CN112852913B - 脱乙酰氧头孢菌素C合成酶突变体及其在β-内酰胺抗生素母核合成中的应用 - Google Patents

脱乙酰氧头孢菌素C合成酶突变体及其在β-内酰胺抗生素母核合成中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了脱乙酰氧头孢菌素C合成酶突变体及其在β‑内酰胺抗生素母核合成中的应用。本发明公开的脱乙酰氧头孢菌素C合成酶突变体为对scDAOCS7的第61、225、160、162、179、73、102和/或158位进行突变得到的蛋白质，scDAOCS7的氨基酸序列为序列表中SEQ ID No.2。实验证明，scDAOCS7及其突变体可以催化6‑APA一步生成7‑ADCA；还可以催化青霉素G钾盐合成G‑7‑ADCA，且催化能力相较于scDAOCS7有显著的提高，具有广泛的应用前景。

Description

脱乙酰氧头孢菌素C合成酶突变体及其在β-内酰胺抗生素母 核合成中的应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域中，脱乙酰氧头孢菌素C合成酶突变体及其在β-内酰胺抗生素母核合成中的应用。
背景技术
7-氨基去乙酰氧基头孢烷酸(7-ADCA，分子式为C8H10N2O3S)是重要的头孢类抗生素合成的母核，目前采用7-ADCA合成的药物包括头孢羟氨、头孢拉定、头孢克罗等，都是国内外抗生素市场用量较大的抗生素药物。7-ADCA合成方法主要有两种，化学法和酶法。其中化学法首先以青霉素G钾盐为原料将其氧化为青霉素G亚砜，然后扩环重排产生7-苯乙酰氨基去乙酰氧基头孢烷酸，最后采用化学水解的方法制得7-ADCA。因为化学法合成7-ADCA工艺复杂，工序多，设备要求严格，反应过程中会大量使用化工原料和有机溶媒，存在劳动保护和环境污染问题等缺点而逐渐被酶法替代。
目前生产7-ADCA的主要工艺为半合成酶法，以青霉素G钾盐为底物，经过过氧化氢催化扩环生成7-苯乙酰氨基去乙酰氧基头孢烷酸(G-7-ADCA)，然后通过青霉素酰化酶水解去掉侧链获得7-ADCA。然而，该过程需要大量的过氧化氢，对环境冲击较大，而生物酶法由于反应条件温和、绿色环保等优点逐渐受到工业界的青睐，因此对生物酶法合成7-ADCA的研究具有重要科学研究与应用价值。生物酶法合成7-ADCA通常是以价格低廉的青霉素G钾盐为原料，合成7-ADCA的路线为：青霉素G钾盐在脱乙酰氧头孢菌素C合成酶(DAOCS)的催化作用下发生扩环反应生成7-苯乙酰氨基去乙酰氧基头孢烷酸(G-7-ADCA)，青霉素G到G-7-ADCA的反应结构式路线图如图1所示，G-7-ADCA在青霉素酰化酶的催化作用下发生水解反应生成7-ADCA。其中20世纪60年代发现的大肠杆菌来源的青霉素酰化酶由于其固定化后具有长时间的操作稳定性等优点而备受关注，已经在工业领域被广泛的应用，所以青霉素酰化酶不是酶法合成7-ADCA的限速步骤，因此目前酶法合成7-ADCA的关键在于提高DAOCS对青霉素G的催化活性，但是DAOCS的活性较低，难以满足工业化的生产需求。
顶头孢霉菌(C.acremonium)，棒状链霉菌(S.clavuligerus)和诺卡氏菌(N.lactamdurans)来源的DAOCS已经获得表达纯化，并且证明是Fe2+、O2和α-酮戊二酸依赖的酶(Vallejo et al,.1987；Yeh and Dotzlaf.,1987)。scDAOCS(S.clavuligerus来源的DAOCS,EC 1.14.20.1)是当前唯一获得单晶解析的DAOCS酶。scDAOCS以三聚体的形式存在，且每个单体的羧基端(残基308-311)插入相邻单体的活性口袋中。当体系中存在Fe2+和α-酮戊二酸时，会诱导scDAOCS解离为单体形式。研究表明，scDAOCS单体是催化扩环反应的活性形式，而其催化活性则与scDAOCS单体和scDAOCS三聚体之间的平衡有关。虽然针对底物青霉素G钾盐的脱乙酰氧头孢菌素C合成酶也进行了相关突变研究(Yang et al.,2012)，但是其活性仍然满足不了工业化的需求，因此，改造提高催化活力来满足工业化需求就显得尤为重要。
发明内容
本发明的目的是提供脱乙酰氧头孢菌素C合成酶突变体在制备7-ADCA中的应用。
本发明首先提供了制备7-ADCA的方法，所述方法包括：以6-氨基青霉烷酸(6-APA)为底物，利用scDAOCS7或scDAOCS7突变蛋白质进行催化反应，得到7-ADCA；
所述scDAOCS7的氨基酸序列为序列表中SEQ ID No.2；所述scDAOCS7突变蛋白质为对scDAOCS7的第61、225、160、162、179、73、102和/或158位进行突变得到的蛋白质。
上述方法中，所述scDAOCS7突变蛋白质可为对scDAOCS7进行如下八种的全部、任七种、任六种、任五种、任四种、任三种、任两种或任一种改造得到的蛋白质：
X1、将scDAOCS7第61位的丙氨酸残基突变为天冬氨酸残基或谷氨酸残基；
X2、将scDAOCS7第225位的苯丙氨酸残基突变为亮氨酸残基或异亮氨酸残基；
X3、将scDAOCS7第160位的精氨酸残基突变为丙氨酸残基、缬氨酸残基、苏氨酸残基、异亮氨酸残基、半胱氨酸残基或甘氨酸残基；
X4、将scDAOCS7第162位的精氨酸残基突变为丙氨酸残基、缬氨酸残基、苏氨酸残基、异亮氨酸残基、半胱氨酸残基或甘氨酸残基；
X5、将scDAOCS7第179位的精氨酸残基突变为亮氨酸残基、异亮氨酸残基、丙氨酸残基、甘氨酸残基、脯氨酸残基、缬氨酸残基或苏氨酸残基；
X6、将scDAOCS7第73位的苏氨酸残基突变为丙氨酸残基、缬氨酸残基、异亮氨酸残基、亮氨酸残基、甲硫氨酸残基、半胱氨酸残基或丝氨酸残基；
X7、将scDAOCS7第102位的丝氨酸残基突变为丙氨酸残基、缬氨酸残基、异亮氨酸残基、亮氨酸残基、甲硫氨酸残基、苏氨酸残基或半胱氨酸残基；
X8、将scDAOCS7第158位的亮氨酸残基突变为丙氨酸残基、缬氨酸残基、异亮氨酸残基、甲硫氨酸残基、苏氨酸残基、半胱氨酸残基或丝氨酸残基。
在本发明的一个实施例中，所述scDAOCS7突变蛋白质为scDAOCS7-A61D、scDAOCS7-A61E、scDAOCS7-F225I、scDAOCS7-F225L、scDAOCS7-A61D/F225I、scDAOCS7-A61D/F225L、scDAOCS7-A61E/F225I或scDAOCS7-A61E/F225L。所述scDAOCS7-A61D为将scDAOCS7的第61位的丙氨酸残基突变为天冬氨酸残基得到的蛋白质。所述scDAOCS7-A61E为将scDAOCS7的第61位的丙氨酸残基突变为谷氨酸残基得到的蛋白质。所述scDAOCS7-F225I为将scDAOCS7的第225位的苯丙氨酸残基突变为异亮氨酸残基得到的蛋白质。所述scDAOCS7-F225L为将scDAOCS7的第225位的苯丙氨酸残基突变为亮氨酸残基得到的蛋白质。所述scDAOCS7-A61D/F225I为将scDAOCS7的第61位的丙氨酸残基突变为天冬氨酸残基、第225位的苯丙氨酸残基突变为异亮氨酸残基得到的蛋白质。所述scDAOCS7-A61D/F225L为将scDAOCS7的第61位的丙氨酸残基突变为天冬氨酸残基、第225位的苯丙氨酸残基突变为亮氨酸残基得到的蛋白质。所述scDAOCS7-A61E/F225I为将scDAOCS7的第61位的丙氨酸残基突变为谷氨酸残基、第225位的苯丙氨酸残基突变为异亮氨酸残基得到的蛋白质。所述scDAOCS7-A61E/F225L为将scDAOCS7的第61位的丙氨酸残基突变为谷氨酸残基、第225位的苯丙氨酸残基突变为亮氨酸残基得到的蛋白质。
在本发明的另一个实施例中，所述scDAOCS7突变蛋白质为scDAOCS7-R179L、scDAOCS7-R160A/R162A/R179I、scDAOCS7-R160I/R162C/R179A、scDAOCS7-R160G/R162A/R179I、scDAOCS7-T73S/S102V/L158T、scDAOCS7-T73L/S102C/L158I、scDAOCS7-T73M/S102T/L158I、scDAOCS7-T73A/S102L/L158I、scDAOCS7-T73L/S102M/L158T、scDAOCS7-T73M/S102I/L158I、scDAOCS7-T73V/S102T/L158S、scDAOCS7-S102I/L158A、scDAOCS7-T73L/S102I/L158V、scDAOCS7-T73S/S102M/L158A、scDAOCS7-T73L/S102C/L158I、scDAOCS7-T73M/S102C/L158I、scDAOCS7-T73S/S102L/L158I、scDAOCS7-T73L/S102C/L158A、scDAOCS7-T73V/S102M/L158I、scDAOCS7-T73L/S102A/L158A、scDAOCS7-T73C/S102T、scDAOCS7-T73M/S102C/L158A、scDAOCS7-L158I、scDAOCS7-L158V、scDAOCS7-T73S/S102I、scDAOCS7-T73V/S102A/L158C或scDAOCS7-T73C/S102I/L158S。
所述scDAOCS7-R179L为将scDAOCS7的第179位的精氨酸残基突变为亮氨酸残基得到的蛋白质。
所述scDAOCS7-R160A/R162A/R179I为将scDAOCS7的第160、162、179位的精氨酸残基分别突变为丙氨酸残基、丙氨酸残基、异亮氨酸残基得到的蛋白质。
所述scDAOCS7-R160I/R162C/R179A为将scDAOCS7的第160、162、179位的精氨酸残基分别突变为异亮氨酸残基、半胱氨酸残基、丙氨酸残基得到的蛋白质。
所述scDAOCS7-R160G/R162A/R179I为将scDAOCS7的第160、162、179位的精氨酸残基分别突变为甘氨酸残基、丙氨酸残基、异亮氨酸残基得到的蛋白质。
所述scDAOCS7-T73S/S102V/L158T为将scDAOCS7的第73位的苏氨酸残基突变为丝氨酸残基、第102位的丝氨酸残基突变为缬氨酸残基、第158位的亮氨酸残基突变为苏氨酸残基得到的蛋白质。
所述scDAOCS7-T73L/S102C/L158I为将scDAOCS7的第73位的苏氨酸残基突变为亮氨酸残基、第102位的丝氨酸残基突变为半胱氨酸残基、第158位的亮氨酸残基突变为异亮氨酸残基得到的蛋白质。
所述scDAOCS7-T73M/S102T/L158I为将scDAOCS7的第73位的苏氨酸残基突变为甲硫氨酸残基、第102位的丝氨酸残基突变为苏氨酸残基、第158位的亮氨酸残基突变为异亮氨酸残基得到的蛋白质。
所述scDAOCS7-T73A/S102L/L158I为将scDAOCS7的第73位的苏氨酸残基突变为丙氨酸残基、第102位的丝氨酸残基突变为亮氨酸残基、第158位的亮氨酸残基突变为异亮氨酸残基得到的蛋白质。
所述scDAOCS7-T73L/S102M/L158T为将scDAOCS7的第73位的苏氨酸残基突变为亮氨酸残基、第102位的丝氨酸残基突变为甲硫氨酸残基、第158位的亮氨酸残基突变为苏氨酸残基得到的蛋白质。
所述scDAOCS7-T73M/S102I/L158I为将scDAOCS7的第73位的苏氨酸残基突变为甲硫氨酸残基、第102位的丝氨酸残基突变为异亮氨酸残基、第158位的亮氨酸残基突变为异亮氨酸残基得到的蛋白质。
所述scDAOCS7-T73V/S102T/L158S为将scDAOCS7的第73位的苏氨酸残基突变为缬氨酸残基、第102位的丝氨酸残基突变为苏氨酸残基、第158位的亮氨酸残基突变为丝氨酸残基得到的蛋白质。
所述scDAOCS7-S102I/L158A为将scDAOCS7的第102位的丝氨酸残基突变为异亮氨酸残基、第158位的亮氨酸残基突变为丙氨酸残基得到的蛋白质。
所述scDAOCS7-T73L/S102I/L158V为将scDAOCS7的第73位的苏氨酸残基突变为亮氨酸残基、第102位的丝氨酸残基突变为异亮氨酸残基、第158位的亮氨酸残基突变为缬氨酸残基得到的蛋白质。
所述scDAOCS7-T73S/S102M/L158A为将scDAOCS7的的第73位的苏氨酸残基突变为丝氨酸残基、第102位的丝氨酸残基突变为甲硫氨酸残基、第158位的亮氨酸残基突变为丙氨酸残基得到的蛋白质。
所述scDAOCS7-T73L/S102C/L158I为将scDAOCS7的第73位的苏氨酸残基突变为亮氨酸残基、第102位的丝氨酸残基突变为半胱氨酸残基、第158位的亮氨酸残基突变为异亮氨酸残基得到的蛋白质。
