CN104693270A - 一种用于融合蛋白的连接肽 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种用于融合蛋白的连接肽，其组成如下式(1)所示：(F)n(R)m (1)；其中，n和m为0～5的整数，且满足2≤n+m≤5，F表示氨基酸序列为GGGGS的柔性单元，R表示氨基酸序列为EAAAK的刚性单元，上述式(1)中F和R各自独立地以任意顺序排列。
Description
技术领域
本发明涉及一种用于融合蛋白构建的连接肽，以及编码其的DNA分子。
技术背景
重组蛋白技术已经成为了目前获取大量目的蛋白质的有力手段。利用基因重组等分子生物学和细胞生物学手段，将编码目的蛋白质产物的基因组装到大肠杆菌或其它原核、真核生物的蛋白质表达平台上，就能够大量、高效的表达所需要的蛋白质。同时，通过调整、改造蛋白质表达平台的元件，如启动子、终止子、操纵子、核糖体结合位点等，以及优化密码子，能对蛋白质的表达量进行按需调控。另外，根据突变实验的结果，或者结合生物信息学、结构生物学等，可以直接对蛋白质的氨基酸序列进行修改，进而设计和改造原有蛋白质的功能和结构。可以说，重组蛋白技术是人们研究蛋白质性能和利用蛋白质的重要基础。
融合蛋白技术是以蛋白质重组技术为基础发展起来的一项技术，在科学研究和生产领域都有广泛的应用。融合蛋白是指通过某种方式将两个原本由单独的基因编码的蛋白质(或蛋白质的结构域)实现分子水平的连接而获得的新型蛋白质。目前融合蛋白主要是通过将编码目的蛋白质(或蛋白结构域)的基因，利用分子生物学方法，连接而得到融合蛋白的编码基因，进而在蛋白质表达平台上进行融合蛋白的表达。构建融合蛋白的形式主要有两种，即首尾相接的串联融合和插入融合，而由于插入融合难度实现难度相对较大，目前应用中主要以串联融合为主。
发明内容
通过构建融合蛋白，可以实现蛋白质的多功能化。蛋白质往往具有其独特的生物学功能，如催化多种化学反应、调控其它蛋白质的活性、帮助蛋白多肽链的翻译后折叠以获得天然的三、四级结构等。通过合理的设计，将具有不同功能的蛋白质进行融合，能获得满足人们需要的多功能蛋白质。融合蛋白技术目前已得到广泛的应用。如通过将绿色荧光蛋白和目标蛋白进行融合，可以实现对目标蛋白的可视化跟踪；在此基础上，结合荧光共振转移技术，更能对蛋白质-蛋白质相互作用进行研究。另外，将对某种介质具有特异的亲和吸附特性的蛋白质和需要纯化的蛋白质进行融合，可以实现蛋白质的一步纯化，可以大大简化常规的蛋白质纯化流程；通过对融合位点进行合理设计，可以利用特定的蛋白酶对目标蛋白质以外的部分进行切割，获得高纯度的天然蛋白质。将催化多步反应的蛋白质(酶)构建融合蛋白，能减少反应中间产物的扩散效应、缩短其传递距离，极大的提高整体反应速率。在典型的酶制剂生产-应用的过程中，往往需要经过发酵-细胞破碎-分离纯化-催化等步骤，其中分离纯化中需要多种方法结合使用，才能从细胞裂解物中获取纯度较高的酶，步骤繁多。同时，在发酵和催化过程中需要对酶的活性进行必要的监控。这些都导致酶制剂的生产使用成本高，不利于其推广应用。利用融合蛋白技术，通过构建具有荧光-亲和吸附-催化等多功能的三重融合蛋白质，能够实现酶的一步纯化，且催化能在固定介质上原位进行，同时荧光能作为酶催化活性的实时指标，可以减少酶活测定的步骤。利用融合蛋白技术，通过过程集成的思想，极大的降低了酶制剂的生产成本，提高了生产效率。
然而，构建融合蛋白的过程中也会遇到各种问题，例如在单独表达时能正确折叠的蛋白质在融合蛋白中不能正确折叠；融合的两个蛋白质因为空间距离靠近从而导致活性位点的屏蔽；融合蛋白分子因不能正确折叠或其构象的原因而容易被蛋白酶降解；原本具有一定柔性的蛋白质催化域在融合之后失去了原有的功能；等等。这些问题的出现，往往导致融合蛋白活性的损失甚至完全失去。一般认为，构建融合蛋白后，原有蛋白质的活性会有一定程度的下降；一个有意义的融合蛋白其各部分的活性应该在原有蛋白质的50%以上。
为了解决以上问题，人们对融合蛋白的设计和构建进行了研究和探索，以提高融合蛋白的活性。如通过改变融合蛋白的首尾顺序，变换不同的融合位点，采用不同的融合方法，或者采用连接肽等方法。虽然这些方法都有成功的例子，但对于如何设计融合蛋白的构建策略，没有明确的理论指导，更多的是根据经验进行设计，通过试错的方式检验其效果。另外，这些方法没有普适性，对于特定的蛋白质来说，需要进行试验来确定其合适的构建策略。这些都制约了融合蛋白的发展和利用。
相比其它融合策略，使用连接肽(linker)具有多种优势。第一，组成连接肽的氨基酸具有多样性(20种常见氨基酸)，而且连接肽的长度也是可调参数之一，由此可以带给连接肽丰富的多样性(20的n次方种，n是连接肽的氨基酸残基数)，有利于对其进行工程改造；连接肽能为两个蛋白质提供一定的空间间隔，以有利于其顺利折叠而不相互干扰；连接肽能为两个蛋白质提供相互作用的可能性，利于相互间协同作用。
有不少文献报道了连接肽序列对于融合蛋白构建和表达的影响。例如，在构建单链抗体1F7的研究中，发现采用一个常规的Genex212连接肽(GSTSGSGKSSEGKG)来连接其轻链和重链时，不能获得蛋白质原有的催化活性，且蛋白质不稳定；通过构建具有随机序列的连接肽(18个氨基酸残基)的库进行筛选，才获得了具有活性的单链抗体。有研究者构建了绿色荧光蛋白和蓝色荧光蛋白的融合蛋白(GFP-BFP)，通过改变其连接肽的序列及长度，能影响GFP和BFP蛋白之间的空间距离。另外，研究者发现登革热病毒的NS28蛋白(一个N端为丝氨酸蛋白酶，C端为RNA解旋酶，连接肽是一段11个氨基酸残基的多肽)，通过在原173和174位点氨基酸残基之间插入甘氨酸残基，以及将174位的脯氨酸替换成甘氨酸，均导致两端蛋白质活性的显著下降，表明其天然连接肽所具有的长度和刚柔性是长期进化的结果，对该天然融合蛋白的功能具有重要意义。
