CN103374563A - 一种改良7-aca产生菌的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种改良7-ACA产生菌的方法，包括以下步骤：1)取含有不同抗性筛选标记基因的两个亲本，其中第一亲本是含有外源野生型头孢菌素C酰基转移酶的基因的顶头孢霉(Acremonium chrysogenum)基因工程菌，第二亲本是含有外源头孢菌素C酰基转移酶正向突变体的基因的顶头孢霉基因工程菌，该头孢菌素C酰基转移酶正向突变体的酶活性和头孢菌素C底物耐受性比野生型均有提高，分别用第一亲本和第二亲本的孢子制备原生质体；2)进行原生质体融合；3)将融合子摇瓶发酵，选择7-ACA含量比两亲本高的融合子即为改良的7-ACA产生菌。本发明的方法可以方便、有效、快速的得到7-ACA产量大幅提高的菌株。

Description

一种改良7-ACA产生菌的方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，特别涉及一种改良7-ACA产生菌的方法。

背景技术

头孢类半合成抗生素目前上市品种已达60余种，具有抗菌谱较广，抗菌活性强、耐青霉素酶、疗效高、毒性低、过敏反应少等优点，7-氨基头孢烷酸(7-ACA)是这类抗生素半合成的重要中间体，工业上广泛使用两步酶法裂解头孢菌素C进行7-ACA的工业化生产，但其成本较高，涉及到两步反应，且需要体外酶的制备及固定化等需求。专利申请CN200810205094.0中构建了基因工程顶头孢霉可直接发酵生产7-ACA，但产量还是没有达到工业化生产的要求。

在工业微生物菌种选育中原生质体诱变及原生质体融合技术已被广泛应用，并取得了良好效果。将两者相结合的诱变融合技术的不断发展，尤其是基因组改组技术的出现为育种带来了新的思路。

发明内容

本发明要解决的技术问题是针对现有的制备7-ACA生产菌的方法所得的基因工程顶头孢霉生产7-ACA的产量低的不足，提供一种改良7-ACA生产菌的方法，该方法能够获得7-ACA产量大幅度提高的菌株。

本发明解决上述技术问题的技术方案如下：一种改良7-ACA产生菌的方法，包括以下步骤：

1)取含有不同抗性筛选标记基因的两个亲本，其中第一亲本是含有外源野生型头孢菌素C酰基转移酶的基因的顶头孢霉(Acremoniumchrysogenum)基因工程菌，第二亲本是含有外源头孢菌素C酰基转移酶正向突变体的基因的顶头孢霉基因工程菌，该头孢菌素C酰基转移酶正向突变体的酶活性和头孢菌素C底物耐受性比野生型均有提高，分别用第一亲本和第二亲本的孢子制备原生质体；

2)将步骤1)制备所得的第一亲本和第二亲本的原生质体在融合剂的存在下进行原生质体融合，融合剂为PEG2000-6000，融合剂浓度20％-40％(重量)，在含有第一亲本抗性和第二亲本抗性两种抗性的再生平板上长出的单菌落即为融合子；

3)将步骤2)所得的融合子摇瓶发酵，检测发酵液中7-ACA的含量，选择7-ACA含量比两亲本高的融合子即为改良的7-ACA产生菌。

本发明中，所述的野生型头孢菌素C酰基转移酶是常规的，如来源于假单胞菌N176中头孢菌素C酰基转移酶(GL-7-ACA酰基转移酶)(参见文献Pollegioni L.，et al，Protein Science，2005，14：3064)。所述的野生型头孢菌素C酰基转移酶基因可以是野生型基因，如来源于假单胞菌N176的基因(vac)，较佳的是经过密码子优化在顶头孢霉中高效表达的基因，如ecs(参见200810205094.0)。

本发明中，所述的头孢菌素C酰基转移酶正向突变体的酶活性和头孢菌素C底物耐受性比野生型头孢菌素C酰基转移酶均有提高，只要该基因表达的头孢菌素C酰基转移酶的的酶活性和头孢菌素C底物耐受性比野生型头孢菌素C酰基转移酶高，那么该基因就在本发明的范围之内。优选的，所述的外源头孢菌素C酰基转移酶正向突变体的基因是如下(1)或(2)的基因：

(1)其碱基序列如序列表中SEQ ID No.1所示；

(2)编码如下蛋白质(a)或(b)的基因：

(a)其氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.2所示；

(b)在(a)中的氨基酸序列的N端或C端添加一个或几个氨基酸残基并且具有CPC酰化酶活性的重组蛋白质。

其中，SEQ ID No.2所示氨基酸序列的头孢菌素C酰基转移酶正向突变体的酶活性和头孢菌素C底物耐受性比野生型头孢菌素C酰基转移酶均有提高。SEQ ID No.2所示氨基酸序列的头孢菌素C酰基转移酶正向突变体的编码基因是SEQ ID No.1所示碱基序列的核苷酸，其命名为PYG232-50，全长2349bp，其编码序列(CDS)从第1个碱基起至第2349个碱基止，起始密码子为ATG，终止密码子为TGA。该序列无内含子。