所述scDAOCS7-T73M/S102C/L158I为将scDAOCS7的第73位的苏氨酸残基突变为甲硫氨酸残基、第102位的丝氨酸残基突变为半胱氨酸残基、第158位的亮氨酸残基突变为异亮氨酸残基得到的蛋白质。
所述scDAOCS7-T73S/S102L/L158I为将scDAOCS7的第73位的苏氨酸残基突变为丝氨酸残基、第102位的丝氨酸残基突变为亮氨酸残基、第158位的亮氨酸残基突变为异亮氨酸残基得到的蛋白质。
所述scDAOCS7-T73L/S102C/L158A为将scDAOCS7的第73位的苏氨酸残基突变为亮氨酸残基、第102位的丝氨酸残基突变为半胱氨酸残基、第158位的亮氨酸残基突变为丙氨酸残基得到的蛋白质。
所述scDAOCS7-T73V/S102M/L158I为将scDAOCS7的第73位的苏氨酸残基突变为缬氨酸残基、第102位的丝氨酸残基突变为甲硫氨酸残基、第158位的亮氨酸残基突变为异亮氨酸残基得到的蛋白质。
所述scDAOCS7-T73L/S102A/L158A为将scDAOCS7的第73位的苏氨酸残基突变为亮氨酸残基、第102位的丝氨酸残基突变为丙氨酸残基、第158位的亮氨酸残基突变为丙氨酸残基得到的蛋白质。
所述scDAOCS7-T73C/S102T为将scDAOCS7的第73位的苏氨酸残基突变为半胱氨酸残基、第102位的丝氨酸残基突变为苏氨酸残基得到的蛋白质。
所述scDAOCS7-T73M/S102C/L158A为将scDAOCS7的第73位的苏氨酸残基突变为甲硫氨酸残基、第102位的丝氨酸残基突变为半胱氨酸残基、第158位的亮氨酸残基突变为丙氨酸残基得到的蛋白质。
所述scDAOCS7-L158I为将scDAOCS7的第158位的亮氨酸残基突变为异亮氨酸残基得到的蛋白质。
所述scDAOCS7-L158V为将scDAOCS7的第158位的亮氨酸残基突变为缬氨酸残基得到的蛋白质。
所述scDAOCS7-T73S/S102I为将scDAOCS7的第73位的苏氨酸残基突变为丝氨酸残基、第102位的丝氨酸残基突变为异亮氨酸残基得到的蛋白质。
所述scDAOCS7-T73V/S102A/L158C为将scDAOCS7的第73位的苏氨酸残基突变为缬氨酸残基、第102位的丝氨酸残基突变为丙氨酸残基、第158位的亮氨酸残基突变为半胱氨酸残基得到的蛋白质。
所述scDAOCS7-T73C/S102I/L158S为将scDAOCS7的第73位的苏氨酸残基突变为半胱氨酸残基、第102位的丝氨酸残基突变为异亮氨酸残基、第158位的亮氨酸残基突变为丝氨酸残基得到的蛋白质。
上述方法中，所述催化反应的反应体系可为向100μL 50mM磷酸盐缓冲液(pH 7.4)中加入scDAOCS7或所述scDAOCS7突变蛋白质、FeSO4、α-酮戊二酸、L-抗坏血酸和6-APA得到的体系，FeSO4、α-酮戊二酸、L-抗坏血酸、6-APA在反应体系中的终浓度分别为1.8mM、4mM、0.4mM、2.5mM。
所述催化反应可在25℃下进行。所述催化反应的时间可为5h。
本发明还提供了另一种制备7-ADCA的方法，所述方法包括：以6-APA为底物，利用表达scDAOCS7或所述scDAOCS7突变蛋白质的重组细胞或所述重组细胞的裂解物进行催化反应，得到7-ADCA。
上述方法中，所述重组细胞可通过向生物细胞中导入能表达scDAOCS7或所述
scDAOCS7突变蛋白质的重组载体实现。
所述生物细胞可为微生物。所述微生物可为大肠杆菌，也可以是其他菌，如枯草芽孢杆菌、谷氨酸棒状杆菌、酵母菌、链霉菌、青霉菌或顶头孢霉等丝状真菌。在本发明的一个实施例中，所述微生物为大肠杆菌BL21(DE3)为例。
所述重组载体可为将pET24a(+)载体中NdeI和XhoI识别序列间的小DNA片段替换为scDAOCS7基因或所述scDAOCS7突变蛋白质的编码基因得到的重组质粒。
所述scDAOCS7基因可为序列表中SEQ ID No.1所示的核酸分子。
所述scDAOCS7突变蛋白质的编码基因可为scDAOCS7-A61D基因、scDAOCS7-A61E基因、scDAOCS7-F225I基因、scDAOCS7-F225L基因、scDAOCS7-A61D/F225I基因、scDAOCS7-A61D/F225L基因、scDAOCS7-A61E/F225I基因、scDAOCS7-A61E/F225L基因、scDAOCS7-R179L基因、scDAOCS7-R160A/R162A/R179I基因、scDAOCS7-R160I/R162C/R179A基因、scDAOCS7-R160G/R162A/R179I基因、scDAOCS7-T73S/S102V/L158T基因、scDAOCS7-T73L/S102C/L158I基因、scDAOCS7-T73M/S102T/L158I基因、scDAOCS7-T73A/S102L/L158I基因、scDAOCS7-T73L/S102M/L158T基因、scDAOCS7-T73M/S102I/L158I基因、scDAOCS7-T73V/S102T/L158S基因、scDAOCS7-S102I/L158A基因、scDAOCS7-T73L/S102I/L158V基因、scDAOCS7-T73S/S102M/L158A基因、scDAOCS7-T73L/S102C/L158I基因、scDAOCS7-T73M/S102C/L158I基因、scDAOCS7-T73S/S102L/L158I基因、scDAOCS7-T73L/S102C/L158A基因、scDAOCS7-T73V/S102M/L158I基因、scDAOCS7-T73L/S102A/L158A基因、scDAOCS7-T73C/S102T基因、scDAOCS7-T73M/S102C/L158A基因、scDAOCS7-L158I基因、scDAOCS7-L158V基因、scDAOCS7-T73S/S102I基因、scDAOCS7-T73V/S102A/L158C基因或scDAOCS7-T73C/S102I/L158S基因。
所述scDAOCS7-A61D基因通过将所述scDAOCS7基因的第181-183位由GCA突变为GAT或GAC得到。
所述scDAOCS7-A61E基因通过将所述scDAOCS7基因的第181-183位由GCA突变为GAA或GAG得到。
所述scDAOCS7-F225I基因通过将所述scDAOCS7基因的第673-675位由TTC突变为ATT或ATC或ATA得到。
所述scDAOCS7-F225L基因通过将所述scDAOCS7基因的第673-675位由TTC突变为TTA或TTG或CTT或CTC或CTA或CTG得到。
所述scDAOCS7-A61D/F225I基因通过将所述scDAOCS7基因的第181-183位由GCA突变为GAT或GAC、第673-675位由TTC突变为ATT或ATC或ATA得到。
所述scDAOCS7-A61D/F225L基因通过将所述scDAOCS7基因的第181-183位由GCA突变为GAT或GAC、第673-675位由TTC突变为TTA或TTG或CTT或CTC或CTA或CTG得到。
所述scDAOCS7-A61E/F225I基因通过将所述scDAOCS7基因的第181-183位由GCA突变为GAA或GAG、第673-675位由TTC突变为ATT或ATC或ATA得到。
所述scDAOCS7-A61E/F225L基因通过将所述scDAOCS7基因的第181-183位由GCA突变为GAA或GAG、第673-675位由TTC突变为TTA或TTG或CTT或CTC或CTA或CTG得到。
所述scDAOCS7-R179L基因通过将所述scDAOCS7基因的第535-537位的CGC突变为TTA或TTG或CTT或CTC或CTA或CTG得到。
所述scDAOCS7-R160A/R162A/R179I基因通过将所述scDAOCS7基因的第478-480位的CGT突变为GCT或GCC或GCA或GCG、第484-486位的CGT突变为GCT或GCC或GCA或GCG、第535-537位的CGC突变为ATT或ATC或ATA得到。
所述scDAOCS7-R160I/R162C/R179A基因通过将所述scDAOCS7基因的第478-480位的CGT突变为ATT或ATC或ATA、第484-486位的CGT突变为TGT或TGC、第535-537位的CGC突变为GCT或GCC或GCA或GCG得到。
所述scDAOCS7-R160G/R162A/R179I基因通过将所述scDAOCS7基因的第478-480位的CGT突变为GGT或GGC或GGA或GGG、第484-486位的CGT突变为GCT或GCC或GCA或GCG、第535-537位的CGC突变为ATT或ATC或ATA得到。
所述scDAOCS7-T73S/S102V/L158T基因通过将所述scDAOCS7基因的第217-219位的ACA突变为TCT或TCC或TCA或TCG或AGT或AGC、第304-306位的AGC突变为GTT或GTC或GTA或GTG、第472-474位的CTG突变为ACT或ACC或ACA或ACG得到。
所述scDAOCS7-T73L/S102C/L158I基因通过将所述scDAOCS7基因的第217-219位的ACA突变为TTA或TTG或CTT或CTC或CTA或CTG、第304-306位的AGC突变为TGT或TGC、第472-474位的CTG突变为ATT或ATC或ATA得到。
所述scDAOCS7-T73M/S102T/L158I基因通过将所述scDAOCS7基因的第217-219位的ACA突变为ATG、第304-306位的AGC突变为ACT或ACC或ACA或ACG、第472-474位的CTG突变为ATT或ATC或ATA得到。
所述scDAOCS7-T73A/S102L/L158I基因通过将所述scDAOCS7基因的第217-219位的ACA突变为GCT或GCC或GCA或GCG、第304-306位的AGC突变为TTA或TTG或CTT或CTC或CTA或CTG、第472-474位的CTG突变为ATT或ATC或ATA得到。
所述scDAOCS7-T73L/S102M/L158T基因通过将所述scDAOCS7基因的第217-219位的ACA突变为TTA或TTG或CTT或CTC或CTA或CTG、第304-306位的AGC突变为ATG、第472-474位的CTG突变为ACT或ACC或ACA或ACG得到。
所述scDAOCS7-T73M/S102I/L158I基因通过将所述scDAOCS7基因的第217-219位的ACA突变为ATG、第304-306位的AGC突变为ATT或ATC或ATA、第472-474位的CTG突变为ATT或ATC或ATA得到。
所述scDAOCS7-T73V/S102T/L158S基因通过将所述scDAOCS7基因的第217-219位的ACA突变为GTT或GTC或GTA或GTG、第304-306位的AGC突变为ACT或ACC或ACA或ACG、第472-474位的CTG突变为TCT或TCC或TCA或TCG或AGT或AGC得到。
所述scDAOCS7-S102I/L158A基因通过将所述scDAOCS7基因的第304-306位的AGC突变为ATT或ATC或ATA、第472-474位的CTG突变为GCT或GCC或GCA或GCG得到。
所述scDAOCS7-T73L/S102I/L158V基因通过将所述scDAOCS7基因的第217-219位的ACA突变为TTA或TTG或CTT或CTC或CTA或CTG、第304-306位的AGC突变为ATT或ATC或ATA、第472-474位的CTG突变为GTT或GTC或GTA或GTG得到。
所述scDAOCS7-T73S/S102M/L158A基因通过将所述scDAOCS7基因的第217-219位的ACA突变为TCT或TCC或TCA或TCG或AGT或AGC、第304-306位的AGC突变为ATG、第472-474位的CTG突变为GCT或GCC或GCA或GCG得到。
所述scDAOCS7-T73L/S102C/L158I基因通过将所述scDAOCS7基因的第217-219位的ACA突变为TTA或TTG或CTT或CTC或CTA或CTG、第304-306位的AGC突变为TGT或TGC、第472-474位的CTG突变为ATT或ATC或ATA得到。
所述scDAOCS7-T73M/S102C/L158I基因通过将所述scDAOCS7基因的第217-219位的ACA突变为ATG、第304-306位的AGC突变为TGT或TGC、第472-474位的CTG突变为ATT或ATC或ATA得到。
所述scDAOCS7-T73S/S102L/L158I基因通过将所述scDAOCS7基因的第217-219位的ACA突变为TCT或TCC或TCA或TCG或AGT或AGC、第304-306位的AGC突变为TTA或TTG或CTT或CTC或CTA或CTG、第472-474位的CTG突变为ATT或ATC或ATA得到。