但是目前对设计和构建连接肽的方法中还存在诸多问题(1)设计缺乏明确的指导原则，往往根据经验原则和实验基础，且针对某个融合蛋白的连接肽不具有普适性；(2)虽然连接肽序列可更改由此带来很大的多样性，但实际上使用的连接肽种类有限，制约了连接肽的应用。上述问题直接影响了所述方法在融合蛋白构建表达上的应用。
因此，本领域迫切需要开发出更丰富的、更适用于融合蛋白构建和表达的连接肽，且这些连接肽具有广泛的适用性和可移植性，以克服现有技术的缺陷。
本发明的目的在于提供一种用于融合蛋白的连接肽，其涉及如下方面：
1.一种连接肽，其组成如下式(1)所示：
(F)n(R)m (1)
其中，n和m为0～5的整数，且满足2≤n+m≤5，F表示氨基酸序列为GGGGS(Seq ID NO:1)的柔性单元，R表示氨基酸序列为EAAAK(Seq IDNO:2)的刚性单元，
上述式(1)中F和R各自独立地以任意顺序排列。
2.根据项1所述的连接肽，其中，n+m=2，所述连接肽为FF(Seq IDNO:3)、RR(Seq ID NO:4)、FR(Seq ID NO:5)或RF(Seq ID NO:6)。
3.根据项1所述的连接肽，其中，n+m=3，所述连接肽为FFF(Seq IDNO:7)、FFR(Seq ID NO:8)、FRF(Seq ID NO:9)、RFF(Seq ID NO:10)、FRR(SeqID NO:11)、RFR(Seq ID NO:12)、RRF(Seq ID NO:13)或RRR(Seq ID NO:14)。
4.根据项1所述的连接肽，其中，n+m=4，所述连接肽为FFFF(Seq IDNO:15)、FFFR(Seq ID NO:16)、FFRF(Seq ID NO:17)、FRFF(Seq ID NO:18)、RFFF(Seq ID NO:19)、FFRR(Seq ID NO:20)、FRRF(Seq ID NO:21)、RRFF(SeqID NO:22)、FRFR(Seq ID NO:23)、RFRF(Seq ID NO:24)、RFFR(Seq IDNO:25)、FRRR(Seq ID NO:26)、RFRR(Seq ID NO:27)、RRFR(Seq ID NO:28)、RRRF(Seq ID NO:29)或RRRR(Seq ID NO:30)。
5.根据项1所述的连接肽，其中，n+m=5，所述连接肽为FFFFF(Seq IDNO:31)、FFFFR(Seq ID NO:32)、FFFRF(Seq ID NO:33)、FFFRR(Seq IDNO:34)、FFRFF(Seq ID NO:35)、FFRFR(Seq ID NO:36)、FFRRF(Seq IDNO:37)、FFRRR(Seq ID NO:38)、FRFFF(Seq ID NO:39)、FRFFR(Seq IDNO:40)、FRFRF(Seq ID NO:41)、FRFRR(Seq ID NO:42)、FRRFF(Seq IDNO:43)、FRRFR(Seq ID NO:44)、FRRRF(Seq ID NO:45)、FRRRR(Seq IDNO:46)、RFFFF(Seq ID NO:47)、RFFFR(Seq ID NO:48)、RFFRF(Seq IDNO:49)、RFFRR(Seq ID NO:50)、RFRFF(Seq ID NO:51)、RFRFR(Seq IDNO:52)、RFRRF(Seq ID NO:53)、RFRRR(Seq ID NO:54)、RRFFF(Seq IDNO:55)、RRFFR(Seq ID NO:56)、RRFRF(Seq ID NO:57)、RRFRR(Seq IDNO:58)、RRRFF(Seq ID NO:59)、RRRFR(Seq ID NO:60)、RRRRF(Seq IDNO:61)或RRRRR(Seq ID NO:62)。
本发明的另一方面涉及一种DNA分子，其编码上述项1～5中任一项所述的连接肽。
本发明的另一方面涉及上述连接肽的用途，用于连接蛋白质、蛋白质结构域、多肽或抗体以构建融合蛋白。
利用本发明的连接肽，通过组合连接肽中的刚性单元和柔性单元的数量和排列，可以对由连接肽所连接的目的蛋白质的活性进行调控，并对目的蛋白质之间的距离进行调控，从而实现对融合蛋白的功能实现有效地调节和表达，从而发挥融合蛋白中各目标蛋白质的最优功效。
本发明的其他目的，在本说明书对本发明的描述中体现。另外本发明涉及的其它的特点和优点将在下面的详细说明中进行描述。
附图说明
图1大肠杆菌BL21(DE3)中表达PhoC-linker-GFP融合蛋白的细胞破碎上清的SDS-PAGE，其中条带1表示PhoC-FFFFF-GFP融合蛋白，条带2表示PhoC-RRRRR-GFP融合蛋白，以及条带3表示PhoC-FFFFR-GFP融合蛋白。
图2实施例1中三种具有不同连接肽的PhoC-linker-GFP融合蛋白的荧光活性、磷酸酶活性和磷酸转移酶活性的比较。
图3表达CFP-linker-YFP的细胞的破碎液上清SDS-PAGE。M是蛋白分子量标准，其中条带1表示CFP-FFFFR-YFP融合蛋白，条带2表示CFP-FFFRR-YFP融合蛋白，条带3表示CFP-FFFFF-YFP融合蛋白，条带4表示CFP-RRRRR-YFP融合蛋白，条带5表示CFP-FRRRR-YFP融合蛋白，条带6表示CFP-FFRRR-YFP融合蛋白。
图4实施例3中的六种不同连接肽的CFP-linker-YFP的CFP荧光和YFP荧光测定结果，其中横坐标0表示CFP-FFFFF-YFP融合蛋白，横坐标1表示CFP-FFFFR-YFP融合蛋白，横坐标2表示CFP-FFFRR-YFP融合蛋白，横坐标3表示CFP-FFRRR-YFP融合蛋白，横坐标4表示CFP-FRRRR-YFP融合蛋白，横坐标5表示CFP-RRRRR-YFP融合蛋白。
