CN101768594B - 一种编码cpc酰基转移酶的核苷酸序列及生产7-aca的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种编码头孢菌素C酰基转移酶的核苷酸序列、其重组表达载体及其转化子。该核苷酸序列是选自下组之一的核苷酸序列：a)序列表中SEQ ID NO.1所述的核苷酸序列；b)与序列表中SEQ ID NO.1所述的核苷酸序列的同源性≥94.4％的核苷酸序列；c)与a)或b)中所述的核苷酸序列互补的核苷酸序列。本发明还公开一种生产7-氨基头孢烷酸的方法，该方法包括培养上述转化子，从中获得7-ACA。本发明首次采用生物工程技术，由工程菌直接生产7-ACA，与现有的化学合成方法以及生物酶催化方法相比，该方法步骤简单，原料广泛，生产过程中无化工污染，大大降低生产成本，将带来巨大的经济效益，具有优良的工业化前景。

Description

一种编码CPC酰基转移酶的核苷酸序列及生产7-ACA的方法

技术领域

本发明属于生物工程领域，特别涉及一种编码头孢菌素C(CPC)酰基转移酶的核苷酸序列、其重组表达载体及其转化子及一种生产7-氨基头孢烷酸(7-ACA)的方法。

背景技术

7-氨基头孢烷酸(7-ACA)是β-内酰胺类抗生素合成的主要前体，工业上主要以化学法由头孢菌素C(CPC)进行合成获得。由于化学裂解法环境污染大，原料成本高，现在已有部分厂家采用生物酶催化法进行7-ACA生产。生物酶催化法采用生物酶作为催化剂，在体外将酶和底物进行催化反应，形成7-ACA。现有生物酶催化法包括两步酶法及一步酶法。两步酶法已有用于工业化生产的报道，其涉及两个酶(D-氨基酸氧化酶和戊二酰基转移酶)分步催化。一步酶法用头孢菌素C酰基转移酶直接催化CPC形成7-ACA，目前还没有工业化，技术上有待进一步改进。生物酶催化法，步骤繁琐，成本较高。

发明内容

本发明要解决的技术问题就是针对现有的7-氨基头孢烷酸生产方法存在的不足，提供一种编码头孢菌素C酰基转移酶的核苷酸序列、其重组表达载体、转化子(或称转化体)，及其一种全新的生产7-氨基头孢烷酸的方法。

本发明人经过广泛的研究发现，天然的顶头胞霉(Acremoniumchrysogenum)自身就可产生CPC，但不合成头孢菌素C酰基转移酶，而CPC是头孢菌素C酰基转移酶催化形成7-ACA的底物。因此，本发明人经过了大量的试验，将头孢菌素C酰基转移酶基因重组转化顶头胞霉，终于获得了直接发酵生产7-ACA的重组顶头胞霉，从而完成了本发明。

因此，本发明解决上述技术问题所采用的技术方案之一是：一种编码头孢菌素C酰基转移酶的核苷酸序列，该核苷酸序列是选自下组之一的核苷酸序列：

a)序列表中SEQ ID NO.1所述的核苷酸序列；

b)与序列表中SEQ ID NO.1所述的核苷酸序列的同源性≥94.4％的核苷酸序列；

c)与a)或b)中所述的核苷酸序列互补的核苷酸序列。

根据本发明，较佳的，c)中所述的同源性≥94.4％的核苷酸序列为序列表中SEQ ID NO.2所述的核苷酸序列。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案之二是：一种重组表达载体，其含有如上所述的核苷酸序列。根据本发明，较佳的，其载体骨架为质粒pUC18、pET-28a(+)或pYG13。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案之三是：一种转化子，其含有如上所述重组表达载体。根据本发明，较佳的，其宿主细胞为大肠杆菌或顶头孢霉(Acremonium chrysogenum)。所述的大肠杆菌较佳的为E.coli DH5α或E.coli BL21(DE3)。所述的顶头孢霉较佳的为顶头孢霉ATCC 11550。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案之四是：一种生产7-氨基头孢烷酸的方法，包括培养如上所述的转化子，从培养物中获得7-氨基头孢烷酸，其中所述的转化子可为CPC产生菌、如上述的顶头孢霉的基因工程菌。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案之五是：一种如上所述的转化子在制备7-氨基头孢烷酸中的应用。

本发明所用的原料或试剂除特别说明之外，均市售可得。

相比于现有技术，本发明的有益效果如下：本发明提供了一种全新的生产7-氨基头孢烷酸(7-ACA)的方法。该方法首次采用生物工程技术，由工程菌直接生产7-ACA。只要让工程菌在普通的培养基中发酵，从发酵液中进一步提取、纯化就能获得7-ACA。与现有的化学合成方法以及生物酶催化方法相比，该方法步骤简单，原料广泛，生产过程中不产生化工污染，将大大降低生产成本，具有优良的工业化前景，经过进一步对发酵条件和纯化条件的优化，将带来巨大的经济效益。