相同的，本发明所述的头孢菌素C酰基转移酶正向突变体的基因也可以是编码蛋白质(a)或(b)的任何基因。例如，由于密码子的简并性，编码SEQ IDNo.2的氨基酸序列的碱基序列不仅仅局限于SEQ ID No.1。较佳的是经过密码子优化在顶头孢霉中高效表达的基因，如ecs-50。

另外，本发明所述的头孢菌素C酰基转移酶正向突变体的基因还可以是通过适当引入替换、缺失、改变、插入或增加来提供一个多聚核苷酸的同系物。本发明中多聚核苷酸的同系物可以通过对碱基序列SEQ ID No.1的一个或多个碱基在保持CPC酰化酶活性范围内进行替换、缺失或增加来制得。

SEQ ID No.1的同系物较佳地指启动子突变体。在所述的碱基序列之前的启动子或信号序列可通过一个或多个核苷酸的替换、插入或缺失而改变，但这些改变对启动子的功能没有负面影响。而且通过改变启动子的序列或甚至用来自不同种生物体的更有效的启动子完全替换，可提高目标蛋白的表达水平，例如对本发明有利的调节序列可来自于革兰氏阴性菌的启动子中，如cos、tac、trp、tet、trp-tet、lpp、lac、T7、T5、T3、gal、trc、ara、SP6等；或存在于革兰氏阳性启动子amy和SPO2中；或来自于真菌或酵母启动子ADC1、AC、P-60、CYC1、GAPDH、TEF、rp28、ADH、Ptrp，pcpc，PpcbAB-PpcbC等；或者来自Hansenula的丙酮酸脱羧酶启动子或人工启动子等。最优选启动子Ptrp，pcpc，双向启动子PpcbAB-PpcbC。

本发明中，(b)所述的“几个”更佳地是指二个至小于100个，最佳的是小于30个氨基酸残基。所述的一个或几个氨基酸残基组成的肽段是信号肽(Signal peptide)或蛋白标签(Protein tag)。所述信号肽是指新生肽链N端的一段20～30氨基酸残基组成的肽段，该肽段的主要功能是决定新生肽链在细胞中的定位或决定某些氨基酸残基的修饰。常见的信号肽包括：分泌信号肽、输出细胞核信号肽、输入线粒体信号肽、输入质体信号肽、输入过氧化物酶体信号肽、输入内质网信号肽、返回内质网信号肽、由质膜到内体信号肽等。所述蛋白标签是指利用DNA体外重组技术，与目的蛋白一起融合表达的多肽或蛋白质，以便于目的蛋白的表达、检测、示踪和分离纯化等。常见的蛋白标签包括：His tag、FLAG tag、MYC tag、SBP tag、CBP tag、GST tag、EGFP tag等。只要该重组蛋白具有CPC酰化酶活性，本发明发现这样的重组蛋白同样是可以酰化CPC底物的CPC酰化酶，并达到底物耐受性好，产率较高的效果。也就是说本发明发现只要由(a)衍生的蛋白质具有CPC酰化酶活性，且衍生方式如上所述，则都可以达到本发明的发明目的。其中(b)所述的几个氨基酸残基所组成的肽段更佳地是His(组氨酸)tag。

本发明中，所述的第一亲本较佳的含有外源野生型头孢菌素C酰基转移酶基因的表达盒和第一抗性筛选标记基因的表达盒，或者含有外源野生型头孢菌素C酰基转移酶基因和第一抗性筛选标记基因的双基因表达盒。所述的第二亲本较佳的含有外源头孢菌素C酰基转移酶正向突变体基因的表达盒和第二抗性筛选标记基因的表达盒，或者含有外源头孢菌素C酰基转移酶正向突变体基因和第二抗性筛选标记基因的双基因表达盒。所述的表达盒包括启动子和所述的外源基因。所述的启动子如上所述，是各种可以在顶头孢霉启动基因表达的启动子。优选强启动子，最优选启动子Ptrp，pcpc，双向启动子PpcbAB-PpcbC。

本发明中，所述的抗性筛选标记基因是常规的适用于顶头孢霉生长的抗生素的抗性基因。优选的，所述的抗性筛选标记基因是phleo或hygB。hygB是潮霉素抗性基因，而phleo是抗腐草霉素基因。

本发明中，所述的顶头孢霉是顶头孢霉属的任何一种，包括Acremoniumchrysogenum，优选ATCC 11550。

最优选的，所述的第一亲本是7-ACA产生菌顶头孢霉基因工程菌Acremonium chrysogenum/pYG233，所述的第二亲本是顶头孢霉基因工程菌Acremonium chrysogenum/pYG236。

根据本发明，步骤1)所述的顶头孢霉原生质体制备方法是常规技术，可参见CN200810205094.0。较佳的包括以下步骤：在顶头孢霉菌体中加入DTT孵育；固液分离取沉淀；加入溶壁酶(Lysing酶)孵育至大部分菌丝释放出原生质体；滤除残留的菌丝体，即得原生质体；

