CN109234194B - 一种多拉菌素产生菌及其应用 - Google Patents

一种多拉菌素产生菌及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN109234194B
CN109234194B CN201811123921.1A CN201811123921A CN109234194B CN 109234194 B CN109234194 B CN 109234194B CN 201811123921 A CN201811123921 A CN 201811123921A CN 109234194 B CN109234194 B CN 109234194B
Authority
CN
China
Prior art keywords
doramectin
strain
producing
fermentation
cctcc
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201811123921.1A
Other languages
English (en)
Other versions
CN109234194A (zh
Inventor
高经纬
张卫元
戴军
康远军
郝康
代兵
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
WUHAN HVSEN BIOTECHNOLOGY CO Ltd
Original Assignee
WUHAN HVSEN BIOTECHNOLOGY CO Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by WUHAN HVSEN BIOTECHNOLOGY CO Ltd filed Critical WUHAN HVSEN BIOTECHNOLOGY CO Ltd
Priority to CN201811123921.1A priority Critical patent/CN109234194B/zh
Publication of CN109234194A publication Critical patent/CN109234194A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN109234194B publication Critical patent/CN109234194B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C12N1/205—Bacterial isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/465—Streptomyces
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/44—Preparation of O-glycosides, e.g. glucosides
    • C12P19/60—Preparation of O-glycosides, e.g. glucosides having an oxygen of the saccharide radical directly bound to a non-saccharide heterocyclic ring or a condensed ring system containing a non-saccharide heterocyclic ring, e.g. coumermycin, novobiocin
    • C12P19/62—Preparation of O-glycosides, e.g. glucosides having an oxygen of the saccharide radical directly bound to a non-saccharide heterocyclic ring or a condensed ring system containing a non-saccharide heterocyclic ring, e.g. coumermycin, novobiocin the hetero ring having eight or more ring members and only oxygen as ring hetero atoms, e.g. erythromycin, spiramycin, nystatin

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明属于生物技术领域，具体公开了一种多拉菌素产生菌，该多拉菌素产生菌保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2017年9月14日，保藏编号为CCTCC NO：M 2017506，其分类命名为阿维菌素链霉菌643a31（Streptomyces avermitilis 643a31）。本发明还公开了该菌株的应用，即利用该菌株制备多拉菌素的方法。本发明的菌株产生的多拉菌素与多拉菌素结构类似物比例显著提高，可简化多拉菌素纯化工艺。本发明的菌株是发明人通过对发明人自主保藏的多拉菌素产生菌suk17‑643a进行4轮紫外线复合氯化锂诱变筛选，获得多拉菌素占比提高的突变菌株。最终筛选获得643a31菌株，多拉菌素占比可达到85%以上，摇瓶发酵效价达到700μg/ml以上。

