CN112831421A - 一种头孢菌素类化合物生产菌株及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种生产头孢菌素类化合物的菌株及其制备方法，还提供了该菌株发酵生产的DAOC并进一步制备7‑ADCA的方法，通过该菌株发酵生产的DAOC产量高、色纯高，质量优异，有利于进一步制备生产7‑ADCA，为7‑ADCA环保、稳定的工业化生产提供了新手段。

Description

一种头孢菌素类化合物生产菌株及其应用

技术领域

本发明属于微生物发酵工程领域，具体涉及一种头孢菌素类化合物生产菌株及其应用。

背景技术

头孢菌素是一类具有重要治疗意义的抗生素，属β-内酰胺类抗生素家族成员，目前占我国抗生素药物市场份额高达51％。工业上用顶头孢霉菌发酵制备或者将青霉素的四氢噻唑环化学扩环形成双氢噻嗪环制备。在β-内酰胺和双氢噻嗪环的各个位置插上侧链可以合成大量具有更强抗生能力或药物动力学性质改善的头孢菌素。近年来，对于制备这类半合成抗生素已经表现出越来越浓厚的兴趣，并在它们的制备工艺和方法上产生了许多优化和创新。

7-氨基去乙酰氧基头孢烷酸(7-ADCA)是制头孢氨苄、头孢羟氨苄、头孢拉定等半合成头孢菌素的重要中间体，与7-氨基头孢烷酸(7-ACA)相比，在3位消除了不稳定的乙酰氧基，具有广泛的应用前景。目前7-ADCA的合成主要是化学合成法，由价廉易得的青霉素G(或V)经酯化、扩环重排、酶解去侧链而得。其反应过程包括青霉素G在低温下经过氧乙酸氧化后用双-三甲基硅脲进行酯化保护；吡啶和溴乙酰作用下加热进行开环、脱水、分子重排产生6-元的头孢菌素环结构；水解去三甲基硅后酰化酶水解脱侧链得到7-ADCA。然而，化学合成不可避免地存在化学溶剂的毒性和污染的问题。

专利US5354667、EP0496993、EP0843015等都公开了在DAO和GLA酶的催化下，将乙酰氧头孢菌素C(DAOC)转化成7-ADCA的方法，但均没有用于工业生产中。DAOC可以从头孢菌素C(CPC)发酵过程中获得，然而，CPC发酵过程的产物中还包括有CPC、去乙酰头孢菌素C(DCPC)等物质，DAOC是CPC发酵过程中的副产物，CPC的结构类似物，因此在发酵中无法得到单纯的DAOC产物。公开号为CN1357051A的专利，公开了一种将A.chrysogenum菌株的cefEF基因失活，表达cefE基因得到的新菌株，能使DAOC的产量提高，而DAOC是主要的头孢菌素。但是，通过基因工程的方法改造菌株具有很大的不稳定性。

利用微生物发酵的方法获得产量高、纯度高的DAOC，将为7-ADCA的合成提供重要的新途径。微生物的诱变筛选是获得高产高效的优良工业菌株的重要手段，但是目前，还未有通过诱变方法得到产量高、色纯高的产DAOC菌株的方法报道。

发明内容

本发明菌株通过诱变选育得到产DAOC的菌株，通过酶法将DAOC侧链切除后由DAOC制备7-ADCA，减少了化学合成法中的化学溶剂有毒性和污染问题，同时解决了基因工程方法改造菌株不稳定的问题，具有非常重大的工业生产价值。

本发明目的是提供一种头孢菌素类化合物生产菌株及其应用。

同时本发明要解决的技术问题之一在于提供一种顶头孢霉菌(Cephalosporiumacremonium)及其诱变选育方法，使其发酵产物DAOC大幅度提高。

本发明要解决的技术问题之二在于提供所述顶头孢霉菌发酵产DAOC进一步合成7-ADCA的应用。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：