图5实施例3中六种不同连接肽的CFP-linker-YFP的净FRET(net FRET)及其线性拟合结果，其中横坐标0表示CFP-FFFFF-YFP融合蛋白，横坐标1表示CFP-FFFFR-YFP融合蛋白，横坐标2表示CFP-FFFRR-YFP融合蛋白，横坐标3表示CFP-FFRRR-YFP融合蛋白，横坐标4表示CFP-FRRRR-YFP融合蛋白，横坐标5表示CFP-RRRRR-YFP融合蛋白。
图6A和B实施例6中构建的10种PhoC-linker-GFP融合蛋白的磷酸酶活性，图中横坐标表示了其中linker的组成，顺序为从PhoC蛋白下游到GFP的上游。
图7A和B实施例6中构建的10种PhoC-linker-GFP融合蛋白的磷酸转移酶活性，图中横坐标表示了其中linker的组成，顺序为从PhoC蛋白下游到GFP的上游。
图8A和B实施例6中构建的10种PhoC-linker-GFP融合蛋白的GFP荧光量，图中横坐标表示了其中linker的组成，顺序为从PhoC蛋白下游到GFP的上游。
图932种linker对CFP-linker-YFP的FRET和空间距离的影响。
具体实施方式
以下，对本发明的详细内容和实施方式进行具体说明。
如无特殊说明，本说明书中所用术语的含义与本领域技术人员一般理解的含义相同，但如有冲突，则以本说明书中的定义为准。
本发明人经过深入的研究，首次设计了一类连接肽(包含多个具体的连接肽)，该连接肽的刚性(或柔性)能够在完全刚性和完全柔性之间控制，在融合蛋白构建中具有应用价值。特别是对于连接肽的刚性敏感的融合蛋白体系，可以方便的从该连接肽库中选择具有合适刚性的连接肽，并应用于构建融合蛋白。
<连接肽序列>
本发明涉及的连接肽(linker)是用于连接两个或以上目标蛋白质或蛋白质结构域的一段氨基酸序列，通常连接肽的长度为3～50个氨基酸(参见例如Arai R,et al.2001,Protein Eng14(8):529-32.Chen X,et al.2012.Fusion proteinlinkers:Property,design and functionality.Adv Drug Deliv Rev65(10):1357-1369)。
本发明涉及一种连接肽，其组成如下式(1)所示：
(F)n(R)m (1)
其中，n和m为0～5的整数，且满足2≤n+m≤5，F表示氨基酸序列为GGGGS的柔性单元，R表示氨基酸序列为EAAAK的刚性单元，上述式(1)中F和R各自独立地以任意顺序排列。
本发明所述的连接肽中，刚性单元R，例如Glu-Ala-Ala-Ala-Lys或者EAAAK，能自身内部或者与相同相邻序列之间形成α-螺旋，从而使得该多肽具有相对稳定的立体构象，因而结构具有刚性。另一方面，连接肽序列中含有的柔性单元，例如Gly-Gly-Gly-Gly-Ser或GGGGS，不能形成任何结构固定的构象，属于无规卷曲，从而使得该多肽结构上具有柔性。刚性单元和柔性单元的组合序列，则能赋予该多肽具有介于完全刚性和完全柔性之间的构象，多肽具体的刚性(或柔性)程度因两种序列之间的比例、排列而异。通过设计不同比例和排列的刚性单元和柔性单元的组合序列，能对连接肽的刚性进行细微调控，以满足融合蛋白构建中，对连接肽刚性的不同要求。
本发明涉及的具有如上组成的连接肽可以适用于连接不同的体系的两个或多个蛋白质、多肽、抗体等等。本领域技术人员可以根据所需要连接的蛋白质、多肽、抗体的性质等来适当地选择具有不同刚性和柔性组合以及顺序的连接肽。
在具体的实施方式中，当n+m=2时，该连接肽为FF、RR、FR或RF。
在具体的实施方式中，当n+m=3时，该连接肽为FFF、FFR、FRF、RFF、FRR、RFR、RRF或RRR。
在具体的实施方式中，当n+m=4时，该连接肽为FFFF、FFFR、FFRF、FRFF、RFFF、FFRR、FRRF、RRFF、FRFR、RFRF、RFFR、FRRR、RFRR、RRFR、RRRF或RRRR。
在具体的实施方式中，当n+m=5时，该连接肽为FFFFF、FFFFR、FFFRF、FFFRR、FFRFF、FFRFR、FFRRF、FFRRR、FRFFF、FRFFR、FRFRF、FRFRR、FRRFF、FRRFR、FRRRF、FRRRR、RFFFF、RFFFR、RFFRF、RFFRR、RFRFF、RFRFR、RFRRF、RFRRR、RRFFF、RRFFR、RRFRF、RRFRR、RRRFF、RRRFR、RRRRF或RRRRR。
<DNA序列>
对本发明编码所述的连接肽的基因没有特别的限制，只要通过翻译能表达出相应的多肽序列即可。通常，为达到提高蛋白质表达水平的目的，可根据宿主细胞的密码子偏好性，对编码基因进行优化，从而得到所需连接肽的编码基因。
可以采用多种方式对密码子进行优化，从各种数据库查得待表达上述连接肽的宿主的密码子使用频率表。然后利用多种软件进行密码子优化。以例如GeneDesigner软件为例，可以将宿主的密码子使用频率表输入GeneDesigner软件，设临界密码子使用频率为某一特定值(Lindberg P,Park S,Melis A,Engineering a platform for photosynthetic isoprene production incyanobacteria,using Synechocystis as the model organism,MetabolicEngineering,12,70-79(2010))。尽量保证基因中同义密码子的数量比和使用的表达宿主中相应密码子使用频率比相同。现在也可以通过很多提供密码子优化的公司来进行密码子优化。
<利用连接肽序列连接的目的蛋白质(或蛋白质结构域)>
对在本发明中利用上述连接肽连接的目的蛋白质(或蛋白质结构域)、多肽或抗体没有什么限制，只要能够通过本发明的连接肽被串联融合而表达即可。