Description

一种多拉菌素产生菌及其应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种多拉菌素产生菌及其应用。
背景技术
多拉菌素(doramectin)是大环内酯类动物专用体内外广谱抗寄生虫药。多拉菌素由微生物发酵生产，具有多拉菌素合成基因的微生物以环己烷甲酸为起始物，合成多拉菌素。由于多拉菌素合成涉及多步酶促反应以及合成酶对反应底物的专一性不强，多拉菌素产生菌在合成多拉菌素过程中，同时会产生多种多拉菌素结构类似物，对多拉菌素的生产效率和多拉菌素的纯化均有影响。不同多拉菌素产生菌产生的结构类似物的种类和比例不尽相同，据文献资料报道，通过基因工程修饰多拉菌素产生菌aveC基因，多拉菌素与结构类似物CHC-B2的最佳比例关系可达到1:0.4(Stutzman-Engwall，2002)，假设无其它结构类似物，则多拉菌素占比最高可达到71％。刁金娜2011年论文《多拉菌素产生菌基因重排育种》报道，所选育出的菌种多拉菌素产量最高为547μg/ml。
发明人与武汉大学陈实教授合作开发suk17-643a菌种，此菌种可产生多拉菌素及一种多拉菌素结构类似物，多拉菌素占比最高可达75％，发酵产量可达409μg/ml。此菌株多拉菌素占比与发酵产量分别与文献报道的最高值相当，具有生产应用的前景。
发明内容
发明目的：为进一步提升suk17-643a菌种性能，本发明以suk17-643a为出发菌株，进行4轮紫外线复合氯化锂诱变筛选，获得菌株643a31，多拉菌素占比可达到85％以上，摇瓶发酵效价达到712μg/ml。
本发明所要解决的技术问题是提供了一种多拉菌素产生菌。
本发明还要解决的技术问题是提供了多拉菌素产生菌在生产制备多拉菌素中的应用。
本发明最后要解决的技术问题是提供了一种多拉菌素的制备方法。
技术方案：为实现上述技术目的，本发明采取如下的技术方案：一种多拉菌素产生菌，该多拉菌素产生菌保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2017年9月14日，保藏编号为CCTCC NO：M 2017506，其分类命名为阿维菌素链霉菌643a31(Streptomycesavermitilis 643a31)。
本发明的一种多拉菌素产生菌的制备方法，它包括以下步骤：
A、紫外线复合氯化锂诱变处理
(1)孢子悬浮液制备：将出发菌株的孢子制成孢子悬液，于波长254nm，进行紫外线诱变；
(2)诱变处理：将紫外线诱变后孢子悬液系列稀释涂布在含氯化锂的平板MS培养基上，28摄氏度培养6天；
B、诱变株的筛选
将诱变后培养的单菌落转接至斜面MS培养基，同时对应点种至含有固体发酵培养基的24孔深孔板，每孔点一个菌落，28摄氏度培养2-3天，在每孔中加入环己甲酸钠溶液，继续培养5-7天。在每孔中加入甲醇浸泡2-4小时，取浸提液进行液相检测。选择多拉菌素组分占比提高的菌株，用摇瓶发酵法进行复筛，最终挑选出发酵组分高并且发酵效价也高的菌株作为再次进行诱变的出发菌株。
C、重复步骤A和B四次，最终获得菌株643a31。
本发明内容还包括一种微生物菌剂，其包含所述的多拉菌素产生菌。
本发明内容还包括所述的多拉菌素产生菌或所述的微生物菌剂在多拉菌素生产中的应用。
本发明内容还包括一种多拉菌素的制备方法，所述多拉菌素通过将所述的多拉菌素产生菌发酵获得。
本发明所述的多拉菌素的制备方法，包括以下步骤：
1)培养基的制备：种子培养基和发酵培养基的制备；
2)种子液的制备；将含有多拉菌素产生菌的斜面采用接种环将孢子刮下，制成孢子悬液，然后接种到种子培养基中进行培养2～3天得到种子液；
3)发酵液的制备：将步骤2)得到的种子液接种到发酵培养基中培养2～3天后，加入环己甲酸钠溶液，环己甲酸钠溶液的终浓度浓度为1.5％-3％(％为质量体积百分比m/v％，m/v＝g/mL)，继续培养5-7天得到发酵液；
4)多拉菌素的获得：将步骤3)得到发酵液离心收集菌丝体，加入甲醇浸泡2-4小时得到浸提液即为多拉菌素。
其中，所述步骤1)的种子培养基的制备方法如下：将黄豆饼粉加蒸馏水煮2～3小时，用纱布过滤得到滤液，将滤液分装到装有玉米淀粉的三角瓶中，调pH至7.2-7.3即得。
其中，所述步骤1)的发酵培养基的制备方法如下：取玉米淀粉、豆粕粉、酵母粉、氯化钴和淀粉酶，加自来水溶解后定容，分装，灭菌即得。
其中，所述发酵培养基中各组分含量分别为玉米淀粉120g/L，豆粕粉30g/L，酵母粉6g/L，氯化钴0.01g/L，淀粉酶0.01g/L。
其中，所述步骤2)的接种量为1～2％。
其中，所述步骤3)的接种量为8～10％。
与现有技术相比，本发明具有如下优点和有益效果：