一种头孢菌素类化合物生产菌株，其为顶头孢霉菌(Cephalosporiumacremonium)B-1822-S-04的突变体菌株，名称为D-G3-B-2001，已于2020年9月20日，保藏于中国微生物菌种保藏管理中心CGMCC，保藏编号为CGMCC NO:20270。

本发明所述的顶头孢霉菌D-G3-B-2001的筛选方法是：顶头孢霉菌B-1822-S-04出发菌株，通过化学和物理相结合的复合诱变的方法使其突变，诱变通过摇瓶进行反复筛选，直至筛选到目标菌株，即顶头孢霉菌D-G3-B-2001。

本发明诱变得到的顶头孢霉菌D-G3-B-2001的形态学及生理生化特征如下：

菌落颜色：淡黄色

需氧方式：好氧

菌落大小：1-3mm

适宜生长温度：25-30℃；

适宜生长pH:4.5-6.5

菌落形态：圆形

本发明还提供通过诱变获得顶头孢霉菌D-G3-B-2001的方法，具体步骤如下：

1)制备孢子悬液：将顶头孢霉菌B-1822-S-04菌株经活化培养后，刮取孢子与无菌水混合研磨后，用双层无菌脱脂棉过滤，制得孢子悬液，并控制孢子总数为10⁸个/ml。

2)制备诱变培养基：平板培养基配制，其中控制培养基pH6.0，配制盐酸羟胺溶液，并经0.22um过滤膜过滤后，待培养基灭菌后加入，并控制盐酸羟胺的终浓度分别为0.1mol/L、0.5mol/L、1.0mol/L。

3)诱变处理：将步骤1所述孢子悬液置于距紫外灯30cm处，分别照射60S、90S、120S后，进行10倍梯度系列稀释，分别取10^-1至10^-6的稀释浓度涂布于含0.1mol/L、0.5mol/L、1.0mol/L盐酸羟胺的平板培养基上，然后避光培养8-14天，统计菌落数并计算致死率。经过多批次诱变处理，共筛选单克隆菌株1000株以上的菌株进行摇瓶发酵筛选。

4)4)摇瓶筛选：a:将步骤3中的诱变单克隆菌株接种于平板或斜面置于28±1℃，50％±5％RH环境中，培养8-14天。进行平板培养。b：摇瓶一级种子培养:由培养好的平板或斜面孢子，经挖块后接入装有30ml摇瓶种子培养基的300ml三角瓶中，于25-30℃，230r/min摇床培养60-72小时。c:摇瓶二级种子培养：将培养合格的摇瓶一级种子按5％-10％的移种量，转接至装有30ml二级种子培养基的300ml三角瓶中，于25-30℃，230r/min摇床培养30-55小时。d:摇瓶发酵培养：将二级种子液3ml接入装有27ml发酵培养基的300ml挡板三角瓶中，于25-30℃，210r/min摇床培养30-55小时后，变温至28℃，培养至80-100小时后，每瓶补加1.5ml豆油，培养6-7天放瓶,高效液相色谱检测，测定DAOC的含量，筛选出发酵产DAOC含量高的顶头孢霉菌作在经过稳定性筛选后作为第二轮诱变筛选的出发菌株，重复上述步骤，经过两次复合诱变和稳定性筛选即得顶头孢霉菌D-G3-B-2001。

所述步骤2)中平板培养基包含氧化淀粉10-20g/L，硫酸镁0.2-0.8g/L，甘氨酸1-2g/L，硫酸铵10-15g/L，磷酸二氢钾0.5-1.0g/L，酵母萃取物3-5g/L，蛋白胨5-7g/L，硫酸钙3-6g/L，琼脂15-25g/L，pH6.6-7.0。

所述步骤4)中一级种子培养步骤中的培养基包含酵母提取物1-3g/L，蛋白胨1-3g/L，葡萄糖1-2g/L，磷酸氢二钾1-2g/L，磷酸二氢钾0.2-.8g/L。

