CN116875578A - 一种三联体融合酶及其制备方法和以之制备烟酰胺单核苷酸的方法 - Google Patents

一种三联体融合酶及其制备方法和以之制备烟酰胺单核苷酸的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种三联体融合酶及其制备方法和以之制备烟酰胺单核苷酸的方法，其中所述三联体融合酶为一个烟酰胺磷酸核糖转移酶的肽链C端与一个核糖激酶的肽链N端相连，和该核糖激酶的肽链C端与一个核糖磷酸焦磷酸激酶的肽链N端相连的三联体多肽链，其中以所述三联体融合酶制备烟酰胺单核苷酸的方法是一种生物催化法，其以烟酰胺、核糖及ATP(腺嘌呤核苷三磷酸)为原料，和以所述三联体融合酶为酶催化剂，相对于现有的全酶法基于一次发酵即可制得烟酰胺单核苷酸，因而同全酶法具有安全与环保的优势，并相对于全酶法简化了工艺步骤而具有高生产效率和低廉的生产成本的优势。

Description

一种三联体融合酶及其制备方法和以之制备烟酰胺单核苷酸 的方法
技术领域
本发明涉及β-烟酰胺单核苷酸(NMN)合成技术领域，特别涉及一种三联体融合酶及其制备方法和以之制备烟酰胺单核苷酸的方法。
背景技术
NMN(全称：β-烟酰胺单核苷酸，别名：烟酰胺单核苷酸)是一种自然存在的具有生物活性核苷酸，其存在于各种生物体内，也是人体内固有的物质，同时富含在一些水果和蔬菜中，因烟酰胺属于维生素b3，故此NMN属于维生素b族衍生物范畴，其广泛参与人体多项生化反应，与免疫、代谢息息相关。
具体地，NMN是肌体合成烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)的直接前体，补充NMN是提升肌体NAD的含量水平的最有效途径，其中NAD是生物体内的脱氢酶的一种辅酶，生物体许多基本的代谢运动，例如碳水化合物、蛋白质、脂肪的分解，都离不开脱氢酶，许多脱氢酶必须在辅酶NAD的参与下才能促使代谢运动，故NAD在生物体的代谢运动中不可或缺，其对维持全身健康和平衡都至关重要。因此，通过补充NMN的方式提升肌体NAD的含量水平对于促进肌体正常的新陈代谢具有广泛而深远的健康意义，特别对于肌体NAD的含量水平较低的长者而言，NMN是目前国际范围经充足的实验验证和广泛的学术论证被认为最有效的抗衰老成分，在全球知名期刊如《科学》、《细胞》、《自然》等均刊登有积极面文章。然而，通过进食自然食物的方式并无法获得足够的NMN，因此合成的NMN有望在商业上成为全球范围大规模应用的膳食补充剂。
目前，NMN的现有合成技术有发酵法、化学合成法以及生物催化法三种方法。其中发酵法需要构建产生NMN微生物菌种，在此微生物大量培养繁殖的过程中，由菌体细胞合成NMN。由于各个物种包括低等的单细胞生物体内催化合成NMN的关键酶(NAMPT，烟酰胺磷酸核糖转移酶)的基础活性都普遍很低，使构建高效表达NMN的菌种异常困难，又因为NMN的合成路线长，涉及多酶体系及天然的分解酶系统，所以高效大规模的发酵法生产NMN的生产方法十分困难，工艺成本高，产品没有市场竞争力。化学合成法是以烟酰胺(或烟酸)、四乙酰核糖、三氯氧磷等基础原料，用化学方法先合成烟酰胺核糖(NR)，再进一步将NR磷酸化得到NMN。该方法的主要问题在于第二步的化学磷酸化步骤涉及易燃易爆及剧毒，大规模产业化面临严重的环保与安监问题，也存在化学对映体杂质及毒性原料及溶剂残留等问题，其产品长期人体应用的安全性疑虑是面对消费者难以消除的问题。生物催化法因不含机溶剂残留，也不存在手性问题且制备的NMN与肌体内的同型而成为目前最绿色环保无公害的NMN的制备方法。现有的生物催化法中，全酶法是肌体天然的合成方法，在安全与环保方面的优势是显而易见的，该方法是以烟酰胺、核糖及ATP(腺嘌呤核苷三磷酸)等为基础原料，经历三步酶促反应形成NMN，其难点在于涉及三个酶的表达而需要进行三次发酵和纯化步骤，因而具有较低的生产效率和对应较高的生产成本而难以实现规模化生产，因此设法提高全酶法的生产效率以对应降低其生产成本对于提高全酶法的市场竞争力具有重要的价值和迫切的商业需求。
发明内容
本发明的一个目的在于提供一种三联体融合酶及其制备方法和以之制备烟酰胺单核苷酸的方法，其中以所述三联体融合酶制备烟酰胺单核苷酸的方法是一种生物催化法，其以烟酰胺、核糖及ATP(腺嘌呤核苷三磷酸)为原料，和以所述三联体融合酶为酶催化剂，相对于现有的全酶法基于一次发酵即可制得烟酰胺单核苷酸，因而同全酶法具有安全与环保的优势，并相对于全酶法简化了工艺步骤而具有高生产效率和低廉的生产成本的优势。
本发明的另一个目的在于提供一种三联体融合酶及其制备方法和以之制备烟酰胺单核苷酸的方法，其中以所述三联体融合酶制备烟酰胺单核苷酸的方法相对于全酶法简化了工艺步骤而具有高生产效率和低廉的生产成本的优势，因而适宜大规模工业化生产而具有重要的商业价值。
本发明的另一个目的在于提供一种三联体融合酶及其制备方法和以之制备烟酰胺单核苷酸的方法，其中以所述三联体融合酶制备烟酰胺单核苷酸的方法相对于全酶法在简化了工艺步骤的同时，不会对工艺环境提出额外的要求，因而适于基于全酶法的工艺环境实现大规模的工艺转换，具有工艺转换成本低的优势而有利于基于全酶法的工艺环境大规模普及。
本发明的另一个目的在于提供一种三联体融合酶及其制备方法和以之制备烟酰胺单核苷酸的方法，其中所述三联体融合酶适于作为酶催化剂，基于生物催化法以烟酰胺、核糖及ATP(腺嘌呤核苷三磷酸)为原料经一次发酵制备酰胺单核苷酸，因而对于提高生物催化法的生产效率和降低生物催化法的生产成本以提高生物催化法的市场竞争力具有重要的价值。