在本发明具体的实施方式中，该目的蛋白质(或蛋白质结构域，下同)或抗体或多肽的长度范围可以为10-500aa；进一步目的蛋白质的长度范围为100-400aa；目的蛋白质的长度为200-300aa。可以列举的蛋白质例如由绿色荧光蛋白、黄色荧光蛋白、蓝色荧光蛋白、血红蛋白、酸性磷酸酶、肝素酶I、肝素酶II、肝素酶III、硫酸软骨素酶AC、硫酸软骨素酶B、麦芽糖结合蛋白、谷胱甘肽、转铁蛋白、肿瘤坏死因子α、免疫球蛋白G、甲羟戊酸合成酶、甲羟戊酸还原酶、纤维素酶、木质纤维素酶、半纤维素酶、纤维素结合域、硫解酶、醇脱氢酶、醛脱氢酶、甲酸脱氢酶、抗体片段等。
作为目的蛋白质的实例，可以列举如绿色荧光蛋白(GFP，239aa)，黄色荧光蛋白(YFP，239aa)和酸性磷酸酶(PhoC，248aa)等，本领域技术人员可以理解这几种蛋白质仅仅是例子，本发明的连接肽完全可以用于连接其他蛋白质、蛋白质结构域、抗体或多肽。
在本发明中，针对所要连接的目标蛋白质或蛋白质结构域的不同，可以从本发明所提供的一系列连接肽中选择具有不同长度，不同刚性或柔性组合的连接肽来连接不同的目标蛋白质。
<融合蛋白的构建和表达>
通过所述的连接肽将目的蛋白质进行融合，所构建的融合蛋白是指将两个目的蛋白按照一定顺序连接而得到的融合蛋白。
融合蛋白的构建和表达方法是本领域技术人员所熟知的，例如可采用如下的步骤：
(1)将编码目的蛋白(或蛋白结构域)的基因与编码连接肽的基因实现串联连接，构建融合基因。其中所述的连接方法包括：设计适当的引物，通过聚合酶链式反应(PCR)方法得到融合基因；也可以采用人工合成的方法直接合成所需的融合基因。
(2)将(1)中所述的融合基因到表达载体的多克隆位点区域，从而得到插入了融合基因的表达载体。
(3)将(2)中所述的插入了融合基因的表达载体转化合适的宿主细胞，获得转化的宿主细胞。
(4)培养转化的宿主细胞，通过合适的方式诱导融合蛋白的表达。
(5)从(4)所述的细胞中提取、分离目的融合蛋白。
利用本发明的连接肽，通过将刚性单元和柔性单元的组合，能对连接肽的刚性进行调整，使其在完全刚性和完全柔性之间变化。在融合蛋白的构建中，对连接肽的刚性和柔性有不同的要求，而且连接肽的刚性会影响融合蛋白的表达、折叠和功能等方面。可以通过连接肽刚性的微调来在本发明提供的连接肽中寻找特定融合蛋白所适合的连接肽，从而对融合蛋白的功能实现有效地调节和表达，从而发挥融合蛋白中各目标蛋白质的最大功效。
此外，可以从本发明的一组连接肽中选择长度不同的连接肽来调节目标蛋白质之间的距离，从而可以更好地分别发挥目标蛋白质各自的作用。
实施例
下面列举实施例对本发明进行进一步的说明。
下述实施例中，如无特殊说明，均为常规方法。PCR相关试剂来自北京全式金公司；限制性内切酶均购自NEB(New England BioLabs)公司；T4DNA连接酶购自宝生物工程有限公司(Takara)；质粒提取试剂盒购自Omega公司；细菌基因组DNA提取试剂盒购自Tiangen公司；PCR产物纯化，酶切产物纯化试剂盒购自上海华舜公司。
在下文中如无特殊说明PCR按照如下程序进行。
PCR反应体系(50μl)
(1)94℃2min
(2)进行以下循环30次：
94℃30s
55℃30s
72℃1kb/min
(3)72℃10min
其中，模板DNA少于0.5μg，正向和反向引物终浓度各为0.2-0.4μM。
SDS-PAGE可以参照常规的方法进行(例如参考萨姆布鲁克.2008.分子克隆实验指南.北京:科学出版社.)。
实施例1磷酸酶和绿色荧光蛋白的融合蛋白的构建
本实施例中，所需构建的融合蛋白含有目的蛋白磷酸酶(PhoC，Genbank登录号ABW37174)和增强型绿色荧光蛋白(GFP，Genbank登录号AAK15492)，采用的连接肽序列如下(3种)：
连接肽序列1：
Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(即FFFFF)；
连接肽序列2：
Glu-Ala-Ala-Ala-Lys-Glu-Ala-Ala-Ala-Lys-Glu-Ala-Ala-Ala-Lys-Glu-Ala-Ala-Ala-Lys-Glu-Ala-Ala-Ala-Lys(即RRRRR)；
连接肽序列3：
Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Glu-Ala-Ala-Ala-Lys(即FFFFR)。
本实施例中的融合蛋白结构分别为：PhoC-FFFFF-GFP，PhoC-RRRRR-GFP以及PhoC-FFFFR-GFP。
实施例1中使用的引物如下(下划线表示酶切位点)：
以含有PhoC编码基因的序列为模板，利用引物组合1，进行PCR反应，可获得编码PhoC-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser序列且两端携带酶切位点的目的基因1。
然后，以含有GFP编码基因的序列为模板，利用引物组合2，进行PCR反应，可获得编码Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-GFP序列且两端携带酶切位点的目的基因2。