所述scDAOCS7-T73L/S102C/L158A基因通过将所述scDAOCS7基因的第217-219位的ACA突变为TTA或TTG或CTT或CTC或CTA或CTG、第304-306位的AGC突变为TGT或TGC、第472-474位的CTG突变为GCT或GCC或GCA或GCG得到。
所述scDAOCS7-T73V/S102M/L158I基因通过将所述scDAOCS7基因的第217-219位的ACA突变为GTT或GTC或GTA或GTG、第304-306位的AGC突变为ATG、第472-474位的CTG突变为ATT或ATC或ATA得到。
所述scDAOCS7-T73L/S102A/L158A基因通过将所述scDAOCS7基因的第217-219位的ACA突变为TTA或TTG或CTT或CTC或CTA或CTG、第304-306位的AGC突变为GCT或GCC或GCA或GCG、第472-474位的CTG突变为GCT或GCC或GCA或GCG得到。
所述scDAOCS7-T73C/S102T基因通过将所述scDAOCS7基因的第217-219位的ACA突变为TGT或TGC、第304-306位的AGC突变为ACT或ACC或ACA或ACG得到。
所述scDAOCS7-T73M/S102C/L158A基因通过将所述scDAOCS7基因的第217-219位的ACA突变为ATG、第304-306位的AGC突变为TGT或TGC、第472-474位的CTG突变为GCT或GCC或GCA或GCG得到。
所述scDAOCS7-L158I基因通过将所述scDAOCS7基因的第472-474位的CTG突变为ATT或ATC或ATA得到。
所述scDAOCS7-L158V基因通过将所述scDAOCS7基因的第472-474位的CTG突变为GTT或GTC或GTA或GTG得到。
所述scDAOCS7-T73S/S102I基因通过将所述scDAOCS7基因的第217-219位的ACA突变为TCT或TCC或TCA或TCG或AGT或AGC、第304-306位的AGC突变为ATT或ATC或ATA得到。
所述scDAOCS7-T73V/S102A/L158C基因通过将所述scDAOCS7基因的第217-219位的ACA突变为GTT或GTC或GTA或GTG、第304-306位的AGC突变为GCT或GCC或GCA或GCG、第472-474位的CTG突变为TGT或TGC得到。
所述scDAOCS7-T73C/S102I/L158S基因通过将所述scDAOCS7基因的第217-219位的ACA突变为TGT或TGC、第304-306位的AGC突变为ATT或ATC或ATA、第472-474位的CTG突变为TCT或TCC或TCA或TCG或AGT或AGC得到。
所述催化反应的反应体系可为向10mL 50mM磷酸盐缓冲液(pH 7.4)中加入所述重组细胞、葡萄糖、FeSO4和6-APA得到的体系，所述重组细胞、葡萄糖、FeSO4、6-APA在反应体系中的终浓度分别为0.1-0.3g/L、2g/L、1.8mM、5mM。所述催化反应可在25℃下进行。所述催化反应可在摇床中或反应器中进行。所述催化反应的时间可为0.5-5h。
所述催化反应的反应体系还可为向100μL 50mM磷酸盐缓冲液(pH 7.4)中加入或所述重组细胞的裂解物、FeSO4、α-酮戊二酸、L-抗坏血酸和6-APA得到的体系，FeSO4、α-酮戊二酸、L-抗坏血酸、6-APA在反应体系中的终浓度分别为1.8mM、4mM、0.4mM、2.5mM。所述催化反应可在25℃下进行。所述催化反应的时间可为2-5h。
所述重组细胞的裂解物可由裂解所述重组细胞得到。
本发明还提供了制备G-7-ADCA的方法，所述方法以青霉素G钾盐为底物，利用scDAOCS7或所述scDAOCS7突变蛋白质进行催化反应，得到G-7-ADCA。
上述方法中，所述催化反应的反应体系可利用所述重组细胞进行。
上述方法中，所述催化反应的反应体系可为向50mM的pH为7.4磷酸盐缓冲液中加入所述重组细胞、葡萄糖、硫酸亚铁和青霉素G钾盐得到的体系，葡萄糖、硫酸亚铁和青霉素G钾盐在反应体系中的终浓度分别为10g/L、50μg/mL、5mM。
所述催化反应可在25℃下进行。所述催化反应可在摇床中或反应器中进行。
所述催化反应的时间可为2h。
所述scDAOCS7突变蛋白质，也属于本发明的保护范围。
本发明还提供了与所述scDAOCS7突变蛋白质相关的生物材料，所述生物材料为下述B1)至B4)中的任一种：
B1)编码所述scDAOCS7突变蛋白质的核酸分子；
B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；
B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体、或含有B2)所述表达盒的重组载体；
B4)含有B1)所述核酸分子的重组微生物、或含有B2)所述表达盒的重组微生物、或含有B3)所述重组载体的重组微生物。
B1)所述核酸分子可为所述scDAOCS7-A61D基因、所述scDAOCS7-A61E基因、所述scDAOCS7-F225I基因、所述scDAOCS7-F225L基因、所述scDAOCS7-A61D/F225I基因、所述scDAOCS7-A61D/F225L基因、所述scDAOCS7-A61E/F225I基因、所述scDAOCS7-A61E/F225L基因、所述scDAOCS7-R179L基因、所述scDAOCS7-R160A/R162A/R179I基因、所述scDAOCS7-R160I/R162C/R179A基因、所述scDAOCS7-R160G/R162A/R179I基因、所述scDAOCS7-T73S/S102V/L158T基因、所述scDAOCS7-T73L/S102C/L158I基因、所述scDAOCS7-T73M/S102T/L158I基因、所述scDAOCS7-T73A/S102L/L158I基因、所述scDAOCS7-T73L/S102M/L158T基因、所述scDAOCS7-T73M/S102I/L158I基因、所述scDAOCS7-T73V/S102T/L158S基因、所述scDAOCS7-S102I/L158A基因、所述scDAOCS7-T73L/S102I/L158V基因、所述scDAOCS7-T73S/S102M/L158A基因、所述scDAOCS7-T73L/S102C/L158I基因、所述scDAOCS7-T73M/S102C/L158I基因、所述scDAOCS7-T73S/S102L/L158I基因、所述scDAOCS7-T73L/S102C/L158A基因、所述scDAOCS7-T73V/S102M/L158I基因、所述scDAOCS7-T73L/S102A/L158A基因、所述scDAOCS7-T73C/S102T基因、所述scDAOCS7-T73M/S102C/L158A基因、所述scDAOCS7-L158I基因、所述scDAOCS7-L158V基因、所述scDAOCS7-T73S/S102I基因、所述scDAOCS7-T73V/S102A/L158C基因或所述scDAOCS7-T73C/S102I/L158S基因。
本发明还提供了下述任一产品：
M1、由6-APA与所述scDAOCS7突变蛋白质组成的成套产品；
M2、由6-APA与所述生物材料组成的成套产品；
M3、由6-APA与scDAOCS7组成的成套产品；
M4、由青霉素G钾盐、6-APA与所述scDAOCS7突变蛋白质组成的成套产品；
M5、由青霉素G钾盐、6-APA与所述生物材料组成的成套产品；
M6、由青霉素G钾盐、6-APA与scDAOCS7组成的成套产品。
M1-M6中任一产品可用于制备7-ADCA。
本发明还提供了scDAOCS7、所述scDAOCS7突变蛋白质或所述生物材料的下述任一应用：
Z1、在催化6-APA生成7-ADCA中的应用；Z2、在制备催化6-APA生成7-ADCA产品中的应用；Z3、在生产7-ADCA中的应用；Z4、在制备生产7-ADCA产品中的应用；Z5、在催化青霉素G钾盐生成G-7-ADCA中的应用；Z6、在制备催化青霉素G钾盐生成G-7-ADCA产品中的应用；Z7、在生产G-7-ADCA中的应用；Z8、在制备生产G-7-ADCA产品中的应用。
所述产品的下述任一应用，也属于本发明的保护范围：
Z3、在生产7-ADCA中的应用；Z4、在制备生产7-ADCA产品中的应用。
本发明的实验证明，scDAOCS7及其突变蛋白质可以催化6-APA生成7-ADCA，在实际生产中，以6-APA为底物，利用scDAOCS7或其突变蛋白质进行催化反应，实现6-APA向7-ADCA的合成,并且通过定向进化技术对脱乙酰氧头孢菌素C合成酶进行进一步改造提高了该酶合成7-ADCA的催化活力。该7-ADCA生产路线相较于现有的半合成酶法生产7-ADCA有许多的优点：首先，该路线的原料容易获得，通过向含有高纯度6-APA的溶液中加入表达scDAOCS7或其突变蛋白质的菌体后,通过全细胞或其裂解液或粗酶粉即可直接合成7-ADCA，是一种新的7-ADCA合成方法。另外，本发明的scDAOCS7突变蛋白质还可以催化青霉素G钾盐合成G-7-ADCA，且催化能力相较于scDAOCS7有显著的提高。本发明的7-ADCA生产路线以及scDAOCS7突变蛋白质具有广泛的应用前景。
附图说明
图1为青霉素G到G-7-ADCA的反应结构式路线图。
图2为6-APA到7-ADCA的反应结构式路线图。
图3为pET24a-scDAOCS7质粒图谱。
图4为7-ADCA的标准曲线。
图5为R160、R162和R179三位点组合突变库引物设计策略图。
图6为G-7-ADCA的标准曲线图。
图7为T73、S102和L158三位点组合突变库引物设计策略图。
具体实施方式
本发明提供了一种新的7-ADCA合成路线，如图2所示，以6-氨基青霉烷酸(6-APA)为底物，通过改造scDAOCS7获得具有催化6-APA向7-ADCA合成功能的scDAOCS7突变蛋白质，scDAOCS7基因的序列为序列表中SEQ ID No.1，其编码的scDAOCS7蛋白质的序列为SEQ IDNo.2，并且通过定向进化技术对脱乙酰氧头孢菌素C合成酶进行进一步改造提高了该酶合成7-ADCA的催化活力。改造scDAOCS7所用引物如表1所示。
表1、引物序列表
Figure BDA0002455471770000101
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂、仪器等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。下述实施例中，如无特殊说明，序列表中各核苷酸序列的第1位均为相应DNA/RNA的5′末端核苷酸，末位均为相应DNA/RNA的3′末端核苷酸。
青霉素G钾盐：上海迈瑞尔化学技术有限公司，货号F21739-500G。
下述实施例中的质粒pET24a-scDAOCS7为将pET24a(+)载体(Novagen)中NdeI和XhoI识别序列间的小DNA片段替换为SEQ ID No.1所示的scDAOCS7基因得到的重组质粒。pET24a-scDAOCS7图谱如图3所示，含有SEQ ID No.1所示的scDAOCS7基因。
实施例1、scDAOCS7突变蛋白质催化7-ADCA的合成
本实施例通过对scDAOCS7进行改造，获得scDAOCS7突变蛋白质，具体是在第61位的丙氨酸残基(A61)和第225位的苯丙氨酸残基(F225)上分别进行单点饱和突变。
一、粗酶催化7-ADCA的合成
A61突变体库的构建：
以质粒pET24a-scDAOCS7为模板，将表1中的引物A61-NDT-F、A61-VMA-F、A61-ATG-F、A61-TGG-F按照摩尔比为12：6：1：1的比例进行混合，取2μL上述引物的混合液作为上游引物，取2μL的A61-R作为下游引物进行两轮PCR构建A61突变体库。第一轮PCR程序为：预变性98℃2min，变性98℃15s，退火55℃15s，延伸72℃30s，最后72℃10min，变性到延伸程序设定为30个循环。以第一轮的PCR产物2μL为引物，质粒pET24a-scDAOCS7为模板进行第二轮PCR，第二轮PCR程序为：预变性98℃2min，变性98℃15s，退火60℃15s，延伸72℃4min，最后72℃10min，变性到延伸程序设定为30个循环，得到用于构建A61突变体库的第二轮PCR产物。
F225突变体库的构建：按照A61突变体库的构建步骤，所用上游引物为F225-NDT-F、F225-VMA-F、F225-ATG-F、F225-TGG-F按照摩尔比为12：6：1：1的比例进行混合得到的混合液，下游引物为F225-R，其他步骤均不变，得到用于构建F225突变体库的第二轮PCR产物。
将两种第二轮PCR产物分别进行如下操作：
向第二轮PCR的产物中加入1μL的Dpn I酶用于消化质粒模板，37℃恒温条件下处理3h。取2μL酶消化后的第二轮PCR产物电转化进大肠杆菌BL21(DE3)中，将电转后的大肠杆菌BL21(DE3)菌液均匀的涂布在卡那霉素抗性(浓度为50μg/mL)的LB平板上，37℃恒温条件下培养14h后长出单菌落，即突变体库。将一个平板上的所有单菌落刮下送测序验证突变体库的多样性后，用无菌牙签分别挑取阴性对照菌BL21(DE3)/pET24a(挑取3个单菌落)、阳性对照菌BL21(DE3)/pET24a-scDAOCS7(挑取3个单菌落)和另一个突变体库LB平板上长出的单菌落(共挑取90个单菌落)转接至含有300μL的TB培养基的96孔深孔培养板，加入卡那霉素使其终浓度为50μg/mL，37℃、800rpm振荡培养12h，每个孔中取120μL的菌液进行保菌，然后向96孔深孔培养板每孔中加入800μL的TB培养基，并加入卡那霉素和异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)，使其终浓度分别为50μg/mL和0.1mM，20℃、800rpm条件下振荡培养12h。然后在4000rpm、4℃条件下离心10min收集菌体。用1000μL的50mM的磷酸盐缓冲液(pH7.4)洗涤菌体一次。然后向菌体中加入6U/mL DNase I和1mg/mL溶菌酶25℃振荡培养2h以破碎细胞，4000rpm、4℃条件下离心30min收集各单菌落所得上清液转移到新的96孔板中。
其中，BL21(DE3)/pET24a为将pET24a(+)导入大肠杆菌BL21(DE3)中得到的重组菌，BL21(DE3)/pET24a-scDAOCS7为将pET24a-scDAOCS7导入大肠杆菌BL21(DE3)中得到的重组菌。
制备催化反应体系：向100μL 50mM磷酸盐缓冲液(pH 7.4)中加入200μL上清液、FeSO4、α-酮戊二酸、L-抗坏血酸、6-APA，FeSO4、α-酮戊二酸、L-抗坏血酸、6-APA在反应体系中的终浓度分别为1.8mM、4mM、0.4mM、2.5mM。每个单菌落得到的上清液为一个体系。6-APA为山东鲁抗医药股份有限公司提供。
将所得反应体系于25℃反应5h，然后通过HPLC检测反应产物7-ADCA的量。
6-APA和7-ADCA的HPLC检测条件：色谱柱：Cosmosil 5C18-MS-II 4.6ID×150mm；流动相：水相(50mM磷酸盐缓冲液，pH7.4)/甲醇＝98/2(体积比)；流速：1mL/min；检测波长：215nm检测7-ADCA的量，260nm检测6-APA的量。
所用标准品为7-ADCA(山东鲁抗医药股份有限公司)cas号为22252-43-3。利用该标准品制备7-ADCA的标准曲线，如图4所示。计算转化率，转化率＝100％×P/(2.5×10-3M)，P为液相检测出的7-ADCA的产量(g/L)，M为7-ADCA的摩尔质量(g/mol)。
表2、7-ADCA的转化率
Figure BDA0002455471770000121
HPLC检测结果如表2所示，A61突变体库的90个单菌落和F225突变体库的90个单菌落中含有A61D、A61E、F225I或F225L突变的突变蛋白的转化率显著高于阳性对照。提取对应菌株质粒，并对目标DNA进行测序。
将含有A61D突变的突变蛋白记为scDAOCS7-A61D，将表达该突变蛋白的菌株和质粒分别记为BL21(DE3)/pET24a-scDAOCS7-A61D和pET24a-scDAOCS7-A61D。其中scDAOCS7-A61D为将scDAOCS7的第61位的丙氨酸残基突变为天冬氨酸残基得到的蛋白质，该菌株和质粒中的scDAOCS7基因的第181-183位由GCA突变为了GAT，即得到了scDAOCS7-A61D基因，该菌株和质粒中仅含有发生该种突变的scDAOCS7突变蛋白质和scDAOCS7突变基因。
将含有A61E突变的突变蛋白记为scDAOCS7-A61E，将表达该突变蛋白的菌株和质粒分别记为BL21(DE3)/pET24a-scDAOCS7-A61E和pET24a-scDAOCS7-A61E。其中scDAOCS7-A61E为将scDAOCS7的第61位的丙氨酸残基突变为谷氨酸残基得到的蛋白质，该菌株和质粒中的scDAOCS7基因的第181-183位由GCA突变为了GAA，即得到了scDAOCS7-A61E基因，该菌株和质粒中仅含有发生该种突变的scDAOCS7突变蛋白质和scDAOCS7突变基因。
将含有F225I突变的突变蛋白记为scDAOCS7-F225I，将表达该突变蛋白的菌株和质粒分别记为BL21(DE3)/pET24a-scDAOCS7-F225I和pET24a-scDAOCS7-F225I。其中scDAOCS7-F225I为将scDAOCS7的第225位的苯丙氨酸残基突变为异亮氨酸残基得到的蛋白质，该菌株和质粒中的scDAOCS7基因的第673-675位由TTC突变为了ATT，即得到了scDAOCS7-F225I基因，该菌株和质粒中仅含有发生该种突变的scDAOCS7突变蛋白质和scDAOCS7突变基因。
将含有F225L突变的突变蛋白记为scDAOCS7-F225L，将表达该突变蛋白的菌株和质粒分别记为BL21(DE3)/pET24a-scDAOCS7-F225L和pET24a-scDAOCS7-F225L。其中scDAOCS7-F225L为将scDAOCS7的第225位的苯丙氨酸残基突变为亮氨酸残基得到的蛋白质，该菌株和质粒中的scDAOCS7基因的第673-675位由TTC突变为了CTG，即得到了scDAOCS7-F225L基因，该菌株和质粒中仅含有发生该种突变的scDAOCS7突变蛋白质和scDAOCS7突变基因。
然后使用筛选到的突变体粗酶粉来进一步验证突变体的活性。具体操作为：
分别挑取阴性对照菌BL21(DE3)/pET24a、阳性对照菌BL21(DE3)/pET24a-scDAOCS7以及BL21(DE3)/pET24a-scDAOCS7-A61D、BL21(DE3)/pET24a-scDAOCS7-A61E、BL21(DE3)/pET24a-scDAOCS7-F225I、BL21(DE3)/pET24a-scDAOCS7-F225L的单克隆，按照如下步骤制备粗酶粉：将单克隆转接到含5mL的LB培养基(卡那霉素浓度为50μg/mL)的试管中，37℃、220rpm振荡培养过夜；然后按1％的接种量接种到100mL的TB培养基(卡那霉素浓度为50μg/mL)中，37℃、220rpm振荡培养3h左右，当菌液的OD600值达到0.6时加入在体系中终浓度为0.1mM的IPTG，25℃、220rpm继续振荡培养18h；然后4000rpm、4℃离心10min收集菌体，超声破碎细胞后离心收集上清液，利用冷冻干燥机干燥上清液，分别得到六种菌株的粗酶粉。
反应体系的制备：向10mL 50mM磷酸盐缓冲液(pH 7.4)中加入所得粗酶粉、FeSO4、α-酮戊二酸、L-抗坏血酸、6-APA，粗酶粉、FeSO4、α-酮戊二酸、L-抗坏血酸、6-APA在反应体系中的终浓度分别为10g/L、1.8mM、4mM、0.4mM、2.5mM。每个体系一种粗酶粉。
将所得反应体系在25℃、800rpm条件下反应2h，然后通过HPLC检测反应产物7-ADCA的量，计算转化率，检测条件同上文。
表3、7-ADCA的转化率
Figure BDA0002455471770000131
结果如表3所示，scDAOCS7-A61D对6-APA的催化活力略微的提高，而scDAOCS7-A61E、scDAOCS7-F225I、scDAOCS7-F225L对6-APA的催化活力均有显著的提高。
二、全细胞催化7-ADCA的合成
分别挑取BL21(DE3)/pET24a、BL21(DE3)/pET24a-scDAOCS7以及步骤一的BL21(DE3)/pET24a-scDAOCS7-A61D、BL21(DE3)/pET24a-scDAOCS7-A61E、BL21(DE3)/pET24a-scDAOCS7-F225I、BL21(DE3)/pET24a-scDAOCS7-F225L的单菌落按照如下方法制备菌体：
将单菌落转接到含5mL的卡那霉素抗性(卡那霉素浓度为50μg/mL)的LB液体培养基中，37℃、220rpm下培养14h，按照1：100的比例转接到含50mL卡那霉素浓度为50μg/mL的TB液体培养基的锥形瓶中，37℃、220rpm条件下培养到OD600为0.6的时候加入终浓度为0.1mM的IPTG进行诱导，诱导条件为25℃、220rpm，培养18h后收集菌体，用pH7.4的磷酸盐缓冲液(50mM)洗涤一次，离心收集菌体。
利用菌体进行全细胞催化，反应体系：向10mL 50mM磷酸盐缓冲液(pH 7.4)中加入所得菌体、葡萄糖、FeSO4、6-APA，菌体、葡萄糖、FeSO4、6-APA在反应体系中的终浓度分别为0.3g/L、2g/L、1.8mM、5mM。每个体系为一种菌体的反应体系。
将所得反应体系于25℃、220rpm进行反应，在反应5h取样,1000rpm离心1min后取上清液进行液相检测，并计算转化率，转化率计算公式同上，结果如表4所示。液相检测条件同上。
表4、7-ADCA的转化率
Figure BDA0002455471770000141
如表4所示，说明基因改造后的全细胞也能够合成7-ADCA，且scDAOCS7-A61D、scDAOCS7-A61E、scDAOCS7-F225I、scDAOCS7-F225L对6-APA的催化活力有显著的提高。
三、组合突变的scDAOCS7突变蛋白质催化7-ADCA的合成
以scDAOCS7-A61D和scDAOCS7-A61E为基础，在其第225位的苯丙氨酸残基(F225)上进行突变，获得含有A61D/F225I、A61D/F225L、A61E/F225I或A61E/F225L的双突变的突变蛋白。具体的操作如下：
提取步骤一的BL21(DE3)/pET24a-scDAOCS7-A61D的质粒，得到质粒pET24a-scDAOCS7-A61D，以质粒pET24a-scDAOCS7-A61D为模板，利用上下游引物F225I-F和F225I-R进行第一轮PCR,第一轮PCR的程序为：预变性98℃2min，变性98℃15s，退火55℃15s，延伸72℃30s，最后72℃10min，变性到延伸程序设定为30个循环。取第一轮的PCR产物2μL为第二轮PCR的引物进行PCR，质粒pET24a-scDAOCS7-A61D为模板，第二轮PCR程序为：预变性98℃2min，变性98℃15s，退火60℃15s，延伸72℃4min，最后72℃10min，变性到延伸程序设定为30个循环。向第二轮的PCR产物中加入1μL的Dpn I酶，37℃恒温条件下处理3h以除去模板质粒。取2μL的酶消化后的PCR产物电转化入大肠杆菌BL21(DE3)中,将电转后的大肠杆菌BL21(DE3)菌液均匀的涂布在含有浓度为50μg/mL的卡那霉素抗性的LB平板上，37℃恒温条件下培养14h后长出单菌落，挑取单菌落提取质粒进行测序，测序正确的为获得含有双突变体的质粒pET24a-scDAOCS7-A61D/F225I。
pET24a-scDAOCS7-A61D/F225L的构建按照pET24a-scDAOCS7-A61D/F225I的构建步骤进行，不同的是所用引物为F225L-F和F225L-R。pET24a-scDAOCS7-A61E/F225I的构建按照pET24a-scDAOCS7-A61D/F225I的构建步骤进行，不同的是所用模板为pET24a-scDAOCS7-A61E。pET24a-scDAOCS7-A61E/F225L的构建按照pET24a-scDAOCS7-A61D/F225I的构建步骤进行，不同的是所用模板为pET24a-scDAOCS7-A61E，引物为F225L-F和F225L-R。
将含有pET24a-scDAOCS7-A61D/F225I的菌株记为BL21(DE3)/pET24a-scDAOCS7-A61D/F225I，该质粒和菌株中的scDAOCS7基因的第181-183位由GCA突变为了GAT、第673-675位由TTC突变为了ATT，将突变后的基因记为scDAOCS7-A61D/F225I基因，scDAOCS7-A61D/F225I基因编码scDAOCS7-A61D/F225I蛋白质，scDAOCS7-A61D/F225I蛋白质为将scDAOCS7蛋白质的第61位的丙氨酸残基突变为天冬氨酸残基、第225位的苯丙氨酸残基突变为异亮氨酸残基得到的突变蛋白，该菌株和质粒中仅含有发生该种突变的scDAOCS7突变蛋白质和scDAOCS7突变基因。
