CN1357051A - 7－氨基去乙酰氧基头孢菌素酸(7－adca)的制备方法 - Google Patents

7－氨基去乙酰氧基头孢菌素酸(7－adca)的制备方法 Download PDF

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Abstract

本文提供一种获得7－氨基去乙酰氧基头孢菌素酸(7－ADCA)的方法。该方法基于使用从A.chrysogenum(也称Cephalosporiumacremonium)直接发酵产生的去乙酰氧基头孢菌素C(DAOC),然后用酶活D－氨基酸－氧化酶(DAO)和戊二酰－7－ACA乙酰酶(GLA)催化。用A.chrysogenum发酵制备DAOC的方法基于将cefEF基因失活,接着再表达cefE基因生成A.chrysogenumΔcefEF－cefE菌株。本发明包括以下几个部分:(I)将编码酶活去乙酰氧基头孢菌素C合成酶(DAOCS或扩环酶)和去乙酰头孢菌素C合成酶(DACS或羟化酶)的A.chrysogenumcefEF基因失活,(II)在cefEF基因失活的A.chrysogenum转化菌株中表达编码来源于放射菌类DAOCS酶活的cefE基因,(III)形成用重组菌株发酵生产DAOC的方法,(IV)用DAO和GLA酶催化下使DAOC转化成7－ADCA。另外一个可选择的方法,在生产DAOC的A.chrysogenumΔcefEF－cefE菌株中组合表达编码DAO和GLA的基因,或者在A.chrysogenumΔcefEF－cefE中表达编码头孢菌素催化酶的基因直接发酵生成7－ADCA。

Description

7-氨基去乙酰氧基头孢菌素酸(7-ADCA)的制备方法
发明领域
本发明涉及利用经转化的金黄顶孢霉属(Acremoniumchrysogenum)菌株发酵生产7-ADCA或其中间产物青霉素N或去乙酰氧基头孢菌素C。现有技术描述
头孢菌素是一类具有重要治疗意义的抗生素，工业上用A.chrysogenum发酵制备或者将青霉素的四氢噻唑环化学扩环形成双氢噻嗪环制备。在β-内酰胺和双氢噻嗪环的各个位置上插入侧链可以合成大量具有更强抗生能力或药物动力学性质改善的头孢菌素。近些年来，对于制备这类半合成抗生素已经表现出越来越浓厚的兴趣，并在它们的制备工艺和方法上产生了许多优化和创新。
7-氨基去乙酰氧基头孢菌素酸(7-ADCA)是一种用于制备3-位功能化缺失的特殊头孢菌素中使用的底物。由于3-位功能化缺失，通常7-ADCA是从发酵生成的青霉素的四氢噻唑环扩环合成，而其他头孢菌素化合物是从发酵得到的天然头孢菌素开始制备。通常，7-ADCA是从青霉素G或V经过4-5步化学反应把青霉素的五元环扩展成头孢菌素的六元环生成的。和生物学方法相比较，所述方法象一些化学方法一样有很多缺点：即该方法是一种多步骤的复杂过程，需要应用具毒性和昂贵的化学试剂，需要应用有害环境的有机溶剂，在合成过程中还产生需要复杂纯化系统的副产品和杂质。作为化学方法的替代，提出很多利用微生物发酵和生物转化生产7-ADCA的策略。这涉及到和二十世纪八十年代形成的利用酶水解青霉素G和V生产6-氨基青霉素酸(6-APA)一样的方法，或者与二十世纪九十年代提出的利用酶水解头孢菌素C的D-(α)-氨基己二酸侧链一样的策略。在后一个策略中，反应由D-氨基酸氧化酶(DAO)和戊二酰-7-ACA酰基转移酶催化，所述D-氨基酸氧化酶参与将氨基己二酸侧链转化为戊二酸的转氨作用，戊二酰-7-ACA酰基转移酶将戊二酸侧链水解生成7-ACA。
去乙酰氧基头孢菌素C(DAOC)是A.chrysogenum菌株的过表达产物，它是7-ADCA的直接前体，但是上述微生物中存在双功酶——去乙酰氧基头孢菌素C合酶(DAOCS或扩环酶)导致产物复杂化，该酶使四氢噻唑环扩环并水解生成去乙酰基头孢菌素C(DAC)。与放线菌中发生的问题一样，由于存在能把头孢菌素分子上的7位甲氧基化形成头孢霉素的酶，妨碍了菌株过表达产生DAOC。大部分利用酶法或者发酵处理获得7-ADCA的尝试都集中在应用具有DAOCS活性的酶上，该酶催化青霉素中的五元四氢噻唑环扩展到头孢菌素中的六元双氢噻嗪环。
理论上说，直接由发酵和(或)酶水解青霉素G或V生成的6-APA能够用DAOCS扩环形成7-ACA，可惜目前为止没有一个DAOCS能够以6-APA为底物，因此不能够使四氢噻唑环扩环。另一方面，在体内或者体外，利用DAOCS形成相应的头孢菌素G或V，再酶水解生成7-ADCA从而扩展青霉素G或V的可能性已经有人阐述了。无论如何，由于DAOCS底物的高度特异性，这些系统的效率和产率远远达不到工业化的要求。
最近有报告表明可以利用表达了带棒状链霉菌的DAOCS的重组黄青霉菌(P.chrysogenum)菌株生产己二酰-7-ADCA。在发酵中附加己二酸(分别代替在制备青霉素G或V中的苯乙酸或苯氧乙酸)能够提高己二酰基-6-APA的产生，该分子是一种在体内被DAOCS识别从而将四氢噻唑环扩环生成己二酰-7-ADCA的分子。然后己二酰-7-ADCA从发酵培养基中与其它成分(特别是己二酰基-6-APA)分离纯化，并且用己二酰基转移酶水解生成7-ADCA。虽然上述生产和酶扩环以及侧链的水解过程都有很高的效率，但它存在下列基本缺陷：(I)必须添加昂贵的侧链，比如说己二酸，和(II)产物是己二酰基-6-APA和己二酰-7-ADCA的混合物，由于它们具有相似的结构和对己二酰基转移酶的相似酶水解活性，必须预先分离，这增加了工艺复杂性。
青霉素，头孢菌素和头孢霉素的生物合成途径(表1)是近些年来研究的主题，人们已经对其生物合成途径有了精确的理解。β-内酰胺抗生素是由三种氨基酸前体衍生而来：L-α-氨基己二酸，L-半胱氨酸和L-缬氨酸，在ACV合酶(ACVS)作用下缩合成前体三肽：δ-(L-α-氨基己二酰)-L-半胱酰胺-D-缬氨酸(LLD-ACV)。接着线性三肽在异青霉素N合酶(IPNS)作用下环氧化产生异青霉素N(IPN)。这个化合物具有弱抗生素活性，是青霉素、头孢菌素和头孢霉素的共同前体。α-氨基己二酸侧链和另一个苯乙酸(预先被激活为苯乙酰-辅酶A)交换使IPN转化为青霉素G，而这个转化反应由乙酰辅酶A：6-APA乙酰转移酶催化。
Figure A0080912800091
                        表一
对于这一部分来说，头孢菌素和头孢霉素的生物合成是从IPN的侧链L-α-氨基己二酰异构化为D-α-氨基己二酰开始的，催化酶是IPN异构酶(IPNE)。产生的青霉素N在DAOCS作用下转化为DAOC，其中DAOCS将青霉素的五元噻唑环转化为头孢菌素和头孢霉素的六元双氢噻嗪环。下一步反应为DAOC分子水解产生去乙酰头孢菌素C(DAC)，该反应由DAC合酶(DACS)或水解酶催化。在产头孢菌素的真菌中，DAC的乙酰化随之头孢菌素C(CPC)生成是生物合成的最后一步。这个反应由DAC乙酰转移酶催化。
在A.chrysogenum中编码与合成头孢菌素相关的酶的大部分基因都被确定了：pcbAB编码ACVS(Gutierrez等，1991，细菌学杂志(J.Bacteriol.)，173：2354-2365)，pcbC编码IPNS(Samson等，1985，自然，318：191-194)，cefEF编码DAOCS/DACS(Samson等，1987，生物技术(Biotechnology)，5：1207-1214)，以及cefG编码DAC乙酰转移酶(Gutierrez等，1992，细菌学杂志，174：3056-3064)。其中编码生合成途径前两个酶(pcbAB和pcbC)的基因定位于第六染色体，而编码催化该途径后两步骤的酶的cefEF和cefG定位于第二染色体(Skatrud和Queener，1989，基因，78：331-338)。但是，在A.chrysogenum菌中和放线菌中cefD基因(Coque等，1993，Mol.Gen.Genet.236：453-458；Kovacevic等1990，细菌学杂志，172：3952-3958)对应的编码酶活性IPNE的基因还没有确定。DAOCS和DACS的活性定位在A.chrysogenum的cefEF基因(Samson等，1987，生物技术，5：1207-1214)编码的一个单独的多肽上(Scheidegger等，1984，抗生素杂志(J.Antibiot.)37：522-531)，而在产头孢霉素的微生物中上述的活性定位在两个分别由cefE基因(Kovacevic等1989，细菌学杂志，171：754-760；Barredo等，1991微生物学(Microbiologia)7：1-12；Ingolia T.D.等1991，US5070020；Coque等1993 Mol.Gen.Genet.236：453-458；Kimura等1996应用微生物学和生物技术(Appl.Microbiol.Biotechnol.)44：589-596；Enguita等1998细菌学杂志180：5489-5494)和cefF基因(Kovacevic等1991，细菌学杂志，173：398-400)编码的多肽上。用于改良A.chrysogenum菌株的工业程序应用染色体重组，其在不同头孢菌素生产菌菌株中产生不同的电泳结果，但是关于上述的染色体重组和抗生素的产量之间关系的详细知识还没有弄清楚。
