CN115838753A

CN115838753A - 一种生产7-氨基去乙酰氧基头孢烷酸的方法

Info

Publication number: CN115838753A
Application number: CN202111097082.2A
Authority: CN
Inventors: 孙周通; 杨大猛; 李湘莹; 苏文成; 蒋迎迎; 曲戈
Original assignee: Tianjin Institute of Industrial Biotechnology of CAS
Current assignee: Tianjin Institute of Industrial Biotechnology of CAS
Priority date: 2021-09-18
Filing date: 2021-09-18
Publication date: 2023-03-24

Abstract

本发明公开了一种生产7‑氨基去乙酰氧基头孢烷酸的方法。该方法包括如下步骤：向酿酒酵母BY4741中导入SEQ ID No：3所示的pcbCsc基因、SEQ ID No：6所示的penDEen、SEQ ID No.12所示的cefEsc9skl、Symbiodiniummicroadriaticum来源的pcbAB基因和Aspergillus nidulans来源的npgA基因，从而获得用于生产7‑ADCA的工程菌；发酵培养工程菌，收集发酵菌体；破碎发酵菌体，离心，收集菌体破碎后的上清液；菌体破碎后的上清液中含有7‑ADCA。本发明制备的重组酿酒酵母DM282的菌体破碎后上清液中7‑ADCA的产量达到2.28mg/g。本发明具有重要的应用价值。

Description

一种生产7-氨基去乙酰氧基头孢烷酸的方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种生产7-氨基去乙酰氧基头孢烷酸的方法。

背景技术

7-氨基去乙酰氧基头孢烷酸(7-Aminodesacetoxycephalosporanicacid，7-ADCA)是一种白色或淡黄色的粉末，能够在强酸或者强碱溶液中溶解，但是不溶于有机溶剂。7-ADCA的分子式为C₈H₁₀N₂O₃S，结构式如图1所示。7-ADCA是重要的β-内酰胺类抗生素母核，其全球市场需求在4000-5000万吨。目前采用7-ADCA合成的药物(如头孢羟氨、头孢拉定、头孢克罗)都是国内外抗生素市场用量较大的抗生素药物。但是合成7-ADCA的技术有待提高，产量较低，同时在质量上也无法满足市场需求。目前，合成7-ADCA的方法有四种，分别为化学法、化学酶法、酶法与生物酶法。

目前，我国仍然主要使用化学法合成7-ADCA，该工艺是以青霉素G钾盐为原料，首先选用合适的氧化剂将底物氧化为青霉素亚砜，其次利用酯化剂将青霉素亚砜的羧基保护起来，然后在无水无氧的有机溶剂中利用酸作为催化剂进行扩环重排合成头孢G酸酯，之后利用稀硫酸去水解头孢G酸酯获得头孢G酸，最后与PCl₅和MeOH进行反应合成胺酯，胺酯水解后获得7-ADCA。

由于酶法合成7-ADCA具有低成本和低污染的优势，逐渐受到工业界的青睐。目前，微生物来源的青霉素酰化酶能够高效的水解头孢G酸合成7-ADCA，已经被工业界广泛的应用。而使用改造后的扩环酶直接催化青霉素G钾盐合成头孢G酸虽然能够实现，但是由于扩环酶的催化效率低和稳定性差等缺点，目前酶法催化青霉素G钾盐合成7-ADCA还停留在研发阶段。生物酶法是首先通过微生物合成中间体，然后再通过酶法催化中间体合成7-ADCA，该方法目前仅在文献中报道。而迄今为止，无论是在学术界还是在工业界均未见直接发酵法合成7-ADCA的报道。直接发酵法可以通过消耗廉价的碳源直接获得7-ADCA，其市场前景广阔，但是未见有7-ADCA天然途径的报道，因此只能寄希望于通过人工设计的代谢途径进行7-ADCA的发酵合成。

发明内容

本发明的目的是生产7-ADCA。

本发明首先保护一种制备用于生产7-ADCA的工程菌的方法，可包括如下步骤：提高酵母中异青霉素N合酶、酰基辅酶A:6-氨基青霉烷酸酰基转移酶和脱乙酰氧基头孢菌素C合成酶的表达量和/或活性，同时导入Symbiodinium microadriaticum来源的pcbAB基因和Aspergillus nidulans来源的npgA基因，从而获得用于生产7-ADCA的工程菌。

上述任一所述异青霉素N合酶可为如下a1)或a2)或a3)或a4)：

a1)氨基酸序列是SEQ ID NO：13所示的蛋白质；

a2)在SEQ ID NO：13所示的蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质或者整合上细胞器的锚定序列；

a3)将a1)或a2)所示的蛋白质经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有异青霉素N合酶活性的蛋白质；

a4)与a1)或a2)所示的蛋白质具有80％或80％以上同一性，且具有异青霉素N合酶活性的蛋白质。

上述任一所述酰基辅酶A:6-氨基青霉烷酸酰基转移酶可为如下b1)或b2)或b3)或b4)：

b1)氨基酸序列是SEQ ID NO：14所示的蛋白质；

b2)在SEQ ID NO：14所示的蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质或者整合上细胞器的锚定序列；

b3)将b1)或b2)所示的蛋白质经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有酰基辅酶A:6-氨基青霉烷酸酰基转移酶活性的蛋白质；

b4)与b1)或b2)所示的蛋白质具有80％或80％以上同一性，且具有酰基辅酶A:6-氨基青霉烷酸酰基转移酶活性的蛋白质。

上述任一所述脱乙酰氧基头孢菌素C合成酶可为如下c1)或c2)或c3)或c4)或c5)：

c1)氨基酸序列是SEQ ID NO：15所示的蛋白质；

c2)氨基酸序列是SEQ ID NO：2所示的蛋白质；

c3)在SEQ ID NO：15或SEQ ID NO：2所示的蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质或者整合上细胞器的锚定序列；

c4)将c1)或c2)或c3)所示的蛋白质经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有脱乙酰氧基头孢菌素C合成酶活性的蛋白质；

c5)与c1)或c2)或c3)所示的蛋白质具有80％或80％以上同一性，且具有脱乙酰氧基头孢菌素C合成酶活性的蛋白质。

上述任一所述标签可为PTS(SKL)、Poly-Arg(RRRRR)、Poly-His(HHHHHH)、FLAG(DYKDDDDK)、Strep-tag II(WSHPQFEK)或c-myc(EQKLISEEDL)。

上述方法中，所述提高酵母中异青霉素N合酶、酰基辅酶A:6-氨基青霉烷酸酰基转移酶和脱乙酰氧基头孢菌素C合成酶的表达量和/或活性可通过向酵母中导入异青霉素N合酶的编码基因、酰基辅酶A:6-氨基青霉烷酸酰基转移酶的编码基因和脱乙酰氧基头孢菌素C合成酶的编码基因来实现。

所述异青霉素N合酶的编码基因的核苷酸序列可如SEQ ID No：3所示。

所述酰基辅酶A:6-氨基青霉烷酸酰基转移酶的编码基因的核苷酸序列可如SEQID No：6所示。

所述脱乙酰氧基头孢菌素C合成酶的编码基因的核苷酸序列可如SEQ ID No.12或SEQ ID No：1所示。

上述任一所述Symbiodinium microadriaticum来源的pcbAB基因和上述任一所述Aspergillus nidulans来源的npgA基因均记载于公开号为CN112852907A的专利文献中。

上述方法中，所述酵母可为啤酒酵母、葡萄汁酵母、汉逊酵母、球拟酵母、假丝酵母、毕赤酵母、红酵母或棉病针酵母。

上述方法中，所述酵母具体可为酿酒酵母BY4741。

采用上述任一所述方法制备得到的用于生产7-ADCA的工程菌也属于本发明的保护范围。

上述任一所述用于生产7-ADCA的工程菌具体可为本发明实施例提及的重组酿酒酵母DM280或重组酿酒酵母DM282。

所述重组酿酒酵母DM280可为使酿酒酵母BY4741表达如下基因：pcbCsc(核苷酸序列如SEQ ID No：3所示，编码氨基酸序列如SEQ ID No：13所示的蛋白质)、penDEen(核苷酸序列如SEQ ID No：6所示，编码氨基酸序列如SEQ ID No：14所示的蛋白质)、cefEsc9(核苷酸序列如SEQ ID No：1所示)、Symbiodinium microadriaticum来源的pcbAB和Aspergillusnidulans来源的npgA。

所述重组酿酒酵母DM282可为使酿酒酵母BY4741表达如下基因：pcbCsc、penDEen、cefEsc9skl(核苷酸序列如SEQ ID No.12所示，编码氨基酸序列如SEQ ID No：15所示的蛋白质)、Symbiodinium microadriaticum来源的pcbAB和Aspergillus nidulans来源的npgA。

上述任一所述工程菌在生产7-ADCA中的应用也属于本发明的保护范围。

本发明还保护一种生产7-ADCA的方法，可包括如下步骤：

(1)发酵培养上述任一所述工程菌，收集发酵菌体；

(2)完成步骤(1)后，将所述发酵菌体进行破碎，得到菌体破碎液；之后离心，收集菌体破碎后的上清液；

从菌体破碎后的上清液中获得7-ADCA。

所述步骤(1)中，发酵参数可为23-33℃(如23-25℃、25-30℃、30-33℃、23℃、25℃、30℃或33℃)、180-260rpm(如180-220rpm、220-260rpm、1800rpm、220rpm或260rpm)发酵培养7天以上(如7天、8天或9天)。

