CN105018455B - 一种头孢菌素c酰基转移酶的纯化方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种新的头孢菌素C酰基转移酶的纯化方法。该方法用盐析法替代柱层析法，不仅操作简单、生产周期短、成本低。而且产品的纯度高；从而可以大幅度提高我国高品质头孢菌素C酰基转移酶的产能，满足国内外市场的需求。

Description

一种头孢菌素C酰基转移酶的纯化方法
技术领域
本发明属于生物化学领域，具体涉及一种从发酵液中纯化头孢菌素C酰基转移酶的方法。
背景技术
7-氨基头孢烷酸（简称7-ACA），是头孢菌素合成中最常用、最重要的母核。7-ACA生产工艺主要有化学法和酶法两种。化学法主要包括酰氯法和混酐法，需要经过活化、缩合、保护和去保护等繁琐的过程，存在合成路线程长、步骤多、反应条件苛刻、产生大量的三废等诸多弊端。相较化学法，酶法合成工艺具有许多优点，如：生产工艺简单、周期短、反应条件温和、pH接近中性，另外，由于反应具有高度的区域和立体选择性，无需保护和去保护过程，从而割除了化学合成中所需的毒害物质，劳动环境得到改善，减少了三废的排放。
酶法合成7-ACA，因为使用的酶不同，又分为两步法和一步法。利用7-ACA D-氨基酸氧化酶和GL-7-ACA 酰化酶的两步酶法，从头孢菌素C到7-ACA的转化率较低，且7-ACA D-氨基酸氧化酶催化反应难以控制。一步酶法利用头孢菌素C酰基转移酶，不经过GL-7-ACA等中间体，直接将头孢菌素C转变到7-ACA。一步酶法的转化率与化学法相当，而且得到较高质量的7-ACA。因为具有上述优势，一步酶法逐步成为研发和应用的热点。
如果头孢菌素C酰基转移酶纯度不够，用于生产7-ACA时，其中的杂酶会参与酶裂解作用，产生与7-ACA理化性质和结构相似的杂质，如D-7ACA、DO-7ACA、GL-7ACA等。这些杂质因为与7-ACA的高度相似性，难以分离，从而影响7-ACA的质量；同时企业的生产成本也因为分离提纯而增加。因为一步酶法对头孢菌素C酰基转移酶的高度依赖，使得高品质的头孢菌素C酰基转移酶成为制约7-ACA生产的关键因素。目前头孢菌素C酰基转移酶还没有实现国产化，几乎全部依赖进口。韩国立科公司的头孢菌素C酰基转移酶占据了中国市场的90%以上，另外国际上，德国Sandoz的头孢菌素C酰基转移酶也占据主流市场。所以，优质、价廉的国产头孢菌素C酰基转移酶的工业化批量生产迫在眉睫。
头孢菌素C酰基转移酶大部分是通过发酵产生的，从发酵液中提取头孢菌素C酰基转移酶工艺复杂，现在的技术大多在分离步骤中或早或晚的使用树脂层析法。如公开号CN1641019A(公开日2005年7月20日)的中国发明专利申请“头孢菌素C酰基转移酶”，公开了使用亚氨基二乙酸基的螯合树脂柱。其中，说明书实施例2中记载，投入90U的头孢菌素C酰基转移酶，回收72U，回收率为80%，头孢菌素C酰基转移酶成品的活性为12U/ml，比活性为6.5U/mg。公开号CN1085252A（公开日1994年4月13日）的中国发明专利申请，公开了利用高效液体色谱柱：Tsk-gel TM DEAE-Toyopearl-5PW(Toso Co., Ltd., Japan) 纯化头孢菌素C酰基转移酶，成品纯度95%。US 5320948也记载了使用DEAE-Toyopearl 650H (Toso Co.,Ltd., Japan) (15×15 cm) 分离提纯一种新的头孢菌素C酰基转移酶的方法。公开号CN1836044A（公开日2006年9月20日）的中国发明专利申请则公开了使用DEAE-琼脂糖阴离子交换柱（5×18.5cm)和Phenyl- Toyoperl柱。
