CN105821066A - 一种生产α-酮戊二酸的双酶共表达菌株 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种生产α‑酮戊二酸的双酶共表达菌株，属于发酵工程和酶工程技术领域。本发明的双酶共表达菌株真的L‑谷氨酸氧化酶和过氧化氢酶之间的连接序列如SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6或者SEQ ID NO.7所示。本发明得到的共表达菌株，可以在额外添加Mn²⁺条件下实现无过氧化氢酶添加条件下α‑酮戊二酸的高效生产；其中共表达菌株F006发酵得到的菌体细胞可以直接用于转化生产α‑KG，底物转化率可达98.7％，既无过氧化氢酶添加也无需添加Mn²⁺。

Description

一种生产α-酮戊二酸的双酶共表达菌株

技术领域

本发明涉及一种生产α-酮戊二酸的双酶共表达菌株，属于发酵工程和酶工程技术领域。

背景技术

α-酮戊二酸(α-ketoglutarate,简称α-KG)作为一种重要的高值精细化学品(20-25万元/吨)，广泛应用于食品、医药、化工和化妆品等工业领域中。在医药领域中，α-KG能减轻肾病患者的肾脏负担、减少并发症和促进患者手术后快速恢复；与精氨酸等氨基酸复配，能快速帮助运动员补充能量，广泛应用于功能性营养强化剂；除此以外，由于α-KG特殊的化学性质，被广泛用于化学合成行业。随着α-KG应用领域的不断拓展，导致国内和国际市场对α-KG的需求不断增加。从海关了解到的数据，目前国际市场对食品级α-KG需求量缺口达5万吨以上，而目前食品级α-KG市场价格为20-25万元/吨，且面临有价无市的窘境。α-KG的生产方法包括：化学合成法、酶催化法和微生物发酵法。目前，工业化生产α-KG主要采用有机合成法，涉及一系列复杂的化学反应过程，从而引起原料来源、环境污染等方面一系列问题。同时由于化学法合成α-KG过程中存在严重的安全问题，导致α-KG难以直接用于食品、医药和化妆品等领域。因此，如何采用生物技术法大规模制备安全性高的α-KG，是国内外学术界和产业界所关注的焦点问题。

本研究室前期构建了L-谷氨酸氧化酶高效表达菌株E.coliFMME089，并通过高密度发酵手段实现了L-谷氨酸氧化酶的大规模制备，使酶法转化L-谷氨酸生产α-KG的工业化生产成为可能。然而在酶法转化过程中需要添加过氧化氢酶，工业用过氧化氢酶中杂质较多对α-KG产品后期的分离纯化造成困扰且外源添加过氧化氢酶造成成本较高。

发明内容

为了解决上述问题，降低成本，本发明旨在原有L-谷氨酸生产α-KG体系的基础上实现不添加过氧化氢酶条件下的高效率转化，构建符合条件的L-谷氨酸氧化酶和过氧化氢酶共表达菌株。

本发明的第一个目的是提供一种共表达L-谷氨酸氧化酶和过氧化氢酶的DNA片段，所述DNA片段由编码L-谷氨酸氧化酶的基因序列、连接序列、编码过氧化氢酶的基因序列依次连接而成。

所述L-谷氨酸氧化酶的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示，核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。

所述过氧化氢酶的氨基酸序列如SEQIDNO.3所示，核苷酸序列如SEQIDNO.4所示。

在本发明的一种实施方式中，所述连接序列的核苷酸序列如SEQIDNO.5、SEQIDNO.6或者SEQIDNO.7所示。

本发明的第二个目的是提供表达所述DNA片段的重组载体或者重共表达菌株。

在本发明的一种实施方式中，所述重组载体，是将所述DNA片段连接到pET28a表达载体上得到的。

在本发明的一种实施方式中，所述共表达菌株，是将所述重组载体转化到宿主大肠杆菌中得到的共表达菌株。

本发明的第三个目的是提供所述DNA片段经表达后得到的酶系。

本发明的第四个目的是提供所述酶系或者共表达菌株在转化生产α-酮戊二酸方面的应用。

在本发明的一种实施方式中，所述应用，是以L-谷氨酸或谷氨酸钠为底物，在pH6.0-8.0，温度30-42℃下，转化18-24h，利用所述酶系或者共表达菌株催化生产α-酮戊二酸。