所述二级种子培养步骤中的培养基包含黄豆粉25-35g/L，牛肉浸膏25-35g/L，玉米浆15-25g/L，蔗糖25-35g/L，葡萄糖5-15g/L，碳酸钙3-7g/L，pH7.0±0.05。

所述摇瓶发酵培养步骤中的培养基包含花生粉25-35g/L，牛肉浸膏25-35g/L，玉米蛋白粉30-40g/L，玉米浆10-20g/L，玉米粉15-25g/L，缬氨酸5-10g/L，硫酸铵.0.8-1.2g/L，碳酸钙12-18g/L，液化糖40-60g/L，棉籽油100-200g/L，pH7.2±0.05。

本发明发酵所用的顶头孢霉菌D-G3-B-2001，已于2020年9月20日，保藏于中国微生物菌种保藏管理中心CGMCC，保藏编号为CGMCC NO:20270。

本发明还提供一种所述顶头孢霉菌D-G3-B-2001发酵产DAOC的方法，包含如下步骤：

1)发酵：

a种子液培养：①母斜面孢子制备：将冷冻保存在砂土管中的顶头孢菌D-G3-B-2001孢子，接种于灭菌的斜面培养基上，在温度28-34℃条件下，培养7-9天；②子斜面孢子制备：将母斜面孢子，接种于灭菌的斜面培养基上，在温度28-34℃条件下，培养7-9天；③种子培养：将子斜面孢子，接种于灭菌的液体种子培养基中，经过三级种子扩大培养，得到种子液；

b发酵液培养：将种子液按15-40％体积比接种于灭菌的培养基中，通入无菌空气并开启搅拌，溶氧控制在10-45％，并添加营养物质，在温度25-30℃条件下，pH控制在5.0-6.0之间，培养140-165小时后，得发酵液。

所述发酵培养基包括如下成分：玉米浆39-76重量份、花生粉9-21重量份、葡萄糖4-13重量份、水解淀粉19-31重量份、缬氨酸2-9重量份、植物油49-71体积份、消沫剂1.4-4体积份；

从发酵液中分离得到含有DAOC的滤液：发酵液除渣后，用浓度为20％的浓硫酸调pH为2.0-2.8，采用50nm-100nm孔径的陶瓷膜过滤，过滤液用超滤膜过滤，超滤膜滤液用200分子量的纳滤膜进行浓缩，得到浓缩液，浓缩液通过DM700大孔树脂吸附，解析，脱色、纳滤浓缩得到DAOC浓缩液，通过高效液相色谱进行检测，浓缩液中DAOC色纯为90-96％以上，通过IR、13C-NMR、1H-NMR、COSY、HSQC、HMBC、MS进行确证化学结构的研究，其结果见实例5。

本发明进一步提供由上述发酵获得的DAOC合成7-ADCA的方法，包含如下步骤：将上述步骤2)中的DAOC浓缩液通过CPC酰化酶酶解，酶解过程使用氨水控制反应pH 8.2-8.4，反应温度维持在8-10℃，反应时间控制30-60分钟以上。将酶解后酶解液进行活性炭脱色，脱色后调节pH至2.5-5.2进行结晶，结晶完成后经过抽滤洗涤，45-55℃干燥得到7-ADCA产品，通过高效液相色谱进行检测，7-ADCA、D-7ACA和DAOC的含量分别为99.0-99.9％、0.01-0.25％、0.01-0.25％。

综上，本发明菌株能够提高顶头孢霉菌发酵液中DAOC的色纯，同时进一步通过DAOC酶解得到7-氨基-3-脱乙酰氧基头孢烷酸(7-ADCA)，是目前首次用于工业生产放大，具有重要工业生产价值。

生物材料保藏

本发明的顶头孢霉菌(Cephalosporium acremonium)D-G3-B-2001已于2020年9月20日，保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC，地址：中国，北京，中国科学院微生物研究所)，保藏编号为CGMCC NO:20270。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