附图说明

以下结合附图说明本发明的特征和有益效果。

图1是本发明的优化设计的基因序列ecs与原始序列vac的序列比较及差异。

图2是本发明的ecs全长基因人工合成示意图。

图3是本发明的重组表达质粒pYG231的质粒构建图。

图4是本发明的重组表达质粒pYG232的质粒构建图。

图5是本发明的重组表达质粒pYG232转化表达宿主菌E.coli BL21(DE3)感受态细胞后，检测其表达水平的SDS-PAGE电泳图。1，(标准品)Marker；2，Pet28/DE3；3，pYG232/DE3菌液；4，pYG232/DE3纯化。

图6是本发明的粗酶液在酶活的测定中，酶底物反应液的HPLC检测结果。A图，标准品7-ACA(3％(w/v)NaHCO3)；B图，酶底物反应液。

图7是本发明的粗酶液在酶活的测定中，酶底物反应液的TLC检测结果。1，标准品；2，酶底物反应液。

图8是本发明的顶头孢霉表达载体pYG232的质粒构建图。

图9是本发明的顶头孢霉转化子的PCR验证结果。1，pYG233质粒；2，顶头孢霉pYG233转化子；3，DL2000分子量标准；4，顶头孢霉宿主基因组。

图10是本发明的顶头孢霉转化子的Southern blotting验证结果。A图是电泳图，B图是Southern blotting杂交图。1，pYG233；2，pYG233/EcoRI；3，pYG233顶头孢霉转化子-1的基因组DNA；4，pYG233顶头孢霉转化子-2的基因组DNA；5，顶头孢霉宿主基因组DNA。

图11是本发明的各转化子的发酵液的HPLC检测结果。A图，体外转化；B图，体内发酵；C图，阴性对照。

具体实施方式

本发明人利用顶头孢霉的密码子偏爱性及RNA二级结构预测分析，设计并合成了全长的头孢菌素C酰基转移酶突变基因(ecs)，体外表达验证重组酶的正确性及其催化效率后，将其导入顶头孢霉中进行表达，重组菌能直接发酵产生7-ACA。

下面用实施例来进一步说明本发明，但本发明并不受其限制。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所述的“室温”是指进行试验的操作间的温度，一般为25℃。

实施例1基因序列的优化

基于文献报道的来源于假单胞菌N176中头孢菌素C酰基转移酶(GL-7-ACA酰基转移酶)基因(vac)序列(Pollegioni L.，et al，Protein Science，2005，14：3064)，设计了适用于顶头孢霉中表达的基因。首先将该基因的全长序列进行遗传密码优化设计，即根据密码子使用偏好把体外表达基因改变为适用于顶头孢霉表达的编码方式。优化的原则兼顾顶头孢霉密码子偏爱性及利用频率的平衡性，减少编码Phe的UUA和UUG密码子，编码Cys的UGU密码子，编码Leu的CUA密码子，编码Arg的CGA密码子，编码Ile的AUA密码子，编码Asn的AAA密码子，编码Ser的AGA密码子，编码Val的GUA密码子，平衡编码各个氨基酸密码子的使用频率。同时利用RNA预测软件选择二级结构自由能较小，结构简单，利于表达的起始结构等的最优基因序列。优化设计的头孢菌素C酰基转移酶突变基因(命名为ecs)，全长2349bp，基因序列见序列表中的SEQ ID NO.1。该优化设计的基因序列ecs与原始序列vac的序列比较及差异见图1。两者的RNA的二级结构预测的结构自由能分别为：原始序列vac，-838kkal/mol；优化基因序列ecs，-811kkal/mol。

在优化后序列中设计7个酶切位点ctgcag(PstI)；gctagc(NheI)；aagctt(HindIII)，gcatgc(SphI)，ggatcc(BamHI)gcggccgc(NotI)，gctagc(NheI)将其分割为8段，即ecs1(241 bp)、ecs2(464 bp)、ecs3(197bp)、ecs4(305bp)、ecs5(201bp)、ecs6(190bp)、ecs7(483bp)、ecs8(318bp)；各大段再设计为数个60～68 bp的寡核苷酸片段进行合成，每段寡核苷酸片段有相互18～20 bp的重叠碱基。对ecs1、ecs2、ecs3、ecs4、ecs5、ecs6、ecs7、ecs8分别设计一对接头引物(引物两端分别带有上述酶切位点和保护碱基)。该优化后的序列具体参见序列表中的SEQ ID NO：1。该序列与原始序列的同源性是94％。同时在该序列(SEQ ID NO：1)的5’端和3’端分别引入KpnI和XbaI酶切位点。

实施例2 ecs序列的人工合成及PCR拼接

PCR酶切连接法合成实施例1所设计的ecs全长基因：将化学合成(合成公司：上海英俊生物技术有限公司)的57个寡聚核苷酸片段，每个片段长(60～68bp)拼接组装起来，获得完整的总长为2349bp的ecs序列。拼接过程见图2。

实施例3体外克隆质粒构建

实施例2中PCR拼接而成的ecs全长基因，经过XbaI和KpnI酶切与pUC18克隆载体(TaKaRa公司)连接(构建过程见图3)，连接按照说明书进行。连接产物转化E.coli DH5α(Takara公司)感受态细胞。在含有氨苄青霉素、X-gal和IPTG的LB筛选平板上进行蓝白斑筛选，并提取白菌落质粒进行菌落PCR以鉴定阳性重组子。E.coli DH5α感受态细胞的制备及转化采用CaCl₂法，步骤参见文献《分子克隆》。