在本发明的一种实施方式中，所述应用需要添加1～5mmol/L的MnCl₂作为两种酶的激活剂。

在本发明的一种实施方式中，所述底物的浓度为110-135g/L。

在本发明的一种实施方式中，所述共表达菌株的菌体添加量为2～2.5g/L。

本发明的第五个目的是提供一种所述生产α-酮戊二酸的双酶共表达菌株的构建方法，所述方法在全细胞转化L-谷氨酸生产α-酮戊二酸转化体系基础上预测所需L-谷氨酸氧化酶和过氧化氢酶的用量，进而通过分子生物学手段从转录和翻译水平调节双酶表达来构建L-谷氨酸氧化酶和过氧化氢酶的共表达菌株，实现两种酶不同表达量的要求，以达到该转化体系下α-酮戊二酸高效生产，过程中无需过氧化氢酶的额外添加。

所述方法，在构建单酶表达菌株测定酶学性质基础上确定双酶需求量，通过双酶不同构建方式、SD序列与起始密码子ATG之间的间隔以及RBS序列强度优化等方法逐步实现两种酶各种所需表达量要求，同时通过转化反应对共表达菌株性能进行验证。

所述全细胞转化L-谷氨酸生产α-酮戊二酸转化体系是以L-谷氨酸氧化酶重组菌株E.coliFMME089进行全细胞转化。

在本发明的一种实施方式中，所述转化体系是指以L-谷氨酸或者谷氨酸钠为底物生产α-KG的方法，在pH6.0-8.0，温度30-42℃下，转化18-24h，催化生产α-酮戊二酸。

在本发明的一种实施方式中，所述全细胞转化L-谷氨酸生产α-酮戊二酸转化体系及转化条件为：110g/LL-谷氨酸，2～2.5g/L菌体，pH6.5磷酸缓冲液体系，30～42℃，200rpm条件下转化24h。

在本发明的一种实施方式中，所述底物浓度为110-135g/L。

在本发明的一种实施方式中，所述重组大肠杆菌或共表达菌株为以E.coliBL21(DE3)为宿主菌、以pET28a表达载体；L-谷氨酸氧化酶来源于StreptomycesghanaensisATCC14672，过氧化氢酶来源于E.coliK12。

在本发明的一种实施方式中，所述L-谷氨酸氧化酶和过氧化氢酶的性质是通过分别构建酶的高效表达菌株FXC001和FXC007，诱导表达、破碎、离心、过滤、挂柱、洗脱及脱盐等过程后测得。

在本发明的一种实施方式中，所述过氧化氢酶的用量是通过转化体系中直接添加纯化后的过氧化氢酶直接测得。

在本发明的一种实施方式中，所述过氧化氢酶的需求量最低为1000U/mL。

所述分子生物学手段是指通过基因克隆技术、PCR技术、融合表达技术、RBS强度预测技术、质粒构建技术等，涉及分子生物学领域的一些分子操作。

所述转录水平调控双酶表达是指通过双酶不同构建方式如单启动子双酶双联表达、双启动子双酶串联表达、单启动子双酶融合表达等来构建共表达质粒，其中L-谷氨酸氧化酶均位于过氧化氢酶之前，构建完成的三株共表达菌株分别命名为F001，F002和F003。

所述翻译水平调控双酶表达是指通过改变SD序列与起始密码子之间的间隔或者RBS序列强度调节核糖体与mRNA的结合强度，进而影响翻译起始速率，在翻译水平上调节蛋白质表达量。所述SD序列与起始密码子ATG之间的间隔优化是指通过优化过氧化氢酶基因前端的SD序列与起始密码子之间的间隔调控过氧化氢酶的不同表达量，间隔设定在3bp～12bp，分别构建了四株共表达菌株并命名为FXC003～FXC006。所述RBS序列强度优化是指通过RBSCalculatorv1.1(https://www.denovodna.com/software/)预测达到一定表达量所需的过氧化氢酶基因前端RBS强度及翻译起始速率TIF＞24,000au，从而设计4组符合要求的RBS序列，构建双酶串联表达质粒，L-谷氨酸氧化酶位于过氧化氢酶之前，构建成功的四株共表达菌株分别命名为F004～F007。

在本发明中所有重组菌的性能评价均在同一条件下诱导测定产酶效果，随后利用菌体或者酶系转化L-谷氨酸生产α-KG。

在本发明的一种实施方式中，所述诱导的诱导剂添加为OD600在0.6～1.2之间时，添加0.3～0.5mmol/LIPTG或者3～7g/L乳糖诱导。

在本发明的一种实施方式中，所述诱导的诱导温度为25-30℃。

在本发明的一种实施方式中，所述诱导的诱导时间为4-8h。

所述方法中，对于发酵培养基，本领域技术人员完全可以根据现有的大肠杆菌培养基，选择适合产酶的培养基或者是进一步对培养基进行优化。

所述方法中，对于转化体系，本领域技术人员完全可以根据现有转化，选择合适的类似缓冲液体系和转化条件或者是进一步添加辅助因子。

本发明的有益效果：

1、应用本发明方法先后得到11株L-谷氨酸氧化酶和过氧化氢酶共表达菌株，实现了两种酶的不同表达水平的高效表达；

2、应用本发明合理实现了目标酶特定的表达量范围；

3、部分共表达菌株在额外添加Mn²⁺条件下，也可以实现无过氧化氢酶添加条件下α-酮戊二酸的高效生产；

4、共表达菌株F006发酵得到的菌体细胞可以直接用于转化生产α-KG，底物转化率可达98.7％，既无过氧化氢酶添加也无需添加Mn²⁺；

5、在110g/LL-谷氨酸，2～2.5g/L菌体，pH6.5磷酸缓冲液体系，30℃，200rpm条件下转化18～24h，最优菌株F006的α-酮戊二酸产量可以达到107.2g/L，转化率为98.4％，完全替代外源添加过氧化氢酶且无需添加Mn²⁺；增加菌体浓度，132g/L底物条件下α-酮戊二酸的产量可以达到127.1g/L，转化率96.9％。

附图说明

图1：重组LGOX纯化及SDS-PAGE分析(1为发酵液，2为重组菌，3为Ni柱纯化后LGOX，4为脱盐后LGOX)；

图2：重组KatG纯化及SDS-PAGE分析(1为BL21空质粒菌，2为重组菌，3为纯化后蛋白)；

图3：30℃下LGOX的温度稳定性；

图4：Lineweaver-Burk双倒数曲线；

图5：KatG添加量对转化的影响；

图6：不同间隔共表达质粒的构建；

图7：不同RBS强度共表达菌株蛋白电泳图；

图8：全细胞催化剂对转化的影响。

具体实施方式

实施例1L-谷氨酸氧化酶性质研究及过氧化氢酶需求量确定

分别将来源于StreptomycesghanaensisATCC14672的L-谷氨酸氧化酶(LGOX)基因(氨基酸序列如SEQIDNO.1所示，核苷酸序列如SEQIDNO.2所示)，来源于E.coliK12的过氧化氢酶基因KatG(氨基酸序列如SEQIDNO.3所示，核苷酸序列如SEQIDNO.4所示)，通过引物1(上游引物：5’-CATGCCATGGCAATGCTGCCCGCACCGGCCGCCT-3’，序列如SEQIDNO.8；下游引物：5’-CCCAAGCTTGTCACGCTGTGTGGATCTCCAAG-3’，序列如SEQIDNO.9)以及引物2(上游引物：5′-CATGCCATGGCAATGAGCACGTCAGACGAT-3′，序列如SEQIDNO.10；下游引物：5′-CCCAAGCTTGCAGCAGGTCGAAACGGTC-3′，序列如SEQIDNO.11)克隆表达于质粒pET28a中，重组质粒转入E.coliBL21(DE3)中，筛选出阳性菌株分别命名为FXC001和FXC007。重组菌株于TB培养基中诱导表达，当OD₆₀₀为0.6-1.2之间时加入0.4mmol/L的IPTG进行30℃诱导5～6h，随后经过破碎、离心、过滤、挂柱、洗脱及脱盐处理后分别获得两种纯化后的酶(图1和图2)，蛋白大小分别为65kDa和80kDa。最后，对两种酶进行性质研究。

1)测定30℃条件下LGOX的活性随时间的变化值，拟合失活方程曲线(图3)计算出该酶的半衰期为4.62h；随后对其动力学参数进行了测定，得到图4所示Lineweaver-Burk双倒数曲线，计算出LGOX的结合常数K_m为6.32mmol·L^-1，V_max为40μmol·min^-1·mg^-1，对应的k_cat为1.23min^-1。

2)在转化体系(110g/LL-谷氨酸，2～2.5g/LE.coliFMME089菌体，pH6.5磷酸缓冲液)基础上，通过添加0～2000U/mL纯化后的KatG测定24h内α-KG的产量，结果见图5，粗略估算该转化体系共需要该类过氧化氢酶的用量为1250U/mL或以上(此时转化率超过95％)，确定了共表达菌株中所需该基因的表达水平。