附图说明

图1为实施例1头孢菌素C发酵液的高效液相色谱图。

图2为实施例1菌株D-G3-B-2001发酵液的高效液相色谱图。

图3为实施例3复合诱变结果统计图。

图4为实施例3筛选菌株效价对比图。

图5为实施例3 DAOC的结构图。

图6为实施例3 DAOC的IR光谱谱图。

图7为实施例3 DAOC的H-NMR谱图。

图8为实施例3 DAOC的C-NMR谱图。

图9为实施例3 DAOC的gCOSY谱图。

图10为实施例3 DAOC的gHSQC谱图。

图11为实施例3 DAOC的gHMBC谱图。

图12为实施例3 DAOC的质谱图。

图13为实施例3 7-ADCA产品高效液相图谱

具体实施方式

在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。为了更好地理解本发明，下面提供相关术语的定义和解释。

本发明中，DAOC指乙酰氧头孢菌素C，DCPC指去乙酰头孢菌素C，7-ADCA指7-氨基去乙酰氧基头孢烷酸。

本发明中，术语“培养”指允许微生物在人工控制的条件下生长。多种本领域熟知的方法可用于培养本发明的菌株，可以用分批方法或连续方法如补料分批方法或重复补料分批方法培养，但本发明不限于此。

用于培养的培养基必须满足所使用菌种的要求。培养基的碳源可以是：可溶性淀粉、糊精、谷元粉、液化糖、葡萄糖等。用于培养本发明菌株的氮源可以是：花生饼粉、黄豆饼粉、玉米粉、蛋白胨、玉米浆、硫酸铵等。培养基的其他成分可包括氯化钠、硫酸钙、碳酸钙等。上述这些材料可以单独或组合使用。

本发明中，“具有[规定菌株的]鉴定特征的菌株”，或“具有[规定菌株的]鉴定特征的培养物”，包括规定菌株的同源物或突变体，与规定菌株紧密相关(即与其享有共同祖先)或来源于规定菌株，但通常与规定菌株在一种或多种基因型或表型特征上有差异。通常通过遗传差异的评估，可鉴定突变体。具有鉴定特征的菌株，包括具有规定菌株的所有鉴定特征(例如，对应于规定菌株的DNA指纹的基于DNA分析的DNA指纹)的同源菌株或突变菌株。

本发明中，术语“培养物”指通过将微生物进行生长和/或扩增而获得的产物，其可以是微生物的生物学纯培养物，也可以含有一定量的培养基、代谢物或培养过程中产生的其他成分，只要这些成分不会实质上影响该培养物生产产物的活性。术语“培养物”还包括通过将微生物传代而获得的传代培养物，其可以是某一代的培养物，也可以是若干代的混合物。所述(传代)培养物产生头孢菌素类化合物的能力与本发明的D-G3-B-2001基本上相同。

本发明中，术语“生物学纯的培养物”指基本没有生物污染的并具有遗传一致性从而使得从中取得的不同传代培养物将呈现基本相同的基因型和表型的培养物(例如，培养物具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、最高100％纯的纯度)。

本发明中，通过“衍生”获得的菌株指通过任何方式的转化，例如通过一次或更多次的杂交和/或通过变异和/或通过转基因而衍生出的菌株。

通过杂交衍生出的菌株可通过将根据本发明的菌株与相同菌株或另一种根据本发明的菌株，或者任何其他的菌株进行杂交来获得。

通过变异衍生出的菌株可以为经过至少一次其基因组中的自发变异或经过通过例如致突变而诱发的至少一次变异的菌株。所述衍生菌株的变异是或不是无声的。用表述“致突变”表示通过辐射(例如紫外线)或致突变化学品得到的标准的致突变，和通过转座或外源DNA片段的整合实现的插入诱变。通过射线致突变包括使用紫外线、X射线或伽马射线。致突变化学物质例如EMS(乙基-甲基磺酸酯)、EES(乙基-乙基磺酸酯)、亚硝基胍、亚硝酸、黄曲霉素B1，羟胺、5-溴-尿嘧啶、2-氨基-嘌呤、前黄素、吖啶橙。