将含有pET24a-scDAOCS7-A61D/F225L的菌株记为BL21(DE3)/pET24a-scDAOCS7-A61D/F225L，该质粒和菌株中的scDAOCS7基因的第181-183位由GCA突变为了GAT、第673-675位由TTC突变为了CTG，将突变后的基因记为scDAOCS7-A61D/F225L基因，scDAOCS7-A61D/F225L基因编码scDAOCS7-A61D/F225L蛋白质，scDAOCS7-A61D/F225L蛋白质为将scDAOCS7蛋白质的第61位的丙氨酸残基突变为天冬氨酸残基、第225位的苯丙氨酸残基突变为亮氨酸残基得到的突变蛋白，该菌株和质粒中仅含有发生该种突变的scDAOCS7突变蛋白质和scDAOCS7突变基因。
将含有pET24a-scDAOCS7-A61E/F225I的菌株记为BL21(DE3)/pET24a-scDAOCS7-A61E/F225I，该质粒和菌株中的scDAOCS7基因的第181-183位由GCA突变为了GAA、第673-675位由TTC突变为了ATT，将突变后的基因记为scDAOCS7-A61E/F225I基因，scDAOCS7-A61E/F225I基因编码scDAOCS7-A61E/F225I蛋白质，scDAOCS7-A61E/F225I蛋白质为将scDAOCS7蛋白质的第61位的丙氨酸残基突变为谷氨酸残基、第225位的苯丙氨酸残基突变为异亮氨酸残基得到的突变蛋白，该菌株和质粒中仅含有发生该种突变的scDAOCS7突变蛋白质和scDAOCS7突变基因。
将含有pET24a-scDAOCS7-A61E/F225L的菌株记为BL21(DE3)/pET24a-scDAOCS7-A61E/F225L，该质粒和菌株中的scDAOCS7基因的第181-183位由GCA突变为了GAA、第673-675位由TTC突变为了CTG，将突变后的基因记为scDAOCS7-A61E/F225L基因，scDAOCS7-A61E/F225L基因编码scDAOCS7-A61E/F225L蛋白质，scDAOCS7-A61E/F225L蛋白质为将scDAOCS7蛋白质的第61位的丙氨酸残基突变为谷氨酸残基、第225位的苯丙氨酸残基突变为亮氨酸残基得到的突变蛋白，该菌株和质粒中仅含有发生该种突变的scDAOCS7突变蛋白质和scDAOCS7突变基因。
将BL21(DE3)/pET24a、BL21(DE3)/pET24a-scDAOCS7与步骤一的BL21(DE3)/pET24a-scDAOCS7-A61D、BL21(DE3)/pET24a-scDAOCS7-A61E、BL21(DE3)/pET24a-scDAOCS7-F225I、BL21(DE3)/pET24a-scDAOCS7-F225L以及上述BL21(DE3)/pET24a-scDAOCS7-A61D/F225I、BL21(DE3)/pET24a-scDAOCS7-A61D/F225L、BL21(DE3)/pET24a-scDAOCS7-A61E/F225I、BL21(DE3)/pET24a-scDAOCS7-A61E/F225L按照如下方法制备菌体：
将菌株接种到含5mL的卡那霉素抗性(卡那霉素浓度为50μg/mL)的LB液体培养基的试管中，37℃、220rpm下培养14h，按照体积比为1：100的比例转接到含50mL卡那霉素浓度为50μg/mL的TB液体培养基的锥形瓶中，37℃、220rpm条件下培养到OD600为0.6时加入终浓度为0.1mM的IPTG进行诱导，诱导条件为25℃、220rpm，培养18h后收集菌体，用pH7.4的磷酸盐缓冲液(50mM)洗涤一次，离心收集菌体。
利用菌体进行全细胞催化，反应体系：向10mL 50mM磷酸盐缓冲液(pH 7.4)中加入所得菌体、葡萄糖、FeSO4、6-APA，菌体、葡萄糖、FeSO4、6-APA在反应体系中的终浓度分别为0.1g/L、2g/L、1.8mM、5mM。每个体系为一种菌体的反应体系。
将所得反应体系于25℃、220rpm条件下进行反应，分别在反应5h取样,1000rpm离心1min后取上清液进行液相检测，并计算转化率，结果如表5所示。液相检测条件同步骤二。
表5、7-ADCA的转化率
Figure BDA0002455471770000161
从表5的数据中可以得出，反应时间为5h时，单突变体A61D、A61E、F225I、F225L和双突变体A61D/F225I、A61D/F225L、A61E/F225I、A61E/F225L催化活力较高，均显著高于对照(BL21(DE3)/pET24a-scDAOCS7)。
通过增加菌体的量来进一步验证突变体的结果，反应体系：向10mL 50mM磷酸盐缓冲液(pH 7.4)中加入上文所得菌体、葡萄糖、FeSO4、6-APA，菌体、葡萄糖、FeSO4、6-APA在反应体系中的终浓度分别为0.3g/L、2g/L、1.8mM、5mM。每个体系为一种菌体的反应体系。
将所得反应体系于25℃、220rpm条件下进行反应，分别在反应5h取样,1000rpm离心1min后取上清液进行液相检测，并计算转化率，结果如表6所示。液相检测条件同步骤二。
表6、7-ADCA的转化率
Figure BDA0002455471770000171
如表6所示，在反应5h时，与BL21(DE3)/pET24a-scDAOCS7相比，单突变位体和双突变体的催化效率出现显著的提高，其中双突变体scDAOCS7-A61E/F225L的催化效率最高，可作为潜在的工业化应用酶。
综上所述，本实施例实现了6-APA到7-ADCA的合成，且分别进行了粗酶法和全细胞的催化实验，构建出的突变蛋白催化6-APA合成7-ADCA的活力也获得了明显的提高，构建出的突变蛋白及其编码基因可作为潜在的工业化应用酶。
实施例2、利用其他scDAOCS7突变蛋白合成G-7-ADCA
本实施例通过对scDAOCS7的其他位点进行改造，获得scDAOCS7突变蛋白质，改造位点为第160位、第162位和第179位的精氨酸残基(即R160、R162和R179)以及第73位的苏氨酸残基、第102位的丝氨酸残基和第158位的亮氨酸残基(T73、S102、L158)。
一、R160、R162和R179突变蛋白质可以催化合成G-7-ADCA
将R179突变为Arg、Gly、Pro、Ile、Leu、Val、Thr、Ala，所用简并密码子为VBA；将R160和R162两个位点分别突变为Arg、Ala、Val、Thr、Ile、Gly、Cys，所用简并密码子均为RBA。突变蛋白质的制备方法如下：
在scDAOCS7上构建三位点组合突变库，突变体库的引物设计策略如图5所示，引物序列如表1所示，以质粒pET24a-scDAOCS7为模板，以上下游引物PG-LIBRARY-F、PG-LIBRARY-R进行两轮PCR构建R160、R162、R179位点的组合突变体库。第一轮PCR程序为：预变性98℃2min，变性98℃15s，退火55℃15s，延伸72℃30s，最后72℃10min，变性到延伸程序设定为30个循环。以第一轮的PCR产物2μL为引物，质粒pET24a-scDAOCS7为模板进行第二轮PCR，第二轮PCR程序为：预变性98℃2min，变性98℃15s，退火60℃15s，延伸72℃4min，最后72℃10min，变性到延伸程序设定为30个循环。向第二轮PCR的产物中加入1μL的Dpn I酶用于消化质粒模板，37℃恒温条件下处理3h。取2μL酶消化后的第二轮PCR产物电转化进大肠杆菌BL21(DE3)中，将电转后的大肠杆菌BL21(DE3)菌液均匀的涂布在含卡那霉素抗性(卡那霉素浓度为50μg/mL)的LB平板上，37℃恒温条件下培养14h后长出单菌落。
用无菌牙签分别挑取突变体库LB平板上长出的单菌落(挑取864个单菌落)，以及阴性对照菌BL21(DE3)/pET24a(挑取3个单菌落)、阳性对照菌BL21(DE3)/pET24a-scDAOCS7(挑取3个单菌落)，将挑取的单菌落分别转接至含有300μL的LB培养基的96孔深孔培养板，加入卡那霉素抗生素使终浓度为50μg/mL，37℃、800rpm振荡培养12h，每个孔中取120μL的菌液进行保菌，然后向96孔深孔培养板中加入800μL的TB培养基，并加入卡那霉素和IPTG，使其终浓度分别为50μg/mL和0.1mM，20℃、800rpm振荡培养12h。然后在4000rpm、4℃条件下离心10min收集菌体。用1000μL的50mM的磷酸盐缓冲液(pH7.4)洗涤菌体一次。然后向菌体中加入含10g/L的葡萄糖、50μg/mL的硫酸亚铁、5mM的青霉素G钾盐的50mM的pH为7.4磷酸盐缓冲液(500μL)，在25℃、800rpm条件下分别培养2h，然后4000rpm、4℃条件下离心10min，收集上清液，将上清液转移到石英96孔板中，利用酶标仪在检测波长为275nm的条件下进行初筛，吸收波长大于96孔板中培养BL21(DE3)/pET24a-scDAOCS7的菌株中表达的scDAOCS7突变体具有更强的催化活力，结果显示，864个单菌落中有10个孔的吸光度高于阳性对照，之后通过液相检测上清液进行进一步的确定，并对G-7-ADCA产量高于阳性对照的菌株的突变位点进行测序。
其中，BL21(DE3)/pET24a为将pET24a(+)导入大肠杆菌BL21(DE3)中得到的重组菌，BL21(DE3)/pET24a-scDAOCS7为将pET24a-scDAOCS7导入大肠杆菌BL21(DE3)中得到的重组菌。
液相检测条件为：
色谱柱：Agilent ZORBAX SB-C18StableBond Analytical 4.6×250mm，流动相：水相(20mM磷酸钠缓冲液，pH3.0)/甲醇＝55/45(体积比)，流速：1mL/min，检测波长：215nm。
所用标准品为G-7-ADCA(山东鲁抗药业股份有限公司)，利用G-7-ADCA制备标准曲线，G-7-ADCA的标准曲线如图6所示。液相检测结束后根据标准曲线计算转化率，转化率＝100％×P/(5×10-3M)，P为液相检测出的G-7-ADCA的产量(g/L)，M为G-7-ADCA的摩尔质量(g/mol)。
表7、G-7-ADCA的转化率
Figure BDA0002455471770000181
结果如表7所示，有四株菌的转化率高于阳性对照，即BL21(DE3)/pET24a-scDAOCS7-R179L、BL21(DE3)/pET24a-scDAOCS7-R160A/R162A/R179I、BL21(DE3)/pET24a-scDAOCS7-R160I/R162C/R179A和BL21(DE3)/pET24a-scDAOCS7-R160G/R162A/R179I，其中BL21(DE3)/pET24a-scDAOCS7-R160A/R162A/R179I和BL21(DE3)/pET24a-scDAOCS7-R160I/R162C/R179A的转化率显著高于阳性对照。
BL21(DE3)/pET24a-scDAOCS7-R179L含有质粒pET24a-scDAOCS7-R179L，该菌株与质粒中scDAOCS7蛋白质的第179位的精氨酸残基突变为亮氨酸残基，将突变后的蛋白质记为scDAOCS7-R179L，其编码基因由scDAOCS7基因的第535-537位的CGC突变为CTG，将突变后的基因记为scDAOCS7-R179L基因，该菌株和质粒中仅含有发生该种突变的scDAOCS7突变蛋白质和scDAOCS7突变基因。
BL21(DE3)/pET24a-scDAOCS7-R160A/R162A/R179I含有质粒pET24a-scDAOCS7-R160A/R162A/R179I，该菌株与质粒中scDAOCS7蛋白质的第160、162、179位的精氨酸残基分别突变为丙氨酸残基、丙氨酸残基、异亮氨酸残基，将突变后的蛋白质记为scDAOCS7-R160A/R162A/R179I，其编码基因由scDAOCS7基因的第478-480位的CGT突变为GCG、第484-486位的CGT突变为GCG、第535-537位的CGC突变为ATT，将突变后的基因记为scDAOCS7-R160A/R162A/R179I基因，该菌株和质粒中仅含有发生该种突变的scDAOCS7突变蛋白质和scDAOCS7突变基因。
BL21(DE3)/pET24a-scDAOCS7-R160I/R162C/R179A含有质粒pET24a-scDAOCS7-R160I/R162C/R179A，该菌株与该质粒中scDAOCS7蛋白质的第160、162、179位的精氨酸残基分别突变为异亮氨酸残基、半胱氨酸残基、丙氨酸残基，将突变后的蛋白质记为scDAOCS7-R160I/R162C/R179A，其编码基因由scDAOCS7基因的第478-480位的CGT突变为ATT、第484-486位的CGT突变为TGT、第535-537位的CGC突变为GCG，将突变后的基因记为scDAOCS7-R160I/R162C/R179A基因，该菌株和质粒中仅含有发生该种突变的scDAOCS7突变蛋白质和scDAOCS7突变基因。
BL21(DE3)/pET24a-scDAOCS7-R160G/R162A/R179I含有pET24a-scDAOCS7-R160G/R162A/R179I，该菌株与质粒中scDAOCS7蛋白质的第160、162、179位的精氨酸残基分别突变为甘氨酸残基、丙氨酸残基、异亮氨酸残基，将突变后的蛋白质记为scDAOCS7-R160G/R162A/R179I，其编码基因由scDAOCS7基因的第478-480位的CGT突变为GGC、第484-486位的CGT突变为GCG、第535-537位的CGC突变为ATT，将突变后的基因记为scDAOCS7-R160G/R162A/R179I基因，该菌株和质粒中仅含有发生该种突变的scDAOCS7突变蛋白质和scDAOCS7突变基因。
这四种突变蛋白质均可作为潜在的工业化应用的酶，催化青霉素G钾盐合成G-7-ADCA。
二、T73、S102、L158突变蛋白质可以催化合成G-7-ADCA
将T73、S102、L158突变为Ala、Val、Ile、Leu、Met、Thr、Cys、Ser，突变蛋白质的制备方法如下：
在scDAOCS7上构建三位点组合突变体库，突变体库的引物设计策略如图7所示，引物序列如表1所示，以质粒pET24a-scDAOCS7为模板，将上游引物T73-DYA-F、T73-ATG-F、T73-TGC-F按照摩尔比为6：1：1的比例进行混合作为上游混合引物T73-MIX-F，将下游引物S102-DYA-F、S102-ATG-F、S102-TGC-F按照摩尔比为6：1：1的比例进行混合作为下游混合引物S102-MIX-F进行PCR扩增出PCR产物T73-S102。以质粒pET24a-scDAOCS7为模板，上游引物为L158-F，将下游引物L158-HRT-R、L158-TAC-R、L158-ACG-R按照摩尔比为6：1：1的比例进行混合作为下游混合引物L158-MIX-F进行PCR扩增出PCR产物L158。PCR程序均为：预变性98℃2min，变性98℃15s，退火55℃15s，延伸72℃30s，最后72℃10min，变性到延伸程序设定为30个循环。将扩增出的两个PCR产物电泳后进行胶回收获得纯化后的基因片段T73-S102和L158，将两个基因片段进行等摩尔混合，然后加入引物T73-MIX-F和L158-MIX-F进行PCR，将PCR产物电泳及胶回收后获得基因片段T73-S102-L158，PCR程序为：变性98℃15s，退火55℃15s，延伸72℃30s，最后72℃10min，变性到延伸程序设定为30个循环。取T73-S102-L158基因片段2μL作为引物，质粒pET24a-scDAOCS7为模板进行PCR，PCR程序为：预变性98℃2min，变性98℃15s，退火60℃15s，延伸72℃4min，最后72℃10min，变性到延伸程序设定为30个循环，向所得PCR的产物中加入1μL的Dpn I酶用于消化质粒模板，37℃恒温条件下处理3h。取2μL酶消化后的PCR产物电转化进大肠杆菌BL21(DE3)中，将电转后的大肠杆菌BL21(DE3)菌液均匀的涂布在卡那霉素抗性(卡那霉素浓度为50μg/mL)的LB平板上，37℃恒温条件下培养14h后长出单菌落。
用无菌牙签分别挑取阴性对照菌BL21(DE3)/pET24a(挑取3个单菌落)、阳性对照菌BL21(DE3)/pET24a-scDAOCS7(挑取3个单菌落)和突变体库LB平板上长出的单菌落(挑取1536个单菌落)转接至含有300μL的LB培养基的96孔深孔培养板，加入卡那霉素使终浓度为50μg/mL，37℃、800rpm条件下振荡培养12h，每个孔中取120μL的菌液进行保菌，然后向96孔深孔培养板中加入800μL的TB培养基，并加入卡那霉素和IPTG，使终浓度分别为50μg/mL和0.1mM，20℃、800rpm振荡培养12h。然后在4000rpm、4℃条件下离心10min收集菌体。用1000μL的50mM的磷酸盐缓冲液(pH7.4)洗涤菌体一次。然后向菌体加入含10g/L的葡萄糖、50μg/mL的硫酸亚铁、5mM的青霉素G钾盐的50mM pH7.4的磷酸盐缓冲液(500μL)，在25℃、800rpm条件下分别培养2h，4000rpm、4℃条件下离心10min，收集上清液，将上清液转移到石英96孔板中，利用酶标仪在检测波长为275nm的条件下进行初筛，吸收波长大于96孔板中培养BL21(DE3)/pET24a-scDAOCS7的菌株中表达的scDAOCS7突变体可能具有更强的催化活力。结果显示，1536个单菌落中36个孔中上清液的转化率高于阳性对照，之后通过液相检测上清液进行进一步的确定，并对G-7-ADCA产量高于阳性对照的菌株的突变位点进行测序，液相检测条件同上，而后计算转化率。
表8、G-7-ADCA的转化率
Figure BDA0002455471770000201
Figure BDA0002455471770000211
如表8所示的菌株的转化率均高于阳性对照的转化率，其中BL21(DE3)/pET24a-scDAOCS7-T73S/S102V/L158T、BL21(DE3)/pET24a-scDAOCS7-T73S/S102L/L158I、BL21(DE3)/pET24a-scDAOCS7-T73V/S102M/L158I、BL21(DE3)/pET24a-scDAOCS7-T73C/S102T、BL21(DE3)/pET24a-scDAOCS7-T73M/S102C/L158A、BL21(DE3)/pET24a-scDAOCS7-L158I、BL21(DE3)/pET24a-scDAOCS7-L158V、BL21(DE3)/pET24a-scDAOCS7-T73S/S102I、BL21(DE3)/pET24a-scDAOCS7-T73V/S102A/L158C、BL21(DE3)/pET24a-scDAOCS7-T73C/S102I/L158S的转化率显著高于阳性对照，上述表达的所有scDAOCS7突变蛋白质可作为潜在的工业化应用的酶。
其中，BL21(DE3)/pET24a-scDAOCS7-T73S/S102V/L158T含有质粒pET24a-scDAOCS7-T73S/S102V/L158T，该菌株与该质粒中scDAOCS7基因的第217-219位的ACA突变为AGC、第304-306位的AGC突变为GTG、第472-474位的CTG突变为ACC，将突变后的基因记为scDAOCS7-T73S/S102V/L158T基因，scDAOCS7-T73S/S102V/L158T基因编码scDAOCS7-T73S/S102V/L158T蛋白质，scDAOCS7-T73S/S102V/L158T蛋白质为将scDAOCS7蛋白质的第73位的苏氨酸残基突变为丝氨酸残基、第102位的丝氨酸残基突变为缬氨酸残基、第158位的亮氨酸残基突变为苏氨酸残基得到的突变蛋白，该菌株和质粒中仅含有发生该种突变的scDAOCS7突变蛋白质和scDAOCS7突变基因。
BL21(DE3)/pET24a-scDAOCS7-T73L/S102C/L158I含有质粒pET24a-scDAOCS7-T73L/S102C/L158I，该菌株与该质粒中scDAOCS7基因的第217-219位的ACA突变为CTG、第304-306位的AGC突变为TGC、第472-474位的CTG突变为ATT，将突变后的基因记为scDAOCS7-T73L/S102C/L158I基因，scDAOCS7-T73L/S102C/L158I基因编码scDAOCS7-T73L/S102C/L158I蛋白质，scDAOCS7-T73L/S102C/L158I蛋白质为将scDAOCS7蛋白质的第73位的苏氨酸残基突变为亮氨酸残基、第102位的丝氨酸残基突变为半胱氨酸残基、第158位的亮氨酸残基突变为异亮氨酸残基得到的突变蛋白，该菌株和质粒中仅含有发生该种突变的scDAOCS7突变蛋白质和scDAOCS7突变基因。
BL21(DE3)/pET24a-scDAOCS7-T73M/S102T/L158I含有质粒pET24a-scDAOCS7-T73M/S102T/L158I，该菌株与该质粒中scDAOCS7基因的第217-219位的ACA突变为ATG、第304-306位的AGC突变为ACC、第472-474位的CTG突变为ATT，将突变后的基因记为scDAOCS7-T73M/S102T/L158I基因，scDAOCS7-T73M/S102T/L158I基因编码scDAOCS7-T73M/S102T/L158I蛋白质，scDAOCS7-T73M/S102T/L158I蛋白质为将scDAOCS7蛋白质的第73位的苏氨酸残基突变为甲硫氨酸残基、第102位的丝氨酸残基突变为苏氨酸残基、第158位的亮氨酸残基突变为异亮氨酸残基得到的突变蛋白，该菌株和质粒中仅含有发生该种突变的scDAOCS7突变蛋白质和scDAOCS7突变基因。
BL21(DE3)/pET24a-scDAOCS7-T73A/S102L/L158I含有质粒pET24a-scDAOCS7-T73A/S102L/L158I，该菌株与该质粒中scDAOCS7基因的第217-219位的ACA突变为GCG、第304-306位的AGC突变为CTG、第472-474位的CTG突变为ATT，将突变后的基因记为scDAOCS7-T73A/S102L/L158I基因，scDAOCS7-T73A/S102L/L158I基因编码scDAOCS7-T73A/S102L/L158I蛋白质，scDAOCS7-T73A/S102L/L158I蛋白质为将scDAOCS7蛋白质的第73位的苏氨酸残基突变为丙氨酸残基、第102位的丝氨酸残基突变为亮氨酸残基、第158位的亮氨酸残基突变为异亮氨酸残基得到的突变蛋白，该菌株和质粒中仅含有发生该种突变的scDAOCS7突变蛋白质和scDAOCS7突变基因。
BL21(DE3)/pET24a-scDAOCS7-T73L/S102M/L158T含有质粒pET24a-scDAOCS7-T73L/S102M/L158T，该菌株与该质粒中scDAOCS7基因的第217-219位的ACA突变为CTG、第304-306位的AGC突变为ATG、第472-474位的CTG突变为ACC，将突变后的基因记为scDAOCS7-T73L/S102M/L158T基因，scDAOCS7-T73L/S102M/L158T基因编码scDAOCS7-T73L/S102M/L158T蛋白质，scDAOCS7-T73L/S102M/L158T蛋白质为将scDAOCS7蛋白质的第73位的苏氨酸残基突变为亮氨酸残基、第102位的丝氨酸残基突变为甲硫氨酸残基、第158位的亮氨酸残基突变为苏氨酸残基得到的突变蛋白，该菌株和质粒中仅含有发生该种突变的scDAOCS7突变蛋白质和scDAOCS7突变基因。
BL21(DE3)/pET24a-scDAOCS7-T73M/S102I/L158I含有质粒pET24a-scDAOCS7-T73M/S102I/L158I，该菌株与该质粒中scDAOCS7基因的第217-219位的ACA突变为ATG、第304-306位的AGC突变为ATT、第472-474位的CTG突变为ATT，将突变后的基因记为scDAOCS7-T73M/S102I/L158I基因，scDAOCS7-T73M/S102I/L158I基因编码scDAOCS7-T73M/S102I/L158I蛋白质，scDAOCS7-T73M/S102I/L158I蛋白质为将scDAOCS7蛋白质的第73位的苏氨酸残基突变为甲硫氨酸残基、第102位的丝氨酸残基突变为异亮氨酸残基、第158位的亮氨酸残基突变为异亮氨酸残基得到的突变蛋白，该菌株和质粒中仅含有发生该种突变的scDAOCS7突变蛋白质和scDAOCS7突变基因。
BL21(DE3)/pET24a-scDAOCS7-T73V/S102T/L158S含有质粒pET24a-scDAOCS7-T73V/S102T/L158S，该菌株与该质粒中scDAOCS7基因的第217-219位的ACA突变为GTG、第304-306位的AGC突变为ACC、第472-474位的CTG突变为AGC，将突变后的基因记为scDAOCS7-T73V/S102T/L158S基因，scDAOCS7-T73V/S102T/L158S基因编码scDAOCS7-T73V/S102T/L158S蛋白质，scDAOCS7-T73V/S102T/L158S蛋白质为将scDAOCS7蛋白质的第73位的苏氨酸残基突变为缬氨酸残基、第102位的丝氨酸残基突变为苏氨酸残基、第158位的亮氨酸残基突变为丝氨酸残基得到的突变蛋白，该菌株和质粒中仅含有发生该种突变的scDAOCS7突变蛋白质和scDAOCS7突变基因。
BL21(DE3)/pET24a-scDAOCS7-S102I/L158A含有质粒pET24a-scDAOCS7-S102I/L158A，该菌株与该质粒中scDAOCS7基因的第304-306位的AGC突变为ATT、第472-474位的CTG突变为GCG，将突变后的基因记为scDAOCS7-S102I/L158A基因，scDAOCS7-S102I/L158A基因编码scDAOCS7-S102I/L158A蛋白质，scDAOCS7-S102I/L158A蛋白质为将scDAOCS7蛋白质的第102位的丝氨酸残基突变为异亮氨酸残基、第158位的亮氨酸残基突变为丙氨酸残基得到的突变蛋白，该菌株和质粒中仅含有发生该种突变的scDAOCS7突变蛋白质和scDAOCS7突变基因。
BL21(DE3)/pET24a-scDAOCS7-T73L/S102I/L158V含有质粒pET24a-scDAOCS7-T73L/S102I/L158V，该菌株与该质粒中scDAOCS7基因的第217-219位的ACA突变为CTG、第304-306位的AGC突变为ATT、第472-474位的CTG突变为GTG，将突变后的基因记为scDAOCS7-T73L/S102I/L158V基因，scDAOCS7-T73L/S102I/L158V基因编码scDAOCS7-T73L/S102I/L158V蛋白质，scDAOCS7-T73L/S102I/L158V蛋白质为将scDAOCS7蛋白质的第73位的苏氨酸残基突变为亮氨酸残基、第102位的丝氨酸残基突变为异亮氨酸残基、第158位的亮氨酸残基突变为缬氨酸残基得到的突变蛋白，该菌株和质粒中仅含有发生该种突变的scDAOCS7突变蛋白质和scDAOCS7突变基因。
BL21(DE3)/pET24a-scDAOCS7-T73S/S102M/L158A含有质粒pET24a-scDAOCS7-T73S/S102M/L158A，该菌株与该质粒中scDAOCS7基因的第217-219位的ACA突变为AGC、第304-306位的AGC突变为ATG、第472-474位的CTG突变为GCG，将突变后的基因记为scDAOCS7-T73S/S102M/L158A基因，scDAOCS7-T73S/S102M/L158A基因编码scDAOCS7-T73S/S102M/L158A蛋白质，scDAOCS7-T73S/S102M/L158A蛋白质为将scDAOCS7蛋白质的第73位的苏氨酸残基突变为丝氨酸残基、第102位的丝氨酸残基突变为甲硫氨酸残基、第158位的亮氨酸残基突变为丙氨酸残基得到的突变蛋白，该菌株和质粒中仅含有发生该种突变的scDAOCS7突变蛋白质和scDAOCS7突变基因。
BL21(DE3)/pET24a-scDAOCS7-T73L/S102C/L158I含有质粒pET24a-scDAOCS7-T73L/S102C/L158I，该菌株与该质粒中scDAOCS7基因的第217-219位的ACA突变为CTG、第304-306位的AGC突变为TGC、第472-474位的CTG突变为ATT，将突变后的基因记为scDAOCS7-T73L/S102C/L158I基因，scDAOCS7-T73L/S102C/L158I基因编码scDAOCS7-T73L/S102C/L158I蛋白质，scDAOCS7-T73L/S102C/L158I蛋白质为将scDAOCS7蛋白质的第73位的苏氨酸残基突变为亮氨酸残基、第102位的丝氨酸残基突变为半胱氨酸残基、第158位的亮氨酸残基突变为异亮氨酸残基得到的突变蛋白，该菌株和质粒中仅含有发生该种突变的scDAOCS7突变蛋白质和scDAOCS7突变基因。
BL21(DE3)/pET24a-scDAOCS7-T73M/S102C/L158I含有质粒pET24a-scDAOCS7-T73M/S102C/L158I，该菌株与该质粒中scDAOCS7基因的第217-219位的ACA突变为ATG、第304-306位的AGC突变为TGC、第472-474位的CTG突变为ATT，将突变后的基因记为scDAOCS7-T73M/S102C/L158I基因，scDAOCS7-T73M/S102C/L158I基因编码scDAOCS7-T73M/S102C/L158I蛋白质，scDAOCS7-T73M/S102C/L158I蛋白质为将scDAOCS7蛋白质的第73位的苏氨酸残基突变为甲硫氨酸残基、第102位的丝氨酸残基突变为半胱氨酸残基、第158位的亮氨酸残基突变为异亮氨酸残基得到的突变蛋白，该菌株和质粒中仅含有发生该种突变的scDAOCS7突变蛋白质和scDAOCS7突变基因。
BL21(DE3)/pET24a-scDAOCS7-T73S/S102L/L158I含有质粒pET24a-scDAOCS7-T73S/S102L/L158I，该菌株与该质粒中scDAOCS7基因的第217-219位的ACA突变为AGC、第304-306位的AGC突变为CTG、第472-474位的CTG突变为ATT，将突变后的基因记为scDAOCS7-T73S/S102L/L158I基因，scDAOCS7-T73S/S102L/L158I基因编码scDAOCS7-T73S/S102L/L158I蛋白质，scDAOCS7-T73S/S102L/L158I蛋白质为将scDAOCS7蛋白质的第73位的苏氨酸残基突变为丝氨酸残基、第102位的丝氨酸残基突变为亮氨酸残基、第158位的亮氨酸残基突变为异亮氨酸残基得到的突变蛋白，该菌株和质粒中仅含有发生该种突变的scDAOCS7突变蛋白质和scDAOCS7突变基因。
BL21(DE3)/pET24a-scDAOCS7-T73L/S102C/L158A含有质粒pET24a-scDAOCS7-T73L/S102C/L158A，该菌株与该质粒中scDAOCS7基因的第217-219位的ACA突变为CTG、第304-306位的AGC突变为TGC、第472-474位的CTG突变为GCG，将突变后的基因记为scDAOCS7-T73L/S102C/L158A基因，scDAOCS7-T73L/S102C/L158A基因编码scDAOCS7-T73L/S102C/L158A蛋白质，scDAOCS7-T73L/S102C/L158A蛋白质为将scDAOCS7蛋白质的第73位的苏氨酸残基突变为亮氨酸残基、第102位的丝氨酸残基突变为半胱氨酸残基、第158位的亮氨酸残基突变为丙氨酸残基得到的突变蛋白，该菌株和质粒中仅含有发生该种突变的scDAOCS7突变蛋白质和scDAOCS7突变基因。
BL21(DE3)/pET24a-scDAOCS7-T73V/S102M/L158I含有质粒pET24a-scDAOCS7-T73V/S102M/L158I，该菌株与该质粒中scDAOCS7基因的第217-219位的ACA突变为GTG、第304-306位的AGC突变为ATG、第472-474位的CTG突变为ATT，将突变后的基因记为scDAOCS7-T73V/S102M/L158I基因，scDAOCS7-T73V/S102M/L158I基因编码scDAOCS7-T73V/S102M/L158I蛋白质，scDAOCS7-T73V/S102M/L158I蛋白质为将scDAOCS7蛋白质的第73位的苏氨酸残基突变为缬氨酸残基、第102位的丝氨酸残基突变为甲硫氨酸残基、第158位的亮氨酸残基突变为异亮氨酸残基得到的突变蛋白，该菌株和质粒中仅含有发生该种突变的scDAOCS7突变蛋白质和scDAOCS7突变基因。
BL21(DE3)/pET24a-scDAOCS7-T73L/S102A/L158A含有质粒pET24a-scDAOCS7-T73L/S102A/L158A，该菌株与该质粒中scDAOCS7基因的第217-219位的ACA突变为CTG、第304-306位的AGC突变为GCG、第472-474位的CTG突变为GCG，将突变后的基因记为scDAOCS7-T73L/S102A/L158A基因，scDAOCS7-T73L/S102A/L158A基因编码scDAOCS7-T73L/S102A/L158A蛋白质，scDAOCS7-T73L/S102A/L158A蛋白质为将scDAOCS7蛋白质的第73位的苏氨酸残基突变为亮氨酸残基、第102位的丝氨酸残基突变为丙氨酸残基、第158位的亮氨酸残基突变为丙氨酸残基得到的突变蛋白，该菌株和质粒中仅含有发生该种突变的scDAOCS7突变蛋白质和scDAOCS7突变基因。
BL21(DE3)/pET24a-scDAOCS7-T73C/S102T含有质粒pET24a-scDAOCS7-T73C/S102T，该菌株与该质粒中scDAOCS7基因的第217-219位的ACA突变为TGC、第304-306位的AGC突变为ACC，将突变后的基因记为scDAOCS7-T73C/S102T基因，scDAOCS7-T73C/S102T基因编码scDAOCS7-T73C/S102T蛋白质，scDAOCS7-T73C/S102T蛋白质为将scDAOCS7蛋白质的第73位的苏氨酸残基突变为半胱氨酸残基、第102位的丝氨酸残基突变为苏氨酸残基得到的突变蛋白，该菌株和质粒中仅含有发生该种突变的scDAOCS7突变蛋白质和scDAOCS7突变基因。
BL21(DE3)/pET24a-scDAOCS7-T73M/S102C/L158A含有质粒pET24a-scDAOCS7-T73M/S102C/L158A，该菌株与该质粒中scDAOCS7基因的第217-219位的ACA突变为ATG、第304-306位的AGC突变为TGC、第472-474位的CTG突变为GCG，将突变后的基因记为scDAOCS7-T73M/S102C/L158A基因，scDAOCS7-T73M/S102C/L158A基因编码scDAOCS7-T73M/S102C/L158A蛋白质，scDAOCS7-T73M/S102C/L158A蛋白质为将scDAOCS7蛋白质的第73位的苏氨酸残基突变为甲硫氨酸残基、第102位的丝氨酸残基突变为半胱氨酸残基、第158位的亮氨酸残基突变为丙氨酸残基得到的突变蛋白，该菌株和质粒中仅含有发生该种突变的scDAOCS7突变蛋白质和scDAOCS7突变基因。
BL21(DE3)/pET24a-scDAOCS7-L158I含有质粒pET24a-scDAOCS7-L158I，该菌株与该质粒中scDAOCS7基因的第472-474位的CTG突变为ATT，将突变后的基因记为scDAOCS7-L158I基因，scDAOCS7-L158I基因编码scDAOCS7-L158I蛋白质，scDAOCS7-L158I蛋白质为将scDAOCS7蛋白质的第158位的亮氨酸残基突变为异亮氨酸残基得到的突变蛋白，该菌株和质粒中仅含有发生该种突变的scDAOCS7突变蛋白质和scDAOCS7突变基因。
BL21(DE3)/pET24a-scDAOCS7-L158V含有质粒pET24a-scDAOCS7-L158V，该菌株与该质粒中scDAOCS7基因的第472-474位的CTG突变为GTG，将突变后的基因记为scDAOCS7-L158V基因，scDAOCS7-L158V基因编码scDAOCS7-L158V蛋白质，scDAOCS7-L158V蛋白质为将scDAOCS7蛋白质的第158位的亮氨酸残基突变为缬氨酸残基得到的突变蛋白，该菌株和质粒中仅含有发生该种突变的scDAOCS7突变蛋白质和scDAOCS7突变基因。
BL21(DE3)/pET24a-scDAOCS7-T73S/S102I含有质粒pET24a-scDAOCS7-T73S/S102I，该菌株与该质粒中scDAOCS7基因的第217-219位的ACA突变为AGC、第304-306位的AGC突变为ATT，将突变后的基因记为scDAOCS7-T73S/S102I基因，scDAOCS7-T73S/S102I基因编码scDAOCS7-T73S/S102I蛋白质，scDAOCS7-T73S/S102I蛋白质为将scDAOCS7蛋白质的第73位的苏氨酸残基突变为丝氨酸残基、第102位的丝氨酸残基突变为异亮氨酸残基，该菌株和质粒中仅含有发生该种突变的scDAOCS7突变蛋白质和scDAOCS7突变基因。
BL21(DE3)/pET24a-scDAOCS7-T73V/S102A/L158C含有质粒pET24a-scDAOCS7-T73V/S102A/L158C，该菌株与该质粒中scDAOCS7基因的第217-219位的ACA突变为GTG、第304-306位的AGC突变为GCG、第472-474位的CTG突变为TGC，将突变后的基因记为scDAOCS7-T73V/S102A/L158C基因，scDAOCS7-T73V/S102A/L158C基因编码scDAOCS7-T73V/S102A/L158C蛋白质，scDAOCS7-T73V/S102A/L158C蛋白质为将scDAOCS7蛋白质的第73位的苏氨酸残基突变为缬氨酸残基、第102位的丝氨酸残基突变为丙氨酸残基、第158位的亮氨酸残基突变为半胱氨酸残基得到的突变蛋白，该菌株和质粒中仅含有发生该种突变的scDAOCS7突变蛋白质和scDAOCS7突变基因。