头孢菌素的生物合成基因以前被用来提高A.chrysogenum工业菌株的产量(Skatrud等1989生物技术7：477-485)。在所述积累大量青霉素N的菌株中，用转化的方法可以增加cefEF基因和cefG基因的拷贝，导致DAOCS酶活性增强，从而减少青霉素N的积累，大大提高CPC的产量。用来源于Vitreoscilla的细菌血红素基因在菌中表达提高载氧量使得A.chrysogenum的CPC提高的方法已被报道过(DeModena等1993生物技术11：926-929)。并且，研究出经过表达来自黄青霉素(Penicillium chrysogenum)的异源基因penDE能够在A.chrysogenum菌株中产生青霉素G(Gutierrez等1990 Mol.Gen.Genet.225：56-64)。penDE基因编码酶活乙酰辅酶A：6-APA乙酰转移酶，它能将异青霉素N分子上的a-氨基己二酸侧链和另一个芳香酸分子交换，比如说苯乙酸。另外一类相当感兴趣的A.chrysogenum的转化是能够直接生产7-氨基头孢菌素酸(7-ACA)的转化(Isogai等，生物技术，9：188-191)。在这种情况下，用镰刀霉菌中编码活性D-氨基酸氧化酶(DAO)的基因和缺陷假单孢菌中编码戊二酰-7-ACA酰基转移酶(GLA)的基因转化A.chrysogenum菌株。该转化菌生产少量的7-ACA，7-ADCA和7-氨基去乙酰头孢菌素酸。
制药工业中较兴趣的化合物之一是7-ADCA，它用作生产半合成头孢菌素的底物。最广泛使用的7-ADCA的工业生产方法是化学法扩展青霉素的四氢噻唑环。化学法合成7-ADCA的出发点是在适当化学催化剂存在下将青霉素水溶液用过氧化物氧化成磺胺青霉素，其五碳环扩展成六元环(7-苯乙酰胺基去乙酰氧基头孢菌素酸或FADCH)。用青霉素酰胺酶或青霉素酰基转移酶催化处理去除纯化FADCH分子上的酰胺键。获得反应产物7-ADCA和侧链。最后一步是纯化7-ADCA。
Figure A0080912800121
                         表二
用生物发酵和转化合成法替代化学法的关键点之一在于确定参与生物合成头孢菌素和头孢霉素的基因和酶。在这个方面，利用各种真核生物包括带棒链霉菌的细胞提取液纯化酶活IPNS，IPNE和DAOCS的方法已经被报道过(Wolfe等1985，US4510246；Wolfe等1985，US4536476)。另外，还报道了带棒链霉菌和N.乳胺菌中编码DAOCS的cefE基因的克隆和特征鉴定。
A.chrysogenum表达能把青霉素中四氢噻唑环扩展到头孢菌素中双氢噻嗪环的酶DAOCS。该微生物中存在编码双功酶DAOCS/DACS的cefEF基因。因此就象在具有单独DAOCS酶和DACS酶的产头孢霉素微生物中一样，该酶的最终产物是DAC而不是DAOC。对不同类型的青霉素用A.chrysogenum细胞提取液处理得到相应的头孢菌素(Demain等1979，US4178210；Demain等，1979，US4248966；Demain等1981，US4307192)。并且，DAOCS/DACS酶的大量参数也已确定，例如等电点，分子量，氨基酸组成，羟化酶/扩环酶活性比和肽片段(Wu-Kuang等1988，US4753881)。虽然人们做了很多努力试图获得拥有单独扩环酶和羟化酶活性的酶，以便将青霉素N扩环形成DAOC，但得到的结果迄今为止还未完全成功。也有建议分离编码DAOCS和DACS的遗传信息然后单独表达这两种酶的可能性，但是这方面的试验还没有报道。
还报道过用不同来源的DAOCS将青霉素G或V酶催化扩环形成相应的去乙酰氧基头孢菌素G或V的各种尝试。最近报道利用带棒状链霉菌NP1(一种产头孢菌素缺陷型突变体)的细胞提取液体外优化扩展大量青霉素，包括青霉素G(Cho等1998，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.11544-11548)。虽然在这一研究中可以调节反应条件使得扩环产率显著提高，但是由于辅助因素的性质和花费、扩环过程的低产率、以及从具相当浓度的未扩环青霉素G中分离纯化头孢菌素G的难度使上述结果离工业化生产的可能性还很遥远。
到目前为止天然DAOCS有效作用于商业上得不到的青霉素N，它是生物合成头孢菌素和头孢霉素的中间产物，却不能作用于可以由P.chrysogenum工业化生产的青霉素：青霉素G和青霉素V。很多研究组织对这样一项命题研究了多年，即通过修饰DAOCS酶作用底物的专一性使得青霉素G能充当底物扩展成苯乙酰-7-ADCA(Cantwell等1990，Curr.Genet.17：213-221)，然而研究成果还没有报道。苯乙酰-7-ADCA的芳香侧链可以用青霉素酰基转移酶很容易的去除掉产生7-ADCA。另外，编码酶活IPNE和DAOCS的S.带棒状链霉菌的cefD和cefE基因同时在P.chrysogenum中表达，产生少量DAOC将IPN异构化为青霉素N，然后形成具有六元环的头孢菌素(Cantwell等1992，P.Roy.Soc.Lond.B 248：283-289)。以前有报道在大肠杆菌中克隆表达编码DACOS活性的带棒状链霉菌的cefE基因(Kovacevic等1989，细菌学杂志171：754-760)。另外，报道带棒状链霉菌的cefE基因的DNA序列，并报道在P.chrysogenum中的表达在所述真菌中产生DACOS活性(Ingolia T.D.等1991，US5070020；Queener等1994 Ann.N.Y.Acad.Sci.721：178-193)。但对于在P.chrysogenum中表达的A.chrysogenum的cefEF基因(与带棒状链霉菌的cefE基因相对应)来说，到现在为止利用重组的P.chrysogenum菌株将青霉素G或V转变为对应的头孢酶菌素还没有论述。
考虑到直接将青霉素G或V直接转变为相应的头孢菌素的困难，采用另外的策略即将具有不同侧链的青霉素转变为扩环形成苯乙酸或苯氧乙酸。在P.chrysogenum发酵中加入苯乙酸或苯氧乙酸分别导致青霉素G，V的生物合成。而且，当培养基加入己二酸时，P.chrysogenum产生己二酰-6-APA或羧基-n-丁基青霉素(Ballio等，1960自然185：97-99)。P.chrysogenum产生的己二酰-6-APA是DAOCS的有效底物，因为它的侧链(己二酸)和作为DACOS的自然底物的青霉素N中的一样。以此研究为基础，首次提出用于工业上生物合成7-ACA和7-ADCA(Crawford等1995生物技术13：58-62；Bovenberg等1998，WO9802551 A2)。该研究中，筛选出表达带棒状链霉菌的cefE基因的P.chrysogenum的工业菌株转化转化体，生产出相对源菌产物青霉素V为17％的己二酰-7-ADCA。象期望的那样，用假单孢菌的酶活性头孢菌素酰基转移酶处理可有效去除己二酸侧链。相似的，表达C.acremonium的cefEF基因(DAOCS-DACS)的P.chrysogenum转化菌株生产出己二酰-7-ADCA和己二酰-7-氨基去乙酰头孢菌素酸(己二酰-7-ADACA)。另外，表达cefEF和cefG基因(DAC乙酰转移酶)的P.chrysogenum转化菌生产己二酰-7-ADCA、己二酰-7-ADACA、己二酰-7-ACA的混合物。虽然他们得到相对较少量这些己二酸衍生物(发酵中加入苯氧乙酸会得到0.6％青霉素V)，但作者建议使用传统的方法改良菌株可能得到允许工业规模应用的产品。
本专利采用的方法是获得在CPC生物合成途径中DAOCS/DACS酶活性水平上阻断的A.acremonium菌株，从而生产青霉素N。这个菌株是利用cefEF基因被阻断的质粒双重组法进行基因破坏使cefEF基因功能失活得到的。这种通过破坏使基因功能失活的技术可以用于修饰生物合成途径和累积可用于得到某些次级代谢物的生物合成中间产物。但是这种方法在丝状真菌的工业菌株中很少获得成功。有个例子，在P.青黄霉素中我们可以破坏lys2基因，得到赖氨酸缺陷的菌株，其能够大量合成青霉素生合成的前体α-氨基己二酸(Casqueiro等1997.西班牙专利P9701343；Casqueiro等，1999.细菌学杂志181：1181-1188)。在A.巢曲菌中，phacA基因被阻断，降低了乙酸苯酯羟化酶的活性，因此，限制了苯乙酸的氧化，促进其插入青霉素G中(Fernandez-Canon等，1997.西班牙专利P9700833；Fernandez-Canon等，1998.PCT/ES98/0010；Mingot等，1999.生物化学杂志(J.Biol.Chem.)274：14545-14550)。已报道使A.chrysogenum菌中的pcbAB(Hoskins等1990.Curr.Genet.18：523-530)、pcbC(Waltz和Kuck.1993.Curr.Genet.24：421-427)和cefG(Matsuda等1992.Biochem.Biophys.Res.Commun.186：40-6)基因失活，在这些研究中得到不能合成头孢菌素C的转化菌株。虽然A.chrysogenum菌是一种很难使用基因阻断方法的微生物(Waltz和Kuck.1993，Curr.Genet.24：421-427)，但本专利首次提出用基因阻断的方法使cefEF基因失活。
然后用一个质粒转化cefEF基因功能失活的A.顶孢霉菌菌株，该质粒含有来自放线菌的cefEF基因，该基因在各种真菌启动子的控制下表达。最后，筛选产生大量DAOC的转化菌株，用两步酶处理使其转化为7-ADCA：(I)在DAO酶的催化下，DAOC转变为7-β(5-羧基-5-氧戊烷氨基)-去乙酰氧基头孢菌素(酮基己二酰-7-ADCA)。形成的酮基己二酰-7-ADCA在没有酶催化的环境下和双氧水反应生成7-β-(羧基丁烷氨基)-去乙酰氧基头孢菌素(戊二酰-7-ADCA或GL-7-ADCA)。(II)用戊二酰酶去除GL-7-ADCA的戊二酰残基，生成7-ADCA。总之，所述过程通过一个完全生物合成途径且未使用有机溶剂的情况下得到7-ADCA。
到目前为止还没有报道说用基因阻断A.chrysogenum的cefEF基因的表达来增加青霉素N的产量，由于该抗生素基于以下几点缺乏商业价值：(I)和疏水青霉素(G或V)、半合成青霉素和头孢菌素相比，青霉素N的抗菌活性不足；(II)由于青霉素N的不稳定性，以及其溶解性和酸碱度等物化性质使其大量分离较复杂，因此它用作制备6-APA中间产物的用处也不大；和(III)用常规青霉素G或V的酰基转移酶不可能将青霉素N的侧链去除。现在只知道存在A.chrysogenum的突变菌株能够积累青霉素N，他们被用来识别头孢菌素的生物合成途径。另一方面，还报道在A.chrysogenum发酵中DAOC与DAC和CPC一起积累。在这项研究中，DAOC被认为是使工业生产可接受纯度的CPC复杂化的不期望的污染物。
到目前为止还未曾报道用DAOC作为生产7-ADCA的中间体，因为在A.chrysogenum发酵中无法得到单纯的DAOC产物。所有研究中只能产生DAOC和DAC的混合物，但是它们很难分离。另外，直到最近一段时间，用酶法将DAOC的氨基己二酸侧链去除还是很困难的，这意味着DAOC分子并不适合工业化生产7-ADCA。然而，构建A.chrysogenum菌株ΔcefEF-cefE能使DAOC的产量提高，而DAOC是主要的头孢菌素。能够用和前面描述过的相同方法(Croux等1994.US5354667；Cambiaghi等1991 EP0496993；Garcia等1998.EP0843015)，在DAO和GLA酶的催化下，将DAOC转化成7-ADCA。发明详述实施例1.阻断A.chrysogenum的cefEF基因1.1构建令A.chrysogenum的cefEF基因失活的质粒pALC73。
利用称之为“一步基因阻断”的双重组基因阻断技术(Rothstein，1983.Meth.Enzymol.101：202-211)使A.chrysogenum的cefEF基因失活，获得积累青霉素N的ΔcefEF突变株。用该方法能获得稳定的阻断转化菌，重组区并不生成直接重复拷贝。该方法将一个标记插入菌株中目标基因的限制性位点以筛选转化菌，从而使得所述基因的读码框被破坏。标记基因必须在两侧拥有和足够长度的目标序列同源的DNA片段，以便发生染色体交换。报道这些同源序列的最小长度为500bp(Rothstein，1991.Meth.Enzytnol.194：281-301)。
在这个实施例中，将由A.巢曲霉菌gpd(甘油醛-3-磷酸脱氢酶)基因的启动子、潮霉素抗性基因(hygr)和trpC(色氨酸C)基因的终止子形成的潮霉素抗性带区，整合到cefEF基因的XhoI位点(图1A-B)。为了达到这个目的，在pBC KS(+)中第一个XhoI位点用SalI-XhoI双酶切去除再连接，得到没有限制性酶切位点XhoI和SalI的质粒pBC*KS(+)。再将包含A.chrysogenum的cefEF和cefG基因的长度为7.2kb的BamHI片段插入到pBC*KS(+)中，生成pALC72质粒(图1A-B)。最后，将包含潮霉素抗性带区且其末端预先用Klenow片段钝化的pAN7.1质粒的BglII-XbaI片段插入到pALC72质粒cefEF基因的XhoI位点，这样就得到pALC73质粒(图1A-B)。这样，选择标记就分别被两段长度为2.2kb和5.0kb的分别与A.chrysogenum基因组中包含cefEF和cefG基因区同源的DNA片段侧面相邻。根据前面描述的方法(Queener等1985.Lieve(编)微生物学-1985.pp.468-472.ASM.华盛顿)获得带有pALC73质粒的A.chrysogenum转化菌株，然后用5-10μg/ml的潮霉素筛选抗性。包含pALC73质粒的菌株，命名为大肠杆菌TOP10/pALC73，保藏于西班牙标准培养物保藏中心(Spanish collectionof Standard Cultures，Coleccion Espanola de Cultivos Tipo，CECT)，Valencia大学，科研楼，Burjasot校园，46100 Burjasot(Valencia)No.5151。1.2.预筛选不能生产头孢菌素的转化菌株
潮霉素抗性筛选的转化菌株在LPE固体培养基(Le Page和Campbell，1946，J.Biol.Chem.162：163-171)上生长，28℃保温培养7天。然后用打孔器从每个转化菌中的移出两孔。为了鉴定头孢菌素的生产，将一孔在添加了对β-乳胺敏感的大肠杆菌(E.Coli ESS)培养物和终浓度为0.1mg/ml的I型青霉素酶(Sigma P-0389)制剂的LB培养基平板上做生物鉴别。另一孔在添加E.coli ESS但没有青霉素酶的LB培养基上做生物鉴别，目的是确定青霉素和头孢菌素的存在。那些在没有青霉素酶的培养皿上产生抑制晕环和在有青霉素酶的培养皿上不产生晕环的转化菌株不能合成头孢菌素，将它们挑选出来。
获得结果如下表所示。
  转化菌株编号 潮霉素抗性(μg/ml)   没有青霉素霉产生的晕环(mm)     有青霉素产生的晕环(mm)
2672*2673*26742675*26762677267826792680*26812682268326842685268626872688268926902691*2692*2693*2694*2695*2696*2697*2698*2699*2700     5101010555510551055555551010510101010101010     1216111115131417141714141516151817161515141817151414131212     001201211111101212121212121212121200000000012
