连续地将甘油-3-磷酸转化成DHAP至少数小时，而不添加外源NAD+(图29)。
将含有酯酶模块的酶融合物TriF2固定到共价附接至固体支撑物的酯酶抑制剂
将在HisTrap柱(5mL)上纯化，随后在Superdex 200 2660柱上的凝胶过滤纯化的TriF2固定至琼脂糖-乙烯砜-硫代己基三氟酮珠粒(2.5mg/mL珠粒)上。或者，将含有TriF2粗裂解物以约45个单位的酯酶活性/mL珠粒(这相当于与对于纯化的蛋白质观察到的容量非常相似的容量)直接施加至琼脂糖-乙烯砜-硫代己基三氟酮珠粒(图30)
将马来酰亚胺-PEG24-2AE-NAD栓系至固定的或溶液中的TriF2
在1mM TCEP存在的情况下，使纯化的TriF2与5或10摩尔当量的马来酰亚胺-PEG24-2AE-NAD在4℃反应1小时。将反应混合物直接固定在琼脂糖-TFK珠粒上，并通过洗涤除去未结合的蛋白质和辅因子，然后在外源性NAD存在和不存在的情况下测定DHAP产生。在替代方法中，将TriF2直接从粗裂解物中固定，并且根据未结合级分中酯酶活性的损失来估计固定化蛋白质的量。在1mM TCEP存在的情况下，使此TriF2与5-85摩尔当量的马来酰亚胺-PEG24-2AE-NAD反应1小时，然后通过洗涤除去未结合的辅因子，并测定DHAP产生。通过两种方法成功地栓系了辅因子，如通过在外源性NAD(H)不存在的情况下产生DHAP的能力所判断的(图31)。
对马来酰亚胺-PEG24-2AE-NAD至固定化TriF2的栓系的优化
在0.1mM或1mM TCEP存在的情况下，使固定化TriF2与马来酰亚胺-PEG24-2AE-NAD(0-40个当量)在4℃下反应1小时，然后洗涤除去未结合的辅因子，并在外源性NAD(H)存在或不存在的情况下测定DHAP产生。在较高的辅因子浓度下，TriF2活性损失(特别是在0.1mMTCEP下)，而在较低浓度下，几乎没有栓系(如从在外源辅因子不存在的情况下缺乏DHAP产物来判断的)。
实施例3-包含三个纳米机器流动反应器的纳米工厂
用固定化1,1,1-三氟-3-((6-巯基己基)硫代)丙-2-酮(TFK)制备琼脂糖珠粒
向乙烯砜活化的琼脂糖的浆液(800mL，600-800mmol乙烯砜基团，50％的1:1乙醇/水中的浆液)中加入饱和NaHCO3水溶液(80mL)、溶解在乙醇(4.8mL)中的1,1,1-三氟-3-((6-巯基己基)硫代)丙-2-酮(104mg，0.4mmol)。将混合物在室温下缓慢搅拌过夜。通过添加2-巯基乙醇(11.2mL，80mmol)封闭过量的反应位点，然后继续搅拌6小时。然后用50％乙醇/水充分洗涤树脂，直至无明显气味。将珠粒在50％乙醇/水中以1:1浆液形式储存。
使用固定在TFK-衍生的琼脂糖珠粒上的融合酶的三重多酶反应器
通过融合酶的酯酶组分与TFK的酮化物基团之间的共价键合将具有栓系的mNAD的TriF2(EcG3PD-CaNOX-AaE2)、半乳糖氧化酶M3-5-酯酶AaE2和ScFruA醛缩酶-酯酶融合蛋白固定在己基-TFK衍生珠粒上(图33)。如表13所示评估固定化酶珠粒活性。
表13.固定在TFK衍生珠粒上的融合酶的比活性。
用估计足够的浆液填充一个单独的Omniflow柱以对于每个固定化融合酶珠粒完全转化5mM底物。然后，分别评估每个纳米机器酶流动反应器，之后在将纳米机器流动反应器组合成三部分多酶纳米机器流动反应器(纳米工厂)，，所述三部分多酶纳米机器流动反应器产生高达96％的5mM甘油-3-磷酸和5mM CBZ-氨基丙二醇至CBZ保护的氨基己酮糖磷酸的转化(图34和图35)。