本发明的菌株产生的多拉菌素与多拉菌素结构类似物比例显著提高，可简化多拉菌素纯化工艺。本发明菌株是发明人通过对发明人自主保藏的多拉菌素产生菌suk17-643a进行4轮紫外线复合氯化锂诱变筛选，获得的多拉菌素占比显著提高的突变菌株。最终筛选获得643a31菌株，其发酵产生的多拉菌素占比可达到85％以上，摇瓶发酵效价达到712μg/ml，远远高于现有技术的最高为547μg/ml的效价。
附图说明
图1为多拉菌素产生菌643a31的电镜图(1000X)；
图2为多拉菌素产生菌643a31平板上的菌落图；
图3多拉菌素产生菌643a31发酵液液相检测结果。
具体实施方式
下面申请人将结合具体的实施例对本发明产品的制备过程及应用过程做详细说明，便于本领域技术人员清楚地理解本发明。但应该理解，以下实施例不应以任何方式被解释为对本申请权利要求书请求保护范围的限制。
实施例1多拉菌素产生菌643a31的筛选
以多拉菌素产生菌suk17-643a为初始出发菌株，按以下方法步骤进行：
A、培养基制备
MS培养基：将10g黄豆饼粉加蒸馏水煮2.5小时，用纱布过滤得到滤液250ml，滤液装到装有5g琼脂和5g甘露醇的500ml三角瓶中，NaOH溶液调pH至7.2-7.3。灭菌后每10ml分装至试管，制备斜面MS培养基。灭菌后每30ml分装至平板，待温度降至60摄氏度左右，加入终浓度0.05％的氯化锂，制备含氯化锂的平板MS培养基。
固体发酵培养基：玉米淀粉120g，豆粕粉30g，酵母粉6g，氯化钴0.01g，淀粉酶0.01g，琼脂20g，自来水定容至1L。灭菌后分装至24孔深孔板。
B、紫外线复合氯化锂诱变处理：
(1)孢子斜面制备：取保存的suk17-643a接种至斜面MS培养基，28摄氏度培养7天，斜面MS培养基上产生丰富的孢子。
(2)孢子悬浮液制备：取斜面1支，以无菌操作法加入10毫升无菌生理盐水，用无菌接种环将孢子刮下，制成孢子悬液。将全部孢子悬液加入直径90mm无菌培养皿，254nm紫外线照射30秒。
(3)将紫外线诱变后孢子悬液系列稀释涂布已制备好的含氯化锂的平板MS培养基，28摄氏度培养6天。
C、诱变株的筛选将诱变后培养的单菌落转接至斜面MS培养基，同时对应点种至含有固体发酵培养基的24孔深孔板，每孔点一个菌落，28摄氏度培养2-3天，在每孔中加入环己甲酸钠溶液，终浓度为质量体积百分比1.5％-3％，继续培养5-7天。在每孔中加入甲醇浸泡2-4小时，取浸提液进行液相检测。选择多拉菌素组分占比提高的菌株，用摇瓶发酵法进行复筛，最终挑选出发酵组分高并且发酵效价也高的菌株作为再次进行诱变的出发菌株。
D、重复步骤A和B四次，最终获得菌株643a31。该多拉菌素产生菌643a31保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2017年9月14日，保藏编号为CCTCC NO：M 2017506，其分类命名为阿维菌素链霉菌643a31(Streptomyces avermitilis 643a31)。
该菌在培养基上生长良好，菌落为暗灰白色，背面颜色无色，孢子链柔曲，孢子柱形，表面光滑。
实施例2摇瓶发酵法复筛高效价菌株
A、培养基制备
种子培养基：将10g黄豆饼粉加蒸馏水煮2.5小时，用纱布过滤得到滤液250ml，每25ml滤液分装到装有0.5g玉米淀粉的250ml三角瓶中，NaOH溶液调pH至7.2-7.3。
发酵培养基：取玉米淀粉120g、豆粕粉30g、酵母粉6g、氯化钴0.01g和淀粉酶0.01g，加自来水定容至1L。分装至500ml三角锥瓶，每瓶装量50ml，灭菌。
B、摇瓶种子的制备
取含丰富孢子的多拉菌素产生菌643a31斜面一支，以无菌操作法加入10ml无菌生理盐水，用无菌接种环将孢子刮下，制成孢子悬液。按1％接种量，接种种子摇瓶，28摄氏度，220rpm摇床培养2天得到种子液。
C、摇瓶发酵取种子液，按10％接种量接种发酵摇瓶。28摄氏度，220rpm摇床培养2天后，加入终浓度为质量体积百分比2.5％的环己甲酸钠溶液，继续培养6天，得发酵液。
D、液相检测取1ml发酵液，离心收集菌丝体。向菌丝体中加入1ml甲醇浸泡2-4小时，取浸提液进行液相检测。
高效液相色谱检测条件：色谱柱Inertsil ODS-3 5um 4.5x150mm；检测波长246nm；流速1.0ml/min；流动相甲醇:乙腈:水＝81:12:7
高效液相检测结果参见图3，菌株643a31发酵液液相检测结果，其中12.083分钟为多拉菌素峰，多拉菌素占比峰面积占比为87.00％，发酵效价为712μg/ml。
最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对发明进行了详细的描述，但本领域的技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。

