CN112852912A

CN112852912A - 一种合成7-氨基去乙酰氧基头孢烷酸的方法

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Publication number: CN112852912A
Application number: CN202010277958.0A
Authority: CN
Inventors: 孙周通; 杨大猛
Original assignee: Tianjin Institute of Industrial Biotechnology of CAS
Current assignee: Tianjin Institute of Industrial Biotechnology of CAS
Priority date: 2020-04-10
Filing date: 2020-04-10
Publication date: 2021-05-28
Anticipated expiration: 2040-04-10
Also published as: CN112852912B

Abstract

本发明公开了一种合成7‑氨基去乙酰氧基头孢烷酸的方法。本发明提供了一种合成7‑苯乙酰氨基去乙酰氧基头孢烷酸的方法，为在生物合成α‑酮戊二酸和生物合成过氧化物酶的作用下，利用生物合成的脱乙酰氧头孢菌素C合成酶scDAOCS7，催化青霉素G或其盐，合成7‑苯乙酰氨基去乙酰氧基头孢烷酸(G‑7‑ADCA)；2)通过青霉素酰化酶催化所述7‑苯乙酰氨基去乙酰氧基头孢烷酸合成7‑氨基去乙酰氧基头孢烷酸(7‑ADCA)。该方法使用全细胞作为催化剂，细胞可以提供辅因子再生的环境，从而在反应过程中无需外源添加辅因子。

Description

一种合成7-氨基去乙酰氧基头孢烷酸的方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种合成7-氨基去乙酰氧基头孢烷酸的方法。

背景技术

7-氨基去乙酰氧基头孢烷酸(7-ADCA,结构式如图1所示)是重要的头孢类抗生素合成的母核，目前以7-ADCA为母核合成的内酰胺类药物包括头孢羟氨、头孢拉定、头孢克罗等都是国内外抗生素市场用量较大的抗生素药物。7-ADCA合成方法主要有两种，化学法和酶法。其中化学法首先以青霉素G钾盐为原料将其氧化为青霉素G亚砜，然后扩环重排产生7-苯乙酰氨基去乙酰氧基头孢烷酸，最后采用化学水解的方法制得7-ADCA,因为化学法合成7-ADCA工艺复杂，工序多，设备要求严格，反应过程中会大量使用化工原料和有机溶媒，存在劳动保护和环境污染问题等缺点而逐渐被化学酶法替代。

目前生产7-ADCA的主要工艺为半合成酶法，以青霉素G钾盐为底物，经过过氧化氢催化扩环生成7-苯乙酰氨基去乙酰氧基头孢烷酸(G-7-ADCA)，然后通过青霉素酰化酶水解去掉侧链获得7-ADCA。然而，该过程需要大量的过氧化氢，对环境冲击较大，而生物酶法由于反应条件温和、绿色环保等优点逐渐受到工业界的青睐，因此对生物酶法合成7-ADCA的研究具有重要科学研究与应用价值。

生物酶法合成7-ADCA通常是以青霉素G钾盐为原料，其合成7-ADCA的路线如图1所示，青霉素G在脱乙酰氧头孢菌素C合成酶(DAOCS)(或简称为扩环酶)的催化作用下发生扩环反应生成G-7-ADCA；G-7-ADCA在青霉素酰化酶的催化作用下发生水解反应生成7-ADCA。青霉素酰化酶属于氨基末端亲核水解酶结构家族，目前发现的来源于细菌和真菌的青霉素酰化酶超过21种，其中20世纪60年代发现的大肠杆菌来源的青霉素酰化酶，由于其固定化后具有长时间的操作稳定性等优点而备受关注(Yasnaya et al.,2010；Kyslík et al.,2013)，目前已经在工业领域被广泛的应用，所以青霉素酰化酶并不是酶法合成7-ADCA的限速步骤，因此生物酶法合成7-ADCA主要针对提高DAOCS对青霉素G的催化活性或其高效转化工艺的研究上。

目前顶头孢霉菌(C.acremonium)，棒状链霉菌(S.clavuligerus)和诺卡氏菌(N.lactamdurans)来源的DAOCS已经表达纯化出来并且证明是Fe²⁺、O₂和α-酮戊二酸依赖的酶(Vallejo et al,.1987；Yeh and Dotzlaf.,1987)。其中scDAOCS(S.clavuligerus来源的DAOCS,EC 1.14.20.1)是当前唯一获得单晶解析的DAOCS酶，scDAOCS以三聚体的形式存在，且每个单体的羧基端(残基308-311)插入相邻单体的活性口袋中。当体系中存在Fe²⁺和α-酮戊二酸时，会诱导scDAOCS解离为单体形式。研究表明，scDAOCS单体是催化扩环反应的活性形式，而其催化活性则与scDAOCS单体和scDAOCS三聚体之间的平衡有关。但是DAOCS催化青霉素G盐合成G-7-ADCA需要添加α-酮戊二酸，因此从成本的角度考虑，通过添加谷氨酸合成α-酮戊二酸更具有经济可行性。

发明内容

本发明一个目的是提供一种合成7-氨基去乙酰氧基头孢烷酸的方法。

本发明提供的方法，包括如下步骤：

1)以青霉素G或其盐为底物，用脱乙酰氧头孢菌素C合成酶DAOCS催化合成7-苯乙酰氨基去乙酰氧基头孢烷酸(G-7-ADCA)；所述催化过程中引入酶级联系统的生物合成途径来提供辅因子α-酮戊二酸和自主清除转化过程中产生的H₂O₂，且以全细胞的方式维持转化过程中的辅因子再生；

2)以所述7-苯乙酰氨基去乙酰氧基头孢烷酸(G-7-ADCA)为底物，用青霉素酰化酶催化合成7-氨基去乙酰氧基头孢烷酸(7-ADCA)。

步骤1)中，所述酶级联系统的生物合成途径为如下：以L-谷氨酸为底物，用L-谷氨酸氧化酶进行催化，生成辅因子α-酮戊二酸和副产物过氧化氢；且在所述催化过程中用过氧化氢酶清除所述副产物过氧化氢；

上述步骤1)的催化反应为用表达脱乙酰氧头孢菌素C合成酶(或称为扩环酶)、L-谷氨酸氧化酶和过氧化氢酶的全细胞催化L-谷氨酸和青霉素G或其盐，合成7-苯乙酰氨基去乙酰氧基头孢烷酸(G-7-ADCA)；

在本发明实施例中，全细胞为大肠杆菌，也可以是其他菌如枯草芽孢杆菌、谷氨酸棒状杆菌、酵母菌、链霉菌、青霉菌、以及顶头孢霉等丝状真菌；本发明实施例中以大肠杆菌BL21(DE3)为例。

步骤1)包括如下步骤：所述表达脱乙酰氧头孢菌素C合成酶、L-谷氨酸氧化酶和过氧化氢酶的大肠杆菌为将所述L-谷氨酸氧化酶、所述过氧化物酶编码基因和所述DAOCS酶编码基因导入所述大肠杆菌。具体采用质粒的形式导入。

上述方法中，所述L-谷氨酸氧化酶为来源于淀粉酶产色链霉菌(Streptomycesdiastatochromogenes)的L-谷氨酸氧化酶sdLGOX，或来源于绿孢链霉菌(Streptomycesviridosporus)的L-谷氨酸氧化酶svLGOX，或来源于链霉菌(Streptomyces mobaraensis)L-谷氨酸氧化酶smLGOX；

或，所述过氧化物酶来源于大肠杆菌(Escherichia coli)；

或，所述脱乙酰氧头孢菌素C合成酶scDAOCS7来源于棒状链霉菌(S.clavuligerus)。

在全细胞表达时可以根据不同的菌进行密码子优化。

上述方法中，所述L-谷氨酸氧化酶、所述过氧化物酶编码基因和所述scDAOCS7酶编码基因通过1个或多个质粒到导入。

上述scDAOCS7、L-谷氨酸氧化酶、过氧化物酶构建到同一个载体上或者多个载体上，且顺序可变；也可将scDAOCS7、L-谷氨酸氧化酶、过氧化物酶进行融合表达；构建成重组表达质粒。

上述方法中，步骤1)中的催化反应是在含有Fe²⁺的体系中进行；

所述含有Fe²⁺的体系包括青霉素G或其盐、L-谷氨酸、Fe²⁺和所述重组菌。

上述表达所述L-谷氨酸氧化酶、所述过氧化物酶和所述脱乙酰氧头孢菌素C合成酶scDAOCS7的大肠杆菌在催化前需要用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导所需酶的表达；IPTG诱导培养采用的培养基为TB液体培养基。

在本发明的实施例中采用的青霉素G盐为青霉素G钾盐；

步骤1)的催化所在体系包括：10-200mM的磷酸盐缓冲液、重组菌菌体浓度0.1g/mL，酶级联系统底物L-谷氨酸浓度范围为0.1-1000mM，青霉素G钾盐的浓度5mM，pH范围为6.0-9.0，反应温度范围为15-40℃；具体为：缓冲液为50mM的pH为7.4的磷酸盐缓冲液，L-谷氨酸50mM，青霉素G钾盐5mM，硫酸亚铁50ug/mL,重组菌菌体浓度达到0.1g/mL(每mL体系中的湿菌重)；催化反应的条件25℃反应2h。

步骤2)的催化所在体系包括：缓冲液为50mM的pH为7.4的磷酸盐缓冲液，上述步骤1)反应产物上清液、青霉素G酰化酶；催化反应的条件30℃、1000rpm条件下反应2h。

本发明另一个目的是提供一种合成7-苯乙酰氨基去乙酰氧基头孢烷酸的方法。

本发明提供的方法，为上述第一个目的方法的步骤1)。

上述方法中的重组菌或其相应的重组质粒也是本发明保护的范围。

上述相应的重组质粒具体可以为表达所述L-谷氨酸氧化酶、所述过氧化物酶编码基因和所述DAOCS酶编码基因的质粒。

上述重组菌在合成7-苯乙酰氨基去乙酰氧基头孢烷酸或7-氨基去乙酰氧基头孢烷酸中的应用也是本发明保护的范围。

本发明针对α-酮戊二酸再生这个问题，通过设计一条从L-谷氨酸出发的酶级联反应来高效的提供α-酮戊二酸，不仅以全细胞的方式维持转化过程中的辅因子再生解决了辅助因子添加的问题，而且与最优突变体结合使用后能够显著提高G-7-ADCA的产量，通过添加固定化的青霉素G酰化酶催化G-7-ADCA进而获得较高的7-ADCA产量。综上所述，采用本发明所述的酶级联反应后，生物酶法合成7-ADCA的效率获得了明显的提高。

本发明针对在酶法合成7-ADCA路线中的青霉素G钾盐到G-7-ADCA部分，提出了一种使用scDAOCS7和两步酶级联系统高效合成G-7-ADCA的方法。两步酶级联系统具体为：以L-谷氨酸为底物，使用L-谷氨酸氧化酶催化合成α-酮戊二酸，使用过氧化物酶清除α-酮戊二酸合成过程中产生的H₂O₂。该酶级联系统具有如下优势：(I)以相对廉价且天然的L-谷氨酸作为底物；(II)自主清除合成过程中的H₂O₂，从而解除其对酶的抑制和对活体细胞的伤害；(III)胞内环境可维持辅因子的再生，从而无需外源添加辅因子。合成的G-7-ADCA可在固定化青霉素酰化酶的催化下合成7-ADCA。

本发明的有益之处：本发明提供了一种7-ADCA的高效生物合成方法，其优势主要体现在3个方面：首先，该方法使用L-谷氨酸为底物，L-谷氨酸是一种相对廉价且易于工业化大规模获取的氨基酸；其次，该方法可自主清除α-酮戊二酸合成过程中产生的H₂O₂，从而解除其对活体细胞的毒害作用；最后，该方法使用全细胞作为催化剂，细胞可以提供辅因子再生的环境，从而在反应过程中无需外源添加辅因子α-酮戊二酸。在未优化菌株转化条件的情况下，YM04比阳性对照的产量提高了29.16％，YM05比阳性对照的产量提高了57.33％，

附图说明

图1为酶法催化青霉素G合成7-ADCA。

图2为酶法催化青霉素G合成成G-7-ADCA。

图3为scDAOCS7与L-谷氨酸氧化酶共表达质粒图谱。

图4为scDAOCS7质粒图谱和L-谷氨酸氧化酶表达质粒图谱。

图5为G-7-ADCA标准品的标准曲线。

图6为scDAOCS7加入L-谷氨酸氧化酶高效液相色谱检测结果。

图7为酶级联系统示意图。

图8为scDAOCS7、L-谷氨酸氧化酶与过氧化物酶共表达质粒图谱。

图9为scDAOCS7加入酶级联系统高效液相色谱结果。

图10为酶级联系统与scDAOCS7共表达合成7-ADCA示意图。

图11为7-ADCA标准品的标准曲线。

图12为固定化青霉素酰化酶催化G-7-ADCA合成7-ADCA高效液相色谱结果。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中采用的脱乙酰氧头孢菌素C合成酶scDAOCS7的氨基酸序列为序列1，编码该酶的核苷酸序列为序列表中序列2所示。

TB液体培养基配方：将下列组分溶解在0.9L水中：蛋白胨12g，酵母提取物24g，甘油4mL，各组分溶解后高压灭菌，冷却到60℃，再加100mL灭菌的170mmol/L KH₂PO₄/0.72mol/L K₂HPO₄的溶液。

本发明中提供的基因序列(ID)号均来自uniprot数据库。

下述实施例中吉布森组装使用的试剂盒为ClonExpressTM II One Step CloningKit，购买于华蔚天津科技有限公司，货号为C112-02。

实施例1、不同来源的L-谷氨酸氧化酶(LGOX)和scDAOCS7偶联催化L-谷氨酸和青霉素G合成G-7-ADCA

如图2所示，以L-谷氨酸为底物通过L-谷氨酸氧化酶的催化，可以高效合成α-酮戊二酸，为脱乙酰氧头孢菌素C合成酶scDAOCS7催化青霉素G的过程提供充足的辅因子α-酮戊二酸。

选取不同来源的L-谷氨酸氧化酶(LGOX)酶进行实验。

通过文献调研及uniprot数据库搜索，找到三种不同来源的L-谷氨酸氧化酶，分别是来源于淀粉酶产色链霉菌(Streptomyces diastatochromogenes)L-谷氨酸氧化酶sdLGOX(编码基因的基因序列号为A0A1B1PF34，接收时间为2016年11月2日)、来源于绿孢链霉菌(Streptomyces viridosporus)L-谷氨酸氧化酶svLGOX(编码基因的基因序列号为D6A5I3，接收时间为2010年7月13日)和来源于链霉菌(Streptomyces mobaraensis)L-谷氨酸氧化酶smLGOX(编码基因的基因序列号为A0A1S6XWY4，接收时间为2017年5月10日)。