所述步骤(1)中，发酵的培养基可为含100-300ng/μL(如100-200ng/μL、200-300ng/μL、100ng/μL、200ng/μL或300ng/μL)潮霉素、100-300ng/μL(如100-200ng/μL、200-300ng/μL、100ng/μL、200ng/μL或300ng/μL)G418、8-12g/L(如8-10g/L、10-12g/L、8g/L、10g/L或12g/L)蛋白胨、8-12g/L(如8-10g/L、10-12g/L、8g/L、10g/L或12g/L)牛肉膏、8-12g/L(如8-10g/L、10-12g/L、8g/L、10g/L或12g/L)葡萄糖和8-12g/L(如8-10g/L、10-12g/L、8g/L、10g/L或12g/L)半乳糖的培养基。所述发酵的培养基的溶质及其浓度可为100-300ng/μL(如100-200ng/μL、200-300ng/μL、100ng/μL、200ng/μL或300ng/μL)潮霉素、100-300ng/μL(如100-200ng/μL、200-300ng/μL、100ng/μL、200ng/μL或300ng/μL)G418、8-12g/L(如8-10g/L、10-12g/L、8g/L、10g/L或12g/L)蛋白胨、8-12g/L(如8-10g/L、10-12g/L、8g/L、10g/L或12g/L)牛肉膏、8-12g/L(如8-10g/L、10-12g/L、8g/L、10g/L或12g/L)葡萄糖和8-12g/L(如8-10g/L、10-12g/L、8g/L、10g/L或12g/L)半乳糖，溶剂为溶剂为水，pH自然。

本发明还保护用于生产7-ADCA的蛋白质组合。所述蛋白质组合包括上述任一所述脱乙酰氧基头孢菌素C合成酶、上述任一所述异青霉素N合酶和上述任一所述酰基辅酶A:6-氨基青霉烷酸酰基转移酶中的至少一种。

所述蛋白质组合具体可由上述任一所述脱乙酰氧基头孢菌素C合成酶、上述任一所述异青霉素N合酶和上述任一所述酰基辅酶A:6-氨基青霉烷酸酰基转移酶组成。

本发明还保护上述任一所述蛋白质组合的应用，可为如下d1)或d2)：

d1)生产7-ADCA；

d2)制备用于生产7-ADCA的产品。

本发明还保护用于生产7-ADCA的核酸分子组合。所述核酸分子组合可包括脱乙酰氧基头孢菌素C合成酶的编码基因、异青霉素N合酶的编码基因和酰基辅酶A:6-氨基青霉烷酸酰基转移酶的编码基因中的至少一种；

所述异青霉素N合酶的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID No：3所示；

所述酰基辅酶A:6-氨基青霉烷酸酰基转移酶的编码基因的核苷酸序列如SEQ IDNo：6所示；

所述脱乙酰氧基头孢菌素C合成酶的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID No.12或SEQ ID No：1所示。

所述核酸分子组合具体可由上述任一所述脱乙酰氧基头孢菌素C合成酶的编码基因、上述任一所述异青霉素N合酶的编码基因和上述任一所述酰基辅酶A:6-氨基青霉烷酸酰基转移酶的编码基因组成。

本发明还保护上述任一所述核酸分子组合的应用，可为如下d1)或d2)：

d1)生产7-ADCA；

d2)制备用于生产7-ADCA的产品。

重组酿酒酵母DM209为使酿酒酵母BY4741表达如下基因：pcbCfc、penDEen、cefEsc14skl、Symbiodiniummicroadriaticum来源的pcbAB和Aspergillus nidulans来源的npgA且这些基因均以质粒的形式存在。实验证明，相较于重组酿酒酵母DM209，重组酿酒酵母DM280的7-ADCA的产量提高了149.24倍，重组酿酒酵母DM282的7-ADCA的产量提高了192.24倍。本发明具有重要的应用价值。

附图说明

图1为7-ADCA的结构式。

图2为7-ADCA的标准曲线。

图3为7-ADCA的人工合成途径。

图4为实施例2中步骤4构建的重组质粒的结构示意图。

图5为重组酿酒酵母生产7-ADCA的产量。

图6为7-ADCA的LC-MS检测结果。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中，LC-MS(高效液相与质谱联用技术)检测参数具体如下：

仪器：高效液相色谱仪；

检测器：UV检测器；

检测波长：全波长；

色谱柱：ZORBAXEclipseAAA Analytical 4.6×150mm,5-Micron；

运行时间:25min；

梯度洗脱：A流动相：甲醇(20mM的甲酸)；B流动相：水(20mM的甲酸)；0-20min：0-100％的A流动相；20-25min：100％的B流动相；

流速：0.8mL/min；

进样量：50μL；

柱温箱温度：20℃；

质谱收集范围：m/z＝100-900。

下述实施例中涉及的引物名称及其核苷酸序列见表1。

表1

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7-ADCA标准品为MERCK公司的产品，货号为A8398。

酿酒酵母BY4741来源于中国工业微生物菌种保藏管理中心，菌株编号为bio-82064。已知酿酒酵母BY4741本身存在合成L-α-氨基己二酸、L-半胱氨酸和L-缬氨酸的代谢途径。

YPD平板：向适量水中加入10g酵母膏、20g蛋白胨、20g葡萄糖和20g琼脂粉，混匀；之后用水定容至1L，121℃灭菌20min；待温度降低至55℃，倒平板，自然冷却，得到YPD平板。

YPD液体培养基的溶质及其浓度为10g/L酵母膏、20g/L蛋白胨和20g/L葡萄糖，溶剂为水，pH自然。

YYPD液体培养基的溶质及其浓度为蛋白胨10g/L、牛肉膏10g/L、10g/L葡萄糖和10g/L半乳糖，溶剂为水，pH自然。

实施例1、定向进化改造脱乙酰氧基头孢菌素C合成酶(DAOCS，即扩环酶)用于人工合成7-ADCA

scDAOCS9基因的核苷酸序列如SEQ ID No：1所示，其编码的蛋白质scDAOCS9的氨基酸序列如SEQ ID No：2所示。

通过对蛋白质scDAOCS9进行改造，获得scDAOCS9突变蛋白质，具体在第164位的苯丙氨酸残基(F164)、第180位的甲硫氨酸残基(M180)、第192位的异亮氨酸残基(I192)、第225位的亮氨酸残基(L225)、第245位的缬氨酸残基(V245)、第258位的精氨酸残基(R258)和第305位的甲硫氨酸残基(M305)上进行组合突变。其中F164突变为精氨酸R或天冬氨酸N，M180突变为谷氨酸E，I192突变为缬氨酸V，L225突变为异亮氨酸I，V245突变为精氨酸R，R258突变为组氨酸H或丝氨酸S，M305突变为组氨酸H或谷氨酸E。

一、组合突变体库的构建

1、将质粒pET-24a(Novagen公司的产品，产品目录号为HG-VYN0163)限制性内切酶NdeI和XhoI之间的DNA小片段替换为SEQ ID No：1所示的scDAOCS9基因，其它步骤均不变，得到重组质粒pET24a-scDAOCS9。

2、以重组质粒pET24a-scDAOCS9为模板，采用2μL引物混合液(由164-180-F1、164-180-F2、164-180-F3、164-180-F4、164-180-F5和164-180-F6等摩尔比混合而成)和2μL引物混合液(由192-R1和192-R2等摩尔比混合而成)进行PCR扩增，回收基因片段G1。以重组质粒pET24a-scDAOCS9为模板，采用2μL引物混合液(由192-F1和192-F2等摩尔比混合而成)和2μL引物混合液(由225-R1和225-R2等摩尔比混合而成)进行PCR扩增，回收基因片段G2。以重组质粒pET24a-scDAOCS9为模板，采用2μL引物混合液(由225-F1和225-F2等摩尔比混合而成)和2μL引物混合液(由245-258-R1、245-258-R2、245-258-R3和245-258-R4等摩尔比混合而成)进行PCR扩增，回收基因片段G3。以重组质粒pET24a-scDAOCS9为模板，采用2μL引物混合液(由245-258-F1、245-258-F2、245-258-F3和245-258-F4等摩尔比混合而成)和2μL引物混合液(由305-R1、305-R2和305-R3等摩尔比混合而成)进行PCR扩增，回收基因片段G4。

PCR扩增程序均为：98℃2min；98℃15s，55℃15s，72℃30s，30个循环；72℃10min。

3、将基因片段G1、基因片段G2、基因片段G3和基因片段G4等摩尔比混合并作为模板，采用2μL引物混合液(由164-180-F1、164-180-F2、164-180-F3、164-180-F4、164-180-F5和164-180-F6等摩尔比混合而成)和2μL引物混合液(由305-R1、305-R2和305-R3等摩尔比混合而成)进行PCR扩增，回收基因片段G1-G4连接产物。

4、以重组质粒pET24a-scDAOCS9为模板，基因片段G1-G4连接产物为引物进行PCR扩增，得到用于构建组合突变体库的第二轮PCR产物。

PCR扩增程序均为：98℃2min；98℃15s，60℃15s，72℃4min，30个循环；72℃10min。

5、向步骤4得到的第二轮PCR产物中加入1μLDpnI酶，37℃恒温条件下处理3h(用于消化质粒模板)，得到酶消化后的第二轮PCR产物。

6、将2μL酶消化后的第二轮PCR产物电转化大肠杆菌BL21(DE3)，之后将电转后的大肠杆菌BL21(DE3)菌液均匀的涂布在含50μg/mL卡那霉素的LB平板上，37℃恒温条件下培养14h后长出单菌落，即突变体库。

将平板上的所有单菌落刮下，送测序验证突变体库的多样性。

二、突变体库中scDAOCS9突变蛋白质的筛选

1、将重组质粒pET24a-scDAOCS9导入大肠杆菌BL21(DE3)，得到重组菌，命名为BL21(DE3)/pET24a-scDAOCS9(阳性对照菌)。将质粒pET-24a导入大肠杆菌BL21(DE3)，得到重组菌，命名为BL21(DE3)/pET24a(阴性对照菌)。

2、用无菌牙签分别挑取BL21(DE3)/pET24a的3个单菌落、BL21(DE3)/pET24a-scDAOCS9的3个单菌落和突变体库LB平板上长出的1296个单菌落，分别转接至装有300μL含50μg/mL卡那霉素的TB培养基的96孔深孔培养板，之后37℃、800rpm振荡培养12h，得到培养菌液。每孔取120μL培养菌液进行保菌。

3、完成步骤2后，分别向所述96孔深孔培养板每孔中加入800μLTB培养基，并加入卡那霉素和IPTG使其终浓度分别为50μg/mL和0.1mM，之后20℃、800rpm振荡培养12h，4℃、4000rpm离心10min，收集菌体。

4、完成步骤3后，分别用1000μLpH7.4、50mM的磷酸盐缓冲液洗涤菌体1次。

5、完成步骤4后，分别向所述菌体中加入DNaseI(Sigma-Aldrich公司的产品，产品目录号为DNaseI)和溶菌酶(Macklin/麦克林公司的产品，产品目录号为L914525-100g)，得到体系；体系中DNaseI的浓度为6U/mL，溶菌酶的浓度为1mg/mL。取所述体系，25℃振荡培养2h(目的为破碎细胞)，然后4℃、4000rpm离心30min，收集上清液。

6、完成步骤5后，分别制备反应体系。每个单菌落得到的上清液为一个体系。

每个反应体系由100μLpH7.4、50mM的磷酸盐缓冲液、200μL上清液、FeSO₄、α-酮戊二酸、L-抗坏血酸和6-APA(山东鲁抗医药股份有限公司的产品)组成。每个反应体系中，FeSO₄、α-酮戊二酸、L-抗坏血酸和6-APA的浓度依次为1.8mM、4mM、0.4mM和2.5mM。

7、分别取步骤6制备的反应体系，25℃反应5h，得到反应产物；之后HPLC检测反应产物中7-ADCA的产量。

6-APA和7-ADCA的HPLC检测条件：色谱柱：Cosmosil 5C18-MS-II 4.6ID×150mm；流动相：水相(pH7.4、50mM磷酸盐缓冲液)/甲醇＝98/2(体积比)；流速：1mL/min；检测波长：215nm检测7-ADCA的量，260nm检测6-APA的量。

采用7-ADCA标准品制备7-ADCA的标准曲线。结果如图2所示。

计算7-ADCA转化率。7-ADCA转化率＝100％×P/(2.5×10^-3M)，P为HPLC检测的7-ADCA的产量(g/L)，M为7-ADCA的摩尔质量(g/mol)。

上清液的7-ADCA转化率越高，则对应的单菌落表达的scDAOCS9突变蛋白质将6-APA转化为7-ADCA的效果越好。

筛选到的部分效果较好的scDAOCS9突变蛋白质及其7-ADCA转化率统计结果见表2。

表2

注：-表示无或不存在。

本发明选择蛋白质scDAOCS9和表2中的突变体蛋白14进行后续实验。

将突变体蛋白14命名为蛋白质DAOCS14SKL。

三、7-ADCA的人工合成途径

本发明提供的7-ADCA的人工合成途径如图3所示。具体如下：

1、以糖为碳源，通过酵母本身的代谢途径，得到L-α-氨基己二酸(L-AAA)、L-半胱氨酸(L-Cys)和L-缬氨酸(L-Val)。

2、以L-α-氨基己二酸、L-半胱氨酸和L-缬氨酸为前体，ACV三肽合成酶和磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶(npgA基因编码，为三肽合成酶的激活酶)负责将三个前体缩合成ACV(δ-L-α-aminoadipyl-L-cysteinyl-D-valine)。

进行该ACV异源合成需要在酿酒酵母(如酿酒酵母BY4741)胞内导入ACV三肽的异源合成基因。表达ACV三肽合成酶的重组质粒的制备及表达ACV三肽的重组菌的制备与专利文献(公开号为CN112852907A)中记载的方法完全一致。

3、ACV被异青霉素N合酶(即pcbC)催化环化合成异青霉素N(IPN)。

4、异青霉素N被酰基辅酶A:6-氨基青霉烷酸酰基转移酶(penDE)脱掉侧链合成6-APA。

5、6-APA被脱乙酰氧基头孢菌素C合成酶扩环合成7-ADCA。

实施例2、用于生产7-ADCA的重组酿酒酵母的制备

1、异青霉素N合酶编码基因的优化

本发明的发明人经过大量实验，将实施例1步骤三中3的异青霉素N合酶的编码基因优化为SEQ ID No：3或SEQ ID No：4所示的DNA分子，并用启动子PGK1p和终止子ADH1t表达异青霉素N合酶。启动子PGK1p和终止子ADH1t的序列与专利文献(公开号为CN112852907A)中记录的完全一致。

将顶头孢霉(Acremonium chrysogenum(Cephalosporium acremonium))的pcbC基因(genbank号为P05189，提交日为1987年8月13日)按照酿酒酵母进行密码子优化，获得SEQID No：3所示的DNA分子，命名为pcbCsc。

将黄杆菌(Flavobacterium sp.)的pcbC基因(genbank号为P16020，提交日为1990年4月1日)按照酿酒酵母进行密码子优化，获得SEQ ID No：4所示的DNA分子，命名为pcbCfc。

2、酰基辅酶A:6-氨基青霉烷酸酰基转移酶编码基因的优化

本发明的发明人经过大量实验，将实施例1步骤三中4的酰基辅酶A:6-氨基青霉烷酸酰基转移酶的编码基因优化为SEQ ID No：5或SEQ ID No：6所示的DNA分子，并用启动子GAL1p和终止子CYC1t表达酰基辅酶A:6-氨基青霉烷酸酰基转移酶，启动子GAL1p和终止子CYC1t的序列与专利文献(公开号为CN112852907A)中记录的完全一致。

将黄青霉(Penicillium chrysogenum)的penDE基因(genbank号为P15802，及提交日为1990年4月1日)编码的酶的羧基端三个氨基酸换成过氧化物酶体锚定序列SKL，之后将该基因按照酿酒酵母进行密码子优化，获得SEQ ID No：5所示的DNA分子，命名为penDEpc。

将构巢裸胞壳(Emericellanidulans)的penDE基因(genbank号为P21133，提交日为1991年5月1日)编码的酶的羧基端三个氨基酸换成过氧化物酶体锚定序列SKL，之后将该基因按照酿酒酵母进行密码子优化，获得SEQ ID No：6所示的DNA分子，命名为penDEen。

3、脱乙酰氧基头孢菌素C合成酶编码基因的优化

本发明的发明人经过大量实验，将实施例1步骤三中5的脱乙酰氧基头孢菌素C合成酶的编码基因优化为SEQ ID No：1所示的DNA分子，并用启动子GAL10p和终止子ADH1t表达脱乙酰氧基头孢菌素C合成酶，启动子GAL10p和终止子ADH1t的序列与专利文献(公开号为CN112852907A)中记录的完全一致。

将棒状链球菌(S.clavuligerus)的cefE基因(genbank号为P18548，提交日为1990年11月1日)按照酿酒酵母进行密码子优化，获得SEQ ID No：1所示的DNA分子，命名为cefEsc9。

4、重组质粒的构建

(1)以酿酒酵母BY4741的基因组为模板，采用PGK1P-F和PGK1P-R组成的引物对进行PCR扩增，得到752bp的基因片段PGK1P。基因片段PGK1P的核苷酸序列如序列SEQ ID No：7所示。以酿酒酵母BY4741的基因组为模板，采用ADH1T-F和ADH1T-R组成的引物对进行PCR扩增，得到160bp的基因片段ADH1T。基因片段ADH1T的核苷酸序列如序列SEQ ID No：8所示。以酿酒酵母BY4741的基因组为模板，采用GAL1，10P-F和GAL1，10P-R组成的引物对进行PCR扩增，得到665bp的基因片段GAL1-10P。基因片段GAL1-10P的核苷酸序列如序列SEQ ID No：9所示。以酿酒酵母BY4741的基因组为模板，采用CYC1T-F和CYC1T-R组成的引物对进行PCR扩增，得到190bp的基因片段CYC1T。基因片段CYC1T的核苷酸序列如序列SEQ ID No：10所示。

(2)以重组质粒pET24a-pcbCsc(将质粒pET-24a限制性内切酶NdeI和XhoI之间的DNA小片段替换为pcbCsc，其它步骤均不变，得到的重组质粒)为模板，采用pcbCsc-F和pcbCsc-R组成的引物对进行PCR扩增，得到1017bp基因片段pcbCsc。以重组质粒pET24a-pcbCfc(将质粒pET-24a限制性内切酶NdeI和XhoI之间的DNA小片段替换为pcbCfc，其它步骤均不变，得到的重组质粒)为模板，采用pcbCfc-F和pcbCfc-R组成的引物对进行PCR扩增，得到981bp的基因片段pcbCfc。以重组质粒pET24a-penDEpc(将质粒pET-24a限制性内切酶NdeI和XhoI之间的DNA小片段替换为penDEpc，其它步骤均不变，得到的重组质粒)为模板，采用penDEpc-F和penDEpc-R组成的引物对进行PCR扩增，得到1074bp的基因片段penDEpc。以重组质粒pET24a-penDEen(将质粒pET-24a限制性内切酶NdeI和XhoI之间的DNA小片段替换为penDEen，其它步骤均不变，得到的重组质粒)为模板，采用penDEen-F和penDEen-R组成的引物对进行PCR扩增，得到1074bp的基因片段penDEen。以重组质粒pET24a-cefEsc14(将质粒pET-24a限制性内切酶NdeI和XhoI之间的DNA小片段替换为cefEsc14(表2中突变体蛋白质14的编码基因，核苷酸序列如SEQ ID No.11所示)，其它步骤均不变，得到的重组质粒)为模板，采用cefEsc9-F和cefEsc9-R组成的引物对进行PCR扩增，得到936bp的基因片段cefEsc14。以重组质粒pET24a-cefEsc14(将质粒pET-24a限制性内切酶NdeI和XhoI之间的DNA小片段替换为cefEsc14，其它步骤均不变，得到的重组质粒)为模板，采用cefEsc9-F和cefEsc9SKL-R组成的引物对进行PCR扩增，得到936bp的基因片段cefEsc14SKL(通过将酶的羧基端末尾三个氨基酸替换为氨基酸序列SKL，SKL是过氧化物酶体锚定序列能够将表达的酶定位表达到过氧化物酶体中)。以重组质粒pET24a-cefEsc9(将质粒pET-24a限制性内切酶NdeI和XhoI之间的DNA小片段替换为cefEsc9，其它步骤均不变，得到的重组质粒)为模板，采用cefEsc9-F和cefEsc9-R组成的引物对进行PCR扩增，得到936bp的基因片段cefEsc9。以重组质粒pET24a-cefEsc9(将质粒pET-24a限制性内切酶NdeI和XhoI之间的DNA小片段替换为cefEsc9，其它步骤均不变，得到的重组质粒)为模板，采用cefEsc9-F和cefEsc9SKL-R组成的引物对进行PCR扩增，得到936bp的基因片段cefEsc9SKL(通过将酶的羧基端末尾三个氨基酸替换为氨基酸序列SKL，SKL是过氧化物酶体锚定序列能够将表达的酶定位表达到过氧化物酶体中)。以质粒pESC-G418(记载于公开号为CN112852907A的专利文献)为模板，采用G418-VECTOR-F和G418-VECTOR-R组成的引物对进行PCR扩增，得到6286bp的载体骨架G418-VECTOR。

反应程序为：96℃5分钟；96℃，15秒，55℃，15秒，30个循环；72℃10分钟。

(3)将基因片段PGK1P、基因片段pcbCsc和基因片段ADH1T通过重叠延伸的方法进行连接，获得片段PGK1P-pcbCsc-ADH1T。将基因片段PGK1P、基因片段pcbCfc和基因片段ADH1T通过重叠延伸的方法进行连接，获得片段PGK1P-pcbCfc-ADH1T。将基因片段CYC1T、基因片段penDEpc、基因片段GAL1-10P、基因片段cefEsc14和基因片段ADH1T通过重叠延伸的方法进行连接，获得片段CYC1T-penDEpc-GAL1-10P-cefEsc14-ADH1T。将基因片段CYC1T、基因片段penDEen、基因片段GAL1-10P、基因片段cefEsc14和基因片段ADH1T通过重叠延伸的方法进行连接，获得片段CYC1T-penDEen-GAL1-10P-cefEsc14-ADH1T。将基因片段CYC1T、基因片段penDEpc、基因片段GAL1-10P、基因片段cefEsc14SKL和基因片段ADH1T通过重叠延伸的方法进行连接，获得片段CYC1T-penDEpc-GAL1-10P-cefEsc14SKL-ADH1T。将基因片段CYC1T、基因片段penDEen、基因片段GAL1-10P、基因片段cefEsc14SKL和基因片段ADH1T通过重叠延伸的方法进行连接，获得片段CYC1T-penDEen-GAL1-10P-cefEsc14SKL-ADH1T。

重叠延伸的方法为：将基因片段和载体骨架G418-VECTOR混合进行吉布森组装(每个基因片段为500ng以上)，之后电转化酿酒酵母BY4741，将菌液均匀的涂布在含400ng/μLG418的YPD平板上，30℃培养至长出单菌落，通过对长出的单菌落中的质粒进行提取，测序正确后获得相应的质粒(吉布森组装将基因片段进行连接获得质粒)。

重叠延伸PCR采用的反应程序为：96℃15秒；50℃15秒，延伸72℃，时间根据片段长度设定，30个循环；72℃10分钟。

将上述基因片段通过重叠延伸和同源重组的方法进行连接后构建成携带7-ADCA下游合成途径的质粒，具体为如下：片段PGK1P-pcbCsc-ADH1T、片段CYC1T-penDEpc-GAL1-10P-cefEsc14-ADH1T和载体骨架G418-VECTOR构成重组质粒pADCA1，结构示意图如图4中A所示；片段PGK1P-pcbCsc-ADH1T、片段CYC1T-penDEen-GAL1-10P-cefEsc14-ADH1T和载体骨架G418-VECTOR构成重组质粒pADCA2，结构示意图如图4中B所示；片段PGK1P-pcbCsc-ADH1T、片段CYC1T-penDEpc-GAL1-10P-cefEsc14SKL-ADH1T和载体骨架G418-VECTOR构成重组质粒pADCA3，结构示意图如图中C所示；片段PGK1P-pcbCsc-ADH1T、片段CYC1T-penDEen-GAL1-10P-cefEsc14SKL-ADH1T和载体骨架G418-VECTOR构成重组质粒pADCA4，结构示意图如图4中D所示；片段PGK1P-pcbCfc-ADH1T、片段CYC1T-penDEpc-GAL1-10P-cefEsc14-ADH1T和载体骨架G418-VECTOR构成重组质粒pADCA5，结构示意图如图4中E所示；片段PGK1P-pcbCfc-ADH1T、片段CYC1T-penDEen-GAL1-10P-cefEsc14-ADH1T和载体骨架G418-VECTOR构成重组质粒pADCA6，结构示意图如图4中F所示；片段PGK1P-pcbCfc-ADH1T、片段CYC1T-penDEpc-GAL1-10P-cefEsc14SKL-ADH1T和载体骨架G418-VECTOR构成重组质粒pADCA7，结构示意图如图4中G所示；片段PGK1P-pcbCfc-ADH1T、片段CYC1T-penDEen-GAL1-10P-cefEsc14SKL-ADH1T和载体骨架G418-VECTOR构成重组质粒pADCA8，结构示意图如图4中H所示；片段PGK1P-pcbCsc-ADH1T、片段CYC1T-penDEen-GAL1-10P-cefEsc9-ADH1T和载体骨架G418-VECTOR构成重组质粒pADCA10，结构示意图如图4中I所示；片段PGK1P-pcbCsc-ADH1T、片段CYC1T-penDEen-GAL1-10P-cefEsc9SKL-ADH1T和载体骨架G418-VECTOR构成重组质粒pADCA12，结构示意图如图4中J所示。

5、重组酿酒酵母的获得

将重组质粒pADCA1和pESC-Hyg-SmABA(记载于公开号为CN112852907A的专利文献)共转化至酿酒酵母BY4741，得到重组酿酒酵母DM202。

按照上述方法，将重组质粒pADCA1分别替换为重组质粒pADCA2、重组质粒pADCA3、重组质粒pADCA4、重组质粒pADCA5、重组质粒pADCA6、重组质粒pADCA7、重组质粒pADCA8、重组质粒pADCA10和重组质粒pADCA12，其它步骤均不变，依次得到重组酿酒酵母DM203、DM204、DM205、DM206、DM207、DM208、DM209、DM280和DM282。

具体步骤如下：

(1)制备酿酒酵母BY4741感受态

将酿酒酵母BY4741在YPD平板上画线，置于30℃下培养直至长出单菌落；将单菌落接种至装有40mL YPD液体培养基的锥形瓶中，30℃、170rpm培养36h，得到菌液；将菌液按照菌液与YPD液体培养基的体积比为1：50的比例接种至装有50mL YPD液体培养基锥形瓶中，30℃、170rpm培养直至菌液的OD_600nm为0.6；之后将菌液转移到50mL的离心管中，4℃、5000rpm离心5min，弃上清液；用25mL冰冷的无菌水重悬沉淀，离心，弃上清液；再次用25mL冰冷的无菌水重悬沉淀，离心，弃上清液；用2mL冰冷的1M的山梨醇重悬沉淀，离心，弃上清液；用250μL冰冷的1M的山梨醇重悬沉淀，每管50μL进行分装，得到酿酒酵母BY4741感受态。

(2)重组酿酒酵母的获得

将重组质粒pADCA(重组质粒pADCA1、重组质粒pADCA2、重组质粒pADCA3、重组质粒pADCA4、重组质粒pADCA5、重组质粒pADCA6、重组质粒pADCA7、重组质粒pADCA8、重组质粒pADCA10或重组质粒pADCA12)和pESC-Hyg-SmABA等摩尔比混合，质粒的量为500ng以上，得到双质粒溶液。将5μL双质粒溶液与50μL酿酒酵母BY4741感受态混合，转入0.2cm冰预冷的电极杯中冰浴5min；在电压1.5KV、电容25uF、电阻为200Ω、电击时间5ms的条件下电转化；电击后立刻加入1mLYPD液体培养基，30℃孵育1h；5000rpm离心5min，去除上清液，加入100μL的1M的山梨醇重悬细胞，全部涂布于含有G418和Hyg双抗性的YPD平板上，30℃培养48h以上待长出单菌落。

重组酿酒酵母DM202为使酿酒酵母BY4741表达如下基因：pcbCsc、penDEpc、cefEsc14、Symbiodinium microadriaticum来源的pcbAB(记载于公开号为CN112852907A的专利文献)和Aspergillus nidulans来源的npgA(记载于公开号为CN112852907A的专利文献)且这些基因均以质粒的形式存在。重组酿酒酵母DM203为使酿酒酵母BY4741表达如下基因：pcbCsc、penDEen、cefEsc14、Symbiodinium microadriaticum来源的pcbAB和Aspergillus nidulans来源的npgA且这些基因均以质粒的形式存在。重组酿酒酵母DM204为使酿酒酵母BY4741表达如下基因：pcbCsc、penDEpc、cefEsc14skl、Symbiodiniummicroadriaticum来源的pcbAB和Aspergillus nidulans来源的npgA且这些基因均以质粒的形式存在。重组酿酒酵母DM205为使酿酒酵母BY4741表达如下基因：pcbCsc、penDEen、cefEsc14skl、Symbiodinium microadriaticum来源的pcbAB和Aspergillus nidulans来源的npgA且这些基因均以质粒的形式存在。重组酿酒酵母DM206为使酿酒酵母BY4741表达如下基因：pcbCfc、penDEpc、cefEsc14、Symbiodinium microadriaticum来源的pcbAB和Aspergillus nidulans来源的npgA且这些基因均以质粒的形式存在。重组酿酒酵母DM207为使酿酒酵母BY4741表达如下基因：pcbCfc、penDEen、cefEsc14、Symbiodiniummicroadriaticum来源的pcbAB和Aspergillus nidulans来源的npgA且这些基因均以质粒的形式存在。重组酿酒酵母DM208为使酿酒酵母BY4741表达如下基因：pcbCfc、penDEpc、cefEsc14skl、Symbiodinium microadriaticum来源的pcbAB和Aspergillus nidulans来源的npgA且这些基因均以质粒的形式存在。重组酿酒酵母DM209为使酿酒酵母BY4741表达如下基因：pcbCfc、penDEen、cefEsc14skl、Symbiodinium microadriaticum来源的pcbAB和Aspergillus nidulans来源的npgA且这些基因均以质粒的形式存在。重组酿酒酵母DM280为使酿酒酵母BY4741表达如下基因：pcbCsc(核苷酸序列如SEQ ID No：3所示，编码氨基酸序列如SEQ ID No：13所示的蛋白质)、penDEen(核苷酸序列如SEQ ID No：6所示，编码氨基酸序列如SEQ ID No：14所示的蛋白质)、cefEsc9(核苷酸序列如SEQ ID No：1所示)、Symbiodinium microadriaticum来源的pcbAB和Aspergillus nidulans来源的npgA。重组酿酒酵母DM282为使酿酒酵母BY4741表达如下基因：pcbCsc、penDEen、cefEsc9skl(核苷酸序列如SEQ ID No.12所示，编码氨基酸序列如SEQ ID No：15所示的蛋白质)、Symbiodiniummicroadriaticum来源的pcbAB和Aspergillus nidulans来源的npgA。

实施例3、重组酿酒酵母DM209在生产7-ADCA中的应用

1、将重组酿酒酵母(重组酿酒酵母DM202、重组酿酒酵母DM203、重组酿酒酵母DM204、重组酿酒酵母DM205、重组酿酒酵母DM206、重组酿酒酵母DM207、重组酿酒酵母DM208或重组酿酒酵母DM209)均匀涂布含200ng/μL潮霉素和200ng/μLG418的YPD平板上，30℃恒温培养24h后，将长出的单菌落转接到装有5mL含200ng/μL潮霉素和200ng/μLG418的YPD液体培养基，30℃、220rpm培养24h，得到菌液；之后将菌液按照体积比1：100的比例分别转接至50mL含200ng/μL潮霉素和200ng/μLG418的YYPD液体培养基，25℃、220rpm发酵培养9天，得到发酵液。

2、分别取两份4mL的发酵液，4000rpm离心5min后分别收集发酵上清液和菌体。分别将菌体用4mL无菌水重悬后，4000rpm离心5min，弃上清液。将一份菌泥烘干后称重，即为细胞干重；另一份菌泥用200μL的无菌水重悬后置于1.5mL的EP管中，加入与菌泥等体积的玻璃珠(北京普益华科技有限公司的产品，产品目录号为G8080-10G)，将EP管置于迷你混合仪(杭州米欧仪器有限公司的产品，货号为MIX-25P)中，破碎10min(最大转速震荡破碎30s，快速转移冰上冰浴30s，进行10个重复)，4000rpm离心5min，收集菌体破碎后上清液。

3、将发酵上清液和菌体破碎后上清液分别用LC-MS(高效液相与质谱联用技术)检测。以7-ADCA为标准品，标准品的保留时间为2.5-4.5min。

发酵上清液LC-MS的检测结果表明，发酵培养重组酿酒酵母后，发酵上清液中未能检测到7-ADCA。

菌体破碎后上清液LC-MS的检测结果见图5中A。结果表明，只有重组酿酒酵母DM209的菌体破碎后上清液中检测到了7-ADCA。

4、采用7-ADCA标准品制备7-ADCA标准曲线，结果如图2所示。按下述公式计算重组酿酒酵母DM209的菌体破碎后上清液中7-ADCA产量。

P＝Y×0.2×10^-3÷M

P(μg/gDCW)为重组酿酒酵母DM209的菌体破碎后上清液中7-ADCA产量，用标准曲线计算重组酿酒酵母DM209的菌体破碎后上清液中7-ADCA的浓度为Y(g/L)，4mL酿酒酵母发酵液中菌体的干重为M(g)。

检测结果见图5中B和图6(左图为7-ADCA标品，即7-ADCA标准品)。结果表明，重组酿酒酵母DM209的菌体破碎后上清液中7-ADCA的产量达到11.86μg/g(ug为7-ADCA的量；g表示细胞干重)。

实施例4、重组酿酒酵母DM280和重组酿酒酵母DM282在提高7-ADCA产量中的应用

按照实施例3的步骤，将重组酿酒酵母替换为重组酿酒酵母DM280或重组酿酒酵母DM282，其它步骤均不变。

部分检测结果见图5中B和图6(左图为7-ADCA标品，即7-ADCA标准品)。

重组酿酒酵母DM280的菌体破碎后上清液中7-ADCA的产量达到1.77mg/g(mg为7-ADCA的量；g表示细胞干重)。重组酿酒酵母DM282的菌体破碎后上清液中7-ADCA的产量达到2.28mg/g(mg为7-ADCA的量；g表示细胞干重)。

上述结果表明，将酰基辅酶A:6-氨基青霉烷酸酰基转移酶和脱乙酰氧基头孢菌素C合成酶共定位到过氧化物酶体中能够显著的提高人工途径的合成7-ADCA效率。相较于重组酿酒酵母DM209，重组酿酒酵母DM280的7-ADCA的产量提高了149.24倍，重组酿酒酵母DM282的7-ADCA的产量提高了192.24倍。

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

<110> 中国科学院天津工业生物技术研究所

<120> 一种生产7-氨基去乙酰氧基头孢烷酸的方法

<160> 15

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 936

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 1

atggatacca ccgtgccgac ctttagtctg gcagaactgc agcagggtct gcatcaggat 60

gaatttcgcc gttgcctgcg cgataaaggt ctgttttatc tgaccgattg tggtctgacc 120

gataccgaac tgaaaagtgc caaagatttg gttattgatt tctttgaaca cggtagcgaa 180

gaagaaaaac gcgccgtgac cagtccggtg ccgaccacac gccgcggttt taccggtctg 240

gaaagcgaaa gtaccgcaca gattaccaat accggtagct atagtgatta tagtatgtgt 300

tatagcatgg gtacagccga taatctgttt ccgagcggcg attttgaacg catttggacc 360

cagtattttg atcgtcagta taccgcaagt cgcgcagttg cacgcgaagt gctgcgcgca 420

accggcaccg aaccggatgg tggtgtggaa gcatttctgg attatgaacc gctgctgcgt 480

tttcgttatt ttccgcaggt gccggaacat cgtagtgccg aagaacagcc gctgcgcatg 540

gcaccgcatc atgatctgag catggtgacc ctgattcagc agaccccgtg cgcaaatggc 600

tttgttagtc tgcaggccga agttggcggc gcctttgttg atctgccgta tcgtccggat 660

gcagtgctgg ttctgtgtgg tgccattgcc accctggtga ccggcggcca ggttaaagca 720

ccgcgtcatc atgtggcagc accgcgtcgt gatcagattg ccggtagtag ccgtaccagc 780

agcgttttct ttctgcgccc gaatgcagat tttaccttta gcattccgct ggcacgtgaa 840

tatggttttg atgttagcct ggatggtgaa accgccacct ttcaggattg gattggcggc 900

aattatgtta atatgcgccg caccagcaaa gcctaa 936

<210> 2

<211> 311

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<400> 2

Met Asp Thr Thr Val Pro Thr Phe Ser Leu Ala Glu Leu Gln Gln Gly

1 5 10 15

Leu His Gln Asp Glu Phe Arg Arg Cys Leu Arg Asp Lys Gly Leu Phe

20 25 30

Tyr Leu Thr Asp Cys Gly Leu Thr Asp Thr Glu Leu Lys Ser Ala Lys

35 40 45

Asp Leu Val Ile Asp Phe Phe Glu His Gly Ser Glu Glu Glu Lys Arg

50 55 60

Ala Val Thr Ser Pro Val Pro Thr Thr Arg Arg Gly Phe Thr Gly Leu

65 70 75 80

Glu Ser Glu Ser Thr Ala Gln Ile Thr Asn Thr Gly Ser Tyr Ser Asp

85 90 95

Tyr Ser Met Cys Tyr Ser Met Gly Thr Ala Asp Asn Leu Phe Pro Ser

100 105 110

Gly Asp Phe Glu Arg Ile Trp Thr Gln Tyr Phe Asp Arg Gln Tyr Thr

115 120 125

Ala Ser Arg Ala Val Ala Arg Glu Val Leu Arg Ala Thr Gly Thr Glu

130 135 140

Pro Asp Gly Gly Val Glu Ala Phe Leu Asp Tyr Glu Pro Leu Leu Arg

145 150 155 160

Phe Arg Tyr Phe Pro Gln Val Pro Glu His Arg Ser Ala Glu Glu Gln

165 170 175

Pro Leu Arg Met Ala Pro His His Asp Leu Ser Met Val Thr Leu Ile

180 185 190

Gln Gln Thr Pro Cys Ala Asn Gly Phe Val Ser Leu Gln Ala Glu Val

195 200 205

Gly Gly Ala Phe Val Asp Leu Pro Tyr Arg Pro Asp Ala Val Leu Val

210 215 220

Leu Cys Gly Ala Ile Ala Thr Leu Val Thr Gly Gly Gln Val Lys Ala

225 230 235 240

Pro Arg His His Val Ala Ala Pro Arg Arg Asp Gln Ile Ala Gly Ser

245 250 255

Ser Arg Thr Ser Ser Val Phe Phe Leu Arg Pro Asn Ala Asp Phe Thr

260 265 270

Phe Ser Ile Pro Leu Ala Arg Glu Tyr Gly Phe Asp Val Ser Leu Asp

275 280 285

Gly Glu Thr Ala Thr Phe Gln Asp Trp Ile Gly Gly Asn Tyr Val Asn

290 295 300

Met Arg Arg Thr Ser Lys Ala

305 310

<210> 3

<211> 1017

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 3

atgggttctg ttccagttcc agttgctaat gttccaagaa ttgatgtctc tcctttgttc 60

ggtgatgaca aagaaaagaa gttggaagtt gctagagcta ttgatgctgc ttctagagat 120

actggttttt tctacgctgt taaccacggt gttgatttgc catggttgtc tagagaaact 180

aacaagttcc atatgtccat caccgatgaa gaaaaatggc aattggctat tagggcctac 240

aacaaagaac acgaatctca aattagagcc ggttactatt tgccaattcc aggtaaaaaa 300

gccgtcgaat ctttctgtta cttgaaccca tctttctcac cagatcaccc aagaatcaaa 360

gaacctactc caatgcatga agttaacgtt tggccagatg aagctaaaca tccaggtttt 420

agagctttcg ctgaaaagta ttactgggac gtttttggtt tgtcctctgc tgttttgaga 480

ggttatgctt tggctttggg tagagatgaa gatttcttca ccagacattc tagaagggat 540

acaaccttgt catccgttgt tttgattaga tacccatact tggacccata tccagaacca 600

gctattaaga ctgctgatga tggtactaag ttgtcctttg aatggcacga agatgtttct 660

ttgatcaccg tcttgtacca atccgatgtt caaaacttac aagtcaagac tccacaaggt 720

tggcaagata ttcaagctga tgatacaggt ttcttgatca actgtggttc ttacatggct 780

cacattaccg atgattatta cccagctcca atccatagag ttaagtgggt taatgaagaa 840

aggcagtctt tgccattctt cgttaactta ggatgggaag atacaatcca accatgggat 900

ccagctactg ctaaagatgg tgcaaaagat gcagctaaag ataagccagc tatttcctat 960

ggtgaatact tgcaaggtgg tctaagaggt ttgattaaca agaacggtca gacttga 1017

<210> 4

<211> 981

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 4

atgaacagac atgccgatgt tccagttatt gatatctctg gtttgtccgg taatgatatg 60

gatgtcaaga aagatattgc cgccagaatt gatagagctt gtagaggttc tggttttttc 120

tacgctgcta atcatggtgt tgatttggct gcattgcaaa agtttactac cgattggcat 180

atggctatgt ctgctgaaga aaaatgggaa ttagctatca gagcttacaa tccagctaac 240

ccaagaaata gaaacggtta ctatatggcc gtcgaaggta aaaaggctaa cgaatctttt 300

tgctacttga acccatcttt cgatgctgat catgctacta ttaaggctgg tttgccatct 360

catgaagtta acatttggcc agatgaagct agacatccag gtatgagaag attttacgaa 420

gcctacttct ccgatgtttt tgatgttgct gctgttatct tgagaggttt cgctattgct 480

ttgggtagag aagaaagctt cttcgaaaga cacttctcta tggatgatac cttgtctgcc 540

gtttccttga ttagataccc attcttggaa aactacccac cattgaaatt gggtccagat 600

ggtgaaaagt tgtccttcga acatcatcaa gacgtttctt tgatcaccgt cttgtaccaa 660

actgctattc caaacttaca agttgaaacc gctgaaggtt acttggatat tccagtttct 720

gatgaacact tcttggttaa ctgtggtact tacatggctc atattaccaa tggttattac 780

ccagctccag ttcacagagt taagtacatt aacgctgaaa ggttgagcat tccattcttc 840

gctaatttgt ctcatgcttc cgctattgat ccatttgctc caccaccata cgctccacca 900

ggtggtaatc caactgtttc ttatggtgat tacttgcagc atggtttgtt ggatttgatt 960

agagctaacg gtcagacttg a 981

<210> 5

<211> 1074

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 5

atgttgcaca ttttgtgcca aggtactcca ttcgaaattg gttatgaaca tggttctgct 60

gctaaggctg ttattgctag atctattgat ttcgccgttg acttgattag aggcaagact 120

aagaaaaccg acgaagaatt gaagcaagtc ttgtctcaat tgggtagagt cattgaagaa 180

agatggccaa agtactacga agaaattaga ggtattgcta agggtgccga aagagatgtt 240

tctgaaatag ttatgttgaa caccagaacc gaattcgctt atggtttgaa agctgctaga 300

gatggttgta ctactgctta ttgtcaattg ccaaatggtg cattgcaagg tcaaaattgg 360

gattttttca gcgccaccaa agaaaacttg atcagattga ctattagaca ggctggtttg 420

ccaaccatta agttcattac tgaagccggt attatcggta aggttggttt taattctgct 480

ggtgttgctg ttaattacaa cgcattgcac ttacaaggtt taagaccaac tggtgttcca 540

tctcatattg ctttgagaat tgccttggaa tctacctctc catctcaagc ttatgataga 600

atcgttgaac aaggtggtat ggctgcttct gctttcatta tggttggtaa tggtcatgaa 660

gctttcggtt tggaattttc cccaacctct attagaaagc aagttttgga tgctaacggt 720

agaatggttc ataccaatca ttgcttgttg cagcatggta agaacgaaaa agaattggat 780

ccattgccag actcttggaa cagacatcaa agaatggaat tcttgttgga tggtttcgac 840

ggtactaagc aagcttttgc tcaattatgg gctgacgaag ataattaccc attctctatc 900

tgtagggctt acgaagaggg taaatctaga ggtgctactc tgtttaacat catctacgat 960

catgctagaa gagaagccac tgttagatta ggtagaccaa ctaatccaga cgaaatgttc 1020

gttatgaggt ttgatgaaga ggacgaaaga tctgctttga actccaagtt gtga 1074

<210> 6

<211> 1074

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 6

atgttgcatg ttacctgtca aggtactcca tctgaaattg gttatcatca tggttctgct 60

gccaaaggtg aaattgctaa ggctattgat tttgccaccg gtttgattca tggtaagact 120

aagaaaaccc aagccgaatt ggaacagttg ttgagagaat tagaacaggt catgaagcaa 180

agatggccaa ggtattacga agaaatttgc ggtattgcta aaggtgccga aagagaagtt 240

tctgaaatcg ttatgttgaa caccagaacc gaatttgctt acggtttggt tgaagctaga 300

gatggttgta ctactgttta ctgtaagact ccaaatggtg cattgcaagg tcaaaattgg 360

gattttttca ccgccaccaa agaaaacttg atccaattga ctatttgcca gccaggtttg 420

ccaaccatta agatgattac tgaagccggt attatcggta aggttggttt taattctgct 480

ggtgttgctg ttaattacaa cgcattgcac ttgcatggtt taagaccaac tggtttgcca 540

tctcatttgg ctttgagaat ggctttggaa tctacttcac catctgaagc ttacgagaag 600

atagtttctc aaggtggtat ggctgcttct gctttcatta tggttggtaa tgctcatgaa 660

gcctacggct tggaattttc tccaatttct ttgtgcaaac aagttgccga taccaacggt 720

agaatcgttc atacaaatca ctgcttgttg aaccatggtc catctgctca agaattgaat 780

ccattgccag attcttggtc tagacatggt agaatggaac acttgttatc tggtttcgac 840

ggtacaaaag aggcttttgc taaattgtgg gaagatgagg ataactaccc attgtctata 900

tgcagagctt acaaagaagg taagagcaga ggttctacct tgtttaacat cgttttcgat 960

cacgttggta gaaaggctac tgttagattg ggtagaccaa acaatccaga cgaaactttc 1020

gttatgacct tctctaattt ggataccaag tccgctattc aatccaagtt gtga 1074

<210> 7

<211> 752

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 7

acgcacagat attataacat ctgcacaata ggcatttgca agaattactc gtgagtaagg 60

aaagagtgag gaactatcgc atacctgcat ttaaagatgc cgatttgggc gcgaatcctt 120

tattttggct tcaccctcat actattatca gggccagaaa aaggaagtgt ttccctcctt 180

cttgaattga tgttaccctc ataaagcacg tggcctctta tcgagaaaga aattaccgtc 240

gctcgtgatt tgtttgcaaa aagaacaaaa ctgaaaaaac ccagacacgc tcgacttcct 300

gtcttcctat tgattgcagc ttccaatttc gtcacacaac aaggtcctag cgacggctca 360

caggttttgt aacaagcaat cgaaggttct ggaatggcgg gaaagggttt agtaccacat 420

gctatgatgc ccactgtgat ctccagagca aagttcgttc gatcgtactg ttactctctc 480

tctttcaaac agaattgtcc gaatcgtgtg acaacaacag cctgttctca cacactcttt 540

tcttctaacc aagggggtgg tttagtttag tagaacctcg tgaaacttac atttacatat 600

atataaactt gcataaattg gtcaatgcaa gaaatacata tttggtcttt tctaattcgt 660

agtttttcaa gttcttagat gctttctttt tctctttttt acagatcatc aaggaagtaa 720

ttatctactt tttacaacaa atataaaaca ca 752

<210> 8

<211> 160

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 8

agttataaaa aaaataagtg tatacaaatt ttaaagtgac tcttaggttt taaaacgaaa 60

attcttattc ttgagtaact ctttcctgta ggtcaggttg ctttctcagg tatagcatga 120

ggtcgctctt attgaccaca cctctaccgg catgccgaga 160

<210> 9

<211> 665

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 9

gttttttctc cttgacgtta aagtatagag gtatattaac aattttttgt tgatactttt 60

attacatttg aataagaagt aatacaaacc gaaaatgttg aaagtattag ttaaagtggt 120

tatgcagttt ttgcatttat atatctgtta atagatcaaa aatcatcgct tcgctgatta 180

attaccccag aaataaggct aaaaaactaa tcgcattatc atcctatggt tgttaatttg 240

attcgttcat ttgaaggttt gtggggccag gttactgcca atttttcctc ttcataacca 300

taaaagctag tattgtagaa tctttattgt tcggagcagt gcggcgcgag gcacatctgc 360

gtttcaggaa cgcgaccggt gaagacgagg acgcacggag gagagtcttc cttcggaggg 420

ctgtcacccg ctcggcggct tctaatccgt acttcaatat agcaatgagc agttaagcgt 480

attactgaaa gttccaaaga gaaggttttt ttaggctaag ataatggggc tctttacatt 540

tccacaacat ataagtaaga ttagatatgg atatgtatat ggatatgtat atggtggtaa 600

tgccatgtaa tatgattatt aaacttcttt gcgtccatcc aaaaaaaaag taagaatttt 660

tgaaa 665

<210> 10

<211> 190

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 10

cttcgagcgt cccaaaacct tctcaagcaa ggttttcagt ataatgttac atgcgtacac 60

gcgtctgtac agaaaaaaaa gaaaaatttg aaatataaat aacgttctta atactaacat 120

aactataaaa aaataaatag ggacctagac ttcaggttgt ctaactcctt ccttttcggt 180

tagagcggat 190

<210> 11

<211> 936

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 11

atggatacca ccgtgccgac ctttagtctg gcagaactgc agcagggtct gcatcaggat 60

gaatttcgcc gttgcctgcg cgataaaggt ctgttttatc tgaccgattg tggtctgacc 120

gataccgaac tgaaaagtgc caaagatttg gttattgatt tctttgaaca cggtagcgaa 180

gaagaaaaac gcgccgtgac cagtccggtg ccgaccacac gccgcggttt taccggtctg 240

gaaagcgaaa gtaccgcaca gattaccaat accggtagct atagtgatta tagtatgtgt 300

tatagcatgg gtacagccga taatctgttt ccgagcggcg attttgaacg catttggacc 360

cagtattttg atcgtcagta taccgcaagt cgcgcagttg cacgcgaagt gctgcgcgca 420

accggcaccg aaccggatgg tggtgtggaa gcatttctgg attatgaacc gctgctgcgt 480

tttcgttatt cgccgcaggt gccggaacat cgtagtgccg aagaacagcc gctgcgcgaa 540

gcaccgcatc atgatctgag catggtgacc ctggtgcagc agaccccgtg cgcaaatggc 600

tttgttagtc tgcaggccga agttggcggc gcctttgttg atctgccgta tcgtccggat 660

gcagtgctgg ttatttgtgg tgccattgcc accctggtga ccggcggcca ggttaaagca 720

ccgcgtcatc atcgtgcagc accgcgtcgt gatcagattg ccggtagtag ctccaccagc 780

agcgttttct ttctgcgccc gaatgcagat tttaccttta gcattccgct ggcacgtgaa 840

tatggttttg atgttagcct ggatggtgaa accgccacct ttcaggattg gattggcggc 900

aattatgtta atgaacgccg caccagcaaa gcctaa 936

<210> 12

<211> 936

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 12

atggatacca ccgtgccgac ctttagtctg gcagaactgc agcagggtct gcatcaggat 60

gaatttcgcc gttgcctgcg cgataaaggt ctgttttatc tgaccgattg tggtctgacc 120

gataccgaac tgaaaagtgc caaagatttg gttattgatt tctttgaaca cggtagcgaa 180

gaagaaaaac gcgccgtgac cagtccggtg ccgaccacac gccgcggttt taccggtctg 240

gaaagcgaaa gtaccgcaca gattaccaat accggtagct atagtgatta tagtatgtgt 300

tatagcatgg gtacagccga taatctgttt ccgagcggcg attttgaacg catttggacc 360

cagtattttg atcgtcagta taccgcaagt cgcgcagttg cacgcgaagt gctgcgcgca 420

accggcaccg aaccggatgg tggtgtggaa gcatttctgg attatgaacc gctgctgcgt 480

tttcgttatt ttccgcaggt gccggaacat cgtagtgccg aagaacagcc gctgcgcatg 540

gcaccgcatc atgatctgag catggtgacc ctgattcagc agaccccgtg cgcaaatggc 600

tttgttagtc tgcaggccga agttggcggc gcctttgttg atctgccgta tcgtccggat 660

gcagtgctgg ttctgtgtgg tgccattgcc accctggtga ccggcggcca ggttaaagca 720

ccgcgtcatc atgtggcagc accgcgtcgt gatcagattg ccggtagtag ccgtaccagc 780

agcgttttct ttctgcgccc gaatgcagat tttaccttta gcattccgct ggcacgtgaa 840

tatggttttg atgttagcct ggatggtgaa accgccacct ttcaggattg gattggcggc 900

aattatgtta atatgcgccg cacctccaag ttgtaa 936

<210> 13

<211> 338

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<400> 13

Met Gly Ser Val Pro Val Pro Val Ala Asn Val Pro Arg Ile Asp Val

1 5 10 15

Ser Pro Leu Phe Gly Asp Asp Lys Glu Lys Lys Leu Glu Val Ala Arg

20 25 30

Ala Ile Asp Ala Ala Ser Arg Asp Thr Gly Phe Phe Tyr Ala Val Asn

35 40 45

His Gly Val Asp Leu Pro Trp Leu Ser Arg Glu Thr Asn Lys Phe His