通过转基因衍生出的菌株为引入外源DNA的菌株。所述外源DNA优选通过质粒引入或直接整合到基因组中。

本发明中，术语“同源性”指多核苷酸或多肽与另一序列有一定百分数的“序列同一性”(sequence identity)。在比较两个序列时，当联配时，这些百分数的碱基或氨基酸是相同的。可以用本领域中已知的软件程序来确定这种联配和同源性百分数或序列同一性，例如描述于CURRENT PROTOCOLS INMOLECULAR BIOLOGY(F.M.Ausubel等人编辑，1987)增刊30，7.7.18部分中的那些程序。优选的联配程序是ALIGN Plus(ScientificandEducational Software，Pennsylvania)，优选地应用缺省参数，如下：错配＝2；开放空位(open gap)＝0；延伸空位(extend gap)＝2。可以应用的另一序列软件程序是TFastAData Searching Program，可以从SequenceAnalysis Software Package版本6.0(GeneticComputer Group，Universityof Wisconsin，Madison，WI)得到。

本发明中，术语“同等或更高的DAOC和DCPC生产能力”中同等的DAOC和DCPC生产能力指在相同的条件下培养时，与衍生前的真菌宿主细胞相比，改变的真菌细胞中的头孢菌素类化合物的产生量或摇瓶效价与改变前相同，或变化量不大于±5％、±4％、±3％、±2％、±1％或更小；更高的的DAOC和DCPC生产能力指上述变化为增加至少6％、10％、15％、20％、30％、40％、50％、60％或更多。

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

实施例1、菌株诱变筛选

本发明菌株D-G3-B-2001是通过诱变筛选得到，诱变方法如下：

(1)制备孢子悬液：将顶头孢霉菌菌株经活化培养后，刮取孢子与无菌水混合研磨后，用双层无菌脱脂棉过滤，制得孢子悬液，并控制孢子总数为10⁸个/ml。

(2)制备诱变培养基：配制平板培养基，控制培养基pH为5.5-6.5，灭菌；同时配制盐酸羟胺(HA)溶液，经0.22um过滤膜过滤后，加入灭菌后的培养基中，并控制盐酸羟胺的终浓度分别为0.1mol/L、0.5mol/L、1.0mol/L。

(3)诱变处理：将步骤1所述孢子悬液置于距紫外灯30cm处，分别照射60S、90S、120S后，进行10倍梯度系列稀释，分别取10^-1至10^-6的稀释浓度涂布于含0.1mol/L、0.5mol/L、1.0mol/L盐酸羟胺的平板培养基上，然后避光培养8-14天。

表1：双因子诱变条件

按照该方法中的诱变条件进行诱变后，不同复合诱变条件下菌株突变情况见图3：随着UV处理时间和HA底物浓度增加，致死率急剧上升，当UV处理时间为120S、HA底物浓度0.5mol/L时，突变效果最佳。

通过对诱变后的菌株进行单克隆摇瓶发酵筛选，筛选培养方法如下：

(1)平板培养：将接种好的孢子平板或斜面置于28±1℃，50％±5％RH环境中，培养8-14天。

(2)摇瓶一级种子培养：由培养好的平板或斜面孢子，经挖块后接入装有30ml一级种子培养基的300ml三角瓶中，于28℃，230r/min回转式摇床培养72小时。

摇瓶二级种子培养：将培养合格的摇瓶一级种子按10％的移种量，转接至装有30ml二级种子培养基的300ml三角瓶中，于28℃，230r/min回转式摇床培养48小时。