为了得到完整的所述的融合蛋白的序列，进行如下操作。用EcoRI和BamHI酶切目的基因1，用BamHI和HindIII，酶切目的基因2，将酶切产物共同克隆入经过EcoRI和HindIII酶切的pET28-a(+)载体(购自NOVAGEN)中，构成含有目的蛋白PhoC-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-GFP的编码基因的质粒pET28a/PhoC-F5R0-GFP。再将所述质粒转化入大肠杆菌BL21(DE3)中，构建工程菌BL21(DE3)/pET28a/PhoC-F5R0-GFP。利用下述方法培养该基因工程菌，液体培养用LB培养基，含50ng/μl卡那霉素，37℃，170转/分；固体培养用含50ng/μl卡那霉素的LB琼脂平板。并利用下述方法来诱导表达培养的基因工程菌：从新鲜划线平板接种单菌落到LB液体培养基进行过夜培养，培养物按3%转接到新鲜LB培养基进行培养，待OD600增加到0.6-0.8时加入IPTG使其终浓度为0.04mM，在15℃下继续培养20h。培养得到的蛋白质经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)鉴定，蛋白质中有目的融合蛋白的表达，进一步纯化，可得到PhoC-FFFFF-GFP融合蛋白(图1)。进一步的鉴定表明，获得的融合蛋白PhoC-FFFFF-GFP融合蛋白同时具有PhoC和GFP本身具有的活性。通过类似的方法，分别利用上述引物组合3-6成功构建PhoC-RRRRR-GFP和PhoC-FFFFR-GFP(图1)，获得的融合蛋白PhoC-RRRRR-GFP和PhoC-FFFFR-GFP同时具有PhoC和GFP本身具有的活性。
实施例2磷酸酶和绿色荧光蛋白的融合蛋白的生物活性测定
通过实施例1中的方法，构建融合并表达融合蛋白PhoC-FFFFF-GFP、PhoC-RRRRR-GFP和PhoC-FFFFR-GFP。通过对可溶部分蛋白进行纯化，纯化利用His-Tagged蛋白亲和纯化柱(GE Healthcare，HisTrap HP，5ml)，根据产品说明书进行纯化，得到纯化的蛋白。
为了考察三种PhoC-linker-GFP的融合蛋白，分别对其进行荧光活性、磷酸水解酶活性以及磷酸转移酶活性的测定。
(1)荧光测定方法
将经过纯化的PhoC-linker-GFP蛋白10μl-100μl加入1ml去离子水中进行适度稀释后，利用荧光分光光度计(F-2000，Hitachi，Japan)进行荧光的检测。检测参数为：激发光波长为488nm，狭缝宽度10nm，发射光波长为512nm，狭缝宽度10nm。检测得到的数值表示其相对荧光强度，以RFU表示，RFU(Relative fluorescence units)表示相对荧光单位，是利用荧光分光光度计检测样品荧光强度时得到的荧光强度单位。
(2)磷酸酶活性测定
磷酸酶活性通过利用待测蛋白对底物pNPP进行水解生成pNP进行测定。pNP在410nm下有最大吸收，通过检测样品在410nm下吸光度的变化即可求出生成pNP的量，从而计算出待测蛋白的磷酸酶活性。反应在1ml的标准反应混合液中进行，其中包含100μmol MES-NaOH缓冲液(pH6.0)，10μmol的pNPP，以及一定量的待测酶液。上述反应混合物在加入酶液后立刻置于30℃水浴中10min，然后通过加入0.2mL的2N NaOH终止反应。通过检测反应后溶液的410nm吸光度确定生成pNP的量。1个单位(1U)磷酸酶活性的定义为：在上述条件下，1min内生成1μmolpNP所需的酶量。
(3)磷酸转移酶活性测定
磷酸转移酶活性利用肌苷和焦磷酸作为底物，通过测定生成的5’-肌苷酸的量进行测定。反应在1mL的标准反应混合液中进行，其中包含100μmol的醋酸钠缓冲液(pH4.2)，40μmol的肌苷，100mol的Na4P2O7·10H2O以及一定量的酶液。上述反应混合物在加入酶液后立刻置于30℃水浴中20min，然后通过加入0.2mL的2N的NaOH终止反应。反应后溶液中生成的5’-肌苷酸的含量通过HPLC进行测定。HPLC所用的柱子为HC-18C(4.6×150mm，5μm，安捷伦)，流动相为5mM的磷酸钾缓冲液(pH2.8)：甲醇(95:5，体积比)，流速为1mL/min。利用紫外检测器在245nm下检测5’-肌苷酸的吸收峰从而对其定量，进而计算磷酸转移酶的活性。1个单位(1U)的磷酸转移酶活性定义为：在上述条件下，1min内生成1μmol5’-肌苷酸所需的酶量。
PhoC同时具有磷酸酶和磷酸转移酶的活性。如果将构建的PhoC-linker-GFP蛋白用于实际生产时，希望使PhoC磷酸转移酶活性高而磷酸酶活性低，同时GFP具有较高荧光水平(易于检测)的情况最好。在本研究中针对连接肽对蛋白活性的影响，则希望三者活性都较高。
分别对上述3种PhoC-linker-GFP的融合蛋白进行以上检测，其结果如图2所示。从上述结果可知，虽然融合蛋白中的功能单元相同，但由于连接肽刚柔性的不同，导致了融合蛋白各种生物学功能(荧光、磷酸酶活性和转移酶活性)的显著差异。而且，三种活性之间的相对大小在三种连接肽下也是有明显差异的。这表明采用本发明的连接肽能调节融合蛋白的各种活性的水平。
实施例3青色荧光蛋白和黄色荧光蛋白的融合蛋白的构建
在本实施例中，构建的目的蛋白是青色荧光蛋白(CFP)(Genbank登录号AAQ96626)和黄色荧光蛋白(YFP)(Genbank登录号AAO48597)，采用的连接肽序列如下：
连接肽序列1：
Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(FFFFF)
连接肽序列2:
Glu-Ala-Ala-Ala-Lys-Glu-Ala-Ala-Ala-Lys-Glu-Ala-Ala-Ala-Lys-Glu-Ala-Ala-Ala-Lys-Glu-Ala-Ala-Ala-Lys(RRRRR)
连接肽序列3：
Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Glu-Ala-Ala-Ala-Lys(FFFFR)
连接肽序列4：
Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Glu-Ala-Ala-Ala-Ly-Glu-Ala-Ala-Ala-Lys(FFFRR)