实施例2双酶共表达菌株转录水平调控

以pET28a为表达载体设定了三种不同策略构建共表达菌株，策略1采用单启动模式将LGOX和KatG串联表达，通过与LGOX前相同的RBS序列连接KatG，构建成功的共表达菌株命名为F001；策略2采用双启动子模式与LGOX和KatG前面添加同样的启动子及相关序列，构建共表达菌株命名为F002；策略3采用单启动子模式将LGOX和KatG通过HindIII直接串联在一起，构建成功的共表达菌株命名为F003。其中，策略1会转录生产一条mRNA，含有两个核苷酸结合位点，翻译出两条蛋白；策略2会转录出一大一小两条mRNA，均含有核苷酸结合位点，翻译出两条蛋白；策略3会转录出一条mRNA，仅含有一个核苷酸结合位点，翻译出一条融合蛋白。其中，策略2的KatG蛋白表达量由于策略1，希望能得到不同KatG表达量的菌株；策略3可以实现LGOX和KatG的肽链数目一致，期望一个融合酶能够完成目标反应，两种酶的活性与折叠结构有关不易判断。

重组菌接种于LB种子培养基上10-12h后，以4％的接种量转接到TB培养基中，当OD₆₀₀为0.6-1.2之间时加入0.4mmol/L的IPTG进行30℃诱导5～6h；随后离心获得共表达菌体，在110g/LL-谷氨酸、2～2.5g/L菌体等转化条件下反应24h；3株共表达菌株的产酶效果和转化效果整理成表格1，可以发现KatG酶活F002>F001>F003，LGOX活性F003>F001>F002，α-KG产量F003>F001>F002，且α-KG产量F001与F003相差不大。因此，可以看出相同启动子串联表达不利于双酶表达，大片段基因融合表达可操作性较差且无法确定双酶活性，单启动子双酶串联表达可以通过RBS调控基因的表达可操作性强，且能较好保存双酶活性，是下一步优化的基础。

表1不同构建方式细胞浓度、产酶及转化效果比较

实施例3SD序列(Shine-Dalgarnosequence)与ATG间隔的影响

按照图6质粒构建方式构建重组质粒(其中RBS*代表不同SD与ATG间隔的序列)，设定间隔分别为3bp、6bp、9bp和12bp，上游引物分别为KatG-rbs1(序列如SEQIDNO.12)、KatG-rbs2(序列如SEQIDNO.13)、KatG-rbs3(序列如SEQIDNO.14)和KatG-rbs4(序列如SEQIDNO.15)，下游引物为KatG-A(序列如SEQIDNO.16)(表2)，通过传统的构建方式构建并验证重组菌株，将构建并验证成功的菌株分别命名为FXC003、FXC004、FXC005(即L-谷氨酸氧化酶和过氧化氢酶通过SEQIDNO.5的连接序列进行连接)、FXC006。

将四株重组菌株于TB培养基中培养OD₆₀₀至0.6～1.2，添加0.4mmol·L^-1IPTG诱导5～6h，测定此时细胞浓度、LGOX活性及KatG活性，并收集细胞进行蛋白电泳及全细胞转化生产α-KG(110g·L^-1L-谷氨酸，全细胞细胞，pH6.5磷酸盐缓冲液体系，200r·min^-1，30℃转化24h)。不同重组菌株的细胞浓度OD₆₀₀、LGOX酶活、KatG活性及全细胞转化α-KG产量列于表3，可以看出LGOX酶活FXC003>FXC005>FXC006>FXC004,且FXC004、FXC005、FXC006相差不大，而KatG活性FXC005>FXC004>FXC006>FXC003，其中FXC003远低于其它三株仅为56U·mL^-1。其中FXC005菌株的KatG活性最接近实验预测值1250U·mL^-1，α-KG产量最高为86.7g·L^-1，转化率为79.6％。虽然有了较大的提高仍没有满足完全替代过氧化氢酶的目的，需要进一步优化。

表2本发明所使用的引物

表3不同间隔共表达菌株细胞浓度、产酶及转化效果比较

实施例4核糖体结合位点(RBS序列)强度对产酶的影响

在FXC003中(RBS序列，即两酶连接序列，为rbs1)，LGOX以NcoI和HindIII为酶切位点连接到pET28a，对应的ΔG_tot为4.21kcal·mol^-1，TIR为375.4au；KatG以HindIII和XholI插入到pET28a-LGOX，对应的ΔG_tot＝1.85kcal·mol^-1，TIR＝1087.31au；又KatG活性为56U·mL^-1，约为需求量的4.5％(所需KatG活性为1250U·mL^-1)，因此所需RBS的TIF在24433.9au以上为宜。