(3)摇瓶发酵培养：将二级种子液3ml接入装有27ml发酵培养基的300ml挡板三角瓶中，于30℃，210r/min回转式摇床培养48小时后，变温至28℃，培养至96小时后，每瓶补加1.5ml豆油，培养6-7天放瓶，测定DAOC含量。

所述步骤(1)中平板培养的培养基包含氧化淀粉10g/L，硫酸镁0.3g/L，甘氨酸1g/L，硫酸铵14g/L，磷酸二氢钾0.6g/L，酵母萃取物5g/L，蛋白胨6g/L，硫酸钙3g/L，琼脂20.0g/L，pH6.6-7.0。

所述步骤(2)一级种子培养的培养基包含酵母提取物2g/L，蛋白胨1.5g/L，葡萄糖1.0g/L，磷酸氢二钾1.25g/L，磷酸二氢钾0.5g/L。

所述步骤(2)二级种子培养的培养基包含黄豆粉33g/L，牛肉浸膏34g/L，玉米浆15g/L，蔗糖25g/L，葡萄糖5g/L，碳酸钙5g/L，pH7.0±0.05。

所述步骤(3)发酵培养的培养基包含花生粉35g/L，牛肉浸膏25g/L，玉米蛋白粉40g/L，玉米浆10g/L，玉米粉25g/L，缬氨酸10g/L，硫酸铵1g/L，碳酸钙10g/L，液化糖40g/L，棉籽油200g/L，pH7.2±0.05。

诱变后通过摇瓶发酵筛选得到D-G-03菌株，其摇瓶发酵DAOC含量最高，DAOC含量高于出发菌株3倍以上(图4)，确定其是高产DAOC菌株，并将该菌株作为出发菌株，进行二次诱变、分离。经过两次复合诱变和稳定性筛选，获得一株摇瓶发酵液中DAOC的色纯在筛选菌株中最高突变菌株，见图1、图2，该菌株命名为D-G3-B-2001。

本发明获得顶头孢霉菌(Cephalosporium acremonium)D-G3-B-2001，于2020年9月16日，保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC，地址：中国，北京，中国科学院微生物研究所)，保藏编号为CGMCC NO:20270。

实施例2菌株发酵液的发酵方法

本发明菌株D-G3-B-2001发酵液的发酵方法可参考发明专利申请号为201210310799.5：一种头孢菌素C的发酵方法以及顶头孢霉发酵培养基进行，该专利公开内容作为本发明的一部分引入本发明。

作为其中一个实施例，该培养和发酵方法可包括如下步骤：

(1)种子液培养：①母斜面孢子制备：将冷冻保存在砂土管或甘油管中的顶头孢菌孢子，接种于灭菌的斜面培养基上，在温度28-34℃条件下，培养7-9天；②子斜面孢子制备：将母斜面孢子，接种于灭菌的斜面培养基上，在温度28-34℃条件下，培养7-9天；③种子培养：将子斜面孢子，接种于灭菌的液体种子培养基中，经过三级种子扩大培养，得到种子液；

(2)取步骤(1)制备三级种子液按15-40％体积比接种至灭菌的顶头孢霉菌发酵培养基中发酵，发酵培养过程中，温度控制在25-30℃之间，pH控制在5.0-5.5之间，为维持溶解氧在25％以上，通过空气流量和搅拌转速相结合的方式进行控制，培养5-8天后得到发酵液。

所述发酵培养基包括如下成分：玉米浆39-76重量份、花生粉9-21重量份、葡萄糖4-13重量份、水解淀粉19-31重量份、缬氨酸2-9重量份、植物油49-71体积份、消沫剂1.4-4体积份；

将步骤(2)所得到的发酵液通过高效液相色谱进行检测，发酵液中DAOC色纯为70-90％，DCPC色纯为5-10％。

实施例3、头孢菌素类化合物的提取方法

本发明从实施例2中D-G3-B-2001发酵液中制备头孢菌素类化合物的方法，可参考发明专利CN102408462A进行，该专利公开内容作为本发明的一部分引入本发明。

作为其中一个实施例，该制备方法可包括如下步骤：

(1)发酵液浓缩：发酵液除渣后，用浓度为20％的浓硫酸调pH为2.0-2.8，采用50nm-100nm孔径的陶瓷膜过滤，过滤液用超滤膜过滤，超滤膜滤液用200分子量的纳滤膜进行浓缩，得到浓缩液，浓缩液通过DM700大孔树脂吸附，解析，脱色、纳滤浓缩得到DAOC浓缩液，通过高效液相色谱进行检测，发酵液中DAOC色纯为96％以上，通过IR、13C-NMR、1H-NMR、COSY、HSQC、HMBC、MS进行确证化学结构的研究，DAOC的结构见图5，测试结果见图6-12。具体测试数据结果见表1-4。

(2)DAOC合成7-ADCA：DAOC浓缩液通过CPC酰化酶酶解，每公斤DAOC浓缩液使用8000-10000单位酰化酶，酶解过程使用氨水控制反应pH8.2-8.4，反应温度维持在8-10℃，反应时间控制60分钟以上。将酶解后酶解液进行活性炭脱色，脱色后调节pH至5.2进行结晶，结晶完成后经过抽滤洗涤，55℃干燥得到7-ADCA产品，通过高效液相色谱进行检测，检测图谱见图13，7-ADCA的含量、特征杂质D-7ACA和DAOC的含量分别为99.7％、0.02％、0.08％。

表1 DAOC的HNMR、CNMR、COSY、HSQC谱数据和解析列表

注：本品共有19个氢，但核磁共振谱中只给出了14个氢的峰，这是因为这是因为用氘代水作为溶剂，活泼氢被取代，所以氨基氮上(3个)以及羧酸上的氢(2个)没有给出核磁共振峰。

表2 DAOC核磁共振炭谱数据和解析列表

表3 DAOC的IR光谱测定数据

表4 DAOC的质谱谱图数据

备注：测定模式为负离子模式

尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，本领域技术人员将会理解。根据已经公开的所有教导，可以对那些细节进行各种修改和替换，这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。

综上，本发明提供了一种生产头孢菌素类化合物的菌株及其制备方法，还提供了该菌株发酵生产的DAOC并进一步制备7-ADCA的方法，通过该菌株发酵生产的DAOC产量高、色纯高，质量优异，有利于进一步制备生产7-ADCA，为7-ADCA环保、稳定的工业化生产提供了新手段。

Claims (24)

1.一种顶头孢霉菌(Cephalosporium acremonium)D-G3-B-2001，保藏于中国微生物菌种保藏管理中心CGMCC，保藏编号为CGMCC NO:20270。

2.一种真菌培养物，其特征在于，其含有权利要求1所述的顶头孢霉菌。

3.根据权利要求2的真菌培养物，其特征在于，所述培养物为生物学纯的培养物。

4.根据权利要求2或3的真菌培养物，其特征在于，所述培养物由顶头孢霉菌菌株D-G3-B-2001培养获得；或所述培养物具有顶头孢霉菌菌株D-G3-B-2001的鉴定特征。

5.一种顶头孢霉菌或其培养物，其由保藏号为CGMCC NO:20270的菌株D-G3-B-2001衍生获得。

6.根据权利要求5所述的顶头孢霉菌或其培养物，所述顶头孢霉菌培养物相对于衍生前具有同等或更高的去乙酰氧头孢菌素C(DAOC)和去乙酰头孢菌素C(DCPC)生产能力。

7.一种顶头孢霉菌，其与保藏号为CGMCC NO:20270的菌株D-G3-B-2001具有相同的或基本相同的基因组序列。

8.根据权利要求7的顶头孢霉菌，所述基本相同的基因组序列指菌株基因组内仅存在自然条件下增值传代中发生的自发突变。

9.根据权利要求7或8的顶头孢霉菌，其特征在于，所述顶头孢霉菌基因组序列与D-G3-B-2001具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％或更高的同源性。