转化菌株2672，2673，2675，2680，2691，2692，2693，2694，2695，2697，2698和2699(用星号标识)拥有要求的特征，挑选出来进行下一步测试。1.3.Southern测试cefEF基因的失活
A.chrysogenum的cefEF基因定位在基因组DNA上的一个7.2kb大小的BamHI片段。pALC73质粒和临近cefEF基因的片段之间的同源双重组导致对先前提到的限制性模板的修饰，通过Southern分析可以观察到上述变化(图2)。对此，从A.chrysogenum父菌株和三个如前面部分说明经生物鉴定筛选的转化菌株(2691，2696和2698)中纯化总DNA。总DNA用BamHI和SalI酶消化，然后电泳分离并转移到硝化纤维膜上，用cefEF基因中的0.5kb的SalI DNA片段作探针杂交。结果(图2)显示限制性模板的预期变化：对于父菌株，能获得7.2kb的BamHI杂交带，而转化菌株分别出现5.7kb和5.3kb的两条杂交带。另外，SalI酶的结果证实了cefEF基因的失活：父菌株中有一个0.5kb的杂交带，在阻断基因的转化菌中有两个2.2kb的杂交带。cefEF基因阻断的菌株被命名为A.chrysogenumΔcefEF T1、。实施例2.利用A.chrysogenumΔcefEF生产青霉素N2.1.A.chrysogenum和A.chrysogenumΔcefEF的发酵
在斜面固体培养基LPE上接种A.chrysogenum父菌株和cefEF基因失活的A.chrysogenumΔcefEFT1、A.chrysogenum ΔcefEF T2和A.chrysogenumΔcefEF T3(Le Page和Campbell，1946，J.Biol.Chem.162：163-171)，在28℃培养7天直到孢子培养物形成。，将得到的孢子接种到含有50ml复合接种培养基(Shen等，1986，Bio/Technology 4：61-64)的250ml摇瓶中，开始在液体培养基中发酵。摇瓶在28℃，250rpm条件下培养48小时获得丰富的营养菌丝体。用包含将0.5ml(3％)上述营养体培养物接种到含15ml发酵复合培养基(Shen等，1986，Bio/Technology 4：61-64)的500ml摇瓶中，开始生产抗菌素的发酵。该培养在25℃，250rpm条件下培养7天，每24小时收集1ml样品考察发酵过程中的抗菌素生产情况。接着，进行鉴定分析：(I)转化菌株A.chrysogenumΔcefEF生产的抗菌素是青霉素N，(II)这些转化菌株产生的青霉素N的产量，(III)发酵中有否存在其他抗菌素。采取的分析如下所述依次为：HPLC、体外酶扩环和LC质谱。2.2.用HPLC法确定抗生素的生产
发酵样品以20000g，5分钟离心去除菌丝体，用水将50微升上清液稀释10倍，在Waters TAD色谱(Waters公司，Milford，MA)中用486M1检测仪、W600泵、717自动注射器和Nucleosil C18-10μm柱(250×4.6毫米)(Phenomenex，Torrance，CA)检测分析。以2.3ml/min的流动率和可变波长(214纳米检测青霉素，254纳米检测头孢菌素)分析样品。用流动相铵甲酸盐pH3.3-甲醇-四氢呋喃(99.85∶0.1∶0.05)以平等模式洗提30分钟。将相同分析条件下参照标准品CPC、DAC、DAOC和青霉素N的峰值和各化合物的峰值进行比较。
分析结果显示，发酵7天后转化菌株A.chrysogenumΔcefEF T1、A.chrysogenumΔcefEF T2和A.chrysogenumΔcefEF T3积累的青霉素N的产量和父菌株中CPC、DAC、DAOC和青霉素N产量的总和相当。所以阻断cefEF基因导致生物合成头孢菌素的途径也被阻断，然而生成β-乳胺的总量没有改变。下面的表中显示不同种抗生素相对于不同菌株产生的总β-乳胺的百分比。
  菌株 CPC  DAC  DAOC  PenN
 A.chrysogenumA.chrysogenumΔcefEF T1A.chrysogenumΔcefEF T2A.chrysogenumΔcefEF T3  75.20.00.10.1  6.30.50.30.2  1.90.00.00.0  16.599.599.699.7
2.3.将青霉素N生物转化为头孢菌素
利用带棒状链霉菌NP1的休眠细胞或全细胞提取液对青霉素N进行酶扩环。这个菌株和父菌株相比几乎不生产头孢霉素(Mabro和Demain，1987)，这有利于确定从青霉素N体外合成的头孢菌素和/或头孢霉素。2.3.1.用带棒状链霉菌NP1的休眠菌进行酶活扩环
在接种培养基MST(1％可溶淀粉，3％不含葡萄糖的胰蛋白酶酱汤，90mM MOPS，pH7.0)上接种带棒状链霉菌NP1的孢子悬浮液，在28℃ 200rpm条件下培养48小时。MST也当作发酵培养基，用5％前面的培养物接种，在28℃ 200rpm条件下培养24小时。培养物长成后，离心(10000rpm/10min/4℃)收获细胞，用软化水冲洗两次。最后，细胞重新悬浮在40ml的软化水中。
酶扩环的反应混合物(10ml)按照已报道的程序制备(Shen等1984.Enzyme Microbiol.Technol.6：402-404)，用A.chrysogenumΔcefEFT1生产的青霉素N作底物：MOPS 50mM pH6.5，FeSO4(七水合物)1.8mM，a-酮戊二酸2.56mM，8ml细胞悬浮液和青霉素N 0.2mM。反应在30℃ 200rpm条件下进行3小时。在不同的时间点取1ml样品，13000rpm离心10分钟。得到的上清液用生物鉴定和HPLC分析。
在含有作为指示微生物的大肠杆菌ESS和50000UI/ml青霉素酶(Difco Bacto penase concentrate，Difco Laboratories，Detroit，MI)的LB(2％琼脂)平板上进行生物鉴定。用枪将200微升样品注入预备的孔中，平板在37℃培养16小时。开始时取得的样品没有抑制大肠杆菌ESS生长的晕环，但在培养1或3小时后，分别获得了17mm和21mm的抑制性晕环，表明已经得到了青霉素酶抗性的反应产物(头孢菌素)。
用配备486M1色谱检测仪、W600泵、717自动注射器和Nucleosil C18-10μm柱(250×4.6毫米)(Phenomenex，Torrance，CA)的Waters TAD设备(Waters公司，Milford，MA)进行HPLC检测分析。扩环反应得到的样品(50微升)以流速2.3ml/min、可变波长(214纳米或254纳米)的条件进行分析。214纳米检测青霉素，254纳米检测头孢菌素。用色谱流动相铵甲酸盐pH3.3-甲醇-四氢呋喃(99.85∶0.1∶0.05)以平等模式洗提30分钟。在214nm对作为底物的发酵液进行分析，表明存在10.1分钟的峰，其与青霉素N的保留时间一致，然而在254纳米分析表明不存在头孢菌素。在反应开始时，在214纳米进行样品分析，显示存在10.1分钟的峰(青霉素N)，然而在254纳米有三个保留时间非常短的峰值(1.8-4分钟)，它们与DAC得到的保留时间(2.98分钟)、头孢霉素C的保留时间(3.3分钟)、DAOC的保留时间(8.8分钟)和CPC的保留时间(17分钟)的峰值不一致。反应1-3小时后的样品在254纳米下分析，显示一个新的峰值，它和刚开始反应时样品的色谱有关。这个峰值在8.8分钟洗脱，和DAOC的保留时间一致。这个结果证明A.chrysogenumΔcefEF T1菌株生产的抗生素是青霉素N，带棒状链霉菌的休眠细胞将得到的青霉素N扩环成DAOC。2.3.2.用带棒状链霉菌NP1的细胞提取液进行酶活扩展
在MST接种培养基(1％可溶淀粉，3％不含葡萄糖的胰蛋白酶酱汤，90mM MOPS，pH7.0)上接种带棒状链霉菌NP1的孢子悬浮液，在28℃ 200rpm条件下培养48小时。离心(10000rpm/10min/4℃)收集细胞，用缓冲液E(15mM Tris HCl pH7.5 10％乙醇)冲洗两次，然后重悬浮于含DTT 10mM和PMSF 2mM的缓冲液E中。用超声波细胞裂解仪Labsonic2000执行三次25秒脉冲裂解细胞。样品在20000rpm、4℃离心20分钟。得到的提取液分成等量几份保存在-20℃，用Bradford技术分析蛋白质含量。
接着进行酶活扩环反应：加100-200微升蛋白质提取液到0.5毫升反应混合物(Tris HCl 50mM，pH7.5、抗坏血酸4mM、硫酸亚铁(七水合物)1.8mM、a-酮戊二酸1.28mM和A.chrysogenumΔcefEF T1菌株生产的青霉素N 0.2mM)。反应在30℃、200rpm进行两小时，然后加入等体积甲醇并在13000rpm离心10分钟终止反应。获得的上清液如2.3.1节的说明，通过生物鉴定和HPLC法分析。
反应开始时的样品没有产生抑制大肠杆菌ESS生长的晕环，但在两小时后，抑菌圈生成，表明出现青霉素酶抗性反应产物(头孢菌素)。此外，用HPLC在214纳米分析反应刚开始时的样品，有一个保留时间是10.1分钟的峰值(青霉素N)，但是在254纳米有三个保留时间很短的峰值(1.8-4分钟)和DAC(2.98分钟)，头孢霉素C(3.3分钟)，DAOC(8.8分钟)和CPC(17分钟)的峰值不一致。样品反应了1-3小时后，在254纳米下出现了一个新的峰值和刚开始反应时样品的色谱相对应。这个峰在8.8分钟洗脱，和DAOC的保留时间一致。这个结果证明A.chrysogenumΔcefEF T1菌株生产的抗生素是青霉素N，用带棒状链霉菌酶活提取液将青霉素N扩环形成DAOC。2.3.3.用大肠杆菌JM109(DE3)pALE38的细胞提取液进行酶活扩展
为了在大肠杆菌中表达诺卡氏菌的cefE基因，构建质粒pALE36(图4A-B)，该质粒具有pBC KS+中质粒pT7-7(Tabor和Richardson，1985，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82：1074-1078)的400bp的BglII-ClaI片段。这个片段包含T7噬菌体Φ10基因启动子下游的多克隆区域。pALE36和pT7-7相比有个优点，它用Cmr基因替换Apr基因。后者编码会降解用作底物的青霉素N的β-内酰胺酶活性。接着，pALE36被NdeI-BamHI酶切，再插入一个1.25kb包含诺卡氏菌cefE基因的NdeI-BglII片段。最后测序证明启动子和cefE基因之间的融合体是正确的，具有获得的质粒pALE38的大肠杆菌/JM109(DE3)细胞转化出来，挑选抗氯霉素的转化克隆。
用大肠杆菌JM109(DE3)pALE38菌落接种到含有50毫升LB培养基且加入30微克/毫升氯霉素的250毫升摇瓶(Sambrook，J.等1989.Molecular cloning，a laboratory manual，Cold Spring Harbor LaboratoryPress)，250rpm、37℃培养14小时。接着用2毫升该培养物接种到含有50毫升LB-氯霉素培养基的250毫升摇瓶中，250rpm、37℃培养直到O.D.660到达0.4为止。在这个时候。加入终浓度为1mM的IPTG，继续培养6小时。如2.3.2节的说明对获得的细胞进行处理、酶活扩环反应、以及通过生物鉴定和HPLC对反应产物进行分析。
样品在刚开始反应的时候没有产生抑制大肠杆菌ESS生长的晕环，但培养两小时后，晕环生成，显示生成抗青霉素酶反应产物。HPLC分析214纳米处刚开始反应时的样品，显示有一个与青霉素N相对应的10.1分钟的峰值。两小时后的样品分析在254纳米有一个和刚开始反应时样品色谱对应的新的峰值。这个峰值在8.8分钟洗脱，和DAOC的保留时间一样。结果证明A.chrysogenumΔcefEF产生的抗菌素是青霉素N，它可以通过大肠杆菌JM109(DE3)pAL38的酶提取物扩环生成DAOC。2.4.质量液相色谱法鉴定青霉素N
A.chrysogenumΔcefEF菌株的发酵样品20000rpm离心5分钟去除菌丝体。接着，取出50微升上清液用水稀释10倍。该样品的25微升用装备有Symmetry 300 C18 5微米柱(2.1×150mm)的Water 2690 TAD色谱仪(Waters公司，Milford，MA)分析。使用的流动相是铵甲酸盐缓冲液pH3.3-甲醇-四氢呋喃(99.85∶0.1∶0.05)，流速0.25ml/min。用Water ZMD检测器进行质谱分析，设置参数：检测范围(996)：200-300纳米；毛细管电压：3.50kV；锥形电压：40V扫描1；70V扫描2；相间：ES+。获得的洗脱时间为11.92分钟的峰值和预期青霉素N的峰一致，在360显示一个分子峰，和青霉素N的分子量对应(图5A-B)。实施例3.在A.chrysogenumΔcefEF中表达cefE基因
在A.chrysogenumΔcefEF中表达编码DAOCS活性的cefE基因，以获得通过发酵生产DAOC的A.chrysogenum菌株。克隆出的cefE基因目前是从放射菌类(带棒状链霉菌，诺卡氏菌，溶原乳胺菌)得到。为了在A.chrysogenumΔcefEF中表达cefE基因，设计了一系列质粒，其中，带棒状链霉菌和诺卡氏菌的cefE基因安排在真菌启动子基因的控制下。选择出两个启动子：一个对应在发酵条件下高表达的基因(pcbC基因，在P.chrysogenum中编码IPNS)，另一个属于A.巢曲菌的gpdA基因，该基因组成型表达，编码甘油醛-3-磷酸脱氢酶活性。
将由真菌启动子、cefE基因和黑曲霉的trpC基因转录终止子形成的簇插到质粒pALfleo7(Barredo等1997.西班牙专利P9700482)中。这个5.4kb的质粒具有印度异型链霉菌的腐草霉素抗性基因，并且该基因与P.chrysogenum的gdhA基因的启动子和黑曲霉trpC基因的转录终止子相邻。3.1.在A.chrysogenumΔcefEF中表达带棒状链霉菌的cefE基因
将带棒状链霉菌的cefE基因亚克隆到质粒pBluescript IKs(+)(Stratagene)中，形成一个包含全部cefE基因和cefD基因的3’末端582bp的带棒状链霉菌基因组中1.6kb的BamHI-KpnI片段。为了在真菌启动子控制下表达cefE基因，用商业试剂盒QuickChange(Stratagene)和SEQ ID No.1和SEQ ID No.2中描述的寡核苷酸通过定点突变的方法在所述基因的5’端产生一个NcoI限制性位点。突变方法按照试剂盒上的说明进行，通过测序验证Ncol位点的生成以及没有别的突变。这样得到的质粒命名为pALC83(图6A-B)。pALC83被KpnI酶切，它的末端用Klenow片段填充，接着用NcoI酶切，最后用QIAEXII试剂盒(Qiagen)纯化得到的0.95kb的片段。把这个片段连接到先用HindIII酶切，再用Klenow片段填充并用Ncol酶切的质粒pALpcbC(图6A-B)。得到的质粒命名为pALC87，它包括：(I)在黄青霉素pcbC基因的启动子控制下表达的带棒状链霉菌cefE基因和(II)A.巢曲菌cefE基因下游的trpC基因的终止子。最后，pALC87质粒用PvuII酶切，包含cefE基因的片段连接到用EcoRV酶切且去磷酸化的pALfleo7质粒中。连接得到质粒pALC88，它是插入体PpcbC-cefE-TtrpC的载体(图6A-B)。
带棒状链霉菌的cefE基因还在A.巢曲菌gpdA基因的启动子控制下表达。对此，包含构建pALC87质粒的带棒状链霉菌cefE基因的0.95kb片段和先用HindIII酶切、用Klenow片段填充、再用NcoI酶切的pTh质粒(Uriach等1995.EPA 0684312 A2)相连接。在得到的质粒pALC92(图7A-B)中，带棒状链霉菌的cefE基因定位在A.巢曲菌gpdA基因的启动子下游，后随A.巢曲菌trpC基因的终止子。由pALC92质粒用EcoRI和PvuI酶切，再用Klenow片段填充得到的PgpdA-cefE-TtrpC表达区域插进用EcoRV酶切并磷酸化的pALfleo7质粒中。连接得到pALC93和pALC94质粒(图7A-B)。其中插入区域PpcbC-cefE-TtrpC可能在两个起点出现。3.2.N.乳胺菌cefE基因在A.chrysogenumΔcefEF中的表达
N.乳胺菌的cefE基因是由pALE38质粒(2.3.3节)用NedI酶切，Klenow片段填充，再用HindIII酶切得到。用这种方法，纯化出一个1250bp的DNA片段，将它连接到质粒pALpcbC(图6A-B)上，该质粒已经预先用NocI酶切，并且突出的末端已用绿豆核酸酶去除，再用HindIII酶切。在得到的质粒(pALC84)中，N.乳胺菌的cefE基因在P.chrysogenum pcbC基因的启动子控制下，后随A.巢曲菌trpC基因的终止子。启动子和cefE基因的融合物测序验证。pALC84质粒用PvuII酶切，得到的片段连接到预先用EcoRV酶切并去磷酸化的pALfleo7质粒上。这样连接后获得pALC85和pALC86质粒(图8A-B)，其中PpcbC-cefE-TtrpC插入有两个可能方向。包含pALC85质粒、命名为大肠杆菌DH5α/pALC85的菌种保藏于西班牙标准培养物保藏中心(CECT)，瓦伦西亚大学，研究院，布扎斯特校区，46100布扎斯特(瓦伦西亚)No.5150。
N.乳胺菌cefE基因还在A.巢曲菌gpdA基因的启动子控制下表达。对此，将上述包含A.巢曲菌gpdA基因的1250bp DNA片段连接到质粒pTh(Uriach等1995.EPA 0684312 A2)上，该质粒预先用NcoI酶切，突出的末端用绿豆核酸酶去除，再用HindIII酶切。在得到的质粒(pACL89；图9A-B)中，N.乳胺菌的cefE基因在A.巢曲菌gpdA基因启动子的控制下，后随A.巢曲菌trpC基因的终止子。启动子和cefE基因的融合物测序验证。pALC89用EcoRI和PvuI酶切，再用Klenow片段填充所得的PgpdA-cefE-TtrpC表达区域插入预先用EcoRV酶切并去磷酸化的质粒pALfleo7中。连接得到pALC90和pALC91质粒(图9A-B)，其中插入有两个可能的方向。3.3.A.chrysogenumΔcefEF菌株的转化
三个不同的A.chrysogenumΔcefEF菌株(T1，T2和T3)按照先前描述的程序(Queener等1985.Lieve(编)Microbiology-1985.pp.468-472.ASM.Washington)用质粒pALC85、pALC86、pALC88、pALC90、pALC91、pALC93和pALC94转化。先用腐草霉素3微克/毫升初步筛选抗性转化菌株，然后在较高浓度下测试它们的抗性，按照以前报道指示，对腐草霉素的抗性水平与基因组中整合的质粒拷贝数量存在直接相关性。3.4.筛选大量生产DAOC的转化菌株
筛选出的转化菌株生长在LPE固体培养基平板(Le Page和Campbell，1946，J.Biol.Chem.162：163-71)上，28℃培养7天。接着，用打孔器从各转化菌株中移出一孔，在加入对β-乳胺敏感的大肠杆菌(E.coliESS)和终浓度为0.1毫克/毫升的青霉素酶I(Sigma)制剂的LB培养基平板上进行生物鉴定。用这种方法，筛选出产生最大抑制圈的转化菌株，显示它们能够生产大量青霉素酶抗性抗生素。
结果如下表所示：
转化菌株编号   菌株/质粒   腐草霉素抗性(μg/ml) 青霉素酶晕环(mm)
 280028012802280328042805280628072808280928102811281228102811281228132814281528162817   T1/pALC88T2/pALC88T3/pALC88T1/pALC92T2/pALC92T3/pALC92T1/pALC93T2/pALC93T3/pALC93T1/pALC85T2/pALC85T3/pALC85T1/pALC86T2/pALC86T3/pALC86T1/pALC90T2/pALC90T3/pALC90T1/pALC91T2/pALC91T3/pALC91     369996996999991299129912     121517181817182017181820181820181820181820
为了分析cefE基因在转化菌株基因组中的整合情况，从A.chrysogenum父菌株、A.chrysogehumΔcefEF T1、A.chrysogenumΔcefEF T2、A.chrysogenumΔcefEF T3菌株、和生物鉴定筛选的转化菌株(A.chrysogenumΔcefEF-cefE)中提取总DNA。用BamHI和SalI消化总DNA，电泳分离后转移到硝酸纤维滤膜上，用对应N.乳胺(转化菌株2800-2808)的0.6kb探针HindIII-KpnI或对应带棒状链霉菌cefE基因(转化菌株2809-2817)的0.5kb探针KpnI-ScaI杂交。结果显示了预期的限制性模板：A.chrysogenum父菌株、A.chrysogenumΔcefEF T1、A.chrysogenumΔcefEF T2、A.chrysogenumΔcefEF T3菌株不显示任何杂交带，但是在A.chrysogenumΔcefEF-cefE转化菌株中出现附加杂交带，证明cefE基因整合到A.chrysogenumΔcefEF基因组中了。实施例4.用A.chrysogenumΔcefEF-cefE生产DAOC4.1.A.chrysogenum、A.chrysogenumΔcefEF和A.chrysogenumΔcefEF-cefE的发酵
如2.1节所示发酵A.chrysogenum、A.chrysogenumΔcefEF和A.chrysogenumΔcefEF-cefE菌株，确定(I)A.chrysogenumΔcefEF-cefE生产的抗生素是DAOC，(II)所述转化菌株产生的DAOC的产量和(III)发酵培养基中存在其他抗菌素的可能性。用HPLC和质量液相色谱法如下所述分析。4.2.用HPLC法确定抗生素的产生
发酵样品20000g离心5分钟去除菌丝体，用水将50微升上清液稀释10倍，用装备有486M1检测仪，W600泵，717自动注射器和Nucleosil C18-10微米柱(250×4.6毫米)(Phenomenex，Torrance，CA)的WatersTAD(Waters Associates，Milford，MA)色谱仪检测分析。以流速2.3ml/min、波长254纳米分析样品。用流动相：铵甲酸盐pH3.3-甲醇-.四氢呋喃(99.85∶0.1∶0.05)以平等模式进行洗脱30分钟。将各化合物得到的峰值和参照标准品CPC、DAC、DAOC和青霉素N在相同条件下的峰值比较。
分析结果显示，发酵7天后A.chrysogenumΔcefEF-cefE转化菌株积累了DAOC。下表显示了各菌株产生的每种类型抗菌素相对于总β-乳胺的百分比：
菌株 CPC  DAC  DAOC  PenN
 A.chrysogenumA.chrysogenum ΔcefEF TlA.chrysogenum ΔcefEF-cefET3/pALC85A.chrysogenum ΔcefEF-cefET3/pALC86A.chrysogenum ΔcefEF-cefET3/pALC87  75.20.00.10.10.1  6.30.50.30.70.9  1.90.095.993.396.7  16.599.53.75.92.3
4.3.A.chrysogenumΔcefEF-cefE产物DAOC的纯化
将含有20克/升DAOC的A.chrysogenumΔcefEF-cefE发酵液共10升用浓硫酸调整pH值到3.0，用布驰纳滤器并用硅藻土抽真空过滤。过滤后的生物体用10升软水洗涤，将所有的DAOC从生物体中洗下，得到16.4升滤液。滤液通过填充10升聚苯乙烯树脂的XAD4聚苯乙烯(Rohm和Haas)柱(1m×16cm)，以150毫升/分钟的流速过滤。滤柱用10升水冲洗，再用0.15M的醋酸钠溶液洗提。洗提组分用HPLC分析，确定DAOC的含量。合并富含DAOC的部分，得到23.5升洗提液。
洗提液调pH值到5.5，用装填阴离子交换树脂IRA68(Rohm和Haas)的柱渗滤脱色纯化。脱色的洗提液用法浓缩至DAOC浓度达到200克/升为止。接着，1.1升反渗透浓缩液搅拌下缓慢加入4升异丙醇沉淀。沉淀两个小时后，用多孔玻璃板过滤，沉淀物用约1升异丙醇洗涤，50℃真空炉中干燥，得到147.3克纯度为92％的DAOC钠盐。实施例5.从DAOC到戊二酰-7-ADCA的生物转化5.1.由固定化DAO催化DAOC到戊二酰-7-ADCA的生物转化
为了对实施例4中所述得到DAOC进行生物转化，将66克DAOC钠盐溶解在包含0.5克偏亚硫酸钠盐的2升25mM磷酸钾缓冲液中。按照已报道的方法(Cambiagbi等1991.EP 496993)，将DAOC溶液置于包含150克固定在Eupergit C(Rohm)上的DAO的3升反应器中。在25℃轻微搅拌并通过位于反应器底部的扩散器鼓氧(1vol/vol/min)下培养混合物。自动添加5％的氢氧化铵保持pH7.5。75分钟内，DAOC转化完全，产生戊二酰-7-ADCA(90％)和酮基己二酰-7-ADCA(10％)的混合物。
为了将酮基己二酰7-ADCA转化为戊二酰-7-ADCA，培养得到的溶液用固定酶过滤分离，加入10毫升过氧化氢(H2O2)至浓度为3.5％每升滤液。混合物在25℃保温15分钟，然后加入0.5克丙酮酸钠。该处理后，酮基己二酰7-ADCA完全转化为戊二酰-7-ADCA，得到3％的戊二酰-7-ADCA溶液。得到的溶液在4℃下渗透浓缩到5％，为下一步酶活过程准备。5.2.完整红酵母股薄肌细胞催化DAOC到戊二酰-7-ADCA的生物转化
包含35克/升DAOC的100升A.chrysogenumΔcefEF-cefE发酵液调节到pH7.5，按照已报道的方法(Cambiaghi等1991.EP 496993)在同一发酵罐中添加5公斤红酵母股薄肌细胞ATCC26217浓缩液，相当于500000个DAO单位。生物转化反应在25℃、轻微搅拌、并通过置于发酵罐底部的扩散孔鼓氧(1vol/vol/min)下进行。自动添加5％的氢氧化铵保持pH7.5，90-120分钟后，DAOC完全转化为戊二酰-7-ADCA。
接着，用截留分子量30000Da膜的超滤系统分离出发酵固体，其中主要包含A.chrysogenum细胞和红酵母股薄肌细胞以及发酵培养基中含量不定的不溶物质。超滤完成后，为了将酮基己二酰-7-ADCA转化为戊二酰-7-ADCA，搅拌下加入10毫升过氧化氢(H2O2)至浓度为3.5％每升滤液。混合物在25℃保温15分钟，加入50克丙酮酸钠。该处理后，所有酮基己二酰7-ADCA完全转化为戊二酰-7-ADCA，得到1％的戊二酰-7-ADCA溶液。得到的溶液反渗透浓缩到约5％戊二酰-7-ADCA。5.3.提取戊二酰-7-ADCA
将1升异丁基醋酸盐加入1升戊二酰-7-ADCA溶液中，剧烈搅拌，冷却到0-5℃。接着，搅拌加入2N硫酸直到溶液pH达到1.5，物相迅速分离。用新的异丁基醋酸盐重复该过程，维持温度0-5℃之间，提尽戊二酰-7-ADCA的水相。把两次得到的富异丁基醋酸盐溶液混合，用0.75升pH8.0 25mM磷酸缓冲液提取。溶液用2N氢氧化钠调节pH8.0，物相分离。有机相用0.25升pH8.0 25mM磷酸缓冲液冲洗，洗尽戊二酰-7-ADCA。合并获得的含50克/升戊二酰-7-ADCA的水相提取液，直接进行接下来的酶活转化，或者将它们真空蒸馏去除有机溶剂，从而增加下面酶活转化的催化寿命。实施例6.戊二酰-7-ADCA到7-ADCA的生物转化6.1.用固定化戊二酰基转移酶催化戊二酰-7-ADCA转化到7-ADCA
含7.5克戊二酰-7-ADCA的150毫升戊二酰-7-ADCA溶液在25℃在存在固定于Eupergit C的30克戊二酰转移酶(31U/g湿重)下培养。反应混合物搅拌反应60分钟，通过自动增加5％铵盐溶液保持pH8.0。最后，超过98％的戊二酰-7-ADCA转化为7-ADCA。生物催化剂用过滤器分离回收，用25毫升水洗涤，能重用至少100个循环的新生物转化(Cambiaghi等1991.EP 496993)。6.2.7-ADCA的提取
175毫升从戊二酰-7-ADCA转化为7-ADCA的转化溶液用3克活性碳室温处理20分钟，搅拌去除杂质，并使终产物脱色。过滤去除碳，用10毫升水洗涤。过滤的溶液添加6N硫酸调节pH4.5以便7-ADCA开始结晶，缓慢搅拌培养15分钟以便开始结晶。温度降到5-10℃，最后用6N硫酸调节pH至3.8。经过两个小时培养后，过滤提取沉淀，用25毫升水洗涤。产物结晶率为95.5％，得到的7-ADCA纯度为98.3％。6.3.7-ADCA的纯化和结晶
125毫升二氯甲烷加入到875毫升7-ADCA溶液中，温度降到0-5℃，加入6N硫酸快速搅拌调节pH至0.8。轻轻倾倒或离心将物相分离，水相用125毫升二氯甲烷再次洗涤。该操作目的在于该条件下用二氯甲烷提取以便去除疏水物质和酸性物质，从而容易获得更纯的最终产物。由此得到的水相再用3克活性碳搅拌处理20分钟，去除杂质和脱色。最后过滤去除活性碳，用10毫升水洗涤。过滤的溶液用2N氨水调节pH3.0，为7-ADCA结晶准备。然后缓慢搅拌15分钟，用2N氢氧化铵调pH3.7，温度5-10℃。两小时后，过滤提取沉淀，用25毫升水洗涤。产物结晶率为94％，得到7-ADCA纯度为98.5％。实施例7.A.chrysogenumΔcefEF-cefE-dao-gla和A.chrysogenumΔcefEF-cefE-cac产生7-ADCA
以先前的描述做基础，可以构建一个生物合成操纵子直接从A.chrysogenum发酵生产7-ACA(Isogai等1991.Biotechnology 9：188-91)。所述系统基于分别在A.chrysogenum中表达镰刀霉菌和缺陷型假单孢菌的编码DAO和GLA酶活的基因(cDNA)。同样的方法应用于A.chrysogenumΔcefEF-cefE菌株，可以构建一个生物合成操纵子，直接从A.chrysogenumΔcefEF-cefE-dao-gla发酵生成7-ADCA。在这个例子中，A.chrysogenumΔcefEF-cefE不可能生成CPC，取代7-ACA的生物合成产物是7-ADCA。A.chrysogenumΔcefEF-cefE-dao-gla发酵生成的7-ADCA可以按照实施例6所述的方法纯化。
附图简述
图1A-B.构建用于阻断A.chrysogenum的cefEF基因的质粒pALC73的图示。首先，包含A.chrysogenum cefEF和cefG基因的质粒pExp7.2BB亚克隆到XhoI位点预先失活的pBCKS(+)质粒的BamHI位点上。得到的质粒命名为pALC72。接着，潮霉素抗性基因(hygR)插入到cefEF基因的XhoI位点上，得到pALC73。这个14.6kb的质粒含有氯霉素抗性基因(CmR)作为大肠杆菌中的选择标记，以及潮霉素抗性基因(hygR)作为A.chrysogenum中的选择标记。hygR基因包含trpC(色氨酸C)终止子，在gpd(甘油醛-3-磷酸-脱氢酶)的启动子控制下表达。
图2阻断A.chrysogenum cefEF基因的图示。质粒pALC73双重组整合到一个cefEF基因失活的A.chrysogenum染色体中。图的下部分显示cefEF基因阻断的A.chrysogenum克隆的Southern分析。父菌株的DNA用BamHI酶切得到的杂交带在cefEF基因失活的转化菌株中变为5.7kb和5.3kb两条带。同样的，父菌株0.5kb的SalI酶切杂交带在阻断cefEF基因的转化菌株中变为另一个2.2kb的条带。阻断的转化菌株命名为A.chrysogenum A cefEF T1，A.chrysogenum A cefEF T2和A.chrysogenumΔcefEF T3。P对应A.chrysogenum的父菌株，T1，T2和T3对应cefEF基因失活的A.chrysogenum转化菌株。
图3用带棒状链霉菌NP1的细胞酶提取液将青霉素N酶扩环为DAOC。图的上部分显示时间为零时的反应体系的色谱图，底部是两小时后的色谱图。横坐标是反应时间(分钟)。纵坐标是光密度OD值。
图4A-B构建pALE38质粒的示意图，该质粒在T7启动子控制下在大肠杆菌中表达诺卡氏菌的cefE基因。
图5A-B A.chrysogenumΔcefEF T1产出的青霉素N的质量液相色谱分析。图上半部分显示214纳米的色谱图，下部显示11.92分钟洗脱的峰的质谱。
图6A-B构建pALC88质粒的示意图，该质粒在P.chrysogenumpcbC基因的启动子控制下，在A.chrysogenum中表达带棒状链霉菌的cefE基因。