分别设计4组rbs序列，分别命名为rbs5(序列如SEQIDNO.17)、rbs6(序列如SEQIDNO.18)、rbs7(序列如SEQIDNO.19)和rbs8(序列如SEQIDNO.20)，其序列见表4，其TIR均在24,000au以上。并分别设计上游引物KatG-rbs5(序列如SEQIDNO.21)、KatG-rbs6(序列如SEQIDNO.22)、KatG-rbs7(序列如SEQIDNO.23)和KatG-rbs8(序列如SEQIDNO.24)，下游引物为KatG-A(表2)，通过传统的构建方式构建并验证重组菌株，将构建出正确的阳性菌株并分别命名F004、F005(即L-谷氨酸氧化酶和过氧化氢酶通过SEQIDNO.6的连接序列进行连接)、F006(即L-谷氨酸氧化酶和过氧化氢酶通过SEQIDNO.7的连接序列进行连接)、F007。

表4不同RBS及其特征

将验证成功的共表达菌株于TB培养基中培养D₆₀₀至0.6～1.2，添加0.4mmol·L^-1IPTG诱导5～6h，收集细胞进行蛋白电泳。结果如图7所示，与对照(E.coliBL21和FXC001)相比，共表达菌株生产LGOX蛋白大小约为65kDa，KatG蛋白大小约为80kDa，两种蛋白都有表达。其中F004和F005的KatG条带明显高于LGOX，F006中KatG和LGOX相差不大，F007中LGOX的条带明显超过KatG。总体KatG的条带亮度F004>F005>F006>F007，符合TIR预测。

参照实施例3对F004、F005、F006和F007进行产酶效果表征，其结果见表5。发现LGOX酶活F007>F006>F004>F005，KatG活性F005>F006>F004>F007，且F005及F006的KatG活性接近预测值1250U·mL^-1，结合SDS-PAGE图谱发现KatG蛋白表达量与KatG活性不成比例，且TIF预测有一定的偏差(F006和F007)。将四株菌进行全细胞转化生产α-KG(110g·L^-1L-谷氨酸，全细胞细胞，pH6.5磷酸盐缓冲液体系，200r·min^-1，30℃转化24h)，发现α-KG产量F006>F005>F004>F007，KatG活性对转化效果较显著，其中F006的转化效果最好，α-KG产量达到103.1g·L^-1，转化率达到94.6％，较好的实现了双酶转化效果。

表5重组菌产酶效果

实施例5共表达菌株F006转化体系优化

以132g·L^-1L-谷氨酸为底物，在1mmol·L^-1Mn²⁺条件下，添加不同比例的全细胞催化剂进行实验，其中以同体积发酵液所获得的细胞作为1倍全细胞催化剂(菌体浓度在2.5g/L～3.5g/L之间)。分别添加1倍、1.5倍和2倍全细胞催化剂进行转化实验，30℃、200r·min^-1条件下24h转化效果见图8，1.5倍时α-KG产量为121.8g·L^-1，转化率为92.9％，2倍时α-KG产量为127.1g·L^-1，此时转化率为96.9％，α-KG产量提高了23.2％。

实施例6酶的应用

将上述所有共表达菌株发酵液离心获得菌体，用于转化L-谷氨酸生产α-KG。

在底物为110～135g/L的L-谷氨酸，采用pH7.0的磷酸盐缓冲液，添加不同浓度的Mn²⁺(1mM～5mM)，30℃转化18～24h测定α-KG的产量。发现FXC005、F005和F006均可以达到转化率在95％以上，实现不添加过氧化氢酶条件下的α-KG高效生产。

根据上述方法可以判断出成功构建出符合要求的共表达菌株FXC005、F005和F006，其中最有菌株为F006。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (10)

1.一种共表达L-谷氨酸氧化酶和过氧化氢酶的DNA片段，其特征在于，所述DNA片段由编码L-谷氨酸氧化酶的基因序列、连接序列、编码过氧化氢酶的基因序列依次连接而成；所述连接序列的核苷酸序列如SEQIDNO.5、SEQIDNO.6或者SEQIDNO.7所示。

2.根据权利要求所述的DNA片段，其特征在于，所述L-谷氨酸氧化酶的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。

3.根据权利要求所述的DNA片段，其特征在于，所述过氧化氢酶的氨基酸序列如SEQIDNO.3所示。

4.含有权利要求1所述DNA片段的重组载体。

5.含有权利要求1所述DNA片段的共表达菌株。

6.权利要求1所述的DNA片段经表达后得到的酶系。

7.权利要求6所述的酶系或者权利要求5所述的共表达菌株在转化生产α-酮戊二酸方面的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述应用是以L-谷氨酸或谷氨酸钠为底物，在pH6.0-8.0，温度30-42℃下，转化18-24h，利用所述酶系或者共表达菌株催化生产α-酮戊二酸。

9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述生产过程中添加1～5mmol/L的MnCl₂。

10.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述转化生产中初始底物的浓度为110-135g/L。