以柱层析为主要手段的头孢菌素C酰基转移酶纯化方法，需要用到大量的洗脱液，操作复杂；洗脱过程繁琐，耗费时间长；并且柱的体积和载样量等严重的限制了产量的提高。因此，柱层析法在工业生产中的应用受到限制。
因此，有必要开发出一种产品纯度高、生产操作简单便捷、适用于工业生产的头孢菌素C酰基转移酶的纯化方法。
发明内容
针对上述问题，本发明提供了一种新的头孢菌素C酰基转移酶的纯化方法。该方法用盐析法替代柱层析法，不仅操作简单、生产周期短、成本低。而且产品的纯度高；从而可以大幅度提高我国高品质头孢菌素C酰基转移酶的产能，满足国内外市场的需求。
为了实现上述发明目的，本发明采用了如下的技术方案：
发明人通过精密调节盐析法中所使用盐种类、使用量以及温度等条件，能够获得高纯度的头孢菌素C酰基酶。
本发明的另一目的是提供了一种新的头孢菌素C酰基酶的提炼方法，其特征在于该方法获得的头孢菌素C酰基酶纯度高于97%。经过试验证明，背景技术中所提到韩国立科和德国Sandoz所生产的头孢菌素C酰基酶进行一步酶生产7-ACA，含有DO-7ACA杂质；而本发明所公开的方法提纯而得的头孢菌素C酰基酶进行一步酶生产7-ACA，不含有DO-7ACA杂质。
本发明的技术方案是：
一种头孢菌素C酰基转移酶的纯化方法，包括以下步骤：头孢菌素C酰基转移酶粗品溶液，0~15℃下，加入硫酸铵，使硫酸铵浓度为1.6~2.4 mol/L，搅拌，盐析，收集盐析沉淀物。
优选的，硫酸铵在所述头孢菌素C酰基转移酶粗品溶液的浓度为1.8~2.2mol/L；更优选为2.0mol/L。
优选的，盐析温度为0~10℃；更优选为4℃。
本发明所述头孢菌素C酰基转移酶的纯化方法，还包括所述盐析沉淀物的纯化；具体操作为：盐析沉淀物溶解于磷酸盐溶液2，搅拌，收集沉淀物，即得。
优选的，所述磷酸盐溶液2为磷酸氢二钾溶液或磷酸二氢钾溶液,所述磷酸盐溶液2浓度为0.005-0.1 mol/L。
更优选的，所述磷酸盐溶液2为0.02mol/L、pH=8.0的磷酸氢二钾溶液。
还优选的，上述磷酸盐溶液2与所述盐析沉淀物的重量比为4.7:1~10.3:1；更优选为7.5:1~10.3:1；最优选为7.5:1。
本发明所述头孢菌素C酰基转移酶的纯化方法，所述头孢菌素C酰基转移酶粗品溶液通过破碎头孢菌素C酰基转移酶发酵液的细胞获得。
优选的，所述头孢菌素C酰基转移酶粗品溶液具体通过如下操作制备：
0~15℃下将头孢菌素C酰基转移酶发酵液离心，得到细胞沉淀物，向所述细胞沉淀物中加入磷酸盐溶液1，使细胞沉淀物重新悬浮，搅拌均匀，破碎细胞，去除菌渣，即得。
优选的，头孢菌素C酰基转移酶发酵液在0~10℃下离心，更优选为4℃。
优选的，所述磷酸盐溶液1为磷酸氢二钾溶液或磷酸二氢钾溶液，所述磷酸盐溶液1浓度为0.005-0.1 mol/L。
更优选的，所述磷酸盐溶液1为0.02mol/L、pH=8.0的磷酸氢二钾溶液。
还优选的，上述磷酸盐溶液1与所述细胞沉淀物的重量比为4:1~6:1；更优选为5:1。
优选的，采用高压均质机破碎细胞。
优选的，细胞破碎后，离心，上清液即为所述头孢菌素C酰基转移酶粗品溶液。
作为一个优选的实施方式，本发明提供一种头孢菌素C酰基转移酶的纯化方法，所述方法包括如下步骤：
1）将头孢菌素C酰基酶发酵液降温至0~10℃，离心，得到细胞沉淀物；
2）向所述细胞沉淀物中加入0.02mol/L、pH=8.0的磷酸氢二钾溶液或磷酸二氢钾溶液，使细胞沉淀物重新悬浮，搅拌均匀，用8MPa的高压均质机将细胞破碎，降温至0~10℃；其中，所述磷酸氢二钾溶液或磷酸二氢钾溶液与所述细胞沉淀物的重量比为4:1~6:1；
3）步骤2）得到的悬浮液离心，得到头孢菌素C酰基转移酶粗品溶液和菌渣；
4）0~10℃下，向步骤3）得到的头孢菌素C酰基转移酶粗品溶液中加入硫酸铵，使硫酸铵的浓度为1.8~2.2mol/L，搅拌1h，进行盐析，离心分离得到盐析沉淀物；
5）向所述盐析沉淀物中加入0.02mol/L、pH=8的磷酸氢二钾溶液或磷酸二氢钾溶液，搅拌1h，离心，分离沉淀，在上清液中得到纯化后的头孢菌素C酰基转移酶；其中，所述磷酸氢二钾溶液或磷酸二氢钾溶液与所述盐析沉淀物的重量比为7.5:1~10.3:1。
作为一个更优选的实施方式，本发明提供一种头孢菌素C酰基转移酶的纯化方法，所述方法包括如下步骤：
1）将头孢菌素C酰基酶发酵液降温至4℃，离心，得到细胞沉淀物；
2）向所述细胞沉淀物中加入0.02mol/L、pH=8.0的磷酸二氢钾溶液，使细胞沉淀物重新悬浮，搅拌均匀，用8MPa的高压均质机将细胞破碎，降温至10℃；其中，所述磷酸二氢钾溶液与所述细胞沉淀物的重量比为5:1；
3）4~10℃下，步骤2）得到的悬浮液离心，得到头孢菌素C酰基转移酶粗品溶液和菌渣；
4）4℃下，向步骤3）得到的头孢菌素C酰基转移酶粗品溶液中加入硫酸铵，使硫酸铵的浓度为2.0mol/L，搅拌1h，进行盐析，离心分离得到盐析沉淀物；
5）向所述盐析沉淀物中加入0.02mol/L、pH=8的磷酸二氢钾溶液，搅拌1h，离心，分离沉淀，在上清液中得到纯化后的头孢菌素C酰基转移酶；其中，所述磷酸二氢钾溶液与所述盐析沉淀物的重量比为7.5:1。
本发明的另一个目的在于提供一种通过上述纯化方法得到的头孢菌素C酰基转移酶。
本发明所述的头孢菌素C酰基转移酶发酵液，可用于各自带有一步酶基因工程菌的发酵液。
与现有技术的柱层析法相比，本发明提供的头孢菌素C酰基转移酶的纯化方法，工艺简单，仅采用价廉的硫酸铵。通过本发明所述纯化方法得到的头孢菌素C酰基转移酶成品中，杂酶含量低于0.7%。将头孢菌素C酰基转移酶成品固定在载体上以后，固化后的头孢菌素C酰基转移酶中杂酶含量低于0.6%，催化头孢菌素C裂解生成7-ACA的反应批次稳定在500批以上，7-ACA的纯度在94%以上。而目前市场上的主流柱层析法纯化产品，如韩国立科和德国Sandoz的头孢菌素C酰基转移酶，相同条件下催化反应批次仅分别为350次和360次，远低于本发明的产品。说明本发明所述纯化方法还能够显著增强头孢菌素C酰基转移酶的固化效果，延长了头孢菌素C酰基转移酶固化使用的半衰期，从而降低7-ACA的生产成本。
具体实施方式
以下参照具体的实施例来说明本发明。本领域技术人员能够理解，这些实施例仅用于说明本发明，其不以任何方式限制本发明的范围。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的药材原料、试剂材料等，如无特殊说明，均为市售购买产品。
实施例1 盐析法中硫酸铵添加量的筛选
因头孢菌素C酰基转移酶的纯度会影响7-ACA的纯度，因此，以头孢菌素C酰基转移酶收率和催化合成的7-ACA的纯度为指标，考察盐析法中硫酸铵添加量对本发明所述纯化方法的影响。
1. 制备不同硫酸铵添加量条件下的头孢菌素C酰基转移酶
1）将固含量为220g/L的头孢菌素C酰基转移酶发酵液600g降温至4℃，离心分离得到细胞沉淀物；
2）向细胞沉淀物中加入0.02mol/L的磷酸氢二钾溶液，使细胞沉淀物重新悬浮，搅拌均匀，用8MPa的高压均质机将细胞破碎，降温至10℃；磷酸氢二钾溶液与细胞沉淀物的重量比为5:1；
3）离心，分离得到头孢菌素C酰基转移酶粗品溶液和菌渣；
4）将头孢菌素C酰基转移酶粗品溶液温度控制在4℃，加入硫酸铵，搅拌1h，进行盐析，离心分离得到盐析沉淀物；
5）向盐析沉淀物中加入0.02mol/L的磷酸氢二钾溶液，搅拌1h，离心分离得到纯化后的头孢菌素C酰基转移酶成品；磷酸氢二钾溶液与盐析沉淀物的重量比为7.5:1。
其中，步骤4）中，向头孢菌素C酰基转移酶粗品溶液加入不同量的硫酸铵，使硫酸铵浓度分别为1.6mol/L、1.8mol/L、2.0mol/L和2.2mol/L。
2. 头孢菌素C酰基转移酶收率和催化效果的考察
通过测定酶活和体积，再经过计算得出头孢菌素C酰基转移酶的收率。
利用共价连接方法，将头孢菌素C酰基转移酶固化在载体上，一步酶法制备7-ACA，使用高效液相色谱法测定7-ACA的纯度。
3. 试验结果：见表1。
根据表1中的数据，可以得出硫酸铵加入量显著影响头孢菌素C酰基转移酶的收率，同时也会影响头孢菌素C酰基酶的纯度，变现为7-ACA的纯度随着硫酸铵的加入量不同而变化。硫酸铵的浓度为1.6mol/L时，头孢菌素C酰基转移酶的收率和7-ACA的纯度都低。随着硫酸铵的加入，头孢菌素C酰基转移酶的收率和7-ACA的纯度都明显升高。尤其是硫酸铵的浓度达到2.0 mol/L时，7-ACA的纯度最高，达到96.05%。但是，硫酸铵的浓度超过2.0mol/L后，对头孢菌素C酰基转移酶收率的影响不明显，7-ACA的纯度反而大幅度的降低。因此，综合考虑，盐析时，硫酸铵的加入量优选为：在头孢菌素C酰基转移酶粗品溶液中，硫酸铵的浓度为1.8~2.2mol/L，最优选为2.0mol/L。
实施例2 盐析沉淀物纯化中磷酸二氢钾溶液添加量的筛选
以头孢菌素C酰基转移酶收率和催化合成的7-ACA的纯度为指标，考察盐析沉淀物纯化中硫酸铵添加量对本发明所述纯化方法的影响。
1. 制备盐析沉淀物纯化中不同磷酸二氢钾溶液添加量条件下的头孢菌素C酰基转移酶
1）将固含量为240g/L的发酵液600g降温至4℃，离心分离得到细胞沉淀物；
2）向细胞沉淀物中加入0.02mol/L、pH=8的磷酸氢二钾溶液，使细胞沉淀物重新悬浮，搅拌均匀，用8MPa的高压均质机将细胞破碎，降温至10℃；其中，磷酸氢二钾溶液与细胞沉淀物的重量比为5:1；
3）离心，分离得到头孢菌素C酰基转移酶粗品溶液和菌渣；
4）将头孢菌素C酰基转移酶粗品溶液温度控制在4℃，加入硫酸铵，使硫酸铵的浓度为2.0mol/L，搅拌1h，进行盐析，离心分离得到盐析沉淀物；
5）向盐析沉淀物中加入0.02mol/L的磷酸氢二钾溶液，搅拌1h，离心分离得到纯化后的头孢菌素C酰基转移酶成品。
步骤5）中，0.02mol/L的磷酸氢二钾溶液加入量与盐析沉淀物的重量比分别为4.7:1、5.6:1、6.6:1、7.5:1、8.4:1、9.4:1、10.3:1。
2. 头孢菌素C酰基转移酶收率和催化效果的考察
利用实施例1相同的方法，测定头孢菌素C酰基转移酶的收率。
利用实施例1相同的方法，将头孢菌素C酰基转移酶固化在载体上，一步酶法制备7-ACA。利用实施例1相同的方法测定7-ACA的纯度。
3. 试验结果：见表2。
从表2中的数据可以得出，0.02mol/L的磷酸氢二钾溶液的加入量会影响头孢菌素C酰基酶的收率，同时也会影响头孢菌素C酰基转移酶的纯度，进而影响7-ACA的纯度。当0.02mol/L的磷酸氢二钾溶液与盐析沉淀物的重量比例为4.7:1~5.6:1时，头孢菌素C酰基转移酶的收率和7-ACA的纯度都较低。随着磷酸氢二钾溶液加入量的增加，头孢菌素C酰基转移酶的收率和7-ACA的纯度都较低添加量时提高，尤其是加入量为7.5:1时，头孢菌素C酰基酶收率和7-ACA的纯度都达到最优。之后，进一步加入磷酸氢二钾溶液，反而使上述两个指标下降。综合考虑，盐析沉淀物纯化时，优选的，0.02mol/L磷酸氢二钾溶液与盐析沉淀物的重量比为7.5:1~10.3:1，最优选为7.5:1。
由此，本发明优选的盐析实施方式为：
0~10℃下，向头孢菌素C酰基转移酶粗品溶液中加入硫酸铵，使硫酸铵的浓度为1.8~2.2mol/L，搅拌1h，进行盐析，离心分离得到盐析沉淀物；
向所述盐析沉淀物中加入0.02mol/L、pH=8的磷酸氢二钾溶液，搅拌1h，离心，分离得到纯化后的头孢菌素C酰基转移酶；其中，所述磷酸氢二钾溶液溶液与所述盐析沉淀物的重量比为7.5:1~10.3:1。
本发明更优选的盐析实施方式为：
4℃下，向头孢菌素C酰基转移酶粗品溶液中加入硫酸铵，使硫酸铵的浓度为2.0mol/L，搅拌1h，进行盐析，离心分离得到盐析沉淀物；
向所述盐析沉淀物中加入0.02mol/L、pH=8的磷酸二氢钾溶液，搅拌1h，离心，分离得到纯化后的头孢菌素C酰基转移酶；其中，所述磷酸二氢钾溶液与所述盐析沉淀物的重量比为7.5:1。
实施例3 头孢菌素C酰基转移酶纯化方法
1）将固含量为198g/L的头孢菌素C酰基酶发酵液600g降温至4℃，离心分离得到细胞沉淀物；
2）向细胞沉淀物中加入0.02mol/L pH=8的磷酸氢二钾溶液，使细胞沉淀物重新悬浮，搅拌均匀，用8MPa的高压均质机将细胞破碎，降温至10℃;磷酸氢二钾溶液与细胞沉淀物的重量比为5:1；
3）离心，分离得到头孢菌素C酰基转移酶粗品溶液和菌渣；
4）将步骤3）得到的头孢菌素C酰基转移酶粗品溶液温度控制在4℃，加入硫酸铵，使硫酸铵的浓度为2.0mol/L，搅拌1h，进行盐析，离心分离得到盐析沉淀物；
5）向步骤4）得到的盐析沉淀物中加入0.02mol/L、pH=8的磷酸氢二钾溶液，磷酸氢二钾溶液与盐析沉淀物的重量比为7.5:1，搅拌1h，离心分离得到纯化后的头孢菌素C酰基转移酶成品。
实施例4
将实施例3制备得到的头孢菌素C酰基转移酶与市场上主流的产品进行比较，进而观察本发明所述纯化方法相较现有技术是否具有优势。
受试品：
1. 按照实施例1所述方法纯化得到的头孢菌素C酰基转移酶成品；
2. 韩国立科公司的头孢菌素C酰基转移酶成品；
3. 德国Sandoz公司的头孢菌素C酰基转移酶成品。
方法：
将各受试品固定在LX-1000EP(C)载体中，根据电位滴定法检测酶活性。记录各受试品稳定催化反应的批次，以及单次一步酶法制备7-ACA的反应时间。
按照实施例1相同的方法，测定各受试品参与催化制备的7-ACA的纯度，以及杂质脱乙酰-7氨基头孢烷酸（D-7ACA，以下简称“D”）和脱乙酰氧-7氨基头孢烷酸（DO-7ACA，以下简称“Do”）的含量。
结果：见表3。
目前尚未见国内厂家生产的头孢菌素C酰基转移酶成品销售。
从表3的数据显示：
1）本发明所述的纯化方法生产的头孢菌素C酰基转移酶成品，酶活高于韩国立科和德国Sandoz的产品，单次催化反应时间也比短于两种国外产品；
2）本发明所述的纯化方法生产的头孢菌素C酰基转移酶成品，催化酰基转移得到的7-ACA，特异性杂质更少。
3）本发明所述的纯化方法生产的头孢菌素C酰基转移酶成品，固化于相同载体上，可以稳定催化的反应批次比韩国立科的产品高43%，比德国Sandoz的高39%。
结论：
说明本发明的酶成品纯度更好。
反应时间更短。本发明所述的纯化方法，得到的头孢菌素C酰基转移酶成品，酶活性、纯度都好于现有的韩国立科和德国Sandoz的产品。最令人意想不到的是，本发明的头孢菌素C酰基转移酶成品的固化效果显著好于上述现有技术的产品。因此，本发明所述纯化方法得到的头孢菌素C酰基转移酶成品，质量明显优于现有技术，更适应工业化生产。
实施例5 头孢菌素C酰基转移酶纯化方法
1）将固含量为198g/L的发酵液600g降温至4℃，离心分离得到细胞沉淀物；
2）向细胞沉淀物中加入0.02mol/L、pH=8的磷酸二氢钾溶液，使细胞沉淀物重新悬浮，搅拌均匀，用8MPa的高压均质机将细胞破碎，降温至10℃；磷酸二氢钾溶液与细胞沉淀物的重量比为5:1；
3）离心，分离得到头孢菌素C酰基转移酶粗品溶液和菌渣；
4）将步骤3）得到的头孢菌素C酰基转移酶粗品溶液温度控制在4℃，加入硫酸铵，使硫酸铵的浓度为1.8mol/L，搅拌1h，进行盐析，离心分离得到盐析沉淀物；
5）向步骤4）得到的盐析沉淀物中加入0.02mol/L、pH=8的磷酸二氢钾溶液，磷酸二氢钾溶液与盐析沉淀物的重量比为8:1，搅拌1h，离心分离得到纯化后的头孢菌素C酰基转移酶成品。
实施例6 头孢菌素C酰基转移酶纯化方法
1）将固含量为208g/L的发酵液600g降温至8℃，离心分离得到细胞沉淀物；
2）向细胞沉淀物中加入0.02mol/L、pH=8的磷酸氢二钾溶液，使细胞沉淀物重新悬浮，搅拌均匀，用8MPa的高压均质机将细胞破碎，降温至0℃；磷酸氢二钾溶液与细胞沉淀物的重量比为4:1；
3）离心，分离得到头孢菌素C酰基转移酶粗品溶液和菌渣；
4）将步骤3）得到的头孢菌素C酰基转移酶粗品溶液温度控制在15℃，加入硫酸铵，使硫酸铵的浓度为2mol/L，搅拌1h，进行盐析，离心分离得到盐析沉淀物；
5）向步骤4）得到的盐析沉淀物中加入0.02mol/L、pH=8的磷酸氢二钾溶液，磷酸氢二钾溶液与盐析沉淀物的重量比为4.7:1，搅拌1h，离心分离得到纯化后的头孢菌素C酰基转移酶成品。
实施例7 头孢菌素C酰基转移酶纯化方法
1）将固含量为210g/L的发酵液600g降温至4℃，离心分离得到细胞沉淀物；
2）向细胞沉淀物中加入0.02mol/L、pH=8的磷酸氢二钾溶液，使细胞沉淀物重新悬浮，搅拌均匀，用8MPa的高压均质机将细胞破碎，降温至15℃；磷酸氢二钾溶液与细胞沉淀物的重量比为6:1；
3）离心，分离得到头孢菌素C酰基转移酶粗品溶液和菌渣；
4）将步骤3）得到的头孢菌素C酰基转移酶粗品温度控制在10℃，加入硫酸铵，硫酸铵的浓度为2mol/L，搅拌1h，进行盐析，离心分离得到盐析沉淀物；
5）向步骤4）得到的盐析沉淀物中加入0.02mol/L、pH=8的磷酸氢二钾溶液，磷酸氢二钾溶液与盐析沉淀物的重量比为5.6:1，搅拌1h，离心分离得到纯化后的头孢菌素C酰基转移酶成品。
实施例8 头孢菌素C酰基转移酶纯化方法
1）将固含量为240g/L的发酵液600g降温至4℃，离心分离得到细胞沉淀物；
2）向细胞沉淀物中加入0.02mol/L、pH=8的磷酸氢二钾溶液，使细胞沉淀物重新悬浮，搅拌均匀，用8MPa的高压均质机将细胞破碎，降温至4℃；磷酸氢二钾溶液与细胞沉淀物的重量比为5:1；
3）离心，分离得到头孢菌素C酰基转移酶粗品溶液和菌渣；
4）将步骤3）得到的头孢菌素C酰基转移酶粗品溶液温度控制在4℃，加入硫酸铵，硫酸铵的浓度为2mol/L，搅拌1h，进行盐析，离心分离得到盐析沉淀物；
5）向盐析沉淀物中加入0.02mol/L、pH=8的磷酸氢二钾溶液，磷酸氢二钾溶液与盐析沉淀物的重量比为6.6:1(w/w)，搅拌1h，离心分离得到纯化后的头孢菌素C酰基转移酶成品。
实施例9 头孢菌素C酰基转移酶纯化方法
1）将固含量为208g/L的发酵液600g降温至4℃，离心分离得到细胞沉淀物；
2）向细胞沉淀物中加入0.02mol/L、pH=8的磷酸氢二钾溶液，使细胞沉淀物重新悬浮，搅拌均匀，用8MPa的高压均质机将细胞破碎，降温至10℃;磷酸氢二钾溶液与细胞沉淀物的重量比为6:1；
3）离心，分离得到头孢菌素C酰基转移酶粗品溶液和菌渣；
4）将步骤3）得到的头孢菌素C酰基转移酶粗品溶液温度控制在10℃，加入硫酸铵，硫酸铵的浓度为2mol/L，搅拌1h，进行盐析，离心分离得到盐析沉淀物；
5）向步骤4）得到的盐析沉淀物中加入0.02mol/L、pH=8的磷酸氢二钾溶液，磷酸氢二钾溶液与盐析沉淀物的重量比为8.4:1，搅拌1h，离心分离得到纯化后的头孢菌素C酰基转移酶成品。
实施例10 头孢菌素C酰基转移酶纯化方法
1）将固含量为208g/L的发酵液600g降温至4℃，离心分离得到细胞沉淀物；
2）向细胞沉淀物中加入0.02mol/L、pH=8的磷酸氢二钾溶液，使细胞沉淀物重新悬浮，搅拌均匀，用8MPa的高压均质机将细胞破碎，降温至10℃；磷酸氢二钾溶液与细胞沉淀物的重量比为6:1；
3）离心，分离得到头孢菌素C酰基转移酶粗品溶液和菌渣；