10.根据权利要求7的顶头孢霉菌，其特征在于，所述顶头孢霉菌与D-G3-B-2001培养物具有同等或更高的DAOC和DCPC生产能力。

11.根据权利要求10的顶头孢霉菌，其特征在于，其培养物生产获得DAOC的色纯为30-99％，进一步优选色纯为60-99％。

12.根据权利要求10的顶头孢霉菌，其特征在于，其培养物生产获得DCPC的色纯为0.1-50％，进一步优选的DCPC色纯为0.1-20％。

13.权利要求1中的顶头孢霉菌株D-G3-B-2001的制备方法，其制备方法为以顶头孢霉菌菌株为出发菌株，通过双因子诱变、菌株选育、优化，获得一株顶头孢霉菌株D-G3-B-2001。

14.权利要求1所述的顶头孢霉菌株D-G3-B-2001在发酵生产头孢菌素类化合物中的用途。

15.根据权利要求14所述的用途，其特征在于：所述头孢菌素类化合物包括头孢菌素C(CPC)、DCPC、DAOC中的一种或多种。

16.一种生产DAOC的方法，包括如下步骤：

(A)采用顶头孢霉菌(Cephalosporium acremonium)D-G3-B-2001菌株发酵，得发酵液；

(B)从发酵液中分离得到含有DAOC的滤液。

17.根据权利要求16所述的方法，其特征在于，步骤(A)所述的发酵方法为：将D-G3-B-2001菌株孢子进行斜面培养，斜面培养获得的孢子悬浮液经多级种子罐培养，然后接入发酵罐中发酵。

18.根据权利要求17所述的方法，其中所述多级种子罐培养为一级种子罐培养，或两级、三级或更多级种子罐连续培养；优选的，所述种子罐培养为三级培养。

19.根据权利要求17或18所述的方法，其中菌株的培养和发酵温度为20-30℃，优选28-30℃。

20.根据权利要求16-19任一所述的方法，其中步骤(A)所述的发酵步骤包括：

(1)种子液培养：①母斜面孢子制备：将冷冻保存在砂土管或甘油管中的顶头孢菌孢子，接种于灭菌的斜面培养基上，在温度28-34℃条件下，培养7-9天；②子斜面孢子制备：将母斜面孢子，接种于灭菌的斜面培养基上，在温度28-34℃条件下，培养7-9天；③种子培养：将子斜面孢子，接种于灭菌的液体种子培养基中，经过三级种子扩大培养，得到种子液；

(2)发酵：将种子液按15-40％体积比接种于灭菌的培养基中，通入无菌空气并开启搅拌，添加营养物质，在温度25-30℃条件下，培养5-8天，得发酵液。

21.一种生产7-ADAC的方法，包括以下步骤：

(1’)从权利要求15-20所述方法制备的发酵液中分离得到含有DAOC的滤液；(2’)通过对DAOC进行处理制备得7-ADCA。

22.根据权利要求21的方法，其特征在于，所述方法包括：将含有DAOC的发酵液通过陶瓷膜过滤，菌渣经环保处理，滤液经过超滤过滤，纳滤膜进行浓缩得到浓缩液，将浓缩液吸附，解析，脱色，酶解，结晶得到7-ADAC产品。

23.权利要求21或22所述方法制备得到的7-ADAC产品，其特征在于：所述7-ADAC产品中包括7-ADCA、D-7ACA和DAOC。

24.根据权利要求23所述的7-ADAC产品，其特征在于：所述D-7ACA和DAOC为7-ADAC产品的特征杂质。进一步优选地，7-ADAC产品中7-ADCA、D-7ACA和DAOC的含量分别为99.0-99.9％、0.01-0.25％、0.01-0.25％。

Images