1、表达scDAOCS7和L-谷氨酸氧化酶(LGOX)的载体的构建

质粒pET-24a-scDAOCS7为将序列2所示的scDAOCS7编码基因插入pET-24a载体(Novagen)中NdeI/XhoI位点间得到的质粒，该质粒用于表达scDAOCS7蛋白；

质粒pET-24a-scDAOCS7-sdLGOX为将带有RBS的sdLGOX基因插入pET-24a-scDAOCS7质粒中scDAOCS7基因的后面(采用下述的吉布森组装方法)与其形成共表达基因scDAOCS7-sdLGOX，得到的质粒，该质粒用于表达scDAOCS7和sdLGOX蛋白；scDAOCS7-sdLGOX由序列2所示的scDAOCS7编码基因、序列3所示的RBS序列和sdLGOX编码基因组成；

质粒pET-24a-scDAOCS7-svLGOX和质粒pET-24a-scDAOCS7-smLGOX与质粒pET-24a-scDAOCS7-sdLGOX不同的是仅将sdLGOX编码基因分别替换为svLGOX编码基因和smLGOX编码基因，其他序列不变。

质粒pET-24a-scDAOCS7-sdLGOX、pET-24a-scDAOCS7-svLGOX和pET-24a-scDAOCS7-smLGOX的图谱如图3所示。

上述各个质粒构建的具体操作为：根据大肠杆菌的密码子偏好对scDAOCS7(序列2)、sdLGOX(基因ID号为A0A1B1PF34，接收时间为2016年11月2日)、svLGOX(基因ID号为D6A5I3，接收时间为2010年7月13日)和smLGOX(基因ID号为A0A1S6XWY4，接收时间为2017年5月10日)的核苷酸序列进行密码子优化，并进行全基因合成(由武汉金开瑞生物工程有限公司合成)，将合成的基因序列分别构建到质粒pET-24a的酶切位点NdeI和XhoI之间，获得质粒pET-24a-scDAOCS7、pET-24a-sdLGOX、pET-24a-svLGOX和pET-24a-smLGOX(质粒图谱如图4所示)。

进一步，以质粒pET-24a-scDAOCS7为模板，用引物VECTOR-sdLGOX-F和VECTOR-sdLGOX-R进行PCR扩增出载体基因片段VECTOR-SDLGOX；以质粒pET-24a-sdLGOX为模板，用引物sdLGOX-F和sdLGOX-R进行PCR扩增出基因片段SDLGOX。

以质粒pET-24a-scDAOCS7为模板，用引物VECTOR-svLGOX-F和VECTOR-svLGOX-R进行PCR扩增出载体基因片段VECTOR-SVLGOX；以质粒pET-24a-svLGOX为模板，用引物svLGOX-F和svLGOX-R进行PCR扩增出基因片段SVLGOX。

以质粒pET-24a-scDAOCS7为模板，用引物VECTOR-smLGOX-F和VECTOR-smLGOX-R进行PCR扩增出载体基因片段VECTOR-SMLGOX；

以质粒pET-24a-smLGOX为模板，用引物smLGOX-F和smLGOX-R进行PCR扩增出基因片段SMLGOX。

上述采用引物的序列如表1所示，上述PCR程序为：预变性98℃2min，变性98℃15s，退火55℃15s，延伸72℃时间根据基因片段长度设定，最后72℃10min，变性到延伸程序设定为30个循环。

将基因片段VECTOR-SDLGOX和SDLGOX、VECTOR-SVLGOX和SVLGOX、VECTOR-SMLGOX和SMLGOX分别通过吉布森组装进行连接，之后利用电转化将组装后的混合液转化进大肠杆菌BL21(DE3)中，将菌液均匀的涂布在含卡那霉素(Kan)抗性的LB平板上，37℃下培养14h待长出单菌落，挑取单菌落进行测序验证，分别获得重组质粒pET-24a-scDAOCS7-sdLGOX、pET-24a-scDAOCS7-svLGOX和pET-24a-scDAOCS7-smLGOX(质粒图谱如图3所示)。

表1为重组质粒构建所用引物序列

2、重组菌的制备

将上述1制备的质粒pET-24a-scDAOCS7、pET-24a-scDAOCS7-sdLGOX、pET-24a-scDAOCS7-svLGOX和pET-24a-scDAOCS7-smLGOX和pET-24a分别转化到BL21(DE3)中，涂Kan抗性的LB平板，37℃下培养过夜，长出单菌落后分别获得重组菌株BL21(DE3)/pET-24a、BL21(DE3)/pET-24a-scDAOCS7、BL21(DE3)/pET-24a-scDAOCS7-sdLGOX(命名为YD01)、BL21(DE3)/pET-24a-scDAOCS7-svLGOX(命名为YD02)、BL21(DE3)/pET-24a-scDAOCS7-smLGOX(命名为YD03)。