根据本发明，步骤2)所述的顶头孢霉原生质体融合的方法是常规的真菌类原生质体融合的方法(参考文献：梁平彦，刘宏迪，陈开英，肖信发；产黄青霉菌原生质体的营养互补融合和二倍体的形成；遗传学报；1981年04期)。较佳的包括以下步骤：将第一亲本原生质体和第二亲本原生质体混合，加入融合剂PEG孵育；离心取沉淀，加入保温的上层软琼脂培养基中，轻轻振荡混匀，然后倾倒在再生平板上，迅速转动平板使软琼脂均匀覆盖在再生平板表面；培养一段时间后覆盖含有潮霉素B和博来霉素的NaCl软琼脂，软琼脂凝固后继续培养，平板上长出的菌落即为融合子。其中，第一亲本原生质体和第二亲本原生质体优选等体积混合，用于融合的原生质体浓度优选10⁸～10⁹个/ml，所述的融合剂优选PEG2000-6000，更优选PEG4000，融合剂浓度优选20％-40％(重量)。融合温度和时间为常规，如25℃30min。所述的再生平板是常规的能够用于顶头孢霉生长的平板。

根据本发明，步骤3)所述的融合子摇瓶发酵的方法是常规的顶头孢霉摇瓶发酵方法。步骤3)所述的检测发酵液中7-ACA含量的方法是常规方法，用HPLC定量分析。

本发明所用的原料或试剂除特别说明之外，均市售可得。

本发明中，若无说明，所述的百分比为重量百分比。

相比于现有技术，本发明的有益效果如下：

本发明经原生质体融合后获得了21株融合子。所得的21株融合子中有5株发酵后7-ACA产量在800μg/ml以上，其中最高一株(17号)达到1437μg/ml，具有较大幅度提高。出发株在同样发酵条件下的7-ACA产量分别为：第一亲本产量380μg/ml，第二亲本537μg/ml。

本发明采用亲本进行原生质体PEG融合的方法，筛选出7-ACA高产菌。两亲本采用的一个是ecs基因，一个是ecs-50基因，并且筛选标记不同，出发菌的遗传差异性大。采用不同抗性基因进行筛选使得融合子的筛选更加方便、有效，最终快速得到了产量提高的融合子。

本发明人发现了酶活性和头孢菌素C底物耐受性均有大幅度提高的头孢菌素C酰基转移酶突变体，从而利用该突变体，使含有该突变体基因的顶头孢霉基因工程菌作为原生质体融合的亲本之一，才能获得大幅度提高7-ACA产量的融合子。

附图说明

以下结合附图说明本发明的特征和有益效果。

图1是ecs基因易错PCR电泳图。1，ecs PCR条带2，阴性对照(无模板)；3，阴性对照(无引物)，4，Marker。

图2是重组表达载体构建图。

图3是突变菌株PYG232-50在酶浓度为0.5mg，底物为0.5mg/ml转化CPC的HPLC图谱，VWD1A，Wavelength＝254nm。

图4是出发菌株PYG232和突变菌株PYG232-50的ECS在不同底物(CPC)的浓度下对CPC转化效率对比图。

图5是PYG232-50号突变株的酶切验证电泳图。1，PYG232-50质粒双酶切2，出发菌株质粒双酶切3，Marker。

图6是PYG232-50号突变株和出发菌株纯化蛋白的western blot图。泳道2是marker，泳道3目的蛋白CPC酰化酶蛋白。

图7是突变株PYG232-50与出发菌株PYG232的ECS的基因序列比对图：(A)核酸序列1-450；(B)核酸序列451-900；(C)核酸序列901-1350；(D)核酸序列1351-1800；(E)核酸序列1801-2250；(F)核酸序列2251-2349；pyg232：原始的ecs基因序列；pyg232-50：突变的ecs基因序列。

图8是ECS和ECS-50的氨基酸序列比对图：(A)氨基酸序列1-300；(B)氨基酸序列301-750；(C)氨基酸序列751-782；顶头孢酶ecs：原始的ECS氨基酸序列；顶头孢酶ecs-50：突变的ECS氨基酸序列。

图9是质粒pYG236的构建过程。

图10是顶头孢霉转化子的hgh抗性基因的PCR验证图。1，转化子；2，阴性宿主菌；3，阳性(Pyg236)；4，DL2000 Marker。

图11是融合子的PCR验证图。A，融合子腐草霉素抗性基因PCR验证。1，融合子；2，宿主菌；3，阳性；4，DL-2000 Marker。B，融合子潮霉素抗性基因PCR验证。1，4，5，6均为转化子；2，宿主菌；3，阳性；7，DL-2000 Marker。

具体实施方式

本发明的一具体实施方式是在7-ACA产生菌顶头孢霉中导入含有不同抗性基因phleo和hygB的质粒，构建分别含有两种筛选标记的的基因工程菌Acremonium chrysogenum/pYG233和Acremonium chrysogenum/pYG236，并以它们作为亲本，通过原生质体融合进行基因组改组(shulfling)，通过博莱霉素和潮霉素两种抗生素筛选发生基因组融合的融合子，从中可以容易的获得7-ACA产量大幅提高的7-ACA产生菌，从而完成了本发明。

下面用实施例来进一步说明本发明，但本发明并不受其限制。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所述的“室温”是指进行试验的操作间的温度，一般为25℃。

实施例1 ecs-50基因及其功能

1.对出发序列进行易错PCR及其产物表达质粒的构建

1.1对出发序列ecs基因进行易错PCR

其中所述出发序列由分段PCR产物连接获得，其基因序列见图8的pyg232。采用DNA聚合酶进行目的基因扩增时，通过调整反应条件，提高镁离子浓度或加入锰离子，运用低保真度DNA聚合酶，来改变扩增过程中的突变频率，从而以一定的频率向目的基因中随机引入突变，获得蛋白质分子的随机突变体。采用的PCR反应体系如下：

其中引物P1，P2序列为：

P₁：5’-GCTTGTCGACTCTAGATCAGTGGTG-3’(下划线部分是Sal I酶切位点)；

P₂：5’-GATCCGAATTCGAGCTCGGTAC-3’(下划线部分是EcoR I酶切位点)，其中的模板DNA是esc基因出发序列。

PCR反应条件为：预变性95℃，2min；变性94℃，30s；退火52℃，30s；延伸72℃，2min共30次循环；72℃延长，10min。可以扩增得到2.3Kb的目的条带，易错PCR的结果见图1。

1.2表达质粒构建

将易错PCR所得的ecs基因用Sal I、EcoR I 37℃双酶切3h后回收，将pET-28a进行同样的双酶切，将载体与目的片段回收，按照1∶3～1∶4的比例混合(摩尔比)，16℃T4DNA连接酶连接15h，通过热击法(42℃热击，90s)将新构建的质粒转化到大肠杆菌BL21中构建工程菌，在卡那霉素浓度为100μg/ml的LB固体培养基平板上筛选转化子，重组表达载体质粒构建图谱请见图2。

2.转化子初筛

2.1转化子细胞培养及蛋白表达

挑选构建的工程菌转接试管过夜培养，然后以2％(V/V)的接种量转接到装有250mlLB液体培养基的摇瓶中，LB培养基中卡那霉素浓度为10～50μg/ml，37℃、220转/分钟培养3小时；

随后添加IPTG使培养基中的IPTG终浓度达到0.6mmol，25℃、220转/分钟，再培养16小时；

在低温离心机8000转/分钟的速度离心沉淀菌体。

2.2转化子初筛

将收集的菌体用3ml的0.1mmol Tris-HCl悬浮，取浓缩的细胞1ml与0.1mg CPC在水浴25℃、28℃、37℃，pH9.6和pH8.0条件分别反应1h，13200r/min离心5min取上清，通过在酶标仪中测定(414nm)7-ACA的吸光值。筛选比出发菌株ESC酶活性有提高或者对pH耐受增强的突变株。共获得63个活性高的转化子。

3.高活性转化子复筛

3.1将初筛得到的63个高活性转化子重新培养

1)250ml诱导表达培养物(实施例2步骤2.1中所得到的诱导表达培养物)，离心(8000rpm，10min)获得菌体，将收获的菌体用5ml P缓冲液(pH8.0，100倍稀释的1M磷酸氢二钠和磷酸二氢钠混合液)悬浮、超声破碎(破碎时间5s/间隔时间5s，500W，超声破碎10min)。

2)离心沉淀：破碎后4℃，8000转/分钟的速度离心(Hitachi Himac CR21G型冷冻高速离心机，转子为R12A)，沉淀细胞碎片。

3)分离纯化：将得到的上清(带his标签)置于100ml烧杯中，用镍柱分离纯化。具体步骤为：

过柱吸附，加入2ml Ni-NTA树脂(购自上海申能博彩公司)混悬液(含50％(V/V)树脂，保存于20％(V/V)乙醇溶液中，置于冰上(或在4℃冰箱中)用脱色摇床120r/min振荡1h。装入层析柱，移去层析柱底端的帽子，上清液通过NTA柱，收集流出液用于电泳分析。

柱子的洗脱，依次用10ml NTA-0(20mM Tris-HCL pH7.9，0.5M NaCl，10％Glycerol)，10ml NTA-20(20mM Tris-HCL pH7.9，0.5M NaCl，10％Glycerol，20mM咪唑)，3ml NTA-60(20mM Tris-HCL pH7.9，0.5M NaCl，10％Glycerol，60mM咪唑)以及3ml NTA-80(20mM Tris-HCL pH7.9，0.5MNaCl，10％Glycerol，80mM咪唑)洗涤层析柱，洗去未结合的杂蛋白。用4ml NTA-200(含200mM咪唑)洗脱目的蛋白，分4次洗脱，每次1ml，收集洗脱液。