图7A-B构建pALC93和pALC94质粒的示意图，所述质粒在A.巢曲菌gpdA基因的启动子控制下，在A.chrysogenum中表达带棒状链霉菌的cefE基因。
图8A-B构建pALC85和pALC86质粒的示意图，所述质粒在P.chrysogenum pcbC基因启动子的控制下，在A.chrysogenum中表达N.乳胺菌的cefE基因。
图9A-B构建pALC90和pALC91质粒的示意图，该质粒在A.巢曲菌的gpdA基因启动子的控制下，在，A.chrysogenum中表达N.乳胺菌的cefE基因。
              序列表<110>抗生素有限公司<120>7-氨基去乙酰氧基头孢菌素酸(7-ADCA)的制备方法<130>PCT-66<150>ES 9901365<151>18.06.1999<160>3<210>SEQ ID NO：1<211>33<212>DNA<213>带棒状链霉菌<220>合成带棒状链霉菌cefE基因5’端的寡聚核酸片段<400>
 GATCAGTGAG AGTCCATGGA CACGACGGTG CCC    33<210>SEQ ID NO.2<211>33<212>DNA<213>带棒状链霉菌<220>合成带棒状链霉菌cefE基因5’端互补链的寡聚核酸片段<400>GGGCACCGTC GTGTCCATGG ACTCTCACTG ATC  33

Claims (37)

1.一种生产7-氨基去乙酰氧基头孢菌素酸(7-ADCA)的方法，特征在于它包括以下几个操作步骤：
a)失活，在生产头孢菌素C的A.chrysogenum菌株中，存在由cefEF
基因编码的酶活去乙酰氧基头孢菌素C合成酶/去乙酰头孢菌素C
合成酶(DAOCS/DACS)，通过将该基因阻断，构建一种生产青
霉素N的菌株；
b)表达，在上述生产青霉素N的菌株中，表达编码酶活去乙酰氧
基头孢菌素C合成酶(DAOCS)的cefE基因，构建一种生产去
乙酰氧基头孢菌素C(DAOC)的菌株；
c)在生产DAOC的条件下，培养产DAOC的菌株，并且纯化产
生的DAOC；
d)用D-氨基酸-氧化酶(DAO)将产生的DAOC生物转化为戊二酰-
7-ADCA；
e)用戊二酰基转移酶(GLA)将戊二酰-7-ADCA生物转化为7-
ADCA；
f)纯化生物转化产生的7-ADCA。
2.按照权利要求1的方法，特征在于步骤(d)和(e)通过在cefEF基因已预先失活而cefE基因已表达的A.chrysogenum菌株中表达分别编码酶活D-氨基酸-氧化酶(DAO)和戊二酰基转移酶(GLA)的dao基因和gla基因进行，得到生产7-ADCA的菌株，在生产7-ADCA的条件下培养所述菌株。
3.按照权利要求1的方法，特征在于(d)和(e)步骤通过在cefEF基因已预先失活而cefE基因已表达的A.chrysogenum菌株中表达编码酶活头孢菌素酰基转移酶(CAC)的cac基因，得到生产7-ADCA的菌株，在生产7-ADCA的条件下培养所述菌株。
4.一种生产青霉素N的方法，特征在于权利要求1至3描述的方法中，一旦步骤(a)终止，所有操作即中断。
5.一种DNA化合物，其由pALC73限制性酶切图谱描述，该图谱包含用潮霉素抗性基因(hygR)失活的cefEF基因。
6.携带有权利要求5所述的DNA化合物或其片段的载体。
7.按照权利要求6的载体，特征在于它们为一种质粒。
8.按照权利要求7的质粒，特征在于它为pALC73。
9.转化的宿主微生物，特征在于它们具有通过导入权利要求5的DNA化合物而被阻断的cefEF基因，所述DNA化合物全部或部分包含于权利要求6到8的载体中。
10.按照权利要求9的转化的宿主微生物，特征在于它为原核生物，优选大肠杆菌或放射菌。
11.按照权利要求10的转化的宿主微生物，特征在于它是以CECT5151或其突变株或其转化衍生株为代表的纯大肠杆菌。
12.按照权利要求9的转化的宿主微生物，特征在于它是真核生物，优选顶孢霉属或青霉属。
13.按照权利要求12的转化的宿主微生物，特征在于它为金黄顶孢霉属(Acremonium chrysogenum)或金黄青霉属(Penicilliumchrysogenum)。
14.按照权利要求13的转化的宿主微生物，特征在于它为金黄顶孢霉属或其突变株或其转化衍生株的纯种菌株。
15.一种获得青霉素N产量提高的转化微生物的方法，特征在于包括下列操作步骤：
a)构建携带全部或部分权利要求5所述DNA化合物或其重组DNA
化合物的载体；
b)将上述载体导入A.chrysogenum菌株，使cefEF基因功能失活；
c)筛选出使青霉素N产量和没有转化的对照菌株相比增加的转化
菌株。
16.按照权利要求15的获得转化微生物的方法，特征在于构建的载体是权利要求6到8中描述的那些。
17.按照权利要求16的方法，其中转化的宿主微生物是权利要求9到14描述的那些。
18.一种生产去乙酰氧基头孢菌素C(DAOC)的方法，特征在于权利要求1到3描述的步骤中，一旦(c)步骤终止，任何步骤即中断。
19.按照权利要求18的方法，其中(b)步骤中使用由pALC88限制性酶切图谱描述的DNA化合物，其包括在P.chrysogenum pcbC基因启动子控制下表达的带棒状链霉菌cefF基因。
20.按照权利要求18的方法，其中(b)步骤中使用由pALC85限制性酶切图谱描述的DNA化合物，其包括在P.chrysogenum pcbC基因启动子控制下表达的N.乳胺菌的cefE基因。
21.按照权利要求18的方法，其中(b)步骤中使用由pALC86限制性酶切图谱描述的DNA化合物，其包括在P.chrysogenum pcbC基因启动子控制下表达的N.乳胺菌的cefE基因。
22.按照权利要求18的方法，其中(b)步骤中使用由pALC93限制性酶切图谱描述的DNA化合物，其包括在A.巢曲菌gpdA基因启动子控制下表达的带棒状链霉菌的cefE基因。
23.按照权利要求18的方法，其中(b)步骤中使用由pALC94限制性酶切图谱描述的DNA化合物，其包括在A.巢曲菌gpdA基因启动子控制下表达的带棒状链霉菌的cefE基因。
24.按照权利要求18的方法，其中(b)步骤中使用由pALC90限制性酶切图谱描述的DNA化合物，其包括在A.巢曲菌gpdA基因启动子控制下表达的N.乳胺菌的cefE基因。
25.按照权利要求18的方法，其中(b)步骤中使用由pALC91限制性酶切图谱描述的DNA化合物，其包括在A.巢曲菌gpdA基因启动子控制下表达的N.乳胺菌的cefE基因。
26.一种携带权利要求19到25描述的DNA化合物或其片段的载体。
27.按照权利要求26的载体，特征在于它们为质粒。
28.按照权利要求27的质粒，特征在于它们选自pALC85、pALC86、pALC88、pALC90、pALC91、pALC93、或pALC94。
29.转化的宿主微生物，特征在于它们具有阻断的cefEF基因并且它们生产青霉素N，其中通过导入权利要求19到25的DNA化合物表达了cefE基因，而权利要求19到25的DNA化合物全部或部分包含于权利要求26到28的载体中。
30.按照权利要求29的转化的宿主微生物，特征在于它是原核生物，优选大肠杆菌或放线菌。
31.按照权利要求30的转化的宿主微生物，特征在于它是由CECT5151或其突变株或其转化衍生株代表的大肠杆菌纯种菌株。
32.按照权利要求29的转化的宿主微生物，特征在于它是真核生物，优选顶孢霉属或青霉属。
33.按照权利要求32的转化的宿主微生物，特征在于它是金黄顶孢霉菌或者金黄青霉菌。
34.按照权利要求33的转化的宿主微生物，特征在于它是金黄顶孢霉菌或其突变株或其转化衍生株的纯种菌株。
35.一种获得去乙酰氧基头孢菌素C(DAOC)产量提高的转化微生物的方法，特征在于包括以下操作：
a)构建具有全部或者部分权利要求19到25所述DNA化合物或其重组DNA化合物的载体；
b)将上述载体导入cefEF基因已失活的A.chrysogenum菌株；
c)筛选去乙酰氧基头孢菌素C(DAOC)产量和未转化对照菌株
相比增加的转化菌株。
36.按照权利要求35的获得转化微生物的方法，特征在于构建的载体是权利要求26到28中描述的那些。
37.按照权利要求36的方法，其中转化的微生物是权利要求29到34描述的那些。
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