这些数据证明使用三重多酶流动反应器(纳米工厂)成功地将CBZ-保护的氨基丙二醇转化成米格列醇前体分子(表示为CBZ保护的氨基己酮糖磷酸)，所述三重多酶流动反应器包含三个具有固定在珠粒上的融合酶的纳米机器流动反应器。该多酶级联反应器产生96％的底物至产物的转化(图35)。
实施例3-纳米机器概念的扩展
纳米机器生物催化剂系统的概念可被扩展至涵盖许多需要烟酰胺辅因子的酶催化的其它工业相关反应化学物质。表14显示了三种其它化学物质的功能性双酶促融合蛋白：烯酮(enoane)还原、手性胺合成和手性仲醇的产生。
表14.需要烟酰胺辅因子来催化另外的反应化学物质的其它功能性双酶促融合蛋白。
评估纯化的双酶促融合蛋白BiF5、6和7的功能性(表15)。BiF5显示能够从酮基-异佛尔酮产生R-左旋二酮，并且还能够经由将乙醇还原成乙醛来有效地将NADPH再循环成NADP+。在这一小时内，添加的NADPH辅因子被融合蛋白周转了总共358次。BiF6展示了从NADH至NAD+的有效再循环以及从辛酮产生S-辛醇，在一小时内7.7mM底物的转化率接近百分之百。将BiF7纯化，并且其显示能够从酮酸底物产生对映异构体纯的支链和芳族D–氨基酸。
表15.双酶促融合蛋白BiF5、BiF6、BiF7对于酮基异佛尔酮的烯酮还原、手性仲醇的产生和手性胺的产生(分别地)的效率。
在室温下以1mL总体积根据需要利用5-50mM起始底物、1至14nM的酶和各100μM的NADH和NAD(P)H进行反应。1小时后收集样品并如方法中所述通过LCMS、手性HPLC和手性GC进行分析。TTN-总周转数(分钟-1)。
实施例4-生物催化流动反应器
D-荞麦碱纳米工厂
经由生产重要的商业上相关的抗糖尿病药物D-荞麦碱证实了保留和再循环辅因子以进行流动生物催化的反应器中的固定化纳米机器的功能性。D-荞麦碱可经由两个区域特异性的辅因子依赖性步骤(ATP-依赖性磷酸化和NAD-依赖性氧化)和立体特异性羟醛缩合)，然后进行化学环化而从甘油酶促产生(图36)。
磷酸转移反应器
为了制备TriF1磷酸转移反应器(图36中的步骤1)，将40毫克TriF1蛋白(296nmol)固定在25g琼脂糖-己基-DVS-TFK珠粒上。用TCEP处理固定化的TriF1，用含有0.5mM EDTA的脱气的喷射PBS洗涤，然后使其在4℃下与6当量ADP-2AE-PEG24-NAD反应6小时，然后用PBS洗涤。在分批反应中在ATP存在和不存在的情况下分析所得的纳米机器珠粒的甘油激酶活性，并证明其具有～10％的栓系效率。然后将所得的包含固定化的ADP-2AE-PEG24-TRIF1的纳米机器珠粒填充至25mm*15mm Benchmark柱(Kinesis,Australia)中并在流动反应器系统中进行评估。
发现填充有包含固定化的ADP-2AE-PEG24-TRIF1的纳米机器珠粒的生物反应器以约0.25mL/分钟的最佳流速将10mM甘油和10mM乙酰磷酸转化成G3P和乙酸，效率为约60％(图37)。这导致70mg G3P L-1hr-1mg-1蛋白质的时空收率。通过继续运行磷酸转移反应器总共870分钟的时间(导致栓系的辅因子总共14222次周转)来进一步评估生物反应器的稳定性。磷酸转移反应器