DNA序列测定与分析：阳性重组子由Invitrogen上海英俊生物技术有限公司进行序列测定。

上述经鉴定为阳性的克隆质粒命名为pYG231。

实施例4重组头孢菌素C酰化酶表达质粒的构建

用EcoRI和SalI双酶切质粒pYG231，把其中的ecs片段插入载体质粒pET-28a(+)(购于Novagen公司)多克隆位点的EcoRI和SalI之间，所得到的重组表达质粒命名为pYG232。构建过程见图4。

实施例5 E.coli BL21(DE3)/pYG232的诱导表达及蛋白纯化

ecs基因在大肠埃希菌中的表达按以下步骤：pYG232转化表达宿主菌E.coli BL21(DE3)感受态细胞。37℃培养至A₆₀₀到0.8，加人IPTG诱导(终浓度为0.6mmol/L)，25℃诱导16h后取样，SDS-PAGE电泳检测表达水平(图5)，可以看到在88.9KD处与对照相比有明显的表达蛋白条带。

ECS蛋白纯化

(1)200ml上述诱导表达培养物经离心获得的细胞，用5ml NTA-0重悬，置于冰浴中超声波破壁5min(500W，工作5s，间歇5s)。细胞破壁液于最大转速4℃离心20min(Eppendorf 5415R小型冷冻高速离心机，最大转速13,200r/min)，取上清置于烧杯(25ml)中；

(2)加入1ml Ni-NTA树脂(购自申能博彩公司)混悬液(含50％V/V树脂，保存于20％V/V乙醇溶液中)，置于冰上(或在4℃冰箱中)用脱色摇床120r/min振荡1h；

(3)装入层析柱，移去层析柱底端的帽子，上清液通过NTA柱，收集流出部分，用于电泳分析；

(4)加10ml NTA-20洗涤层析柱，洗去未结合的杂蛋白；

(5)用2ml NTA-200洗脱目的蛋白，分4次洗脱，每次0.5ml；

(6)柱子的再生，先用5ml NTA-500冲洗柱子，再用5ml 20％V/V乙醇冲洗柱子，最后盖上柱子底端的帽子，用0.5ml 20％V/V乙醇溶液重悬树脂，4℃保存。树脂可重复使用3～5次。

所得蛋白进行SDS-PAGE(图5)。纯化后在58.3KD及30.6KD处有明显条带出现，分别为ECS表达蛋白的α和β两个亚基。说明目的蛋白得到表达并纯化。分光光度计法测定粗酶提取液纯度为21.34mg/ml。测定公式：1.5OD₂₈₀-0.75OD₂₆₀。

实施例6酶活性测定

实施例5所纯化的ECS蛋白即粗酶提取液，用于酶活的测定，活性测定体系：25℃，反应体系总体积1ml，体系含有：0.5mg/ml粗酶液；5mg/mlCPC底物；100mM pH8.0的磷酸钠缓冲液。反应在25℃，轻微摇动下进行，反应6h，HPLC检测产物生成量及底物消耗量，采用C18(5μm，4.6×150mm)柱，流动相为甲醇∶0.2 w/v％磷酸二氢钠(体积比5∶95)，检测波长为254nm，流速1ml/min，柱温为40℃，进样量为10μl。检测结果如图6。HPLC检测反应产物与标准品7-ACA(3％(w/v)NaHCO₃)出峰时间基本相同。

薄层层析(TLC)检测

1.点样

(1)样品的溶解：将标准品CPC和7-ACA溶于3％(w/v)NaHCO₃溶液。上述酶底物反应液即为点样样品。

(2)薄层点样：用毛细管(0.5mm以下)进行点样。点样位置应在距离底边1～1.5cm处；点样量适当；点样直径小于2～3mm；间隔反复点样；多个点样时，间隔为2cm且处于同一条直线上。薄层板选用硅胶板5×15cm规格。

2.展开：当样点上的溶剂充分挥干后，将薄层放置在密闭容器中，使适当的展开剂(正丁醇∶冰醋酸∶水＝体积比3∶1∶1)，从薄层的一端向另一端进行浸润展开的过程。

3.显色：水合茚三酮显色。

4.比移值(Rf)的计算。展开结束，经过显色操作后，斑点分离，以Rf值作为斑点位置的指标：

比移值(Rf)＝(斑点中心与原始样点之间的距离)/(溶剂前沿与原始点样之间的距离)

结果酶底物反应液出现了与标准品7-ACA相同的比移值大致相同，大约为比移值(Rf)＝1/2，TLC结果如图7。

实施例7顶头孢霉表达载体的构建

pYG13(张丕燕等，微生物学报，2004，44：255～257)是现有的用于将vgb转化至顶头孢霉的质粒，其上分别含有原核筛选标记氨苄青霉素抗性基因(amp^r)、真核筛选标记腐草霉素抗性基因(phleo^r)以及由本实验室从顶头孢霉中扩增得到的PpcbAB-PpcbC双向启动子，其中phleo^r和vgb分别位于活性较弱的PpcbAB和活性较强的PpcbC下游。用EcoRI和XbaI将pYG231上的ecs序列切下，经琼脂糖凝胶电泳回收后与经同样双酶切和回收的pYG13大片段相连，构建得到ecs转化载体(命名为pYG233)，其过程如图8所示。经测序验证结构正确。

实施例8pYG233对顶头孢霉的转化

顶头孢霉(Acremonium chrysogenum，ATCC 11550)原生质体制备

(1)从斜面上刮下适量顶头孢霉(Acremonium chrysogenum，ATCC 11550)孢子(购自ATCC)，用玻璃珠或匀浆器打碎后制成单孢子悬液接种于适量玉米浆培养基(玉米浆3％，葡萄糖1％，淀粉3％，CaCO₃ 0.5％，pH6.8，所述百分比均为w/v)中，28℃、230r/min培养96h；

(2)将上述培养液以10％(v/v)的接种量转接于YPS培养基中，同样条件培养12～16h后，室温离心(Beckman Avanti J-25，JA-17转子，12000r/min，10min)收获菌体，用无菌水洗涤2次；

(3)将DTT配成5mmol/L的溶液；

(4)尽量将菌丝体上清倒掉，加入10ml经0.22μm无菌滤膜过滤的DTT溶液，充分混匀后于30℃水浴振荡孵育30～60min；

(5)10000r/min离心10min，用P缓冲液洗涤2次；

(6)将Lysing酶(Sigma)溶于P缓冲液至终浓度10mg/ml；

(7)尽量将菌丝体上清倒掉，加入10ml经0.22μm无菌滤膜过滤的Lysing酶溶液，充分混匀后于30℃水浴振荡孵育2～3h，其间镜检观察原生质体形成情况；

(8)当大部分菌丝已释放原生质体时，加入4倍体积的P缓冲液，用灭菌的装填脱脂棉的针筒过滤除去残留的菌丝体；

(9)3000r/min离心沉淀原生质体；

(10)用P缓冲液重悬洗涤2次，最后将原生质体悬浮于适当体积的P缓冲液中制成悬浮液，使原生质体浓度大于10⁸个/ml。

PEG-CaCl₂介导的顶头孢霉原生质体转化

(1)将上述制备的原生质体分装于1.5ml离心管中，每管100μl。

(2)加入10μg的pYG233质粒DNA，轻轻混匀，冰浴30min。

(3)加入900μl的PEG6000/CaCl₂溶液(30％(w/v)PEG6000，20mmol/LCaCl₂)，25℃孵育20min。

(4)6000r/min离心(Eppendorf5415R台式离心机，下同)5min。

(5)尽量吸出PEG6000溶液，用P缓冲液洗涤1次。

(6)将原生质体重悬于100μl P缓冲液，加入于45℃保温的上层软琼脂培养基(胰蛋白胨1.5％，大豆蛋白胨0.4％，蔗糖10.3％，琼脂粉0.5％，pH7.0，所述百分比均为w/v)中，于旋涡振荡器上轻轻振荡混匀，然后倾倒在再生平板(胰蛋白胨1.5％，大豆蛋白胨0.4％，蔗糖10.3％，琼脂粉1.5～2.0％，pH7.0，所述百分比均为w/v)上，迅速转动平板使软琼脂均匀覆盖在下层培养基表面。

(7)于28℃培养36h，覆盖含有博来霉素的NaCl软琼脂(NaCl，0.7mol/L，pH7.0.)使平板中博来霉素终浓度为5μg/ml，软琼脂凝固后，于28℃培养2周，观察结果。

经镜检计数，用于转化的原生质体浓度达到10⁸～10⁹个/ml。用QIAGEN质粒提取试剂盒(购自Qiagen公司)提取各转化质粒并用乙醇沉淀浓缩，使质粒的浓度达到0.5～1μg/μl。在本研究的转化试验中所采用的抗性标记为腐草霉素，但腐草霉素来源有限，而与之作用机理类似的博来霉素则较容易获得，并且在本实验室之前的转化工作中已证明博来霉素可用于顶头孢霉的筛选，因此在本研究中也采用博来霉素(购自日本化药株式会社)代替腐草霉素用于筛选。

将培养基中博来霉素终浓度定为5μg/ml。在此条件下，各平板上的转化子数量差异较大，少则数个，多则20～30个。

实施例9转化子的验证

从再生转化平板上挑取实施例8所得的顶头孢霉抗性转化子接至含有5μg/ml博来霉素的基础培养基(麦芽汁20％，麦芽糖4.0％，聚胨1％，pH 7.0，加纯化琼脂粉2％，所述百分比均为w/v)平板上培养10～14天(d)，待孢子长得丰满时再将其涂布至基础培养基的斜面上，继续培养10～14天，然后从斜面上刮下孢子，液氮抽提法提取基因组DNA进行PCR和Southernblotting验证。