3、合成G-7-ADCA

分别挑取上述2得到的重组菌株BL21(DE3)/pET-24a、BL21(DE3)/pET-24a-scDAOCS7、YD01、YD02、YD03的单菌落转接到含Kan抗性的5mL的LB液体培养基中，在37℃、220rpm条件下培养过夜，然后按照体积比1：100的比例转接到含Kan抗性的50mL的TB液体培养基中，培养至OD600达到0.6左右后加入终浓度为0.1mM的异丙基-β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷(IPTG)进行酶的诱导表达12h，获得重组蛋白表达菌体。

配制催化体系：

用50mM的pH为7.4的磷酸盐缓冲液清洗诱导后各种重组菌菌体一次，之后用反应液(含有：L-谷氨酸50mM，硫酸亚铁50ug/mL,青霉素G钾盐5mM，溶解于50mM的pH为7.4的磷酸盐缓冲液中)重悬菌体，使菌体浓度达到0.1g/mL(每mL体系中的湿菌重)。

阴性对照为BL21(DE3)/pET-24a，阳性对照为BL21(DE3)/pET-24a-scDAOCS7，实验组分别为YD01、YD02、YD03。

将上述催化体系在25℃反应2h，收集各种重组菌产生的反应液。

将上述各种重组菌产生的反应液10000rpm离心1min后收集上清液，进行高效液相色谱(HPLC)检测，检测条件为：

色谱柱：Agilent ZORBAX SB-C18 StableBond Analytical 4.6×250mm；流动相：水相(20mM磷酸钠缓冲液，pH3.0)/甲醇＝55/45；流速：1mL/min；检测波长：215nm。

以G-7-ADCA(山东鲁抗医药股份有限公司)为标准品，制备标准曲线如图5所示。

G-7-ADCA标准品保留时间为11.1min出峰。

各种重组菌产生的反应产物的液相检测图如图6所示，可以看出，除阴性对照外，其余各种重组菌产生的反应产物均产生11.1min左右峰，均为G-7-ADCA。

根据图5的标准曲线，计算各种重组菌产生的反应产物中G-7-ADCA的含量及转化率，结果如表2所示：

表2为G-7-ADCA检测结果

上述数据为三次重复数据的平均值,产量为每L发酵上清液中G-7-ADCA的含量。

计算转化率，Con＝100％P/(5×10^-3mol×348g/mol)

P为G-7-ADCA的产量，Con为转化率(％)。

从上表可以看出，L-谷氨酸氧化酶的加入反而会显著降低转化率，可能的原因是过氧化氢的产生会影响细胞代谢，因此实施例2验证了直接在质粒上引入过氧化氢酶基因可以解除过氧化氢的积累，提高G-7-ADCA的合成效率。

实施例2、不同来源的L-谷氨酸氧化酶(LGOX)、过氧化氢酶和scDAOCS7催化L-谷氨酸和青霉素G合成G-7-ADCA

大肠杆菌自身存在过氧化氢酶基因katE(基因的ID号为P21179，接收时间为1991年5月1日)，将该基因导入质粒过表达后能够将产生的H₂O₂降解为H₂O和O₂，如图7所示。

因此将katE的基因序列前面加上RBS1序列(如序列4所示)直接放在L-谷氨酸氧化酶基因序列的后面，构建好的质粒图谱如图8所示。

1、共表达scDAOCS7、LGOX和katE的重组质粒的构建

重组质粒pET-24a-scDAOCS7-sdLGOX-katE为将带有RBS1的katE基因插入pET-24a-scDAOCS7-sdLGOX质粒载体中sdLGOX基因的后面(采用下述的吉布森组装方法)与其形成多基因序列scDAOCS7-sdLGOX-katE，该质粒共表达scDAOCS7、sdLGOX和katE蛋白；scDAOCS7-sdLGOX-katE多基因序列，由序列2所示的scDAOCS7编码基因、序列4所示的RBS1序列、sdLGOX编码基因(基因ID号为A0A1B1PF34，接收时间为2016年11月2日)和序列4所示的RBS1和过氧化氢酶基因katE(基因的ID号为P21179，接收时间为1991年5月1日)组成；

重组质粒pET-24a-scDAOCS7-svLGOX-katE和重组质粒pET-24a-scDAOCS7-smLGOX-katE与重组质粒pET-24a-scDAOCS7-sdLGOX-katE的区别仅在于将sdLGOX的基因序列分别替换为svLGOX和smLGOX，其他核苷酸序列不变。

上述重组质粒的具体构建方法如下：以大肠杆菌BL21(DE3)基因组为模板，利用引物katE-F和katE-R扩增出基因片段katE；以pET-24a-scDAOCS7-SDLGOX为模板，利用引物katE-VECTOR-sdLGOX-F和katE-VECTOR-sdLGOX-R扩增出载体片段katE-VECTOR-sdLGOX；以pET-24a-scDAOCS7-svLGOX为模板，利用引物katE-VECTOR-svLGOX-F和katE-VECTOR-svLGOX-R扩增出载体片段katE-VECTOR-svLGOX；以pET-24a-scDAOCS7-smLGOX为模板，利用引物katE-VECTOR-smLGOX-F和katE-VECTOR-smLGOX-R扩增出载体片段katE-VECTOR-smLGOX；引物序列如表1所示，PCR程序为：预变性98℃2min，变性98℃15s，退火55℃15s，延伸72℃时间根据基因片段长度设定，最后72℃10min，变性到延伸程序设定为30个循环。将载体序列片段katE-VECTOR-SDLGOX、katE-VECTOR-SVLGOX和katE-VECTOR-SMLGOX分别与katE通过吉布森组装进行连接，之后利用电转化将组装后的混合液转化进大肠杆菌BL21(DE3)中，将菌液均匀的涂布在Kan抗性的LB平板上，37℃下培养14h待长出单菌落，挑取单菌落进行测序验证后分别获得重组质粒pET-24a-scDAOCS7-sdLGOX-katE、pET-24a-scDAOCS7-svLGOX-katE和pET-24a-scDAOCS7-smLGOX-katE(图8)。

2、重组菌的制备

将上述1制备的重组质粒pET-24a-scDAOCS7-sdLGOX-katE、pET-24a-scDAOCS7-svLGOX-kat和pET-24a-scDAOCS7-smLGOX-katE分别转化到大肠杆菌BL21(DE3)中，涂Kan抗性的LB平板，37℃下培养过夜，长出单菌落后分别获得菌株BL21(DE3)/pET-24a-scDAOCS7-sdLGOX-katE(命名为YM04)、BL21(DE3)/pET-24a-scDAOCS7-svLGOX-katE(命名为YM05)、BL21(DE3)/pET-24a-scDAOCS7-smLGOX-katE(命名为YM06)。

3、合成G-7-ADCA

分别挑取上述2得到的YM04、YM05和YM06的单菌落转接到含Kan抗性的5mL的LB液体培养基中，37℃、220rpm条件下培养14h，之后按照体积比1：100的比例转接到含Kan抗性的50mL的TB液体培养基中，培养(37℃、220rpm条件下培养3h左右)至OD600达到0.6左右后加入0.1mM的异丙基-β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷(IPTG)进行酶的诱导表达12h，得到诱导后各种重组菌体。

配制催化体系：

用50mM的pH为7.4的磷酸盐缓冲液清洗诱导后各种重组菌菌体一次，之后用反应液(L-谷氨酸50mM，硫酸亚铁50ug/mL,青霉素G钾盐5mM，溶解于50mM的pH为7.4的磷酸盐缓冲液中)重悬菌体，使菌体浓度达到0.1g/mL。

阴性对照为BL21(DE3)/pET-24a，阳性对照为BL21(DE3)/pET-24a-scDAOCS7，实验组分别为YM04、YM05和YM06。

将上述催化体系在25℃反应2h，收集各种重组菌体产生的反应液。

将上述各种重组菌产生的反应产物10000rpm离心1min后取的上清液，进行高效液相色谱检测，检测条件为：

各种重组菌产生的反应产物的液相检测图如图9所示，可以看出，除阴性对照外，其余各种重组菌产生的反应产物均产生11.1min左右峰，均为G-7-ADCA。

根据图5中的标准曲线，计算各种重组菌产生的反应产物中G-7-ADCA的含量，结果如表3所示：

表3为G-7-ADCA检测结果

以上数据为三次重复的平均值,产量为每L发酵上清液中G-7-ADCA的含量。计算转化率公式同上。

从表3可以得出结论：除YM06外，YM04比阳性对照的产量提高了29.16％，YM05比阳性对照的产量提高了57.33％。

上述结果表明，本发明设计的两步酶级联反应能够高效的提供辅因子α-酮戊二酸(通过G-7-ADCA的产量体现)且消除反应中产生的H₂O₂，能够显著提高G-7-ADCA的产量。

因此，本发明构建了合成G-7-ADCA的新工艺：在含有L-谷氨酸和青霉素G(如青霉素G钾盐)的体系中，用表达L-谷氨酸氧化酶(LGOX)、过氧化氢酶和scDAOCS7的重组大肠杆菌进行催化反应，通过L-谷氨酸氧化酶(LGOX)、过氧化氢酶和scDAOCS7催化L-谷氨酸和青霉素G，合成G-7-ADCA。

实施例3、偶联青霉素酰化酶合成7-ADCA

根据实施例2得到的合成G-7-ADCA的重组菌，构建合成7-ADCA的新工艺(如图10所示)，具体如下：

在含有L-谷氨酸和青霉素G(如青霉素G钾盐)的体系中，用表达L-谷氨酸氧化酶(LGOX)、过氧化氢酶和scDAOCS7的重组大肠杆菌和青霉素G酰化酶进行催化反应，通过L-谷氨酸氧化酶(LGOX)、过氧化氢酶和scDAOCS7催化L-谷氨酸和青霉素G，合成G-7-ADCA；再通过青霉素G酰化酶催化G-7-ADCA合成7-ADCA。

将实施例2制备的各种重组菌反应产物，10000rpm离心1min，收集上清液。

上述各种菌反应产物分别为：阴性对照BL21(DE3)/pET-24a、阳性对照BL21(DE3)/pET-24a-scDAOCS7、YM04和YM05的反应产物。