为了制备TriF1磷酸转移反应器(图36中的步骤1)，将40毫克TriF1蛋白(296nmol)固定在25g琼脂糖-己基-DVS-TFK珠粒上。用TCEP处理固定化的TriF1，用含有0.5mM EDTA的脱气的喷射PBS洗涤，然后使其在4℃下与6当量的ADP-2AE-PEG24-NAD反应6小时，然后用PBS洗涤。在分批反应中在ATP存在和不存在的情况下分析所得的纳米机器珠粒的甘油激酶活性，并证明其具有～10％的栓系效率。然后将所得的包含固定化的ADP-2AE-PEG24-TRIF1的纳米机器珠粒填充至25mm*15mm Benchmark柱(Kinesis,Australia)中并在流动反应器系统中进行评估。
发现填充有包含固定化ADP-2AE-PEG24-TRIF1的纳米机器珠粒的生物反应器以0.25mL/分钟的最佳流速将10mM甘油和10mM乙酰磷酸转化成G3P和乙酸，效率为约60％(图37)。这导致70mg G3P L-1hr-1mg-1蛋白质的时空收率。通过继续运行磷酸转移反应器总共870分钟的时间(导致栓系的辅因子总共14222次周转)来进一步评估生物反应器的稳定性。
氧化反应器
为了制备TriF2氧化反应器(图36中的步骤2)，将80毫克TriF2蛋白(647纳摩尔；1260个酯酶U)固定在80g琼脂糖-己基-DVS-TFK珠粒上。用TCEP处理固定化的TriF2，用含有0.5mM EDTA的脱气的喷射PBS洗涤，然后在4℃下与6当量ADP-2AE-PEG24-NAD反应6小时，然后用PBS洗涤。在分批反应中在NAD+存在和不存在的情况下分析所得的固定化辅因子栓系的纳米机器珠粒的甘油-3-磷酸脱氢酶活性，并且所述纳米机器珠粒被证明具有～80％的栓系效率。然后将所得的包含固定化的ADP-2AE-PEG24-TRIF2的纳米机器珠粒填充至250mm*15mm Benchmark柱(Kinesis,Australia)中并在流动反应器系统中进行评估。
发现填充有纳米机器珠粒的柱以0.25mL/分钟的流速将10mM G3P转化成DHAP，效率约为40-50％(图38)。
羟醛缩合反应器
使用不同的酶与珠粒比率来评估BiF4(肉葡萄球菌醛缩酶(ScFruA)-嗜酸脂环酸杆菌酯酶2(AAE2))与琼脂糖-DVS-己基-TFK珠粒的结合。0.5:1、1:1和2:1的比率对每体积的固定化珠粒的活性没有显著影响，但0.5:1的比率经选择为最佳的，因为该比例表明每mg蛋白质的活性损失最小，即蛋白质结合在该比率下已饱和(图39)。
使用优化的固定条件，使20mg的BiF4蛋白与20g的琼脂糖-己基-DVS-TFK珠粒反应。然后将所得的固定化醛缩酶纳米机器珠粒填充至150mm*15mm Benchmark柱(Kinesis,Australia)中，直至最终长度为10cm(17.7mL的填充珠粒体积)并在流动反应器系统中进行评估。评估羟醛反应器的最佳流速，发现其为0.1mL/分钟，在这些条件下具有约86％和98％的5mM Cbz-氨基丙醛和5mM DHAP的转化(图40)。
这导致在这些条件下羟醛缩合反应器的28.48mg Cbz-二羟基酮基磷酸产物L-1hr-1mg-1蛋白质的推定时空产量(注意，这是基于底物的损失而不是产物的实际定量)。通过继续运行羟醛缩合反应器总共840分钟的时间来进一步证实生物反应器的稳定性。
经由串联酶促反应器产生氨基环醇
为了证明组合使用模块化分级纳米机器来产生商业上相关的精细化学品，将上述磷酸转移、氧化和羟醛缩合反应器组合以将甘油和Cbz-氨基丙醛转化成D-荞麦碱(一种商业上相关的抗糖尿病药物，如图41中所示的)的前体。
将在具有50μM TCEP的50mM柠檬酸盐缓冲液(pH 8.0)中的5mM甘油供给反应器，并将所述反应器依次系统地耦合在一起，例如将磷酸转移反应器以0.25mL/分钟运行40分钟，然后以0.25ml/分钟加入串联的氧化反应器并运行，两者持续200分钟，然后通过平行泵送系统纳入于50mM柠檬酸盐pH 7.0中的5mM Cbz-氨基丙醛，并在此之后加入串联的羟醛缩合反应器。然后将多酶反应器级联以该配置以0.25ml/分钟运行1200分钟(总体积300mL，20小时)，并且分析随时间推移各级分的底物损失和产物检测。
在串联反应器操作过程中收集的级分的分析表明磷酸转移反应器最初将甘油转化成甘油-3-磷酸(F1-F7)，然后氧化反应器的相继纳入导致甘油-3-磷酸转化成DHAP(F12-F17)。供给5mM Cbz-氨基丙醛的平行泵的纳入导致其在F15-21中出现，然后第三和最终羟醛缩合反应器的纳入造成甘油-3-磷酸和DHAP两者的损失，以及Cbz-氨基丙醛底物的损失。预期的Cbz-二羟基酮基磷酸产物在级分F18-60中被检测到，但由于缺乏已知的曲线标准校准品，因此不能被准确定量。因此，如图42中所示的从Cbz-氨基丙醛底物的损失导出的推定收率，但非确切收率将需要利用已知量的标准Cbz-二羟基酮基磷酸进行确认。
从数据可以看出，由于存在所产生的一些过量的甘油-3-磷酸和Cbz-氨基丙醛，所以在这个实验中三个反应器不处于完美的摩尔平衡(表16)。然而，使用更复杂的流动反应器系统对流速进行更精细的校正以平衡反应器应当能够将所有的起始甘油底物完全转化成D-荞麦碱前体。
总的来说，用于产生氨基环醇前体的串联反应器的量度是非常有前景的，对于每个组成反应器，时空产量为10至70mg L-1hr-1mg-1蛋白质，并且栓系的辅因子的总周转数在104的范围内，从而使该系统成为生产商业上相关的精细化学品的可行示范。
表16.生物催化连续流动反应器的串联反应器总体性能特征的概述。
实施例5-材料和方法
酶的克隆、表达和纯化
除了两个例外，通过从大肠埃希氏菌细胞克隆、表达和纯化获得酶。简言之，将合成基因转移至pDEST17或pETCC2中，分别转化至大肠埃希氏菌BL21AI或大肠埃希氏菌BL21DE3*(Invitrogen)细胞中。然后用0.2M阿拉伯糖或1mM IPTG(分别地)诱导细胞2、4、6或24小时，然后收获细胞，将其重悬浮于1/10体积中并用Bugbuster(Novagen)裂解。通过SDS-PAGE分离，利用NuBlue(Novagen)染色来分析蛋白质表达。选择最佳表达时间，并以与上述相同的方式制备1-2L大规模表达培养物，然后通过用浓度递增的咪唑从NiNTA柱中洗脱来纯化HIS-标记的蛋白质。如有必要，使用GE 200尺寸排阻柱进行洗脱来进一步纯化所需的蛋白质级分。然后将汇集的级分浓缩并根据需要储存在4℃或-80℃。
酶促活性测定
基本上如由(Pettigrew，2009)所述，在室温下以1mL体积进行甘油激酶测定，但通过对反应上清液进行HPLC分析来直接检测ADP和ATP。典型的反应包含1mM甘油、10mMMgCl2、50mM NaHCO3缓冲液pH 9.0、1mM ATP和约2μg/mL酶(35nM)。通过改变ATP或甘油的浓度，同时保持另一种过量来测定动力学，并且使用Hyper(J.S.Easterby,LiverpoolUniversity)计算动力学决定因子。底物和辅因子的浓度范围为0.1至10X Km。