液氮抽提法提取顶头孢霉基因组：

(1)从斜面上刮下少量孢子加入适量的液氮进行研磨；

(2)研磨后用1ml抽提液溶解，抽提液(Tris-HCl pH7.5 0.2mol/ml，NaCl0.5mol/l，EDTA 0.01mol/l，SDS 1％(w/v))；

(3)加入等体积的酚氯仿，旋涡振荡3min，10000r/min，5min；

(4)取上清加入等体积氯仿，10000r/min，5min；

(5)去上清加入等体积异丙醇，室温放置20min，12000r/min，10min，白色沉淀即为基因组。

PCR验证

根据转化质粒pYG233上的腐草霉素抗性基因序列设计引物，以抗性转化子的基因组DNA为模板进行PCR扩增，以质粒为模板进行的PCR反应作为阳性对照，以顶头孢霉出发菌株基因组DNA为模板进行的PCR反应作为阴性对照。理论上以抗性转化子基因组DNA和质粒为模板应能扩增出长约300bp的抗性基因片段。用于扩增抗性基因的引物phleo探针1和phleo探针2的特性见表1，PCR反应条件为：94℃ 2min；然后94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，共进行25个循环；最后72℃保温5min结束反应。PCR产物的电泳结果见图9。表明已经转化成功。

表1.腐草霉素抗性基因引物的序列和性质

Sothern blotting验证(采用购于Roche公司的地高辛标记杂交试剂盒)

探针制备

(1)上述PCR验证中扩增得到的300bp左右的腐草霉素抗性基因片段，通过凝胶电泳纯化该片段后作为模板DNA；

(2)取1μg模板DNA，加无菌双蒸水至终体积为16μl，沸水浴中变性处理该模板DNA 10min，迅速转移至冰浴中冷却；

(3)将DIG-High Primer(vial 1)(试剂盒中1号管：地高辛标记探针)混匀，吸取4μl至已变性的DNA溶液中，混匀后再轻微离心一次，上述反应液在37℃保温1h至过夜；

(4)加入2μl 0.2mol/L EDTA或65℃加热，处理10min终止反应，即得探针。

DNA片段的电泳、变性、转移

(1)用EcoR I限制酶分别消化顶头胞霉转化子、阳性对照pYG233质粒及阴性对照顶头胞霉宿主，经EcoR I限制酶消化后的DNA保存在4℃，加样前加热至56℃ 2～3min，以破坏突出的黏性末端可能形成的任何碱基对；

(2)加样时需缓慢加入，然后静置数分钟，以便DNA在加样孔中充分扩散；

(3)电泳结束后拍照，并将凝胶边缘修饰整齐；

(4)按照真空转移装置的说明依次连接好，平台上依次放置金属板(support screen)，尼龙膜，挖孔的塑料膜；

(5)预先润湿金属板及尼龙膜，压上塑料框，打开真空泵，测定压力，保证装置的密闭性；

(6)凝胶小心放置在尼龙膜对应位置上，开启真空泵。整个过程控制装置压力50mbar；

(7)在凝胶上加脱嘌呤溶液(HCl，0.25 mol/L)，液面以能覆盖整块凝胶为准，进行7min；

(8)去除多余的脱嘌呤溶液，加变性溶液(NaCl，1.5mol/L，NaOH，0.5mol/L)7min；

(9)去除多余的变性溶液，加中和溶液(Tris，1.0mol/L，NaCl，1.5mol/L)，7min；

(10)去除多余的中和溶液，加20×SSC，转移30～45min；

(11)取下凝胶，紫外灯下检测DNA是否转移完全；

(12)小心取下尼龙膜，并在膜上用铅笔标记方向；

(13)潮湿的膜经紫外交联2min(700×100μJ/cm2)后，自然风干。

预杂交与杂交

(1)用10×SSC溶液轻微振荡清洗尼龙膜表面，将膜装入杂交瓶中，与凝胶接触的一面朝上(不贴壁)；

(2)杂交瓶中加入42℃预热的杂交液(vial 7)5ml，预杂交2h，去除预杂交液；

(3)所得标记的探针煮沸变性5min后立即冰浴3min，加入预热至50℃的杂交液，转至杂交瓶中。在计算的杂交温度(本试验采用50℃)下杂交过夜。

清洗及测定

(1)按照上述试剂盒使用说明书配制所需溶液；

(2)室温下用2×SSC+0.1％(w/v)SDS溶液清洗膜，2×10min，加入溶液量可根据清洗容器及膜尺寸大小来调整，以没过膜表面，膜可以在容器内自由转动为准，本试验最终采用30ml，清洗转速50r/min，以下清洗转速同；

(3)杂交温度下用30ml 0.5×SSC+0.1％(w/v)SDS溶液清洗膜，2×15min；

(4)清洗缓冲液简单清洗5min；

(5)足量的封闭剂(马来酸缓冲液稀释vial 6，10×封闭剂至1×封闭剂)50ml，温育70min；

(6)15ml抗体溶液(以封闭剂稀释vial 4抗体，1∶10000)，温育30min；

(7)50ml清洗缓冲液清洗，3×30min；

(8)15ml检测缓冲液平衡5min；

(9)DNA一面朝上，0.5ml CSPD(化学发光底物)加到膜上，整个尼龙膜用保鲜膜封闭，膜上无气泡。室温放置5min；

(10)37℃温育10min以促进发光；

(11)X光胶片曝光，曝光时间根据发光强度调整，经显影和定影后保存胶片。

上述PCR验证中扩增得到的300bp左右的腐草霉素抗性基因片段作为探针，对各转化子基因组及其限制性内切酶消化产物进行Southern blotting验证，以经同样酶切的质粒作为阳性对照，以顶头孢霉出发菌株基因组及其酶切消化产物作为阴性对照。