柱子的再生，先用10ml NTA-500(含500mM咪唑)冲洗柱子，再用10ml 20％(V/V)乙醇冲洗柱子，最后盖上柱子底端的帽子，用0.5ml 20％(V/V)乙醇溶液重悬树脂，4℃保存。树脂可重复使用3～5次。

3.2体外CPC酰化酶活性测定反应体系的建立

纯化获得的CPC酰化酶经透析、浓缩处理后采用酶标仪测定浓度，取0.5mg CPC酰化酶以及0.5mg CPC在37℃，pH9.6反应1h，随后采用截留分子量为10KD的超滤管超滤(7000rpm，5min)，除去酰化酶，取超滤管下层的溶液进行HPLC检测。检测条件为：流动相A：95％的磷酸氢二钠(WT)，流动相B：5％(V/V)的甲醇。检测波长为254nm，流速是1ml/min，柱温为40℃，进样量为10μl。

通过复筛获得的转化率最高的转化子为PYG232-50，其HPLC结果见图3(酶的浓度为0.5mg/ml，底物浓度为5mg/ml，转化率为98％)。图4显示的是在不同底物(CPC)浓度及不同CPC酰化酶的酶量条件下，突变菌株PYG232-50和出发菌株PYG232(ecs基因构建的起始菌株)的ECS酶对CPC的转化情况。

结果表明随底物(CPC)浓度的增大转化率下降，当底物浓度为10mg/ml时CPC的转化率为88％，和出发菌的53％转化率相比，PYG232-50表达的CPC酰化酶活性提高了35％。当CPC酰化酶的浓度为0.5mg/ml，达到同样的94％转化率的时候，初始菌株的底物添加量为1mg/ml，而PYG232-50的底物添加浓度可以达到7mg/ml。因此在维持转化率不变的前提下，突变后的ESC酶对底物(CPC)耐受性增强，可增加PYG232-50的底物添加浓度。

4.PYG232-50号突变株的验证及测序

4.1质粒酶切鉴定。将复筛确认的PYG232-50号突变株质粒经EcoR I和Sal I酶切验证，结果如图5所示。从图5可以看出PYG232-50能切出和原始序列一样大小为2.3Kb的目的基因。

4.2将突变株和出发菌株进行蛋白的纯化验证。蛋白纯化的方法见实施例3。将亲和层析前的上清及沉淀和亲和层析后的蛋白进行Western blotting验证，Western blotting的方法为：按照常规SDS-PAGE蛋白电泳方法剪滤纸和膜，设置电流45mA，电压为1～4V转膜2h。取出膜，置室温中风干，放入一定量膜封闭剂(1％牛血清白蛋白，10mM Tris pH7.5，100mM NaCl，0.1％Tween 20)中，室温悬浮振荡封闭1h或封闭过夜。弃去膜封闭剂，用TBS-T(10mM Tris pH7.5，100mM NaCl，0.1％Tween 20)冲洗数次，加入抗体稀释液，再加入一定量的第一抗体(一抗为兔抗，添加量与TBST体积比为1∶8000)，室温振荡孵育1h。倒去抗体稀释液，加入洗涤缓冲液PBS-T室温振荡洗涤15min，更换PBS-T，再洗涤4次，每次5min。加入抗体稀释液，再加入一定量的第二抗体(辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG)，室温振荡孵育1h。按上述方法洗去非特异结合的二抗。按PIERCE公司的说明书准备化学发光底物，即从两种储备溶液中各取1.5ml等体积混合配制工作液，将膜置于工作溶液中孵育5min。取出膜后，将膜夹在两片透明塑料保护膜之中，再置于夹具内曝光10～30min。曝光后取出X光胶片，置于显影液中2～3min随后把X光胶片移到定影液中2～3min，Western blotting的结果请见图7。

从图6中看出易错子PYG232-50上清中出现的是完整的88KD的蛋白，经过亲和层析后纯化的ECS酰化酶初始蛋白和易错子均出现了大小分别为63KD，25KD的两个亚基，与文献报道一致(A Matsuda，K Toma，and KKomatsuJ Bacteriol.1987 December；169(12)：5821-5826)。

4.3将该ECS易错子的质粒序列进行测序鉴定。质粒测序(上海英骏生物技术有限公司)采用VectorNTI，将PYG232-50序列和出发序列比对结果，发现DNA序列中有2个碱基突变，分别是539位的T被C替换、1182位的G被A替换，由核酸水平突变预测蛋白水平上氨基酸突变体现在180位的缬氨酸(Valine)被丙氨酸(Alanine)替换。ECS酰化酶基因与突变株的核苷酸序列比对及氨基酸序列对比请见图7和图8。

实施例2 表达质粒pYG236构建及转化顶头孢霉(Acremoniumchrysogenum，ATCC 11550)

1、构建含有抗性基因hygB和外源基因ecs的顶头孢霉表达质粒pYG236，采用Ptrp启动子启动ecs基因，pcpc启动子启动抗性基因hygB。pYG236质粒构建过程如下：用XbaI+EcoRI双酶切质粒pYG232-50质粒，得到ecs-50基因，从pDH25质粒(黄大昉等，携带潮霉素抗性基因的质粒pDH25转化灰霉菌研究，中国生物工程杂志1990年05期)用EcoRI+KpnI酶切得到Ptrp启动子，得到的ecs-50基因和Ptrp启动子与用KpnI+XbaI酶切的pUC18质粒相连得到质粒pUC18+ecs-50+Ptrp质粒。用SalI+HindIII酶切得到pcpc+hgh基因，与同样酶切的pUC18相连接，得到pUC18+pcpc+hgh，此质粒经克隆后用HindIII+XbaI酶切后得到的pcpc+hgh基因片段与同样酶切的pUC18+ecs-50+Ptrp的片段相连接后克隆，最终构建完成pYG236质粒。构建过程如图9。

ecs-50基因是经过体外突变得到的比ecs基因对CPC的转化率提高了20％，能够更加有效的转化CPC生成7-ACA。pYG232-50所用的启动子是使用于大肠杆菌表达的启动子的，不能在顶头孢霉中表达，因此需要构建在顶头孢霉中表达的表达载体pYG236。

2、顶头孢霉(Acremonium chrysogenum，ATCC 11550)原生质体制备

(1)从斜面上刮下适量顶头孢霉(Acremonium chrysogenum，ATCC11550)孢子(购自ATCC公司)，用玻璃珠或匀浆器打碎后制成单孢子悬液接种于适量玉米浆培养基【玉米浆3％(w/v)，葡萄糖1％(w/v)，淀粉3％(w/v)，CaCO₃0.5％(w/v)，pH6.8】中，28℃、230r/min培养96h；

(2)将上述培养液以10％(v/v)的接种量转接于YPS培养基中，同样条件培养12～16h后，室温离心(Beckman Avanti J-25，JA-17转子，12000r/min，10min)收获菌体，用无菌水洗涤2次；

(3)将DTT配成5mmol/L的溶液；

(4)尽量将菌丝体上清倒掉，加入10ml经0.22μm无菌滤膜过滤的DTT溶液，充分混匀后于30℃水浴振荡孵育30～60min；

(5)10000r/min离心10min，用P缓冲液(KCl，4.47w/v，MgCl₂·6H₂O0.203w/v，CaCl₂0.278w/v)洗涤2次；

(6)将Lysing酶(Sigma)溶于P缓冲液至终浓度10mg/ml；

(7)尽量将菌丝体上清倒掉，加入10ml经0.22μm无菌滤膜过滤的Lysing酶溶液，充分混匀后于30℃水浴振荡孵育2～3h，其间镜检观察原生质体形成情况；

(8)当大部分菌丝已释放原生质体时，加入4倍体积的P缓冲液，用灭菌的装填脱脂棉的针筒过滤除去残留的菌丝体；

(9)3000r/min离心沉淀原生质体；

(10)用P缓冲液重悬洗涤2次，最后将原生质体悬浮于适当体积的P缓冲液中制成悬浮液，使原生质体浓度大于10⁸个/ml。

3、PEG-CaCl₂介导的顶头孢霉原生质体转化

(1)将上述制备的原生质体分装于1.5ml离心管中，每管100μl；

(2)加入10μg的pYG236质粒DNA，轻轻混匀，冰浴30min；

(3)加入900μl的PEG6000/CaCl₂溶液【30％(w/v)PEG6000，20mmol/LCaCl₂】，25℃孵育20min。

(4)6000r/min离心(Eppendorf 5415R台式离心机，下同)5min。

(5)尽量吸出PEG6000溶液，用P缓冲液洗涤1次；

(6)将原生质体重悬于100μl P缓冲液，加入于45℃保温的上层软琼脂培养基【胰蛋白胨1.5％(w/v)，大豆蛋白胨0.4％(w/v)，蔗糖10.3％(w/v)，琼脂粉0.5％(w/v)，pH7.0】中，于旋涡振荡器上轻轻振荡混匀，然后倾倒在再生平板【胰蛋白胨1.5％，大豆蛋白胨0.4％(w/v)，蔗糖10.3％(w/v)，琼脂粉1.5～2.0％(w/v)，pH7.0】上，迅速转动平板使软琼脂均匀覆盖在下层培养基表面；

(7)于28℃培养36h，覆盖含有潮霉素B的NaCl软琼脂(NaCl，0.7mol/L，pH7.0.)使平板中潮霉素B终浓度为5μg/ml，软琼脂凝固后，于28℃培养2周，观察结果。

经镜检计数，用于转化的原生质体浓度达到10⁸～10⁹个/ml。用

质粒提取试剂盒(购自Qiagen公司)提取各转化质粒并用乙醇沉淀浓缩，使质粒的浓度达到0.5～1μg/μl。在本研究的转化试验中所采用的抗性标记为潮霉素B抗性，用于筛选的潮霉素购自于(biobasic公司)。

实施例3 转化子Acremonium chrysogenum/pYG236的PCR验证

从实施例1的再生转化平板上挑取顶头孢霉抗性转化子接至含有10μg/ml潮霉素的基础培养基【麦芽汁20％(w/v)，麦芽糖4.0％(w/v)，聚胨1％(w/v)，pH7.0，加纯化琼脂粉2％(w/v)】平板上培养10～14天(d)，待孢子长得丰满时再将其涂布至基础培养基的斜面上，继续培养10～14天，然后从斜面上刮下孢子，液氮抽提法提取基因组DNA进行PCR验证。

1、液氮抽提法提取顶头孢霉基因组：

(1)从斜面上刮下少量孢子加入适量的液氮进行研磨；

(2)研磨后用1ml抽提液溶解，抽提液(Tris-HCl pH7.50.2mol/ml，NaCl 0.5mol/l，EDTA 0.01mol/l，SDS 1％)；

(3)加入等体积的酚氯仿，旋涡振荡3min，10000r/min，5min；

(4)取上清加入等体积氯仿，10000r/min，5min；

(5)去上清加入等体积异丙醇，室温放置20min，12000r/min，10min，白色沉淀即为基因组。

2、PCR验证

根据转化质粒pYG236上的潮霉素抗性基因序列设计引物，以抗性转化子的基因组DNA为模板进行PCR扩增，以质粒为模板进行的PCR反应作为阳性对照，以顶头孢霉出发菌株基因组DNA为模板进行的PCR反应作为阴性对照。理论上以抗性转化子基因组DNA和质粒为模板应能扩增出长约400bp的抗性基因片段。PCR反应条件为：94℃2min；然后94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，共进行30个循环；最后72℃保温5min结束反应。PCR产物的电泳结果见图10。表明已经转化成功。

实施例4 原生质体融合条件确定

采用实施例1中制备的含有phleo腐草霉素抗性基因的第一亲本和含有HygB潮霉素B抗性基因的第二亲本作为用于融合的原生质体。按照实施例1中方法制备原生质体，用于融合的原生质体浓度达到10⁸～10⁹个/ml，将第一和第二亲本的原生质体取500μl进行等体积混合，并加入1ml的PEG溶液进行融合，放置在25℃30min培养箱中，6000r/min进行离心，去上清沉淀用P缓冲液洗涤，6000r/min进行离心，沉淀用1ml P缓冲液重悬，取100μl重悬液加入于45℃保温的上层软琼脂培养基【胰蛋白胨1.5％(w/v)，大豆蛋白胨0.4％(w/v)，蔗糖10.3％(w/v)，琼脂粉0.5％(w/v)，pH7.0】中，于旋涡振荡器上轻轻振荡混匀，然后倾倒在再生平板【胰蛋白胨1.5％，大豆蛋白胨0.4％(w/v)，蔗糖10.3％(w/v)，琼脂粉1.5～2.0％(w/v)，pH7.0】上，迅速转动平板使软琼脂均匀覆盖在下层培养基表面；于28℃培养36h，覆盖含有潮霉素B和博来霉素的NaCl软琼脂(NaCl，0.7mol/L，pH7.0.)使平板中潮霉素B终和博来霉素浓度为5μg/ml和5μg/ml，软琼脂凝固后，于28℃培养2周，观察结果。同时将不同分子量的融合剂PEG进行融合实验。原生质体制备后，利用血球计数板计算每毫升中原生质体的数量，计作A。

融合率计算方法：分别用P缓冲液与0.01％(w/v)的SDS水溶液稀释后铺再生培养剂平板【胰蛋白胨1.5％，大豆蛋白胨0.4％(w/v)，蔗糖10.3％(w/v)，琼脂粉1.5～2.0％(w/v)，pH7.0】，使用SDS稀释后长出的为非原生质体单位，可计算出每毫升中的非原生质体单位数B。而用P缓冲液稀释后长出的为原生质体再生(指制备的原生质体本身再生，非原生质体是由于得到的原生质体本身含有菌丝、孢子因此需要扣除)与非原生质体单位的总和，可计算出每毫升得总数C。

融合后，稀释铺板，利用抗性筛选，得出每毫升中的融合子数目D。

融合率R＝D/(C-B)。结果见表1。

表1.不同分子量的融合剂PEG的融合率

PEG分子量	1000	2000	4000	6000
					融合率	1.8％	7.5％	12.9％	9.6％

在PEG4000为40％浓度是其融合率为12.9％，在不同的浓度下其融合率的确定，结果见表2。

表2.不同的浓度的融合剂PEG4000的融合率

PEG4000浓度/％	30	35	40	45
					融合率	15.2％	14.1％	12.8％	11.4％

在原生质体融合实验中，本发明最终选择的融合剂PEG4000浓度是30％。

实施例5 融合子的PCR双抗性验证

在双抗再生平板上长出的单菌落首先根据实施例1中方法进行基因组提取，同时采用扩增潮霉素B抗性基因和腐草霉素抗性基因方法验证融合子的正确性，结果如图11所示。最终获得21株融合子。

实施例6 所得融合子摇瓶发酵及HPLC定量分析

将所得融合子进行斜面培养后接种于装量为20ml种子培养基【玉米浆6％(w/v)，蔗糖3.5％(w/v)，葡萄糖0.5％(w/v)，甲硫氨酸0.05％(w/v)，(NH₄)₂SO₄ 0.8％(w/v)，CaCO₃ 0.5％(w/v)，豆油1％(v/v)，pH6.5】250ml摇瓶中，于旋转式摇床培养3d，转速为230r/min，温度28℃。再以10％(v/v)接种量转接至装量为20ml发酵培养基【玉米浆10％(w/v)，淀粉3％(w/v)，糊精6％(w/v)，葡萄糖0.5％(w/v)，甲硫氨酸0.6％(w/v)，尿素0.3％(w/v)，KH₂PO₄ 0.9％(w/v)，MgSO₄·7H₂O 0.3％(w/v)，(NH₄)₂SO₄ 1.3％(w/v)，CaCO₃ 1％(w/v)，微量元素溶液(FeSO₄·7H₂O 0.8％，MnSO₄·H₂O 0.2％，ZnSO₄·7H₂O 0.2％，CuSO₄·5H₂O 0.2％)1％(v/v)，豆油2％(v/v)，pH6.2】的250ml摇瓶中，25℃，230rpm，培养7d。融合子发酵液经普通滤纸过滤，收集滤液直接进行HPLC分析。采用C18(5μm，4.6×150mm)柱，流动相为甲醇∶0.2％磷酸二氢钠(5∶95)，检测波长为254nm，流速1ml/min，柱温为40℃，进样量为10μl，所得的21株融合子中有五株效价800μg/ml以上，其中17号发酵后7-ACA产量在1437μg/ml，具有较大幅度提高。而出发株在同样发酵条件下的7-ACA产量分别为：第一亲本产量380μg/ml，第二亲本537μg/ml。

实施例7 融合子稳定性实验

选择7-ACA发酵产量最高的融合子17号在抗性平板上传代5次后进行摇瓶发酵及HPLC检测后发现7-ACA产量在1389μg/ml，说明融合子的稳定性较好。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外，应理解，在阅读了本发明的上述内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (10)

1.一种改良7-ACA产生菌的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)取含有不同抗性筛选标记基因的两个亲本，其中第一亲本是含有外源野生型头孢菌素C酰基转移酶的基因的顶头孢霉(Acremoniumchrysogenum)基因工程菌，第二亲本是含有外源头孢菌素C酰基转移酶正向突变体的基因的顶头孢霉基因工程菌，该头孢菌素C酰基转移酶正向突变体的酶活性和头孢菌素C底物耐受性比野生型均有提高，分别用第一亲本和第二亲本的孢子制备原生质体；

2)将步骤1)制备所得的第一亲本和第二亲本的原生质体在融合剂的存在下进行原生质体融合，融合剂为PEG2000-6000，融合剂浓度20％-40％(重量)，在含有第一亲本抗性和第二亲本抗性两种抗性的再生平板上长出的单菌落即为融合子；

3)将步骤2)所得的融合子摇瓶发酵，检测发酵液中7-ACA的含量，选择7-ACA含量比两亲本高的融合子即为改良的7-ACA产生菌。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的野生型头孢菌素C酰基转移酶来源于假单胞菌的基因vac，或者是经过密码子优化在顶头孢霉中高效表达的基因ecs。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的外源头孢菌素C酰基转移酶正向突变体的基因是如下(1)或(2)的基因：

(1)其碱基序列如序列表中SEQ ID No.1所示；

(2)编码如下蛋白质(a)或(b)的基因：

(a)其氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.2所示；

(b)在(a)中的氨基酸序列的N端或C端添加一个或几个氨基酸残基并且具有CPC酰化酶活性的重组蛋白质。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，(b)所述的一个或几个氨基酸残基组成的肽段是信号肽或蛋白标签。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的第一亲本含有外源野生型头孢菌素C酰基转移酶基因的表达盒和第一抗性筛选标记基因的表达盒，或者含有外源野生型头孢菌素C酰基转移酶基因和第一抗性筛选标记基因的双基因表达盒；所述的第二亲本含有外源头孢菌素C酰基转移酶正向突变体基因的表达盒和第二抗性筛选标记基因的表达盒，或者含有外源头孢菌素C酰基转移酶正向突变体基因和第二抗性筛选标记基因的双基因表达盒。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的表达盒包括启动子和所述的外源基因。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述的启动子是启动子Ptrp，pcpc或双向启动子PpcbAB-PpcbC。

8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的抗性筛选标记基因分别是phleo和hygB。

9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的第一亲本是7-ACA产生菌顶头孢霉基因工程菌Acremonium chrysogenum/pYG233。

10.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的第二亲本是顶头孢霉基因工程菌Acremonium chrysogenum/pYG236。

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