以相同的方式进行乙酸激酶测定，用ADP替代ATP并用乙酰磷酸或磷酸烯醇丙酮酸替代甘油。通过改变ADP或乙酰磷酸或磷酸烯醇丙酮酸的浓度，同时保持另一组分过量来测定动力学，并且使用Hyper(J.S.Afterby,Liverpool University)计算动力学决定因子。底物和辅因子的浓度范围为0.1至10X Km。
基本上如(Sakasegawa等，2004)所述，进行甘油-3-磷酸脱氢酶测定。通过改变NAD/NADP或甘油-3-磷酸的浓度，同时保持另一组分过量来测定动力学，并且使用Hyper(J.S.Afterby，Liverpool University)计算动力学决定子。底物和辅因子的浓度范围为0.1至10X Km。
酮和醇的LCMS分析。
使用(Prieto-Blanc等，2010)中所述的方法的改进方法来分离辛酮和辛醇。色谱条件为SIELC ObeliscN柱(250mm)(利用50％流动相A，50％流动相B)，持续30分钟。流动相A：20％甲酸铵pH 4.0；流动相b：乙腈。利用Agilent 6120Quadropole LCMS，使用API-ES模式(根据需要为正或为负)进行质谱分光光度检测。通过对113.19-m/z(庚酮)和115.20-m/z(庚醇)进行选定的离子监测来定量化合物。使用250mm Chirobiotic柱(Sigma-Aldrich)，通过手性HPLC，以1mL/分钟利用流动相甲醇:水:三乙胺(25:65:10)来分离辛醇的R-和S-对映异构体。流速为1mL/分钟时的滞留时间为3.73分钟(S-)和4.20分钟(R-)。
辛醇和庚醇的(R)-和(S)-对映异构体的手性GC分析
在萃取到己烷中后分离并检测对映异构体。在Agilent GC上使用以下程序，利用Chiraldex Astec ATA柱(Sigma-Aldrich)进行手性GC分离。1mL/分钟He，在100℃下保持0.2分钟，然后以10℃/分钟的速率升至250℃并保持10分钟。喷射器温度：280℃。注入1μL样品并通过FID检测产物
ATP和ADP的HPLC分离
使用Agilent Eclipse XDB柱(50mm)，利用25％溶剂A和75％溶剂B的等度梯度进行HPLC分离。溶剂A：乙腈；溶剂B：于10mM磷酸铵缓冲液中的20mM四丁基磷酸铵(TBAP)。
甘油-3-磷酸(G3P)、DHAP和羟醛缩合产物的LCMS分析
使用Prieto-Blanc等(2010)中描述的方法的改进方法分离G3P和DHAP。色谱条件为SIELC ObeliscN柱(250mm)(利用50％流动相A，50％流动相B)，持续30分钟。流动相A：0.1％甲酸；流动相b：含有0.1％乙酸的甲醇。利用Agilent 6120Quadroploe LCMS，使用API-ES模式进行质谱分光光度检测。通过对离子171进行选定的离子监测来定量甘油-3-磷酸，通过对离子169进行选定的离子监测来定量DHAP，通过对甘油、甘油-3-磷酸(G3P)和DHAP的GCMS分析进行选定的离子监测来定量3种羟醛缩合产物：果糖-1,6-二磷酸、“AP”和“XP”。
可在用吡啶中的MSTFA衍生后分离和检测所有三种分析物。将样品在液氮中快速冷冻，然后冷冻干燥过夜。将所得的冻干粉末重悬于50μL 240mM的于吡啶溶液中的甲氧胺-HCl。在65℃下孵育50分钟后，加入80μL MSTFA，并将样品在65℃下再孵育50分钟。以10,000g离心10分钟。可将样品在-20℃储存长达5天。使用以下程序用HP5-MS柱(Agilent)进行GC-MS分离。1mL/分钟He，在100℃下保持0.2分钟，然后以10℃/分钟的速率升至250℃并保持10分钟。喷射器温度：280℃。注射1μL样品，4分钟后通过对DHAP(m/z 400,315,299,73)、G3P(m/z 357,299,73)和甘油(m/z 205,147,73)进行选定的离子监测来检测产物。
峰面积范围差异使得该方法对甘油和甘油-3-磷酸最有用，而对于浓度低于100μM的DHAP不适用。
N6-2AE-NAD的合成
向溶于2mL去离子水中的NAD(1g,1.505mmol)溶液中滴加乙烯亚胺(4.25mmol)，通过加入70％高氯酸使溶液保持在pH 3.2。将反应混合物在室温下搅拌50小时，同时使pH保持为2-3，然后加入1.75mL去离子水以使沉淀增溶。通过加入冰冷的乙醇使产物沉淀，并用乙醇洗涤沉淀物。将所得的N1-2AE-NAD和NAD的混合物溶于水(10mL)中并用0.1M LiOH调整至pH 6.5。将溶液在50℃下搅拌7小时，将pH保持在6.5，然后冷冻，得到产物(为N6-2AE-NAD和NAD的混合物)。
NAD-2AE-PEG24-MAL的合成
向搅拌的于PBS(pH 7.4，1.0mL)中的N6-2AE-NAD/NAD(14.7mg混合物，约0.0104mmol N6-2AE-NAD)溶液中添加于PBS(1mL)中的Mal-PEG24-NHS(17.4mg，0.0124mmol)的溶液。在室温下搅拌该溶液过夜。通过HPLC(0→50％MeCN+0.1％TFA，历时18分钟)分析混合物。Rt 17.8分钟ESI+实测值662.62(M/3，计算值662.65)和993.42(M/2，计算值993.98)。通过pHPLC纯化混合物，并合并Rt 17.8分钟时的级分并冻干，得到纯的NAD--2AE-PEG24-MAL(5.4mg，26％)。
NAD-2AE-PEG24-MAL至BiF2的缀合
在用含有0.1mM TCEP的PBS平衡的Superdex S200 2660柱上通过凝胶过滤进一步纯化NTA纯化的BiF2。收集在177mL(针对二聚体BiF2的预期体积)处洗脱的主峰，并脱盐至脱气的PBS中。收集蛋白质并向BiF2溶液(60mL，7.8μM)中添加0.58mL 0.8mM NAD-2AE-PEG24-MAL(等摩尔量)。在加入TCEP至终浓度1mM之前，在4℃进行反应1小时。如上所述，在含有0.1mM TCEP的PBS中通过凝胶过滤纯化蛋白质缀合物，同时监测259nm、280nm和450nm处的吸光度。收集在177mL处洗脱的蛋白质的主峰并进行浓缩(Amicon 10kDa MWCO浓缩器)。在还原条件下在Invitrogen 4-12％梯度凝胶上通过SDS-PAGE分析蛋白质。在Varian CaryBio 50分光光度计上测定蛋白质的紫外-可见光谱。向0.5mL蛋白质中加入1mL 7M GuHCl，并将混合物在室温下孵育30分钟，然后通过Pall Nanosep 10kDa MWCO浓缩器进行浓缩。去除渗余物(100μl)，并将膜用2x 0.5mL 7M GuHCl洗涤，然后用0.5mL含有0.1mM TCEP的PBS洗涤。将洗出液与渗余物合并，并记录渗余物和滤液的紫外-可见光谱。
本领域技术人员将会理解，可在不背离如广泛描述的本发明的精神或范围的情况下，对具体实施方案中所示的本发明进行多种变化和/或修改。因此，本实施方案在所有方面都被认为是说明性的而不是限制性的。
本申请要求2015年7月20日提交的AU 2015902880和2015年7月24日提交的2015902961的优先权，所述申请的公开内容通过引用并入本文。
以上讨论的所有出版物均整体并入本文。
已包括在本说明书中的对文件、法案、材料、装置、物品等的任何讨论仅出于为本发明提供背景的目的。不应承认，这些事物中的任何或所有因其在本申请的优先权日之前存在而形成现有技术基础的一部分，或是与本发明相关的领域中的公知常识。
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Claims (38)

1.一种分离的酶复合物，所述酶复合物包含：
a)辅因子，
b)需要所述辅因子进行酶促反应的第一酶，和
c)使所述辅因子再循环的第二酶，
其中所述第一酶、第二酶和辅因子通过共价附接形成所述酶复合物，并且其中所述辅因子经由系链共价附接，所述系链允许所述辅因子被所述第一酶使用并被所述第二酶再循环。
2.如权利要求1所述的酶复合物，其中所述辅因子选自由ATP/ADP、NAD+/NADH、NADP+/NADPH和FAD+/FADH2组成的组。
3.如权利要求1或权利要求2所述的酶复合物，其中所述辅因子具有核糖核苷酸核心。
4.如权利要求2或权利要求3所述的酶复合物，其中所述系链经由至所述核糖核苷酸核心的碱基部分的C-N键共价附接至所述核糖核苷酸核心。
5.根据权利要求1至3中任一项所述的酶复合物，其中所述系链包括聚乙二醇(PEG)链、烃链、多肽、多核苷酸。
6.如权利要求5所述的酶复合物，其中所述聚乙二醇链的长度为PEG2–PEG48(即(-CH2CH2O-)2至(-CH2CH2O-)48)。
7.如权利要求5所述的酶复合物，其中所述烃链的长度为C12–C18。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的酶复合物，其中所述辅因子被栓系至所述酶之一。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的酶复合物，其中所述第一和第二酶通过接头共价附接。
10.如权利要求9所述的酶复合物，其中所述辅因子被栓系至所述接头。
11.如权利要求9或权利要求10所述的酶复合物，其中所述接头是氨基酸接头。
12.如权利要求11所述的酶复合物，其中所述接头包含Cys、Thr、Glu或Lys氨基酸残基。
13.如权利要求11或权利要求12所述的酶复合物，其中所述接头包含GlySerSer氨基酸残基重复序列(GlySerSer)n。
14.如权利要求13所述的酶复合物，其中所述接头包含(GlySerSer)3Cys(GlySerSer)3。
15.根据权利要求1至14中任一项所述的酶复合物，其中所述第一酶选自由以下组成的组：
i)激酶；
ii)脱氢酶；
iii)加氧酶；
iv)醛缩酶；
v)还原酶；
vi)合酶。
16.根据权利要求1至15中任一项所述的酶复合物，其中所述第二酶选自由以下组成的组：
i)激酶；
ii)脱氢酶；
iii)氧化酶；
iv)还原酶；
v)过氧化物酶。
17.根据权利要求1至16中任一项所述的酶复合物，其中所述复合物包含：
i)鹿儿岛热球菌甘油激酶、耻垢分枝杆菌ATP激酶、ATP/ADP；
ii)大肠埃希氏菌甘油-3-磷酸脱氢酶、Clostridium aminoverlaricum NADH氧化酶、NAD/NADH；
iii)希瓦氏菌属黄酶、嗜热脱氮地芽孢杆菌醇脱氢酶、NAD/NADH；
iv)嗜热脱氮地芽孢杆菌醇脱氢酶、博伊丁假丝酵母甲酸脱氢酶、NADP/NADPH；或
v)枯草芽孢杆菌黄酶、博伊丁假丝酵母甲酸脱氢酶、NADP/NADPH。
18.根据权利要求1至17中任一项所述的酶复合物，其还包含用于将所述复合物缀合至固体支撑物的共价附接的缀合模块。
19.如权利要求18所述的酶复合物，其中所述缀合模块通过接头共价附接至所述第一酶或所述第二酶。
20.如权利要求18或权利要求19所述的酶复合物，其中所述缀合模块是蛋白质。
21.如权利要求20所述的酶复合物，其中所述蛋白质选自由以下组成的组：
i)酯酶；
ii)链霉亲和素；
iii)谷胱甘肽S-转移酶；
iv)金属结合蛋白；
v)纤维素结合蛋白；
vi)麦芽糖结合蛋白；和
vii)抗体或其抗原结合片段。
22.如权利要求21或权利要求22所述的酶复合物，其中所述接头是如权利要求11至14中任一项中定义的接头。
23.根据权利要求18至22中任一项所述的酶复合物，其中所述复合物包含：
i)鹿儿岛热球菌甘油激酶、耻垢分枝杆菌ATP激酶、ATP/ADP、嗜酸脂环酸杆菌酯酶；或
ii)大肠埃希氏菌甘油-3-磷酸脱氢酶、Clostridium aminoverlaricum NADH氧化酶、NAD/NADH、嗜酸脂环酸杆菌酯酶。
24.根据权利要求18至23中任一项所述的酶复合物，其共价或非共价地附接至所述固体支撑物。
25.如权利要求24所述的酶复合物，其中所述所述固体支撑物是官能化的聚合物。
26.如权利要求25所述的酶复合物，其中所述官能化的聚合物选自由以下组成的组：琼脂糖、棉、聚丙烯腈、聚酯、聚酰胺、蛋白质、核酸、多糖、碳纤维、石墨烯、玻璃、二氧化硅和聚氨酯。
27.根据权利要求24至26中任一项所述的酶复合物，其中所述所述固体支撑物呈珠粒、基质、编织纤维或凝胶形式。
28.一种用于产生根据权利要求1至17中任一项所述的酶复合物的方法，所述方法包括：
i)在宿主细胞或无细胞表达系统中表达编码包含所述第一酶和所述第二酶的嵌合蛋白的多核苷酸；以及
ii)经由所述系链将所述辅因子附接至所述嵌合蛋白。
29.如权利要求28所述的方法，其中所述第一酶和所述第二酶通过接头分离，并且步骤ii)包括将所述系链共价附接至所述接头。
30.如权利要求28或权利要求29所述的方法，其中所述嵌合蛋白还包含如权利要求20或权利要求21所述的缀合模块蛋白。
31.如权利要求30所述的方法，其还包括将所述酶复合物缀合至固体支撑物。
32.根据权利要求28至32中任一项所述的方法，其中所述宿主细胞是细菌细胞、酵母细胞、植物细胞或动物细胞。
33.一种用于产生产物的方法，所述方法包括，
i)提供根据权利要求1至27中任一项所述的酶复合物和所述第一酶的底物，以及
ii)在足以使所述第一酶将所述底物转化成产物并且足以使所述第二酶再循环所述辅因子以供所述第一酶使用的条件下，孵育所述酶复合物和底物一定时间。
34.如权利要求33所述的方法，其包括两个或更多个酶促步骤，并且使用根据权利要求1至27中任一项所述的两种不同的酶复合物进行所述酶促步骤中的至少两个。
35.如权利要求33或权利要求34所述的方法，其在生物反应器中进行。
36.如权利要求35所述的方法，其中所述生物反应器是连续流动生物反应器。
37.一种生物反应器，其包含至少一种根据权利要求1至27中任一项所述的酶复合物。
38.一种组合物，其包含至少一种根据权利要求1至27中任一项所述的酶复合物。
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