本发明的另一个目的在于提供一种三联体融合酶及其制备方法和以之制备烟酰胺单核苷酸的方法，其中所述三联体融合酶为一个烟酰胺磷酸核糖转移酶的肽链C端与一个核糖激酶的肽链N端相连，和该核糖激酶的肽链C端与一个核糖磷酸焦磷酸激酶的肽链N端相连的三联体多肽链，对应该三联体多肽链的N端至C端依次为烟酰胺磷酸核糖转移酶，核糖激酶以及核糖磷酸焦磷酸激酶，如此以在将所述三联体融合酶作为酶催化剂，基于生物催化法以烟酰胺、核糖及ATP(腺嘌呤核苷三磷酸)为原料制备酰胺单核苷酸时，仅需一次发酵即可制得烟酰胺单核苷酸。
本发明的另一个目的在于提供一种三联体融合酶及其制备方法和以之制备烟酰胺单核苷酸的方法，其中在所述三联体融合酶的肽链序列中，烟酰胺磷酸核糖转移酶的肽链C端与核糖激酶的肽链N端经一个连接肽连接，核糖激酶的肽链C端与核糖磷酸焦磷酸激酶的肽链N端经另一个所述连接肽连接，其中所述连接肽具有SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列，如此以保障所述三联体融合酶中各酶的催化功能而能够在以所述三联体融合酶作为酶催化剂，基于生物催化法以烟酰胺、核糖及ATP(腺嘌呤核苷三磷酸)为原料制备酰胺单核苷酸时，仅需一次发酵即可制得烟酰胺单核苷酸。
根据本发明的一个方面，本发明提供一种三联体融合酶，所述三联体融合酶为一个烟酰胺磷酸核糖转移酶的肽链C端与一个核糖激酶的肽链N端相连，和该核糖激酶的肽链C端与一个核糖磷酸焦磷酸激酶的肽链N端相连的三联体多肽链，对应该三联体多肽链的N端至C端依次为烟酰胺磷酸核糖转移酶，核糖激酶以及核糖磷酸焦磷酸激酶。
在一实施例中，其中所述烟酰胺磷酸核糖转移酶是EC编号为EC.2.4.2.12的烟酰胺磷酸核糖转移酶，所述核糖激酶是EC编号为EC2.7.1.15的核糖激酶，所述核糖磷酸焦磷酸激酶是EC编号为EC2.7.6.1的核糖磷酸焦磷酸激酶。
在一实施例中，其中在所述三联体融合酶的肽链序列中，烟酰胺磷酸核糖转移酶的肽链C端与核糖激酶的肽链N端经一个连接肽连接，核糖激酶的肽链C端与核糖磷酸焦磷酸激酶的肽链N端经另一个所述连接肽连接，其中所述连接肽具有SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列。
在一实施例中，其中所述三联体融合酶具有对应于SEQ ID NO：2的氨基酸序列和对应于SEQ ID NO：3的核苷酸序列。
根据本发明的另一个方面，本发明还提供一种三联体融合酶的制备方法，所述三联体融合酶的制备方法包括步骤：
S1、构建与克隆含有所述三联体融合酶基因的载体质粒；
S2、将含所述三联体融合酶基因的载体质粒转化感受态细胞获得三联体融合酶菌种；以及
S3、扩增培养所述三联体融合酶菌种以获得含有所述三联体融合酶的产物；
其中在所述三联体融合酶的肽链序列中，烟酰胺磷酸核糖转移酶的肽链C端与核糖激酶的肽链N端经一个连接肽连接，核糖激酶的肽链C端与核糖磷酸焦磷酸激酶的肽链N端经另一个所述连接肽连接，其中所述连接肽具有对应于SEQ ID NO：1的氨基酸序列，所述烟酰胺磷酸核糖转移酶是EC编号为EC.2.4.2.12的烟酰胺磷酸核糖转移酶，所述核糖激酶是EC编号为EC2.7.1.15的核糖激酶，所述核糖磷酸焦磷酸激酶是EC编号为EC2.7.6.1的核糖磷酸焦磷酸激酶。
在一实施例中，其中在所述步骤S1中，所述载体为pRSET-A。
在一实施例中，其中在所述步骤S1中，选用SEQ ID NO：3的核苷酸序列构建与克隆含有三联体融合酶基因的载体质粒。
在一实施例中，其中在所述步骤S2中，所述感受态细胞为大肠杆菌E.coli BL21。
在一实施例中，其中在所述步骤S3中，进一步包括对扩增培养后的所述感受态细胞的收集步骤和冷冻保存步骤，以获得的三联体融合酶菌体细胞。
在一实施例中，其中在所述步骤S3中，进一步包括将冻存的所述三联体融合酶菌体细胞加水溶解获得三联体融合酶菌液的步骤。
在一实施例中，其中在所述步骤S3中，进一步包括所述三联体融合酶菌液经细胞破碎获得的三联体融合酶细胞破碎液的步骤。
在一实施例中，其中在所述步骤S3中，进一步包括以磁珠蛋白为载体自所述三联体融合酶细胞破碎液获取固定化三联体融合酶的步骤。
根据本发明的另一个方面，本发明还提供一种以三联体融合酶制备烟酰胺单核苷酸的方法，以所述三联体融合酶制备烟酰胺单核苷酸的方法是一种生物催化法，其以烟酰胺、核糖及ATP为原料，和以所述三联体融合酶为酶催化剂，其中在所述三联体融合酶的肽链序列中，烟酰胺磷酸核糖转移酶的肽链C端与核糖激酶的肽链N端经一个连接肽连接，核糖激酶的肽链C端与核糖磷酸焦磷酸激酶的肽链N端经另一个所述连接肽连接，其中所述连接肽具有对应于SEQ ID NO：1的氨基酸序列，所述烟酰胺磷酸核糖转移酶是EC编号为EC.2.4.2.12的烟酰胺磷酸核糖转移酶，所述核糖激酶是EC编号为EC2.7.1.15的核糖激酶，所述核糖磷酸焦磷酸激酶是EC编号为EC2.7.6.1的核糖磷酸焦磷酸激酶。
在一实施例中，其中所述三联体融合酶以酶液、酶冻干粉、含酶细胞、固定化酶以及固定化含酶细胞中的至少一种形态存在。
在一实施例中，其中烟酰胺、核糖及ATP中的至少一种原料以中间反应体形态存在。
在一实施例中，包括同一反应体系下加入腺苷、磷酸盐、可被酵母细胞代谢的糖类、酵母细胞、所述三联体融合酶、烟酰胺以及核糖进行一锅化反应以完成以下步骤：