4）将头孢菌素C酰基转移酶粗品溶液温度控制在10℃，加入硫酸铵，使硫酸铵的浓度为2mol/L，搅拌1h，进行盐析，离心分离得到盐析沉淀物；
5）向步骤4）得到的盐析沉淀物中加入0.02mol/L的磷酸氢二钾溶液，磷酸氢二钾溶液与盐析沉淀物的重量比为9.4:1，搅拌1h，离心分离得到纯化后的头孢菌素C酰基转移酶成品。
实施例11
1）将固含量为208g/L的发酵液600g降温至4℃，离心分离得到细胞沉淀物将；
2）向细胞沉淀物中加入0.02mol/L、pH=8的磷酸氢二钾溶液，使细胞沉淀物重新悬浮，搅拌均匀，用8MPa的高压均质机将细胞破碎，降温至10℃；磷酸氢二钾溶液与细胞沉淀物的重量比为6:1；
3）离心，分离得到头孢菌素C酰基转移酶粗品溶液和菌渣；
4）将头孢菌素C酰基转移酶粗品溶液温度控制在10℃，加入硫酸铵，使硫酸铵的浓度为2mol/L，搅拌1h，进行盐析，离心分离得到盐析沉淀物；
5）向步骤4）得到的盐析沉淀物中加入0.02mol/L、pH=8的磷酸氢二钾溶液，磷酸氢二钾溶液与盐析沉淀物的比例为10.3:1，搅拌1h，离心分离得到纯化后的头孢菌素C酰基转移酶成品。
实施例12
1）将固含量为215g/L的发酵液600g降温至4℃，离心分离得到细胞沉淀物；
2）向细胞沉淀物中加入0.02mol/L、pH=8的磷酸二氢钾溶液，使细胞沉淀物重新悬浮，搅拌均匀，用8MPa的高压均质机将细胞破碎，降温至10℃;磷酸二氢钾溶液与细胞沉淀物的重量比为6:1；
3）离心，分离得到头孢菌素C酰基转移酶粗品和菌渣；
4）将步骤3）得到的头孢菌素C酰基转移酶粗品温度控制在10℃，加入硫酸铵，使硫酸铵的浓度为2mol/L，搅拌1h，进行盐析，离心分离得到盐析沉淀物；
5）向步骤4）得到的盐析沉淀物中加入0.02mol/L、pH=8的磷酸二氢钾溶液，磷酸二氢钾溶液与盐析沉淀物的重量比为10.3:1，搅拌1h，离心分离得到纯化后的头孢菌素C酰基转移酶成品。
以上对本发明具体实施方式的描述并不限制本发明，本领域技术人员可以根据本发明做出各种改变或变形，只要不脱离本发明的精神，均应属于本发明所附权利要求的范围。

Claims (1)

1.一种头孢菌素C酰基转移酶的纯化方法，所述方法包括如下步骤：
1）将头孢菌素C酰基酶发酵液降温至0-10℃，离心，得到细胞沉淀物；
2）向所述细胞沉淀物中加入磷酸盐溶液1，使细胞沉淀物重新悬浮，搅拌均匀，用8MPa的高压均质机将细胞破碎，降温至0-10℃；所述磷酸盐溶液1与细胞沉淀物的重量比为5:1，磷酸盐溶液1为0.02mol/L、pH=8.0的磷酸氢二钾溶液；
3）步骤2）得到的悬浮液离心，上清液即为头孢菌素C酰基转移酶粗品溶液；
4）0-10℃下，向步骤3）得到的头孢菌素C酰基转移酶粗品溶液中加入硫酸铵，硫酸铵在头孢菌素C酰基转移酶粗品溶液的浓度为2.0mol/L；搅拌1h，进行盐析，离心分离得到盐析沉淀物；
向所述盐析沉淀物中加入磷酸盐溶液2，搅拌1h，离心，分离沉淀，在上清液中得到纯化后的头孢菌素C酰基转移酶；所述磷酸盐溶液2与所述盐析沉淀物的重量比为7.5:1，磷酸盐溶液2为0.02mol/L、pH=8.0的磷酸氢二钾溶液。
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