BL21(DE3)/pET24a-scDAOCS7-T73C/S102I/L158S含有质粒pET24a-scDAOCS7-T73C/S102I/L158S，该菌株与该质粒中scDAOCS7基因的第217-219位的ACA突变为TGC、第304-306位的AGC突变为ATT、第472-474位的CTG突变为AGC，将突变后的基因记为scDAOCS7-T73C/S102I/L158S基因，scDAOCS7-T73C/S102I/L158S基因编码scDAOCS7-T73C/S102I/L158S蛋白质，scDAOCS7-T73C/S102I/L158S蛋白质为将scDAOCS7蛋白质的第73位的苏氨酸残基突变为半胱氨酸残基、第102位的丝氨酸残基突变为异亮氨酸残基、第158位的亮氨酸残基突变为丝氨酸残基得到的突变蛋白，该菌株和质粒中仅含有发生该种突变的scDAOCS7突变蛋白质和scDAOCS7突变基因。
综上所述，对于scDAOCS7基因的R160、R162、R179、T73、S102、L158改造实现了青霉素G钾盐向G-7-ADCA的催化过程，且筛选出的突变体转化率均显著高于阳性对照的转化率，上述突变体均能够作为潜在的工业化应用酶。
<110> 中国科学院天津工业生物技术研究所
<120> 脱乙酰氧头孢菌素C合成酶突变体及其在β-内酰胺抗生素母核合成中的应用
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 936
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 1
atggatacca ccgtgccgac ctttagtctg gcagaactgc agcagggtct gcatcaggat 60
gaatttcgcc gttgcctgcg cgataaaggt ctgttttatc tgaccgattg tggtctgacc 120
gataccgaac tgaaaagtgc caaagatttg gttattgatt tctttgaaca cggtagcgaa 180
gcagaaaaac gcgccgtgac cagtccggtg ccgaccacac gccgcggttt taccggtctg 240
gaaagcgaaa gtaccgcaca gattaccaat accggtagct atagtgatta tagtatgtgt 300
tatagcatgg gtacagccga taatctgttt ccgagcggcg attttgaacg catttggacc 360
cagtattttg atcgtcagta taccgcaagt cgcgcagttg cacgcgaagt gctgcgcgca 420
accggcaccg aaccggatgg tggtgtggaa gcatttctgg attatgaacc gctgctgcgt 480
tttcgttatt ttccgcaggt gccggaacat cgtagtgccg aagaacagcc gctgcgcatg 540
gcaccgcatc atgatctgag catggtgacc ctgattcagc agaccccgtg cgcaaatggc 600
tttgttagtc tgcaggccga agttggcggc gcctttgttg atctgccgta tcgtccggat 660
gcagtgctgg ttttctgtgg tgccattgcc accctggtga ccggcggcca ggttaaagca 720
ccgcgtcatc atgtggcagc accgcgtcgt gatcagattg ccggtagtag ccgtaccagc 780
agcgttttct ttctgcgccc gaatgcagat tttaccttta gcattccgct ggcacgtgaa 840
tatggttttg atgttagcct ggatggtgaa accgccacct ttcaggattg gattggcggc 900
aattatgtta atatgcgccg caccagcaaa gcctaa 936
<210> 2
<211> 311
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 2
Met Asp Thr Thr Val Pro Thr Phe Ser Leu Ala Glu Leu Gln Gln Gly
1 5 10 15
Leu His Gln Asp Glu Phe Arg Arg Cys Leu Arg Asp Lys Gly Leu Phe
20 25 30
Tyr Leu Thr Asp Cys Gly Leu Thr Asp Thr Glu Leu Lys Ser Ala Lys
35 40 45
Asp Leu Val Ile Asp Phe Phe Glu His Gly Ser Glu Ala Glu Lys Arg
50 55 60
Ala Val Thr Ser Pro Val Pro Thr Thr Arg Arg Gly Phe Thr Gly Leu
65 70 75 80
Glu Ser Glu Ser Thr Ala Gln Ile Thr Asn Thr Gly Ser Tyr Ser Asp
85 90 95
Tyr Ser Met Cys Tyr Ser Met Gly Thr Ala Asp Asn Leu Phe Pro Ser
100 105 110
Gly Asp Phe Glu Arg Ile Trp Thr Gln Tyr Phe Asp Arg Gln Tyr Thr
115 120 125
Ala Ser Arg Ala Val Ala Arg Glu Val Leu Arg Ala Thr Gly Thr Glu
130 135 140
Pro Asp Gly Gly Val Glu Ala Phe Leu Asp Tyr Glu Pro Leu Leu Arg
145 150 155 160
Phe Arg Tyr Phe Pro Gln Val Pro Glu His Arg Ser Ala Glu Glu Gln
165 170 175
Pro Leu Arg Met Ala Pro His His Asp Leu Ser Met Val Thr Leu Ile
180 185 190
Gln Gln Thr Pro Cys Ala Asn Gly Phe Val Ser Leu Gln Ala Glu Val
195 200 205
Gly Gly Ala Phe Val Asp Leu Pro Tyr Arg Pro Asp Ala Val Leu Val
210 215 220
Phe Cys Gly Ala Ile Ala Thr Leu Val Thr Gly Gly Gln Val Lys Ala
225 230 235 240
Pro Arg His His Val Ala Ala Pro Arg Arg Asp Gln Ile Ala Gly Ser
245 250 255
Ser Arg Thr Ser Ser Val Phe Phe Leu Arg Pro Asn Ala Asp Phe Thr
260 265 270
Phe Ser Ile Pro Leu Ala Arg Glu Tyr Gly Phe Asp Val Ser Leu Asp
275 280 285
Gly Glu Thr Ala Thr Phe Gln Asp Trp Ile Gly Gly Asn Tyr Val Asn
290 295 300
Met Arg Arg Thr Ser Lys Ala
305 310

Claims (10)

1. 制备7-ADCA的方法，包括：以6-APA 为底物，利用scDAOCS7或scDAOCS7突变蛋白质进行催化反应，得到7-ADCA；
所述scDAOCS7的氨基酸序列为序列表中SEQ ID No.2；所述scDAOCS7突变蛋白质为对如SEQ ID No.2所示的scDAOCS7进行如下任一突变得到的：
a1）A61D；
a2）A61E；
a3）F225L；
a4）F225I；
a5）A61D/F225I；
a6）A61D/F225L；
a7）A61E/F225I；
a8）A61E/F225L；
a9）R179L；
a10）R160A/R162A/R179I；
a11）R160I/R162C/R179A；
a12）R160G/R162A/R179I；
a13）T73S/S102V/L158T；
a14）T73L/S102C/L158I；
a15）T73M/S102T/L158I；
a16）T73A/S102L/L158I；
a17）T73L/S102M/L158T；
a18）T73M/S102I/L158I；
a19）T73V/S102T/L158S；
a20）S102I/L158A；
a21）T73L/S102I/L158V；
a22）T73S/S102M/L158A；
a23）T73M/S102C/L158I；
a24）T73S/S102L/L158I；
a25）T73L/S102C/L158A；
a26）T73V/S102M/L158I；
a27）T73L/S102A/L158A；
a28）T73C/S102T；
a29）T73M/S102C/L158A；
a30）L158I；
a31）L158V；
a32）T73S/S102I；
a33）T73V/S102A/L158C；
a34）T73C/S102I/L158S。
2.制备7-ADCA的方法，包括：以6-APA 为底物，利用表达scDAOCS7或权利要求1中所述scDAOCS7突变蛋白质的重组细胞或所述重组细胞的裂解物进行催化反应，得到7-ADCA；
所述scDAOCS7的氨基酸序列为序列表中SEQ ID No.2。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述重组细胞通过向生物细胞中导入能表达scDAOCS7或权利要求1中所述scDAOCS7突变蛋白质的重组载体实现。
4.制备G-7-ADCA的方法，以青霉素G钾盐为底物，利用scDAOCS7或权利要求1中所述scDAOCS7突变蛋白质进行催化反应，得到G-7-ADCA；
所述scDAOCS7的氨基酸序列为序列表中SEQ ID No.2。
5.权利要求1中所述scDAOCS7突变蛋白质。
6.与权利要求1中所述scDAOCS7突变蛋白质相关的生物材料，为下述B1）至B4）中的任一种：
B1）编码权利要求1中所述scDAOCS7突变蛋白质的核酸分子；
B2）含有B1）所述核酸分子的表达盒；
B3）含有B1）所述核酸分子的重组载体、或含有B2）所述表达盒的重组载体；
B4）含有B1）所述核酸分子的重组微生物、或含有B2）所述表达盒的重组微生物、或含有B3）所述重组载体的重组微生物。
7.下述任一产品：
M1、由6-APA与权利要求1中所述scDAOCS7突变蛋白质组成的成套产品；
M2、由6-APA与权利要求6所述生物材料组成的成套产品；
M3、由6-APA与scDAOCS7组成的成套产品；所述scDAOCS7的氨基酸序列为序列表中SEQID No.2；
M4、由青霉素G钾盐、6-APA与权利要求1中所述scDAOCS7突变蛋白质组成的成套产品；
M5、由青霉素G钾盐、6-APA与权利要求6所述生物材料组成的成套产品；
M6、由青霉素G钾盐、6-APA与scDAOCS7组成的成套产品；
M1- M6中任一产品用于制备7-ADCA。
8.权利要求1中所述scDAOCS7突变蛋白质或权利要求6所述生物材料的下述任一应用：
Z3、在生产7-ADCA中的应用；
Z4、在制备生产7-ADCA产品中的应用；
Z7、在生产G-7-ADCA中的应用；
Z8、在制备生产G-7-ADCA产品中的应用。
9.权利要求1中所述scDAOCS7突变蛋白质或权利要求6所述生物材料的下述任一应用：
Z1、在催化6-APA生成7-ADCA中的应用；
Z2、在制备催化6-APA生成7-ADCA产品中的应用；
Z5、在催化青霉素G钾盐生成G-7-ADCA中的应用；
Z6、在制备催化青霉素G钾盐生成G-7-ADCA产品中的应用。
10.权利要求7所述产品的下述任一应用：
Z3、在生产7-ADCA中的应用；
Z4、在制备生产7-ADCA产品中的应用。
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