连接肽序列6：
Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Glu-Ala-Ala-Ala-Lys-Glu-Ala-Ala-Ala-Lys-Glu-Ala-Ala-Ala-Lys-Glu-Ala-Ala-Ala-Lys(FRRRR)
注：其中上述连接肽序列1-6构建过程中所用CFP上游引物均为5’-TTAGAATTCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGC，YFP下游引物均为5’-TCCAAGCTTTTACTTGTACAGCTCGTCCATGCCGAG)
构建融合蛋白以及PCR等方法与实施例1相同，除了使用上述引物之外。利用前述连接肽的编码序列将CFP和YFP基因串联成如下融合蛋白的融合基因(在质粒载体pET28a(+)上)：CFP-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-YFP(其质粒为pET28a/CFP-FFFFF-YFP)；CFP-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Glu-Ala-Ala-Ala-Lys-YFP(其质粒为pET28a/CFP-FFFFR-YFP)CFP-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Glu-Ala-Ala-Ala-Ly-Glu-Ala-Ala-Ala-Lys-YFP(其质粒为pET28a/CFP-FFFRR-YFP)；CFP-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Glu-Ala-Ala-Ala-LysGlu-Ala-Ala-Ala-Lys-Glu-Ala-Ala-Ala-Lys-YFP(其质粒为pET28a/CFP-FFRRR-YFP)；CFP-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Glu-Ala-Ala-Ala-Lys-Glu-Ala-Ala-Ala-Lys-Glu-Ala-Ala-Ala-Lys-Glu-Ala-Ala-Ala-Lys-YFP(其质粒为pET28a/CFP-FRRRR-YFP)；CFP-Glu-Ala-Ala-Ala-Lys-Glu-Ala-Ala-Ala-Lys-Glu-Ala-Ala-Ala-Lys-Glu-Ala-Ala-Ala-Lys-Glu-Ala-Ala-Ala-Lys-YFP(其质粒为pET28a/CFP-RRRRR-YFP)。
利用ABI3730XL测序仪(Applied Biosystems，IL，USA)分析测序结果，测序分析结果显示成功构建了上述质粒。将上述质粒转化进入大肠杆菌BL21(DE3)，构建工程菌BL21(DE3)/pET28a/CFP-FFFFF-YFP，BL21(DE3)/pET28a/CFP-FFFFR-YFP，BL21(DE3)/pET28a/CFP-FFFRR-YFP，BL21(DE3)/pET28a/CFP-FFRRR-YFP，BL21(DE3)/pET28a/CFP-FRRRR-YFP，BL21(DE3)/pET28a/CFP-RRRRR-YFP。按照与实施例1相同的方法培养上述基因工程菌，并对其进行诱导表达，经SDS-PAGE鉴定，6种CFP-YFP融合蛋白均得到有表达(图3)。实验结果表明，通过本说明书中所描述方法能成功构建并表达目的融合蛋白。
实施例4青色荧光蛋白和黄色荧光蛋白的融合蛋白的活性比较
按照实施例3中所述方法构建并表达青色荧光蛋白和黄色荧光蛋白的融合蛋白(CFP-linker-YFP)，其中这6种融合蛋白分别具有不同的连接肽，其连接肽序列如实施例3所述。因CFP在436nm激发光下有特征的荧光发射，其最大发射波长为488nm；而YFP在517nm激发光下有特征的荧光发射，其最大发射波长为528nm，所以融合蛋白CFP-linker-YFP也相应的具有这两种荧光特性。下面分别对CFP和YFP荧光进行测定。
(1)CFP荧光的测定
将适量的融合蛋白溶液稀释到1mL去离子水中，放入荧光分光光度计进行荧光测定。测定条件：激发光波长436nm，狭缝宽度10nm，发射光波长488nm，狭缝宽度10nm。检测得到的数值表示其相对荧光强度，以RFU表示。
(2)YFP荧光的测定
将适量的融合蛋白溶液稀释到1mL去离子水中，放入荧光分光光度计进行荧光测定。测定条件：激发光波长517nm，狭缝宽度10nm，发射光波长528nm，狭缝宽度10nm。检测得到的数值表示其相对荧光强度，以RFU表示。
分别对所述6种CFP-linker-YFP进行CFP和YFP荧光的测定，其结果如图4所示。普通CFP蛋白的荧光活性为27000RFU/mg，YFP蛋白的荧光活性为17000RFU/mg，可知6种连接肽的CFP-linker-YFP均具有和原来荧光蛋白处于同等水平的荧光活性。进一步比较6种连接肽的CFP-linker-YFP的结果可知，连接肽在调节CFP和YFP两个功能单元的活性上有一定的作用。本实施例的实验结果表明，通过本发明的连接肽能构建出具有和原来功能单元具有相当活性的融合蛋白，且融合蛋白中功能单位的活性能通过连接肽的不同进行一定程度的调控。
实施例5通过青色荧光蛋白和黄色荧光蛋白的融合蛋白的荧光共振能量转移(FRET)现象研究不同连接肽对功能单元空间距离的影响
通过实施例3和实施例4所述方法，构建并表达具有不同连接肽的6种CFP-linker-YFP融合蛋白。进一步对其进行CFP和YFP荧光的测定，以及CFP-linker-YFP的荧光共振能量转移(FRET)的测定。