50 55 60

Met Ser Ile Thr Asp Glu Glu Lys Trp Gln Leu Ala Ile Arg Ala Tyr

65 70 75 80

Asn Lys Glu His Glu Ser Gln Ile Arg Ala Gly Tyr Tyr Leu Pro Ile

85 90 95

Pro Gly Lys Lys Ala Val Glu Ser Phe Cys Tyr Leu Asn Pro Ser Phe

100 105 110

Ser Pro Asp His Pro Arg Ile Lys Glu Pro Thr Pro Met His Glu Val

115 120 125

Asn Val Trp Pro Asp Glu Ala Lys His Pro Gly Phe Arg Ala Phe Ala

130 135 140

Glu Lys Tyr Tyr Trp Asp Val Phe Gly Leu Ser Ser Ala Val Leu Arg

145 150 155 160

Gly Tyr Ala Leu Ala Leu Gly Arg Asp Glu Asp Phe Phe Thr Arg His

165 170 175

Ser Arg Arg Asp Thr Thr Leu Ser Ser Val Val Leu Ile Arg Tyr Pro

180 185 190

Tyr Leu Asp Pro Tyr Pro Glu Pro Ala Ile Lys Thr Ala Asp Asp Gly

195 200 205

Thr Lys Leu Ser Phe Glu Trp His Glu Asp Val Ser Leu Ile Thr Val

210 215 220

Leu Tyr Gln Ser Asp Val Gln Asn Leu Gln Val Lys Thr Pro Gln Gly

225 230 235 240

Trp Gln Asp Ile Gln Ala Asp Asp Thr Gly Phe Leu Ile Asn Cys Gly

245 250 255

Ser Tyr Met Ala His Ile Thr Asp Asp Tyr Tyr Pro Ala Pro Ile His

260 265 270

Arg Val Lys Trp Val Asn Glu Glu Arg Gln Ser Leu Pro Phe Phe Val

275 280 285

Asn Leu Gly Trp Glu Asp Thr Ile Gln Pro Trp Asp Pro Ala Thr Ala

290 295 300

Lys Asp Gly Ala Lys Asp Ala Ala Lys Asp Lys Pro Ala Ile Ser Tyr

305 310 315 320

Gly Glu Tyr Leu Gln Gly Gly Leu Arg Gly Leu Ile Asn Lys Asn Gly

325 330 335

Gln Thr

<210> 14

<211> 357

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<400> 14

Met Leu His Val Thr Cys Gln Gly Thr Pro Ser Glu Ile Gly Tyr His

1 5 10 15

His Gly Ser Ala Ala Lys Gly Glu Ile Ala Lys Ala Ile Asp Phe Ala

20 25 30

Thr Gly Leu Ile His Gly Lys Thr Lys Lys Thr Gln Ala Glu Leu Glu

35 40 45

Gln Leu Leu Arg Glu Leu Glu Gln Val Met Lys Gln Arg Trp Pro Arg

50 55 60

Tyr Tyr Glu Glu Ile Cys Gly Ile Ala Lys Gly Ala Glu Arg Glu Val

65 70 75 80

Ser Glu Ile Val Met Leu Asn Thr Arg Thr Glu Phe Ala Tyr Gly Leu

85 90 95

Val Glu Ala Arg Asp Gly Cys Thr Thr Val Tyr Cys Lys Thr Pro Asn

100 105 110

Gly Ala Leu Gln Gly Gln Asn Trp Asp Phe Phe Thr Ala Thr Lys Glu

115 120 125

Asn Leu Ile Gln Leu Thr Ile Cys Gln Pro Gly Leu Pro Thr Ile Lys

130 135 140

Met Ile Thr Glu Ala Gly Ile Ile Gly Lys Val Gly Phe Asn Ser Ala

145 150 155 160

Gly Val Ala Val Asn Tyr Asn Ala Leu His Leu His Gly Leu Arg Pro

165 170 175

Thr Gly Leu Pro Ser His Leu Ala Leu Arg Met Ala Leu Glu Ser Thr

180 185 190

Ser Pro Ser Glu Ala Tyr Glu Lys Ile Val Ser Gln Gly Gly Met Ala

195 200 205

Ala Ser Ala Phe Ile Met Val Gly Asn Ala His Glu Ala Tyr Gly Leu

210 215 220

Glu Phe Ser Pro Ile Ser Leu Cys Lys Gln Val Ala Asp Thr Asn Gly

225 230 235 240

Arg Ile Val His Thr Asn His Cys Leu Leu Asn His Gly Pro Ser Ala

245 250 255

Gln Glu Leu Asn Pro Leu Pro Asp Ser Trp Ser Arg His Gly Arg Met

260 265 270

Glu His Leu Leu Ser Gly Phe Asp Gly Thr Lys Glu Ala Phe Ala Lys

275 280 285

Leu Trp Glu Asp Glu Asp Asn Tyr Pro Leu Ser Ile Cys Arg Ala Tyr

290 295 300

Lys Glu Gly Lys Ser Arg Gly Ser Thr Leu Phe Asn Ile Val Phe Asp

305 310 315 320

His Val Gly Arg Lys Ala Thr Val Arg Leu Gly Arg Pro Asn Asn Pro

325 330 335

Asp Glu Thr Phe Val Met Thr Phe Ser Asn Leu Asp Thr Lys Ser Ala

340 345 350

Ile Gln Ser Lys Leu

355

<210> 15

<211> 311

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<400> 15

Met Asp Thr Thr Val Pro Thr Phe Ser Leu Ala Glu Leu Gln Gln Gly

1 5 10 15

Leu His Gln Asp Glu Phe Arg Arg Cys Leu Arg Asp Lys Gly Leu Phe

20 25 30

Tyr Leu Thr Asp Cys Gly Leu Thr Asp Thr Glu Leu Lys Ser Ala Lys

35 40 45

Asp Leu Val Ile Asp Phe Phe Glu His Gly Ser Glu Glu Glu Lys Arg

50 55 60

Ala Val Thr Ser Pro Val Pro Thr Thr Arg Arg Gly Phe Thr Gly Leu

65 70 75 80

Glu Ser Glu Ser Thr Ala Gln Ile Thr Asn Thr Gly Ser Tyr Ser Asp

85 90 95

Tyr Ser Met Cys Tyr Ser Met Gly Thr Ala Asp Asn Leu Phe Pro Ser

100 105 110

Gly Asp Phe Glu Arg Ile Trp Thr Gln Tyr Phe Asp Arg Gln Tyr Thr

115 120 125

Ala Ser Arg Ala Val Ala Arg Glu Val Leu Arg Ala Thr Gly Thr Glu

130 135 140

Pro Asp Gly Gly Val Glu Ala Phe Leu Asp Tyr Glu Pro Leu Leu Arg

145 150 155 160

Phe Arg Tyr Phe Pro Gln Val Pro Glu His Arg Ser Ala Glu Glu Gln

165 170 175

Pro Leu Arg Met Ala Pro His His Asp Leu Ser Met Val Thr Leu Ile

180 185 190

Gln Gln Thr Pro Cys Ala Asn Gly Phe Val Ser Leu Gln Ala Glu Val

195 200 205

Gly Gly Ala Phe Val Asp Leu Pro Tyr Arg Pro Asp Ala Val Leu Val

210 215 220

Leu Cys Gly Ala Ile Ala Thr Leu Val Thr Gly Gly Gln Val Lys Ala

225 230 235 240

Pro Arg His His Val Ala Ala Pro Arg Arg Asp Gln Ile Ala Gly Ser

245 250 255

Ser Arg Thr Ser Ser Val Phe Phe Leu Arg Pro Asn Ala Asp Phe Thr

260 265 270

Phe Ser Ile Pro Leu Ala Arg Glu Tyr Gly Phe Asp Val Ser Leu Asp

275 280 285

Gly Glu Thr Ala Thr Phe Gln Asp Trp Ile Gly Gly Asn Tyr Val Asn

290 295 300

Met Arg Arg Thr Ser Lys Leu

305 310

Claims

1.制备用于生产7-ADCA的工程菌的方法，包括如下步骤：提高酵母中异青霉素N合酶、酰基辅酶A:6-氨基青霉烷酸酰基转移酶和脱乙酰氧基头孢菌素C合成酶的表达量和/或活性，同时导入Symbiodinium microadriaticum来源的pcbAB基因和Aspergillus nidulans来源的npgA基因，从而获得用于生产7-ADCA的工程菌；

所述异青霉素N合酶为如下a1)或a2)或a3)或a4)：

a1)氨基酸序列是SEQ ID NO：13所示的蛋白质；

a4)与a1)或a2)所示的蛋白质具有80％或80％以上同一性，且具有异青霉素N合酶活性的蛋白质；

所述酰基辅酶A:6-氨基青霉烷酸酰基转移酶为如下b1)或b2)或b3)或b4)：

b1)氨基酸序列是SEQ ID NO：14所示的蛋白质；

b4)与b1)或b2)所示的蛋白质具有80％或80％以上同一性，且具有酰基辅酶A:6-氨基青霉烷酸酰基转移酶活性的蛋白质；

所述脱乙酰氧基头孢菌素C合成酶为如下c1)或c2)或c3)或c4)或c5)：

c1)氨基酸序列是SEQ ID NO：15所示的蛋白质；

c2)氨基酸序列是SEQ ID NO：2所示的蛋白质；

c5)与c1)或c2)或c3)所示的蛋白质具有80％或80％以上同一性，且具有脱乙酰氧基头孢菌素C合成酶活性的蛋白质；

进一步，所述酵母为啤酒酵母、葡萄汁酵母、汉逊酵母、球拟酵母、假丝酵母、毕赤酵母、红酵母或棉病针酵母；

进一步，所述酵母为酿酒酵母BY4741。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述提高酵母中异青霉素N合酶、酰基辅酶A:6-氨基青霉烷酸酰基转移酶和脱乙酰氧基头孢菌素C合成酶的表达量和/或活性通过向酵母中导入异青霉素N合酶的编码基因、酰基辅酶A:6-氨基青霉烷酸酰基转移酶的编码基因和脱乙酰氧基头孢菌素C合成酶的编码基因来实现。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于：

所述酰基辅酶A:6-氨基青霉烷酸酰基转移酶的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID No：6所示；

所述脱乙酰氧基头孢菌素C合成酶的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID No.12或SEQ IDNo：1所示。

4.权利要求1至3任一所述方法制备得到的用于生产7-ADCA的工程菌。

5.权利要求4所述工程菌在生产7-ADCA中的应用。

6.一种生产7-ADCA的方法，包括如下步骤：

(1)发酵培养权利要求4所述工程菌，收集发酵菌体；

从菌体破碎后的上清液中获得7-ADCA。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于：所述步骤(1)中，发酵参数为23-33℃、180-260rpm发酵培养7天以上。

8.如权利要求6所述的方法，其特征在于：所述步骤(1)中，发酵的培养基为含100-300ng/μL潮霉素、100-300ng/μL G418、8-12g/L蛋白胨、8-12g/L牛肉膏、8-12g/L葡萄糖和8-12g/L半乳糖的培养基。

9.K1)或K2)：

K1)用于生产7-ADCA的蛋白质组合；所述蛋白质组合包括脱乙酰氧基头孢菌素C合成酶、异青霉素N合酶和酰基辅酶A:6-氨基青霉烷酸酰基转移酶中的至少一种；

c1)氨基酸序列是SEQ ID NO：15所示的蛋白质；

c2)氨基酸序列是SEQ ID NO：2所示的蛋白质；

所述异青霉素N合酶为如下a1)或a2)或a3)或a4)：

a1)氨基酸序列是SEQ ID NO：13所示的蛋白质；

b1)氨基酸序列是SEQ ID NO：14所示的蛋白质；

K2)用于生产7-ADCA的核酸分子组合；所述核酸分子组合包括脱乙酰氧基头孢菌素C合成酶的编码基因、异青霉素N合酶的编码基因和酰基辅酶A:6-氨基青霉烷酸酰基转移酶的编码基因中的至少一种；

10.权利要求9所述蛋白质组合或所述核酸分子组合的应用，为如下d1)或d2)：

d1)生产7-ADCA；

d2)制备用于生产7-ADCA的产品。