反应体系：

在1.5mL的EP管中，分别加入阴性对照BL21(DE3)/pET-24a、阳性对照BL21(DE3)/pET-24a-scDAOCS7(G-7-ADCA的含量为1.73mM)、YM04(G-7-ADCA的含量为2.23mM)和YM05(G-7-ADCA的含量为2.72mM)的反应产物上清液1mL，再加入100g/L固定化的青霉素G酰化酶(购买于广州宝汇生物科技有限公司，货号为K100208)，缓冲体系为50mM的pH为7.4的磷酸盐缓冲液。

30℃、1000rpm条件下反应2h，收集各种反应体系对应的反应产物。

将上述各种反应产物10000rpm离心1min后取的上清液，进行液相检测，检测条件为：

谱柱：Agilent ZORBAX SB-C18 StableBond Analytical 4.6×250mm；流动相：水相(50mM磷酸盐缓冲液，pH7.5)/甲醇＝98/2；流速：1mL/min；检测波长：260nm。

以7-ADCA(结构式如图1中所示)为标准品，制备标准曲线如图11所示。

7-ADCA标准品保留时间为3.3min出峰。

各种重组菌及反应体系产生的反应产物的液相检测图如图12所示，可以看出，除阴性对照外，其余各种重组菌产生的反应产物均产生3.3min左右峰，均为7-ADCA。根据图11的标准曲线，计算各种重组菌对应的反应产物中7-ADCA的含量，结果如表4所示：

表4为7-ADCA的检测结果

上述数据为三次重复数据的平均值,产量为每L发酵上清液中7-ADCA的含量。

计算转化率Con＝100％Y/(MC)