CFP和YFP荧光的测定按照实施例4种所述方法进行。
CFP-linker-YFP的FRET的测定
将适量的融合蛋白溶液稀释到1mL去离子水中，放入荧光分光光度计进行荧光测定。测定条件：激发光波长436nm，狭缝宽度10nm，发射光波长528nm，狭缝宽度10nm。
净FRET荧光的计算
上述FRET测定的结果受到两方面的干扰：(1)CFP受激发而发射的荧光和(2)YFP受到CFP激发光直接引起YFP发射荧光。所以要计算净FRET必须扣除上述两方面的影响。通过以下公式计算净FRET：
净FRET=FRET-A×CFP荧光-B×YFP荧光
其中，系数A和B通过对单独的CFP和YFP蛋白的荧光可进行测定，在本实验中，其值分别为0.437和0.033。
按照上述公式，计算CFP-linker-YFP的净FRET，结果如图5所示。从图5可以看出，根据连接肽中刚性单元数目作图，各个CFP-linker-YFP的净FRET具有良好的线性(R2=0.9672)。因为CFP和YFP之间的FRET的大小取决于CFP和YFP分子之间的空间距离，从而表明实验中所用不同连接肽的融合蛋白中，其CFP和YFP之间具有不同的空间距离，并可通过连接肽的刚性进行调控。利用本发明的连接肽可对融合蛋白中连接肽刚性的大小进行调控，从而控制融合蛋白中两端蛋白的空间距离。
实施例632种连接肽性质比较
在本实施例中一共构建了32种连接肽(linker)，如下表1所示
表1连接肽的构成
1组成中，F代表GGGGS，R代表EAAAK
参照实施例1中的方式，构建PhoC-linker-GFP体系。在酸性磷酸酶PhoC和绿色荧光蛋白GFP之间引入连接肽(linker)构建融合蛋白。采用了2组其组成逐渐变化的linker，分别是(RRRRR，RRRRF，RRRFF，RRFFF，RFFFF，FFFFF)和(RRRRR，FRRRR，FFRRR，FFFRR，FFFFR，FFFFF)。所用引物如下表2所示。
表2构建PhoC-linker-GFP体系所用引物。表中，下和上分别表示PhoC下游引物和GFP上游引物，引物序列均从5’端开始。
注：各连接肽序列构建中所用PhoC上游序列均为：5’-TTAGAATTCATGTTTGCGCTGGTTCCCGCCGGCAAT，所用GFP下游序列均为5’-TCCAAGCTTTTACTTGTACAGCTCGTCCATGCCGAG。
该体系中，按照实施例2描述的方法测定三种活性，分别是PhoC的磷酸转移酶活性、磷酸酶活性，以及GFP的绿色荧光，并分别表示在图6、图7和图8中。通过图6、图7和图8的结果可以看出，通过对连接肽的构成(刚性单元和柔性单元的数量和排列)进行调节，可以对融合蛋白的活性进行一定范围内的调节。
按照实施例3中的方式，构建CFP-linker-YFP体系，在青色荧光蛋白CFP和黄色荧光蛋白YFP之间引入连接肽(linker)构建融合蛋白。所用引物如下表3所示。
表3构建CFP-linker-YFP体系所用引物。表中，下和上分别表示CFP下游引物和YFP上游引物，引物序列均从5’端开始。
注：各连接肽序列构建中所用CFP上游序列均为5’-TTAGAATTCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGC，所用YFP下游序列均为5’-TCCAAGCTTTTACTTGTACAGCTCGTCCATGCCGAG。
利用CFP-linker-YFP之间的荧光共振能量转移(FRET)效应，可以对具有不同连接肽的CFP-YFP之间的物理距离进行定量。测量与实施例5相同，结果如图9所示。图9示出了32种连接肽对CFP-YFP的FRET和空间距离的影响。图9(a)显示了不同连接肽时的CFP-linker-YFP的FRET水平；图9(b)显示了不同连接肽时的CFP-linker-YFP的空间距离。图9中，D是CFP-linker-YFP的空间距离；R0是CFP-linker-YFP的特征距离，此处是Et是CFP-linker-YFP的FRET效率。根据图9的结果显示连接肽能对所连接蛋白结构域的空间距离进行一定的调控
根据上述实施例5和6的结果可以看出，当需要对两种目的蛋白质、多肽或抗体进行连接时，可以根据两种蛋白质、多肽或抗体自身的性质从本发明的构建的连接肽库中进行选择，选择提供合适的刚柔性，以及合适的空间距离的连接肽来构建融合蛋白以实现最优的活性。
本领域技术人员应当理解的是上述用于连接的蛋白质仅仅是示例性的，本发明的连接肽可以用来连接其他蛋白质、多肽或抗体等。
实施例7连接肽重复单元数n=2,3,4时融合蛋白的构建
本实施例中构建了连接肽中具有不同重复单元数(n=2,3,4)的CFP-linker-YFP融合蛋白。
n=2时，构建CFP-FR-YFP，其中连接肽部分F指GGGGS，R指EAAAK，下同。
所用引物如下所示。
引物1：TTAGAATTCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGC
引物2：TTTCGCCGCGGCTTCCGAGCCACCGCCACCCTTGTACAGCT
引物3：GGTGGCGGTGGCTCGGAAGCCGCGGCGAAAATGGTGAGCAAGGGCG
引物4：TCCAAGCTTTTACTTGTACAGCTCGTCCATGCCGAG
利用CFP为模板，利用引物1和2进行PCR，得到PCR产物CFP-FR。同样地，利用YFP为模板，利用引物3和4进行PCR，得到PCR产物FR-YFP。再利用CFP-FR和FR-YFP为模板，利用引物1和4进行PCR，即可得到CFP-FR-YFP。利用实施例3中的方式，即可构建表达CFP-FR-YFP的大肠杆菌菌株。
n=3时，构建CFP-FFR-YFP。
所用引物如下所示。