质粒pYG233经EcoRI酶切得到7.7kb大小的片段，转化子基因组DNA经EcoRI消化后在胶片上的条带大约对应于凝胶电泳上出现多条杂交条带，表明pYG233在顶头孢霉中可能为多拷贝整合；阴性对照及DNA Marker在杂交胶片上都未出现条带。各成分琼脂糖凝胶电泳及杂交曝光照片如图10所示。

实施例10转化子的发酵

从再生转化平板上挑取实施例9所得的顶头孢霉抗性转化子接至含有5μg/ml博来霉素的基础培养基(麦芽汁20％，麦芽糖4.0％，聚胨1％，pH 7.0，加纯化琼脂粉2％，所述百分比均为w/v)平板上培养10～14d，待孢子长得丰满时再将其涂布至基础培养基的斜面上，继续培养10～14d，然后从斜面上刮下孢子，接种于装量为20ml种子培养基(玉米浆6％，蔗糖3.5％，葡萄糖0.5％，甲硫氨酸0.05％，(NH₄)₂SO₄ 0.8％，CaCO₃ 0.5％，豆油0.2ml/20ml，pH 6.5，所述百分比均为w/v)250ml摇瓶中，于旋转式摇床培养3d，转速为230r/min，温度28℃。再以10％(v/v)接种量转接至装量为20ml发酵培养基(玉米浆10％，淀粉3％，糊精6％，葡萄糖0.5％，甲硫氨酸0.6％，尿素0.3％，KH₂PO₄ 0.9％，MgSO₄·7H₂O 0.3％，(NH₄)₂SO₄ 1.3％，CaCO₃ 1％，微量元素溶液(FeSO₄·7H₂O 0.8％，MnSO₄·H₂O 0.2％，ZnSO₄·7H₂O 0.2％，CuSO₄·5H₂O 0.2％)1ml，豆油0.4ml/20ml，pH 6.2，所述百分比均为w/v)的250ml摇瓶中，25℃，230rpm，培养4d。

转化子发酵液的HPLC检测

转化发酵液经普通滤纸过滤，收集滤液直接进行HPLC分析，以外标法进行测定。采用C18(5μm，4.6×150mm)柱，流动相为甲醇∶0.2％(w/v)磷酸二氢钠(体积比5∶95)，检测波长为254nm，流速1ml/min，柱温为40℃，进样量为10μl。检测结果如图11。其中，A图，实施例6所得的pYG232转化E.coli BL21(DE3)的转化子的培养液，体外转化；B图，所得的顶头孢霉转化子发酵液，体内发酵；C图，未转化质粒pYG233的顶头孢霉宿主发酵液，阴性对照。从图11可见，在该转化发酵液中检测到了7-ACA。说明本发明的转化子能够直接发酵生产7-ACA。转化率为38.4％。若经过发酵条件优化和对发酵液的进一步纯化，本发明完全有理由得到具有工业用途的7-ACA。

实施例11第二个优化序列

按照实施例1中的密码子、RNA二级结构优化等原则，又设计了一个适用于顶头孢霉中表达的头孢菌素C酰基转移酶基因的核苷酸序列，该优化序列具体参见序列表中的SEQ ID NO：2。该优化序列与SEQ ID NO：1中的序列的相似度为94.4％。同实施例2～10的方法，按照该优化序列合成全长基因后克隆入质粒pYG13，然后转化顶头孢霉，阳性转化子发酵培养后，在发酵液中用HPLC也检测到了7-ACA。

综上所述，对来源于假单胞菌N176中头孢菌素C酰基转移酶基因(vac)的原始序列(Pollegioni L.，et al，Protein Science，2005，14：3064)，按照本发明的上述优化原则，在选择顶头孢霉偏爱的密码子、其RNA的二级结构经预测有利于蛋白合成、或者在该序列中形成几个限制性酶切位点等方面进行其它密码子的优化，而得到的其它可以编码头孢菌素C酰基转移酶的核苷酸序列均可实现本发明，都应在本发明的保护范围之内。

序列表

<110>上海医药工业研究院

<120>一种编码CPC酰基转移酶的核苷酸序列及生产7-ACA的方法

<130>P4-081526C

<160>2

<170>PatentIn version 3.4

<210>1

<211>2349

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>优化的适于顶头孢霉表达的头孢菌素C酰基转移酶的编码序列

<400>1

atgaccatgg cagctaatac ggatcgcgcg gttcttcaag cggcgctgcc tccgttgtct   60

ggttccctgc cgattccggg cctctcggcc agcgtgcggg tgcgccgtga tgcttggggt  120

atccctcata tcaaggcttc aggtgaagcg gacgcatacc gcgctcttgg cttcgttcat  180

tctcaagatc ggttgttcca aatggaactt acccggcgca aggcgctggg tcgtgctgca  240

gagtggcttg gggcggaggc cgctgaggcc gacatcctgg tccgccgtct gggtatggag  300

aaagtctgcc gccgcgactt cgaggctctc ggcgtcgaag ccaaagatat gctgcgcgcc  360

tacgttgccg gggtgaacgc cttcctggct tcgggggcac ctctgcctgt ggaatacggc  420

ctgcttggtg cggaaccgga gccatgggag ccatggcact caatcgccgt tatgcgccgc  480

ttgggcctgc tgatggggtc tgtgtggttc aaactctggc ggatgcttgc tctgccggtc     540

gtgggggctg ctaacgcgct caagctgcgc tacgacgacg gcgggcgcga cctcttgtgc     600

attccgccgg gcgccgaggc tgaccggctt gaggcggacc tcgcgacgct ccgcccagcc     660

gtcgatgcgc tgctgaaagc catgggtggg gatgctagcg acgccgctgg cgggggcagc     720

aataactggg ccgtcgctcc gggccgcacc gcaaccggtc gcccgatcct ggccggtgat     780

ccgcatcggg tctttgagat tccgggtttc tatgctcaac atcacctggc ttgcgaccgt     840

tttgacatga ttggtctgac cgtgcctggc gtcccgggct tcccaagctt tgcccataac     900

ggtaaggtcg catattgcgt gaccagcgct tttatggata tccacgatct ttacctggaa     960

cagttcgcag gcgagggtcg cacggcccgc ttcggtaacg acttcgaacc ggtggcctgg    1020

tcccgcgacc gtatcgccgt ccgcggcggg gccgaccgcg agttcgacat tgtcgagacg    1080

cgtcacgggc cggttatcgc aggtgaccca cgggacggtg cagcgctgac gctgcggagc    1140

gtccagtttg cggagacgga cctctcgttc gactgcctca cacgcatgcc gggggccagc    1200

accgtcgcgc agctgtatga cgctacccgt ggctgggggt tgatcgatca caacctcgtc    1260

gccggggacg tcgccggctc gatcgggcac cttgtgcgcg ctcgggtgcc gtcccgtcca    1320

cgcgagaatg ggtggttgcc ggtgcctggc tggagcggtg agcacgaatg gcggggctgg    1380

atccctcatg aagctatgcc tcgcgttatt gaccctccgg gtggtatcat cgtgacggcc    1440

aacaaccgcg tcgtcgcgga cgaccaccct gattacttgt gcacggactg ccatccgccg    1500

taccgtgccg agcgcatcat gaagcggttg gttgccaatc ctgcgttcgc tgtggacgat    1560

gcggccgcca tccacgcaga tacactgtca ccgcacgtcg ggctgctgcg ccgccgtctg    1620

gaggccctgg gcgcccgcga cgattcggcc gcagagggtc tccgtcagat gctggtcgcc    1680

tgggatggtc gcatggatgc tgcgtccgag gtcgcctccg cctacaacgc attccgtcgc    1740

gcgctgaccc gtctggtcac agatcggtcc gggctggaac aggctatttc gcatccattt    1800

gccgcggtgg caccgggcgt ttcgccacag ggccaggtgt ggtgggcggt tccgaccctg    1860

ttgcgggacg atgacgctgg tatgctgaag ggttggtcct gggatcaagc tctctcggaa    1920

gcgctgagcg ttgccagcca aaacctgaca ggtcgctcgt ggggtgaaga gcatcgtccg    1980

cgctttacac atcctctggc aacacagttc ccagcttggg caggtttgct caatccagct    2040

agccgcccga ttggcggcga tggggataca gtcctggcga atggcctggt tccaagcgca    2100

ggccctcagg ccacgtacgg cgccttatcc cggtacgtgt tcgatgtcgg caactgggac    2160

aactcacgtt gggtggtgtt tcatggcgca tccggtcatc cggcgtcagc gcattatgcg    2220

gaccagaatg cgccatggtc agattgtgcc atggtcccaa tgctgtattc ttgggatcgc  2280

attgcggcgg aagcggtgac ctctcaggaa cttgtcccgg ctctcgagca ccaccaccac  2340

caccactga                                                          2349

<210>2

<211>2349

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>优化的适于顶头孢霉表达的头孢菌素C酰基转移酶的编码序列