Con为转化率(％)，Y为产生的7-ADCA浓度(g/L)，M为7-ADCA的摩尔质量(g/mol)，C为上清液中残留的G-7-ADCA的浓度(mol/L)。

从表4能够得出结论，固定化的青霉素G酰化酶能够将产生的G-7-ADCA全部转化为7-ADCA且转化率在99.99％以上。

综上所述，本发明设计的从L-谷氨酸出发能够高效提供a-酮戊二酸的酶级联反应能够显著提高以青霉素G钾盐为底物的酶法合成7-ADCA的产量。

SEQUENCE LISTING

<110>中国科学院天津工业生物技术研究所

<120> 一种合成7-氨基去乙酰氧基头孢烷酸的方法

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 311

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<400> 1

Met Asp Thr Thr Val Pro Thr Phe Ser Leu Ala Glu Leu Gln Gln Gly

1 5 10 15

Leu His Gln Asp Glu Phe Arg Arg Cys Leu Arg Asp Lys Gly Leu Phe

20 25 30

Tyr Leu Thr Asp Cys Gly Leu Thr Asp Thr Glu Leu Lys Ser Ala Lys

35 40 45

Asp Leu Val Ile Asp Phe Phe Glu His Gly Ser Glu Ala Glu Lys Arg

50 55 60

Ala Val Thr Ser Pro Val Pro Thr Thr Arg Arg Gly Phe Thr Gly Leu

65 70 75 80

Glu Ser Glu Ser Thr Ala Gln Ile Thr Asn Thr Gly Ser Tyr Ser Val

85 90 95

Tyr Ser Met Cys Tyr Ser Met Gly Thr Ala Asp Asn Leu Phe Pro Ser

100 105 110

Gly Asp Phe Glu Arg Ile Trp Thr Gln Tyr Phe Asp Arg Gln Tyr Thr

115 120 125

Ala Ser Arg Ala Val Ala Arg Glu Val Leu Arg Ala Thr Gly Thr Glu

130 135 140

Pro Asp Gly Gly Val Glu Ala Phe Leu Asp Tyr Glu Pro Leu Leu Arg

145 150 155 160

Phe Arg Tyr Phe Pro Gln Val Pro Glu His Arg Ser Ala Glu Glu Gln

165 170 175

Pro Leu Arg Met Ala Pro His His Asp Leu Ser Met Val Thr Leu Ile

180 185 190

Gln Gln Thr Pro Cys Ala Asn Gly Phe Val Ser Leu Gln Ala Glu Val

195 200 205

Gly Gly Ala Phe Val Asp Leu Pro Tyr Arg Pro Asp Ala Val Leu Val

210 215 220

Phe Cys Gly Ala Ile Ala Thr Leu Val Thr Gly Gly Gln Val Lys Ala

225 230 235 240

Pro Arg His His Val Ala Ala Pro Arg Arg Asp Gln Ile Ala Gly Ser

245 250 255

Ser Arg Thr Ser Ser Val Phe Phe Leu Arg Pro Asn Ala Asp Phe Thr

260 265 270

Phe Ser Ile Pro Leu Ala Arg Glu Tyr Gly Phe Asp Val Ser Leu Asp

275 280 285

Gly Glu Thr Ala Thr Phe Gln Asp Trp Ile Gly Gly Asn Tyr Val Asn

290 295 300

Met Arg Arg Thr Ser Lys Ala

305 310

<210> 2

<211> 936

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 2

atggatacca ccgtgccgac ctttagtctg gcagaactgc agcagggtct gcatcaggat 60

gaatttcgcc gttgcctgcg cgataaaggt ctgttttatc tgaccgattg tggtctgacc 120

gataccgaac tgaaaagtgc caaagatttg gttattgatt tctttgaaca cggtagcgaa 180

gcagaaaaac gcgccgtgac cagtccggtg ccgaccacac gccgcggttt taccggtctg 240

gaaagcgaaa gtaccgcaca gattaccaat accggtagct atagtgatta tagtatgtgt 300

tatagcatgg gtacagccga taatctgttt ccgagcggcg attttgaacg catttggacc 360

cagtattttg atcgtcagta taccgcaagt cgcgcagttg cacgcgaagt gctgcgcgca 420

accggcaccg aaccggatgg tggtgtggaa gcatttctgg attatgaacc gctgctgcgt 480

tttcgttatt ttccgcaggt gccggaacat cgtagtgccg aagaacagcc gctgcgcatg 540

gcaccgcatc atgatctgag catggtgacc ctgattcagc agaccccgtg cgcaaatggc 600

tttgttagtc tgcaggccga agttggcggc gcctttgttg atctgccgta tcgtccggat 660

gcagtgctgg ttttctgtgg tgccattgcc accctggtga ccggcggcca ggttaaagca 720

ccgcgtcatc atgtggcagc accgcgtcgt gatcagattg ccggtagtag ccgtaccagc 780

agcgttttct ttctgcgccc gaatgcagat tttaccttta gcattccgct ggcacgtgaa 840

tatggttttg atgttagcct ggatggtgaa accgccacct ttcaggattg gattggcggc 900

aattatgtta atatgcgccg caccagcaaa gcctaa 936

<210> 3

<211> 15

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 3

ggaggtgaca atatg 15

<210> 4

<211> 13

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 4

aaggagatat acc 13

Claims

1.一种合成7-氨基去乙酰氧基头孢烷酸的方法，包括如下步骤：

1)以青霉素G或其盐为底物，用脱乙酰氧头孢菌素C合成酶scDAOCS7催化反应，合成7-苯乙酰氨基去乙酰氧基头孢烷酸G-7-ADCA；

所述催化过程中引入酶级联系统的生物合成途径来提供辅因子α-酮戊二酸和自主清除转化过程中产生的H₂O₂，且以全细胞的方式维持转化过程中的辅因子再生；

2)以所述7-苯乙酰氨基去乙酰氧基头孢烷酸G-7-ADCA为底物，用青霉素酰化酶催化反应，合成7-氨基去乙酰氧基头孢烷酸7-ADCA。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：

所述酶级联系统的生物合成途径为如下：以L-谷氨酸为底物，用L-谷氨酸氧化酶进行催化，生成辅因子α-酮戊二酸和副产物过氧化氢；且在所述催化过程中用过氧化氢酶清除所述副产物过氧化氢。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：

所述步骤1)的催化反应为用表达脱乙酰氧头孢菌素C合成酶、L-谷氨酸氧化酶和过氧化氢酶的全细胞催化L-谷氨酸和青霉素G或其盐，合成7-苯乙酰氨基去乙酰氧基头孢烷酸G-7-ADCA。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：

步骤1)中，所述全细胞为大肠杆菌；

所述表达脱乙酰氧头孢菌素C合成酶、L-谷氨酸氧化酶和过氧化氢酶的大肠杆菌为将所述L-谷氨酸氧化酶、所述过氧化物酶编码基因和所述scDAOCS7酶编码基因导入所述大肠杆菌。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：

所述L-谷氨酸氧化酶、所述过氧化物酶编码基因和所述scDAOCS7酶编码基因通过1个或多个质粒到导入所述大肠杆菌。

6.根据权利要求3-5中任一所述的方法，其特征在于：

步骤1)中的催化反应是在含有Fe²⁺的体系中进行；

7.根据权利要求2-6中任一所述的方法，其特征在于：

所述L-谷氨酸氧化酶为来源于淀粉酶产色链霉菌(Streptomycesdiastatochromogenes)L-谷氨酸氧化酶sdLGOX或来源于绿孢链霉菌(Streptomycesviridosporus)的L-谷氨酸氧化酶svLGOX或来源于链霉菌(Streptomyces mobaraensis)L-谷氨酸氧化酶smLGOX；

或，所述过氧化物酶来源于大肠杆菌(Escherichia coli)；

或，所述脱乙酰氧头孢菌素C合成酶scDAOCS7来源于棒状链霉菌(S. clavuligerus)。

8.一种合成7-苯乙酰氨基去乙酰氧基头孢烷酸G-7-ADCA的方法，为权利要求1-7中任一所述方法的步骤1)。

9.权利要求2-7中任一所述方法中的重组菌或其相应的重组质粒。

10.权利要求9所述的重组菌在合成7-苯乙酰氨基去乙酰氧基头孢烷酸G-7-ADCA或7-氨基去乙酰氧基头孢烷酸7-ADCA中的应用。