(A)腺苷、磷酸盐以及可被酵母细胞代谢的糖类在酵母细胞的催化作用下反应生成ATP的步骤；和
(B)酶促反应生成烟酰胺单核苷酸的步骤，包括在所述三联体融合酶作用下，烟酰胺、核糖以及ATP反应生成烟酰胺单核苷酸、ADP、AMP以及磷酸盐的步骤，其中所述步骤(B)中生成的ADP、AMP以及磷酸盐自动用于所述步骤(A)中在酵母细胞作用下再生为ATP，以同时执行利用酵母细胞依能量代谢发酵反应生成ATP以及利用ATP进行酶促反应生成烟酰胺单核苷酸的两个步骤，其中酵母细胞是进行氧化磷酸化代谢的酵母细胞并被保持在所述同一反应体系中，以在酶促反应生产烟酰胺单核苷酸的步骤结束后将所述同一反应体系中生成的磷酸盐产物通过能量代谢的方式去除。
通过对随后的描述的理解，本发明进一步的目的和优势将得以充分体现。
具体实施方式
以下描述用于揭露本发明以使本领域技术人员能够实现本发明。但是，应当理解的是，详细描述和具体实施例仅为解释性目的而给出，因为在阅读该详细说明后，在本公开的精神和范围内所作出的各种改变和修饰，对于本领域技术人员来说将变得显而易见。
本发明提供一种三联体融合酶及其制备方法和以之制备烟酰胺单核苷酸的方法，其中所述三联体融合酶适于作为酶催化剂，基于生物催化法以烟酰胺、核糖及ATP(腺嘌呤核苷三磷酸)为原料经一次发酵制备酰胺单核苷酸，因而对于提高生物催化法的生产效率和降低生物催化法的生产成本以提高生物催化法的市场竞争力具有重要的价值。
具体地，所述三联体融合酶为一个烟酰胺磷酸核糖转移酶的肽链C端与一个核糖激酶的肽链N端相连，和该核糖激酶的肽链C端与一个核糖磷酸焦磷酸激酶的肽链N端相连的三联体多肽链，对应该三联体多肽链的N端至C端依次为烟酰胺磷酸核糖转移酶，核糖激酶以及核糖磷酸焦磷酸激酶，如此以在将所述三联体融合酶作为酶催化剂，基于生物催化法以烟酰胺、核糖及ATP(腺嘌呤核苷三磷酸)为原料制备酰胺单核苷酸时，仅需一次发酵即可制得烟酰胺单核苷酸。
进一步地，在本发明的描述中，术语“烟酰胺磷酸核糖转移酶”是EC编号为EC.2.4.2.12的烟酰胺磷酸核糖转移酶，其优选地来源于Haemophilus ducreyi，Musmusculus,Homo sapiens,Rattus norvegicus以及Shewanella oneidensis中的至少一种；术语“核糖激酶”是EC编号为EC2.7.1.15的核糖激酶，其优选地来源于Bacillus subtilis,Klebsiella aerogenes,Escherichia coli str.K-12,Mycobacterium tuberculosis以及Salmonella entrica中的至少一种；术语“核糖磷酸焦磷酸激酶”是EC编号为EC2.7.6.1的核糖磷酸焦磷酸激酶，其优选地来源于Methanocaldococcus jannaschii,Bacillussubtilis,Escherichia coli,Mycobacterium tuberculosis以及Pyrobaculumcalidifontis中的至少一种。
其中在所述三联体融合酶的肽链序列中，烟酰胺磷酸核糖转移酶的肽链C端与核糖激酶的肽链N端经一个连接肽连接，核糖激酶的肽链C端与核糖磷酸焦磷酸激酶的肽链N端经另一个所述连接肽连接，其中所述连接肽具有SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列，如此以保障所述三联体融合酶中各酶的催化功能而能够在以所述三联体融合酶作为酶催化剂，基于生物催化法以烟酰胺、核糖及ATP(腺嘌呤核苷三磷酸)为原料制备酰胺单核苷酸时，仅需一次发酵即可制得烟酰胺单核苷酸。
所述连接肽的氨基酸序列(SEQ ID NO：1)为：
GlyGlyGlyGlySerGluAlaAlaAlaLysGluAlaAlaAlaLysGluAlaAlaAlaLysGlyGlyGlyGlySer
示例地，在所述烟酰胺磷酸核糖转移酶选自GenBank中登录号为WP_010945301的蛋白序列，所述核糖激酶选自GenBank中登录号为WP_001300603.1的蛋白序列，所述核糖磷酸焦磷酸激酶选自GenBank中登录号为WP_209320027.1的蛋白序列时，所述三联体融合酶的氨基酸序列(SEQ ID NO：2)和核苷酸序列(SEQ ID NO：3)分别为：
SEQ ID NO：2
MetAspAsnLeuLeuAsnTyrSerSerArgAlaSerAlaIleProSerLeuLeuCysAspPheTyrLysThrSerHisArgIleMetTyrProGluCysSerGlnIleIleTyrSerThrPheThrProArgSerAsnGluGlnAlaProTyrLeuThrGlnValValSerPheGlyPheGlnAlaPheIleIleLysTyrLeuIleHisTyrPheAsnAspAsnPhePheSerArgAspLysHisAspValValThrGluTyrSerAlaPheIleGluLysThrLeuGlnLeuGluAspThrGlyGluHisIleAlaLysLeuHisGluLeuGlyTyrLeuProIleArgIleLysAlaIleProGluGlyLysThrValAlaIleLysValProValMetThrIleGluAsnThrHisSerAspPhePheTrpLeuThrAsnTyrLeuGluThrLeuIleAsnValSerLeuTrpGlnProMetThrSerAlaSerIleAlaPheAlaTyrArgThrAlaLeuIleLysPheAlaAsnGluThrCysAspAsnGlnGluHisValProPheGlnSerHisAspPheSerMetArgGlyMetSerSerLeuGluSerAlaGluThrSerGlyAlaGlyHisLeuThrSerPheLeuGlyThrAspThrIleProAlaLeuSerPheValGluAlaTyrTyrGlySerSerSerLeuIleGlyThrSerIleProAlaSerGluHisSerValMetSerSerHisGlyValAspGluLeuSerThrPheArgTyrLeuMetAlaLysPheProHisAsnMetLeuSerIleValSerAspThrThrAspPheTrpHisAsnIleThrValAsnLeuProLeuLeuLysGlnGluIleIleAlaArgProGluAsnAlaArgLeuValIleArgProAspSerGlyAsnPhePheAlaIleIleCysGlyAspProThrAlaAspThrGluHisGluArgLysGlyLeuIleGluCysLeuTrpAspIlePheGlyGlyThrValAsnGlnLysGlyTyrLysValIleAsnProHisIleGlyAlaIleTyrGlyAspGlyValThrTyrGluLysMetPheLysIleLeuGluGlyLeuGlnAlaLysGlyPheAlaSerSerAsnIleValPheGlyValGlyAlaGlnThrTyrGlnArgAsnThrArgAspThrLeuGlyPheAlaLeuLysAlaThrSerIleThrIleAsnGlyGluGluLysAlaIlePheLysAsnProLysThr
AspAspGlyPheLysLysSerGlnLysGlyArgValLysValLeuSerArgAspThrTyrValAspGlyL
euThrSerAlaAspAspPheSerAspAspLeuLeuGluLeuLeuPheGluAspGlyLysLeuLeuArg
GlnThrAspPheAspGluIleArgGlnAsnLeuLeuValSerArgThrThrLeuGlyGlyGlyGlySer
GluAlaAlaAlaLysGluAlaAlaAlaLysGluAlaAlaAlaLysGlyGlyGlyGlySerGlnAsnAlaG
lySerLeuValValLeuGlySerIleAsnAlaAspHisIleLeuAsnLeuGlnSerPheProThrProGlyG
luThrValThrGlyAsnHisTyrGlnValAlaPheGlyGlyLysGlyAlaAsnGlnAlaValAlaAlaGly
ArgSerGlyAlaAsnIleAlaPheIleAlaCysThrGlyAspAspSerIleGlyGluSerValArgGlnGln
LeuAlaThrAspAsnIleAspIleThrProValSerValIleLysGlyGluSerThrGlyValAlaLeuIlePh
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SEQ ID NO：3
atggacaacctgctgaactatagtagtcgtgcgtcggccattccgtcgctgctgtgtgacttttataaaacctcccaccgtattatgtatccggaatgtagccagattatttactccacctttacccctcgtagcaacgaacaagctccttatctgacccaagttgtttcctttggttttcaggcatttattattaaatacctgatccattacttcaacgacaactttttttctcgtgataaacacgatgttgtgaccgagtattcagcctttattgaaaaaaccctgcagctggaagataccggtgaacatattgcaaaactgcatgaactgggttatctgccgattcgtattaaagcaattccggaaggtaaaaccgttgcaattaaagttccggttatgaccattgaaaatacccatagcgattttttttggctgaccaattatctggaaaccctgattaatgttagcctgtggcagccgatgaccagcgcaagcattgcatttgcatatcgtaccgcactgattaaatttgcaaatgaaacctgtgataatcaggaacatgttccgtttcagagccatgattttagcatgcgtggtatgagcagcctggaaagcgcagaaaccagcggtgcaggtcatctgaccagctttctgggtaccgataccattccggcactgagctttgttgaagcatattatggtagcagcagcctgattggtaccagcattccggcaagcgaacatagcgttatgagcagccatggtgttgatgaactgagcacctttcgttatctgatggcaaaatttccgcataatatgctgagcattgttagcgataccaccgatttttggcataatattaccgttaatctgccgctgctgaaacaggaaattattgcacgtccggaaaatgcacgtctggttattcgtccggatagcggtaatttttttgcaattatttgtggtgatccgaccgcagataccgaacatgaacgtaaaggtctgattgaatgtctgtgggatatttttggtggtaccgttaatcagaaaggttataaagttattaatccgcatattggtgcaatttatggtgatggtgttacctatgaaaaaatgtttaaaattctggaaggtctgcaggcaaaaggttttgcaagcagcaatattgtttttggtgttggtgcacagacctatcagcgtaatacccgtgataccctgggttttgcactgaaagcaaccagcattaccattaatggtgaagaaaaagcaatttttaaaaatccgaaaaccgatgatggttttaaaaaaagccagaaaggtcgtgttaaagttctgagccgtgatacctatgttgatggtctgaccagcgcagatgattttagcgatgatctgctggaactgctgtttgaagatggtaaactgctgcgtcagaccgattttgatgaaattcgtcagaatctgctggttagccgtaccaccctgggcggtggaggcagtgaagcggctgcaaaagaggctgccgcaaaggaagcagccgcgaaaggtggaggtggcagtcagaacgccggtagtctggttgttctggggagcattaacgccgaccacattctgaacctgcagagctttccgaccccgggtgaaacagtgacgggtaatcactatcaggttgcctttggtggaaaaggtgccaatcaggcagttgcagcaggtcgtagtggagcaaacattgcctttattgcatgtaccggcgacgatagcattggggaaagcgtccgtcagcagctggcaacagataatatcgatattaccccagttagtgttattaaaggtgaaagcaccggtgtggcactgatttttgttaacggtgaaggggaaaatgttattggaattcatgcaggtgcaaatgcagcactgagcccggcactggttgaggcacaacgtgaacgtattgcaaacgcgagcgcactgctgatgcagctggaaagtccgctggaaagtgtgatggcagcagcaaaaattgcacatcaaaataaaacaattgttgcactgaatccagcaccggcacgtgaactgcctgatgaactgctggcgctggttgatattattaccccgaatgaaacggaagcagaaaaactgaccggtattcgcgtggaaaacgatgaagacgcagcaaaagccgcccaggtgctgcatgaaaaaggtatccgtaccgtgctgattaccctgggtagccgtggtgtgtgggcaagtgttaatggagaaggtcagcgtgtgccgggttttcgtgttcaggcagttgatacaattgcagcagggga tacctttaatggtgctctgattaccgcgctgctggaggaaaaacctctgcctgaagcaattcgttttgcacatgcagcagccgcaatcgcagttacccgtaaaggcgcacaaccgagcgttccttggcgtgaagaaattgacgcatttctggatcgtcagcgtggcggtggaggcagtgaagcggctgcaaaagaggctgccgcaaaggaagcagccgcgaaaggtggaggtggcagtatcgtggttagcggcagccagagccagaacctggcatttaaagttgcgaaactgctgaacaccaaactgacccgcgtggaatataaacgctttccggataatgaaatttatgtgcgtatcgttgatgaaattaacgatgatgaagcagtcattatcaatacccagaaaaatcagaacgatgcaattgttgaaaccattctgctgtgtgatgcactgcgtgatgaaggtgttaaaaagattaccctggttgcaccgtatctggcatacgctcgtcaggataaaaagtttaatccaggtgaagcaattagcattcgtgctctggccaaaatttatagcaatattgttgataaactgatcaccattaacccgcatgaaactcatatcaaagatttttttaccatcccttttatctatggcgatgcagttccgaaactggctgaatatgttaaagataaactgaatgatccgatcgtgctggccccggataaaggtgcactggaatttgcaaaaaccgcaagcaaaattctgaatgcagaatatgattatctggaaaaaacccgtctgagcccgaccgaaattcagattgcaccgaaaaccctggatgcaaaagatcgtgatgtttttattgttgatgatattattagcaccggtggtaccatggcaaccgcagttaaactgctgaaagaacagggtgcaaaaaaaattattgcagcatgtgttcatccggttctgattggtgatgcactgaataaactgtatagcgcaggtgttgaagaagttgttggtaccgatacctatctgagcgaagttagcaaagttagcgttgcagaagttattgttgatctgctgggcggtggaggcagtgaagcggctgcaaaagaggctgccgcaaaggaagcagccgcgaaaggtggaggtggcagtcatcaccatcaccatcaccatcac
值得一提的是，在不影响所述三联体融合酶的活性的前提下，所述三联体融合酶允许相对于SEQ ID NO：2的氨基酸序列或SEQ ID NO：3的核苷酸序列在一个或几个位置具有变化，包括基于相应氨基酸或核苷酸的取代、插入或缺失引起的相对于SEQ ID NO：2的氨基酸序列或SEQ ID NO：3的核苷酸序列的变化，其中，取代是指用不同的核苷酸或氨基酸置换占用一个位置的核苷酸或氨基酸，插入是指在邻接并且紧随占据位置的核苷酸或氨基酸之后添加核苷酸或氨基酸，缺失是指去除占据某一位置的核苷酸或氨基酸。
也就是说，在本发明提供的以烟酰胺磷酸核糖转移酶，核糖激酶以及核糖磷酸焦磷酸激酶顺序相连而融合形成的所述三联体融合酶中，所述烟酰胺磷酸核糖转移酶是EC编号为EC.2.4.2.12的烟酰胺磷酸核糖转移酶，并包括具有相同催化作用的突变体而不构成对其氨基酸序列和核苷酸序列的具体限制；所述核糖激酶是EC编号为EC2.7.1.15的核糖激酶，并包括具有相同催化作用的突变体而不构成对其氨基酸序列和核苷酸序列的具体限制；所述核糖磷酸焦磷酸激酶是EC编号为EC2.7.6.1的核糖磷酸焦磷酸激酶，并包括具有相同催化作用的突变体而不构成对其氨基酸序列和核苷酸序列的具体限制。
为进一步理解本发明，本发明还提供所述三联体融合酶的制备方法，其中所述三联体融合酶的制备方法包括步骤：
S1、构建与克隆含有三联体融合酶基因的载体质粒；
S2、将含三联体融合酶基因的载体质粒转化感受态细胞获得三联体融合酶菌种；以及
S3、扩增培养所述三联体融合酶菌种以获得含有所述三联体融合酶的产物；
其中在所述三联体融合酶的肽链序列中，烟酰胺磷酸核糖转移酶的肽链C端与核糖激酶的肽链N端经一个连接肽连接，核糖激酶的肽链C端与核糖磷酸焦磷酸激酶的肽链N端经另一个所述连接肽连接，其中所述连接肽具有对应于SEQ ID NO：1的氨基酸序列，所述烟酰胺磷酸核糖转移酶是EC编号为EC.2.4.2.12的烟酰胺磷酸核糖转移酶，所述核糖激酶是EC编号为EC2.7.1.15的核糖激酶，所述核糖磷酸焦磷酸激酶是EC编号为EC2.7.6.1的核糖磷酸焦磷酸激酶。
值得一提的是，在本发明的描述中，其中在所述步骤S1中，术语“载体”是指线状或环状DNA分子，该分子包含编码多肽的多核苷酸并且该多核苷酸有效地连接于供用于其表达的控制序列。用于本发明的可能载体包括但不限于染色体、非染色体和合成DNA序列，例如细菌质粒、噬菌体DNA、酵母质粒以及从质粒和噬菌体DNA的组合中衍生的载体。具体在本发明的一个优选实施例中，所述载体为大肠杆菌表达载体(pRSET-A)，并具体选自美国Invitrogen公司的pRSET-A。
进一步地，在本发明的上述优选实施例中，所述烟酰胺磷酸核糖转移酶选自GenBank中登录号为WP_010945301的蛋白序列，所述核糖激酶选自GenBank中登录号为WP_001300603.1的蛋白序列，所述核糖磷酸焦磷酸激酶选自GenBank中登录号为WP_209320027.1的蛋白序列，对应在所述步骤S1中，选用SEQ ID NO：3的核苷酸序列构建与克隆含有三联体融合酶基因的载体质粒。
进一步地，其中在所述步骤S2中，术语“转化”具有本领域技术人员普遍理解的意思，其同术语“转染”和“转导”，即将外源性的DNA导入宿主细胞的过程。转化的方法包括任何将核酸导入细胞的方法，这些方法包括但不限于电穿孔法、磷酸钙沉淀法、氯化钙(CaCl2)沉淀法、微注射法、聚乙二醇(PEG)法、DEAE-葡聚糖法、阳离子脂质体法以及乙酸锂-DMSO法，术语“感受态细胞”即宿主细胞，用于本发明的感受态细胞可以是原核细胞或真核细胞，只要是能够导入本发明的含三联体融合酶基因的载体质粒的细胞即可。具体在本发明的上述优选实施例中，所述感受态细胞为大肠杆菌E.coli BL21。
此外，在所述步骤S3中，对所述感受态细胞的扩增培养可以根据本领域的常规方法进行，包括但不限于孔板培养、摇瓶培养、批次培养、连续培养和分批补料培养等，并可以根据实际情况适当地调整各种培养条件如温度、时间和培养基的pH值等。
可以理解的是，在所述步骤S3中，基于不同的应用和/或保存需求，含有所述三联体融合酶的产物的形态多样，其可以是基于对扩增培养后的所述感受态细胞的收集步骤和冷冻保存步骤获得的三联体融合酶菌体细胞；可以是将冻存的所述三联体融合酶菌体细胞加水溶解获得的三联体融合酶菌液；也可以是所述三联体融合酶菌液经细胞破碎步骤获得的三联体融合酶细胞破碎液；还可以是以磁珠蛋白为载体自所述三联体融合酶细胞破碎液获取的固定化三联体融合酶(磁酶)，本发明对此不做限制。