<400>2

atgaccatgg ctgctaatac ggatcgcgcg gtctcacaag ccgcgctgcc cccgttgtcc     60

ggttccctgc cgattccggg cctctcggcc agcgtgcggg tgcgccgtga cgcttggggt    120

atccctcaca tcaaggcttc aggtgaggcg gatgcctacc gcgctcttgg cttcgtccat    180

tcgcaagatc ggttgttcca aatggagctt acccggcgca aggcgctggg tcgcgctgcc    240

gagtggcttg gggccgaggc cgctgaggcg gacatcctgg tccgccgtct gggtatggag    300

aaagtctgcc gccgcgactt cgaggctctc ggcgttgaag cgaaggatat gctccgcgcc    360

tacgtcgccg gggtgaacgc cttcctggct tcgggggccc ccctgcctgt ggagtacggc    420

ctgcttggtg cggaaccgga accctgggag ccatggcact ccatcgcggt catgcgccgc    480

ttgggcctgc tgatggggtc tgtgtggttc aaactctggc gcatgcttgc actgccggtc    540

gtgggggctg ctaacgccct caagctgcgc tacgacgacg gcgggcgcga cctcttgtgc    600

atcccgccgg gcgccgaggc tgaccggctt gaggcggacc tcgcgacgct ccgccccgcg    660

gtcgatgccc tgctgaaggc catgggtggg gacgctagcg acgccgctgg cgggggcagc    720

aataactggg ccgtcgctcc gggccgcacc gctaccggtc gcccgatcct ggccggtgat    780

ccgcaccggg tctttgagat tccgggtttc tatgctcaac atcacctcgc atgcgaccgc    840

tttgacatga tcggtctgac cgtgcccggc gtcccgggct tcccaagctt cgcccacaac    900

ggtaaggtcg cttactgcgt gaccagcgcc tttatggata tccacgacct ttacctggag     960

cagttcgcag gcgaaggtcg gacggcgcgc ttcggtaacg acttcgaacc ggtggcctgg    1020

tcccgcgacc gtatcgcggt tcgcggcggg gccgaccgtg agttcgacat tgtcgagacg    1080

cgccacgggc cggtcatcgc aggtgacccc cgggacggtg ctgcgctgac gctgcgcagc    1140

gttcagtttg ccgagacgga cctctcgttc gactgcctca cacgcatgcc gggggccagc    1200

accgtcgcgc agctgtacga tgctacccgt ggctgggggt tgatcgacca caacctcgtc    1260

gccggggacg tcgcaggctc gatcgggcac cttgtgcgtg ctcgggtgcc gtcacgcccc    1320

cgcgagaacg ggtggctccc ggtgcctggc tggagcggtg agcacgagtg gcggggctgg    1380

atccctcacg aagctatgcc ccgcgttatt gatcctccgg gtggtatcat cgtgacggcc    1440

aacaaccggg tcgtcgcgga cgaccacccc gactacttgt gcacggactg ccatccgccg    1500

taccgtgccg agcgcatcat gaagcggttg gttgccaatc ctgcgttcgc tgtggacgat    1560

gccgccgcca tccacgcaga caccctgtcg ccgcacgtcg ggctgctgcg ccgccgtctg    1620

gaagccctgg gcgcccgcga cgattcggcc gcagagggtc tccgtcagat gctggtcgcc    1680

tgggacggtc gcatggatgc agcgtccgag gtcgcctccg cctacaacgc attccgccgg    1740

gcgctgaccc gtctggtcac agatcggtcc gggctggagc aggctatctc gcaccccttt    1800

gccgccgtgg ctccgggcgt ttctccccag ggccaggtgt ggtgggcggt cccgacactc    1860

ttgcgcgacg atgacgctgg tatgctgaag ggttggtcct gggatcaagc actctcggag    1920

gcgctgagcg ttgccagcca aaatctgaca ggtcgctcgt ggggtgaaga acatcgtccg    1980

cgcttcactc accctctggc cacacagttc ccagcttggg caggtcttct taacccagcg    2040

agccgcccga ttggcggcga tggggataca gtcctggcga atggcctggt tccaagcgca    2100

ggccctcagg cgacgtacgg cgccctctcc cggtatgtgt tcgatgtcgg caactgggac    2160

aactcacgtt gggtggtgtt tcatggcgca tccggtcatc cggcgtccgc gcattatgcg    2220

gaccagaatg cgccatggtc cgattgcgcc atggtcccaa tgctgtattc ctgggatcgc    2280

attgcggcgg aggcggtgac ctctcaggaa ttggtcccgg ctctcgagca ccaccaccac    2340

caccactga                                                            2349

Claims (9)

1.一种编码头孢菌素C酰基转移酶的核苷酸序列，其特征在于，该核苷酸序列是序列表中SEQ ID NO.1所述的核苷酸序列。

2.一种重组表达载体，其特征在于，其含有如权利要求1所述的核苷酸序列。

3.如权利要求2所述的重组表达载体，其特征在于，其载体骨架为质粒pUC18、pET-28a(+)或pYG13。

4.一种转化子，其特征在于，其含有如权利要求2所述的重组表达载体。

5.如权利要求4所述的转化子，其特征在于，其宿主细胞为大肠杆菌或顶头孢霉。

6.如权利要求5所述的转化子，其特征在于，所述的大肠杆菌为E.coliDH5α或E.coli BL21(DE3)。

7.如权利要求5所述的转化子，其特征在于，所述的顶头孢霉为顶头孢霉ATCC 11550。

8.一种生产7-氨基头孢烷酸的方法，其特征在于，包括培养如权利要求7所述的转化子，从培养物中获得7-氨基头孢烷酸。

9.一种如权利要求4所述的转化子在制备7-氨基头孢烷酸中的应用。

Images