引物1：TTAGAATTCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGC
引物2：
TTATTTCGCGGCCGCTTCTGAGCCACCGCCACCCGAGCCACCGCCACCCTTGTACAGCT
引物3：AAATATGCGGCCGCGAAAATGGTGAGCAA
引物4：TCCAAGCTTTTACTTGTACAGCTCGTCCATGCCGAG
通过实施例3中的方式，即可构建表达CFP-FFR-YFP的大肠杆菌菌株。
n=4时，构建CFP-FFRR-YFP。
所用引物如下所示。
引物1：TTAGAATTCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGC
引物2：
TTATTTCGCGGCCGCTTCTGAGCCACCGCCACCCGAGCCACCGCCACCCTTGTACAGCT
引物3：AAATATGCGGCCGCGAAAGAAGCCGCGGCGAAAATGGTGAGCAA
引物4：TCCAAGCTTTTACTTGTACAGCTCGTCCATGCCGAG
通过实施例3中的方式，即可构建表达CFP-FFR-YFP的大肠杆菌菌株。
利用上述菌株进行CFP-YFP融合蛋白的表达，得到含有目的蛋白的上清。经荧光分光光度计检测，融合蛋白CFP-FR-YFP(CFP:6200RFU/mg,YFP:85200RFU/mg)、CFP-FFR-YFP(CFP:6100RFU/mg,YFP:84900RFU/mg)和CFP-FFRR-YFP(CFP:5700RFU/mg,YFP:82000RFU/mg)均具有CFP、YFP的特征荧光，表明连接肽重复单元数n=2,3,4时，利用上述连接肽能构建具有活性的融合蛋白。
利用本发明的连接肽，通过组合刚性单元和柔性单元的数量和排列，可以对由连接肽所连接的目的蛋白质的活性进行调控，并对目的蛋白质之间的距离进行调控，从而实现对融合蛋白的功能实现有效地调节和表达，从而发挥融合蛋白中各目标蛋白质的最优功效。
虽然，本发明以多种不同形式详细地描述概括于本发明的优选的实施方式中。但是，本公开的内容仅是本发明精神的举例说明并且本发明并不限于所举例的实施方式。所提及的所有专利、专利申请、科技论文、以及任何其它的参考资料均通过参考的方式将其全部内容结合引入。另外，本发明包括某些或全部所描述的和所结合的各种实施方式的任何可能的组合。
上述公开的内容意在举例说明并且是非穷举的。对于本领域技术人员来说，本说明书具有多种变形和替换方式。全部的这些变形和替换方式包括在权利要求的范围之内，其中所述“包括”意思是“包括，但不限于”。那些熟悉本领域的人员能够认识到本发明所描述的实施方式的其它等价形式，这些等价形式同样包括在权利要求的范围之内。
所公开的全部范围和参数理解为涵盖任意和全部其所包括的子范围，以及端点之间的每个数值。例如，所述的“1～10”应理解为涵盖最小值1和最大值10之间(并且包括端点)的任意和全部子范围；也就是说，以最小值1或更高值开始的全部子范围(例如，1～6.1)，并且以最大值10或更小值结束(例如，2.3～9.4、3～8、4～7)，并且最终每个数值1、2、3、4、5、6、7、8、9和10均包括在该范围。
至此，完成了对本发明优选的和可替换的实施方式的描述。本领域技术人员能够认识到所描述的实施方式的其它等价形式，这些等价形式包括在附加的权利要求的范围内。
Claims (7)
1.一种连接肽，其组成如下式(1)所示：
(F)n(R)m (1)
其中，n和m为0～5的整数，且满足2≤n+m≤5，F表示氨基酸序列为GGGGS的柔性单元，R表示氨基酸序列为EAAAK的刚性单元，
上述式(1)中F和R各自独立地以任意顺序排列。
2.根据权利要求1所述的连接肽，其中，n+m=2，所述连接肽为FF、RR、FR或RF。
3.根据权利要求1或2所述的连接肽，其中，n+m=3，所述连接肽为FFF、FFR、FRF、RFF、FRR、RFR、RRF或RRR。
4.根据权利要求1～3中任一项所述的连接肽，其中，n+m=4，所述连接肽为FFFF、FFFR、FFRF、FRFF、RFFF、FFRR、FRRF、RRFF、FRFR、RFRF、RFFR、FRRR、RFRR、RRFR、RRRF或RRRR。
5.根据权利要求1～4中任一项所述的连接肽，其中，n+m=5，所述连接肽为FFFFF、FFFFR、FFFRF、FFFRR、FFRFF、FFRFR、FFRRF、FFRRR、FRFFF、FRFFR、FRFRF、FRFRR、FRRFF、FRRFR、FRRRF、FRRRR、RFFFF、RFFFR、RFFRF、RFFRR、RFRFF、RFRFR、RFRRF、RFRRR、RRFFF、RRFFR、RRFRF、RRFRR、RRRFF、RRRFR、RRRRF或RRRRR。
6.一种DNA分子，其编码权利要求1～5中任一项所述的连接肽。
7.权利要求1～5中任一项所述的连接肽的用途，用于连接蛋白质、蛋白质结构域、多肽或抗体以构建融合蛋白。
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Application publication date: 20150610 Assignee: WUHAN YZY BIOPHARMA Co.,Ltd. Assignor: TSINGHUA University Contract record no.: X2020990000538 Denomination of invention: A linker for fusion protein Granted publication date: 20181016 License type: Exclusive License Record date: 20201014 |