进一步地，本发明还提供以所述三联体融合酶制备烟酰胺单核苷酸的方法，其中以所述三联体融合酶制备烟酰胺单核苷酸的方法是一种生物催化法，其以烟酰胺、核糖及ATP(腺嘌呤核苷三磷酸)为原料，和以所述三联体融合酶为酶催化剂，相对于现有的全酶法基于一次发酵即可制得烟酰胺单核苷酸，因而同全酶法具有安全与环保的优势，并相对于全酶法简化了工艺步骤而具有高生产效率和低廉的生产成本的优势。
值得一提的是，由于以所述三联体融合酶制备烟酰胺单核苷酸的方法相对于全酶法简化了工艺步骤而具有高生产效率和低廉的生产成本的优势，因而适宜大规模工业化生产而具有重要的商业价值。并且以所述三联体融合酶制备烟酰胺单核苷酸的方法相对于全酶法在简化了工艺步骤的同时，不会对工艺环境提出额外的要求，因而适于基于全酶法的工艺环境实现大规模的工艺转换，具有工艺转换成本低的优势而有利于基于全酶法的工艺环境大规模普及。
可以理解的是，在以所述三联体融合酶制备烟酰胺单核苷酸的方法中所使用的所述三联体融合酶的具体存在形态和在相应存在形态下的纯化程度并不构成对本发明的限制，其可以是酶液、酶冻干粉、含酶细胞以及固定化酶和固定化含酶细胞中的至少一种存在形态，并且其在相应存在形态下的纯化程度可以是未经纯化的粗酶形态，也可以是经部分纯化或完全纯化的形态。
示例地，在一个实施例中，以摩尔浓度顺序为20mM、10mM、100mM以及50mM的D-核糖、烟酰胺、ATP以及氯化镁配置底物水溶液，和将20g固定化三联体融合酶(磁酶)加入100ml的所述底物水溶液，在37℃搅拌反应180分钟即可依HPLC方法检测到烟酰胺单核苷酸浓度为8.3mM。
可以理解的是，在本发明的这个实施例中，各反应物的浓度和反应条件仅作为示例，其并不构成对本发明的限制，在以本发明的所述三联体融合酶为酶催化剂的状态，本领域技术人员能够基于生物催化法轻易对反应物浓度和反应条件作出合理选择。
值得一提的是，以所述三联体融合酶制备烟酰胺单核苷酸的方法中，作为原料的烟酰胺、核糖及ATP(腺嘌呤核苷三磷酸)中的至少一种原料可选地以中间反应体形态存在，本发明对此亦不做限制。
示例地，为降低原料成本，本发明的一些实施例通过采用廉价的腺苷代替ATP，和在反应中引入酵母细胞依能量代谢将腺苷转化为ATP的方式，结合本发明的以所述三联体融合酶制备烟酰胺单核苷酸的方法实现ATP的重复利用和将形成的磷酸盐作为反应物。
对应以所述三联体融合酶制备烟酰胺单核苷酸的方法以烟酰胺、核糖、腺苷、磷酸盐以及可被酵母细胞代谢的糖类为原料，和以所述三联体融合酶以及酵母细胞为催化剂，将ATP的生成、烟酰胺单核苷酸的合成及ATP的利用统一在一个反应体系内进行，即可完成烟酰胺单核苷酸的高效合成，反应式为：烟酰胺+核糖+可被酵母细胞代谢的糖类+腺苷+磷酸盐+O2→烟酰胺单核苷酸+ATP+CO2+H2O。在该反应系统中，酵母细胞通过氧化磷酸化代谢过程，以可被酵母细胞代谢的糖类的脱氢氧化提供能量驱动磷酸盐与腺苷的结合生成一磷酸腺苷(AMP)，继而生成ADP及ATP；继而ATP驱动核糖生成5-磷酸核糖1-焦磷酸(PRPP)，PRPP再与烟酰胺反应生成烟酰胺单核苷酸。反应体系内原有及生成的ADP、AMP、腺苷及磷酸盐等也都能自动由酵母细胞转化为ATP继续参与反应，相对于现有的生物催化法能够将形成的磷酸盐作为反应物而省去了磷酸盐的去除工艺，并能够实现ATP的重复利用而省去了ATP的回收工艺和降低ATP原料消耗，如此以基于所述腺苷的参与简化烟酰胺单核苷酸产品的纯化工艺。
也就是说，在本发明的以所述三联体融合酶制备烟酰胺单核苷酸的方法包括同一反应体系下加入腺苷、磷酸盐、可被酵母细胞代谢的糖类、酵母细胞、所述三联体融合酶、烟酰胺以及核糖进行一锅化反应以完成以下步骤：
(A)腺苷、磷酸盐以及可被酵母细胞代谢的糖类在酵母细胞的催化作用下反应生成ATP的步骤；和
(B)酶促反应生成烟酰胺单核苷酸的步骤，包括在所述三联体融合酶作用下，烟酰胺、核糖及ATP反应生成烟酰胺单核苷酸、ADP、AMP及磷酸盐的步骤，其中所述步骤(B)中生成的ADP、AMP及磷酸盐自动用于所述步骤(A)中在酵母细胞作用下再生为ATP，以同时执行利用酵母细胞依能量代谢发酵反应生成ATP以及利用ATP进行酶促反应生成烟酰胺单核苷酸的两个步骤，其中酵母细胞是进行氧化磷酸化代谢的酵母细胞并被保持在所述同一反应体系中，以在酶促反应生产烟酰胺单核苷酸的步骤结束后将所述同一反应体系中生成的磷酸盐产物通过能量代谢的方式去除。
具体示例地，在一个实施例中，于1L反应体系中依次加入终浓度为50mM的腺苷，330mM磷酸氢二钾，70mM磷酸二氢钾，500mM葡萄糖，50mM氯化镁，5mM氯化锰，300g酿酒酵母，充分搅拌溶解后，控制反应温度为37℃，静置发酵30分钟。在上述酵母发酵液中加入终浓度为100mM的烟酰胺，100mM的D-核糖，及100g固定化三联体融合酶(磁酶)，300rpm搅拌反应，控制反应温度为37℃，采用自动滴定仪，以3M氢氧化钠控制反应pH为6.5。反应过程中用高效液相色谱检测NMN浓度，反应在四小时内结束，反应得到烟酰胺单核苷酸16.67g。
可以理解的是，在本发明的这个实施例中，各反应物的浓度和反应条件仅作为示例，其并不构成对本发明的限制，在以本发明的所述三联体融合酶为酶催化剂的状态，本领域技术人员能够基于生物催化法轻易对反应物浓度和反应条件作出合理选择。
本领域的技术人员应理解，上述描述所示的本发明的实施例只作为举例而并不限制本发明。本发明的目的已经完整并有效地实现。本发明的功能及结构原理已在实施例中展示和说明，在没有背离所述原理下，本发明的实施方式可以有任何变形或修改。

Claims (16)

1.一种三联体融合酶，其特征在于，所述三联体融合酶为一个烟酰胺磷酸核糖转移酶的肽链C端与一个核糖激酶的肽链N端相连，和该核糖激酶的肽链C端与一个核糖磷酸焦磷酸激酶的肽链N端相连的三联体多肽链，对应该三联体多肽链的N端至C端依次为烟酰胺磷酸核糖转移酶，核糖激酶以及核糖磷酸焦磷酸激酶。
2.根据权利要求1所述的三联体融合酶，其中所述烟酰胺磷酸核糖转移酶是EC编号为EC.2.4.2.12的烟酰胺磷酸核糖转移酶，所述核糖激酶是EC编号为EC2.7.1.15的核糖激酶，所述核糖磷酸焦磷酸激酶是EC编号为EC2.7.6.1的核糖磷酸焦磷酸激酶。
3.根据权利要求2所述的三联体融合酶，其中在所述三联体融合酶的肽链序列中，烟酰胺磷酸核糖转移酶的肽链C端与核糖激酶的肽链N端经一个连接肽连接，核糖激酶的肽链C端与核糖磷酸焦磷酸激酶的肽链N端经另一个所述连接肽连接，其中所述连接肽具有SEQID NO：1所示的氨基酸序列。
4.根据权利要求3所述的三联体融合酶，其中所述三联体融合酶具有对应于SEQ IDNO：2的氨基酸序列和对应于SEQ ID NO：3的核苷酸序列。
5.一种三联体融合酶的制备方法，其特征在于，包括步骤：
S1、构建与克隆含有所述三联体融合酶基因的载体质粒；
S2、将含所述三联体融合酶基因的载体质粒转化感受态细胞获得三联体融合酶菌种；以及
S3、扩增培养所述三联体融合酶菌种以获得含有所述三联体融合酶的产物；
其中在所述三联体融合酶的肽链序列中，烟酰胺磷酸核糖转移酶的肽链C端与核糖激酶的肽链N端经一个连接肽连接，核糖激酶的肽链C端与核糖磷酸焦磷酸激酶的肽链N端经另一个所述连接肽连接，其中所述连接肽具有对应于SEQ ID NO：1的氨基酸序列，所述烟酰胺磷酸核糖转移酶是EC编号为EC.2.4.2.12的烟酰胺磷酸核糖转移酶，所述核糖激酶是EC编号为EC2.7.1.15的核糖激酶，所述核糖磷酸焦磷酸激酶是EC编号为EC2.7.6.1的核糖磷酸焦磷酸激酶。
6.根据权利要求5所述的三联体融合酶的制备方法，其中在所述步骤S1中，所述载体为pRSET-A。
7.根据权利要求6所述的三联体融合酶的制备方法，其中在所述步骤S1中，选用SEQ IDNO：3的核苷酸序列构建与克隆含有三联体融合酶基因的载体质粒。
8.根据权利要求7所述的三联体融合酶的制备方法，其中在所述步骤S2中，所述感受态细胞为大肠杆菌E.coliBL21。
9.根据权利要求5至8中任一所述的三联体融合酶的制备方法，其中在所述步骤S3中，进一步包括对扩增培养后的所述感受态细胞的收集步骤和冷冻保存步骤，以获得的三联体融合酶菌体细胞。
10.根据权利要求9所述的三联体融合酶的制备方法，其中在所述步骤S3中，进一步包括将冻存的所述三联体融合酶菌体细胞加水溶解获得三联体融合酶菌液的步骤。
11.根据权利要求10所述的三联体融合酶的制备方法，其中在所述步骤S3中，进一步包括所述三联体融合酶菌液经细胞破碎获得的三联体融合酶细胞破碎液的步骤。
12.根据权利要求11所述的三联体融合酶的制备方法，其中在所述步骤S3中，进一步包括以磁珠蛋白为载体自所述三联体融合酶细胞破碎液获取固定化三联体融合酶的步骤。
13.一种以三联体融合酶制备烟酰胺单核苷酸的方法，其特征在于，以所述三联体融合酶制备烟酰胺单核苷酸的方法是一种生物催化法，其以烟酰胺、核糖及ATP为原料，和以所述三联体融合酶为酶催化剂，其中在所述三联体融合酶的肽链序列中，烟酰胺磷酸核糖转移酶的肽链C端与核糖激酶的肽链N端经一个连接肽连接，核糖激酶的肽链C端与核糖磷酸焦磷酸激酶的肽链N端经另一个所述连接肽连接，其中所述连接肽具有对应于SEQ ID NO：1的氨基酸序列，所述烟酰胺磷酸核糖转移酶是EC编号为EC.2.4.2.12的烟酰胺磷酸核糖转移酶，所述核糖激酶是EC编号为EC2.7.1.15的核糖激酶，所述核糖磷酸焦磷酸激酶是EC编号为EC2.7.6.1的核糖磷酸焦磷酸激酶。
14.根据权利要求13所述的以三联体融合酶制备烟酰胺单核苷酸的方法，其中所述三联体融合酶以酶液、酶冻干粉、含酶细胞、固定化酶以及固定化含酶细胞中的至少一种形态存在。
15.根据权利要求14中所述的以三联体融合酶制备烟酰胺单核苷酸的方法，其中烟酰胺、核糖及ATP中的至少一种原料以中间反应体形态存在。
16.根据权利要求15中所述的以三联体融合酶制备烟酰胺单核苷酸的方法，包括同一反应体系下加入腺苷、磷酸盐、可被酵母细胞代谢的糖类、酵母细胞、所述三联体融合酶、烟酰胺以及核糖进行一锅化反应以完成以下步骤：
(A)腺苷、磷酸盐以及可被酵母细胞代谢的糖类在酵母细胞的催化作用下反应生成ATP的步骤；和
(B)酶促反应生成烟酰胺单核苷酸的步骤，包括在所述三联体融合酶作用下，烟酰胺、核糖以及ATP反应生成烟酰胺单核苷酸、ADP、AMP以及磷酸盐的步骤，其中所述步骤(B)中生成的ADP、AMP以及磷酸盐自动用于所述步骤(A)中在酵母细胞作用下再生为ATP，以同时执行利用酵母细胞依能量代谢发酵反应生成ATP以及利用ATP进行酶促反应生成烟酰胺单核苷酸的两个步骤，其中酵母细胞是进行氧化磷酸化代谢的酵母细胞并被保持在所述同一反应体系中，以在酶促反应生产烟酰胺单核苷酸的步骤结束后将所述同一反应体系中生成的磷酸盐产物通过能量代谢的方式去除。
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