Claims (3)

1.一种多拉菌素产生菌，其特征在于，该多拉菌素产生菌保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2017年9月14日，保藏编号为CCTCC NO：M 2017506，其分类命名为阿维菌素链霉菌643a31（Streptomyces avermitilis 643a31）。
2.权利要求1所述的多拉菌素产生菌在多拉菌素生产中的应用。
3.一种多拉菌素的制备方法，其特征在于，所述多拉菌素通过将权利要求1所述的多拉菌素产生菌发酵获得。
CN201811123921.1A 2018-09-26 2018-09-26 一种多拉菌素产生菌及其应用 Active CN109234194B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201811123921.1A CN109234194B (zh) 2018-09-26 2018-09-26 一种多拉菌素产生菌及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201811123921.1A CN109234194B (zh) 2018-09-26 2018-09-26 一种多拉菌素产生菌及其应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN109234194A CN109234194A (zh) 2019-01-18
CN109234194B true CN109234194B (zh) 2021-08-24

Family

ID=65056684

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201811123921.1A Active CN109234194B (zh) 2018-09-26 2018-09-26 一种多拉菌素产生菌及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN109234194B (zh)

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2000055304A2 (en) * 1999-03-16 2000-09-21 Virginia Commonwealth University A chc biosynthetic gene cluster
CN105232457A (zh) * 2015-11-17 2016-01-13 宁夏泰瑞制药股份有限公司 一种多拉菌素无菌溶液的制备方法
CN108018324A (zh) * 2016-10-28 2018-05-11 北大方正集团有限公司 一种生产多拉菌素的发酵培养基及其制备方法与应用

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2000055304A2 (en) * 1999-03-16 2000-09-21 Virginia Commonwealth University A chc biosynthetic gene cluster
CN105232457A (zh) * 2015-11-17 2016-01-13 宁夏泰瑞制药股份有限公司 一种多拉菌素无菌溶液的制备方法
CN108018324A (zh) * 2016-10-28 2018-05-11 北大方正集团有限公司 一种生产多拉菌素的发酵培养基及其制备方法与应用

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
阿维链霉菌高产多拉霉素的发酵工艺研究;张安源;《万方数据知识服务平台》;20140925;1-62页 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN109234194A (zh) 2019-01-18

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN109415751B (zh) 用于微生物共培养的组合物和方法
US10968424B2 (en) Bacillus subtilis strain, culture method and use thereof
CN108624524B (zh) 一株生产细菌纤维素的菌株及其分离筛选方法
US11279961B2 (en) Aspergillus oryzae BLCY-006 strain and application thereof in preparation of galactooligosaccharide
CN102653724B (zh) 一株干酪乳杆菌及其在发酵产l-乳酸中的应用
CN113564071B (zh) 一种生产甲萘醌-7的纳豆芽孢杆菌及其应用
CN113444659B (zh) 一株高产多杀菌素的刺糖多孢菌
CN101245362B (zh) 发酵法生产多肽类抗生素安来霉素的方法
CN112831421B (zh) 一种头孢菌素类化合物生产菌株及其应用
CN101041837B (zh) 一种新的天然脱落酸制备方法
WO2006075395A1 (ja) β−ラクタム抗生物質の活性増強剤及びその製造法
CN110804572A (zh) 一株链霉菌及其制备ε-聚赖氨酸的方法
CN107267422B (zh) 睾丸酮丛毛单胞菌hhala-001及采用该菌株生产l-丙氨酸的方法
CN113388556B (zh) 利用金色链霉菌生产金霉素的方法
CN108823110B (zh) 一株产灰黄霉素的菌株及其应用
CN106754486B (zh) 一株高产海藻糖合酶的假单胞菌及其发酵产酶方法
CN109234194B (zh) 一种多拉菌素产生菌及其应用
WO2007010855A1 (ja) 微生物によるｎ－アセチル－ｄ－グルコサミンの醗酵生産方法
CN116262903A (zh) 一种米曲霉工程菌、构建方法及应用
CN113549579B (zh) 一种金霉素产量高、杂质比例低的金色链霉菌突变菌株及其应用
CN113604390B (zh) 一株谷氨酸棒杆菌及其在发酵生产l-鸟氨酸中的应用
CN103014092A (zh) 一种提高丝裂霉素c产率的制备方法
CN116004750B (zh) 桃色欧文氏菌产安吉菌素的方法
CN109837225B (zh) 一株埃博霉素d高产菌及其在发酵产埃博霉素d中的应用
CN108774626B (zh) 一种生产尼莫克汀的方法和菌株

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant