CN104946694A

CN104946694A - 一种生物催化制备l-2-氨基丁酸的方法

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Publication number: CN104946694A
Application number: CN201510443837.8A
Authority: CN
Inventors: 李航; 徐军; 阙利民; 江岳恒; 蔡彤�
Original assignee: ABA Chemicals Corp
Current assignee: ABA Chemicals Corp
Priority date: 2015-07-24
Filing date: 2015-07-24
Publication date: 2015-09-30
Anticipated expiration: 2035-07-24
Also published as: WO2017016444A1; CN104946694B

Abstract

本发明提供了一种生物催化制备L-2-氨基丁酸的方法，包括如下步骤：构建同时表达FDH和LDH的基因工程菌，经发酵制得含FDH和LDH的FDH/LDH共表达粗酶液；在缓冲液中配制反应体系并进行生物催化反应，从而制得L-2-氨基丁酸。所述反应体系包括：苏氨酸、甲酸铵、TD酶液、FDH/LDH共表达粗酶液、NAD⁺、和磷酸吡哆醛。本发明的方法能够简单、高效、低成本的制备L-2-氨基丁酸。

Description

一种生物催化制备L-2-氨基丁酸的方法

技术领域

本发明涉及医药化工领域，尤其涉及一种生物催化制备L-2-氨基丁酸的方法。

背景技术

L-2-氨基丁酸是生产新型抗癫痫药左乙拉西坦的关键中间体，同时也是合成抑菌抗结核药乙胺丁醇的关键手性前体，其作为合成手性药物的手性元，已成为多种手性药物的重要手性中间体。因此，L-2-氨基丁酸的合成技术一直是近年来制药工程研究的热点。

还原型辅酶I(烟酰胺腺嘌呤二核甘酸或二磷酸烟苷，NADH)是氧化还原反应中重要的辅酶。作为电子供体，一分子的NADH可以提供两个电子用于酮基等基团的还原。随着生物催化技术发展，NADH越来越多地应用于化学手性合成。所有的氧化还原酶中大约80％需要NADH作为辅酶，而NADH价格昂贵，从经济技术角度考虑，投加大量的辅酶是不可行的。反应过程中必须提供高效低成本的辅酶再生系统。所谓的辅酶再生，就是把辅酶从氧化态再生为还原态，或者反之，从而使辅酶保持在一定的催化剂水平。应用中常投入还原型辅酶I(NAD+)，构建生物酶催化再生NADH的体系。

相较于传统的化学催化，生物催化因其酶催化反应的高度的化学选择性、区域选择性和立体选择性等优势而备受关注和研究。其中由于氧化还原酶的高效性和特异性等，它们在生物合成中占据相当重要的地位。氧化还原酶能选择性地催化含羰基、醛类及酮类化合物。氧化还原酶作为催化剂制备手性化合物，合成产物的同时会消耗掉一定量的辅酶。

不像其它的酶类，在生物转化反应中，酶与底物的关系只是化学计量的关系，辅酶是一种消耗性的化合物，不像氧化还原酶一样可以重复利用，在反应中作为氢的供体，反应结束后辅酶以氧化态形式存在。而这些辅酶往往比所制备的产品的价格还要昂贵，稳定性比较差，难以重复利用，导致了工业化生产中反应成本的高昂，从而限制了氧化还原酶的使用。在工业化生产中，不可能投加大量的辅酶，所以高效的辅酶再生系统的构建和辅酶的反复使用是当下必须解决的问题。

如上所述，L-2-氨基丁酸是生产新型抗癫痫药左乙拉西坦的关键中间体。以L-2-氨基丁酸为关键起始原料，经甲基化、酯化、酰胺化等一系列反应合成左乙拉西坦的路线中，虽然反应条件温和，副反应少，产品质量高，且总收率高，但是原料L-2-氨基丁酸的价格昂贵，因此，L-2-氨基丁酸的合成技术一直是近年来制药工程研究的热点。

因此，本领域的技术人员致力于开发一种简单、高效、低成本的L-2-氨基丁酸的制备方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种简单、高效、低成本的生物催化制备L-2-氨基丁酸的方法。

为实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：

一种生物催化制备L-2-氨基丁酸的方法，所述方法包括以下步骤：

(1)甲酸脱氢酶(formate dehydrogenase，FDH)和亮氨酸脱氢酶(leucinedehydrogenase，LDH)的异源表达：

构建同时表达FDH和LDH的基因工程菌，经发酵制得含FDH和LDH的FDH/LDH共表达粗酶液；

(2)配制反应体系并进行反应：

在缓冲液中配制反应体系并进行生物催化反应，从而制得L-2-氨基丁酸，

所述反应体系包括：苏氨酸、甲酸铵、TD酶液、FDH/LDH共表达粗酶液、NAD+、和磷酸吡哆醛。

进一步地，所述步骤(1)包括以下步骤：

(a)构建FDH载体：

将FDH基因连入使用核酸内切酶Nde Ⅰ和Xho Ⅰ双酶切的pET28a载体，构建得到重组表达FDH的质粒pFDH-pET28a；

(b)构建LDH载体：

将LDH基因连入使用核酸内切酶Xho Ⅰ和Nde Ⅰ双酶切的pET21a载体，构建得到重组表达质粒pLDH-pET21a；

(c)构建同时表达FDH和LDH的基因工程菌：

将质粒pFDH-pET28a和质粒pLDH-pET21a共转入E.coli BL21(DE3)，得到共表达FDH与LDH的菌株E.coli BL21-FDH/LDH。

进一步地，所述步骤(1)还包括以下步骤：

(d)发酵所述菌株E.coli BL21-FDH/LDH，制备所述FDH/LDH共表达粗酶液：

将共表达菌株E.coli BL21-FDH/LDH在含Amp和Kan的LB液体培养基中培养，加入IPTG至终浓度为0.02mmol/L，22℃诱导表达16h，发酵液经菌体破壁后离心取上清即得所述FDH/LDH共表达粗酶液。

进一步地，所述步骤(a)中以假丝酵母总DNA为模板，分别以上下游引物进行PCR扩增，从而获得所述FDH基因，其中，上游引物为5’-AAACATATGAAAATCGTTCTCGTTTTGTACTCC-3’(划线处为Nde I酶切位点)；下游引物为5’-AAACTCGAGTGCGACCTTTTTGTCATTAC-3’(划线处为Xho I酶切位点)。

进一步地，所述FDH基因序列的基因库(Genbank)登录号为XM_001525495。

进一步地，所述LDH基因序列的基因库登录号为WP_016086354，通过合成获得所述LDH基因。

进一步地，所述步骤(2)中，每30ml反应体系含：苏氨酸1.5-2.5g，甲酸铵2.5-3.5g，0.1mol/L PBS 18ml，TD酶液6ml(6-10U/ml)，FDH/LDH共表达粗酶液6ml(酶活以FDH计为8-15U/ml)，NAD+8-12mg和磷酸吡哆醛2.5-3.5mg。

进一步地，所述步骤(2)中，每30ml反应体系含：苏氨酸2.1g，甲酸铵3.0g，0.1mol/L PBS 18ml，TD酶液6ml(6-8U/ml)，FDH/LDH共表达粗酶液6ml(酶活以FDH计为8-10U/ml)，NAD+10mg和磷酸吡哆醛3.215mg。

进一步地，所述步骤(2)中，反应温度为28-35℃，反应体系pH为7.5-8.5，反应时间为12-22h。

进一步地，所述步骤(2)中，反应温度为30℃，反应体系pH为8.0，反应时间为20h。

由于采用以上技术方案，本发明的有益效果包括：

本发明使用共表达FDH/LDH的酶液催化反应，构建了一个双酶偶联的催化系统，可以高效转化制备化合物1。投料量达到了7g/100ml，产率可达95％

附图说明

图1显示了L-2-氨基丁酸的化学结构；

图2显示了质粒pFDH-pET28a的双酶切验证和FDH的SDS-PAGE检测，其中泳道1是NdeI/XhoI双酶切验证质粒pFDH-pET28a；泳道2是DNAmarker；泳道3是E.coli BL21-FDH诱导后破壁上清液；泳道4是E.coliBL21-FDH诱导后破壁沉淀物；泳道5是E.coli BL21-FDH诱导前产物；泳道6是蛋白质marker；

图3显示了质粒pLDH-pET21a的双酶切验证和FDH与LDH共表达的SDS-PAGE检测，其中泳道1是NdeI/XhoI双酶切验证质粒pLDH-pET21a；泳道2是DNA marker；泳道3是E.coli BL21-FDH/LDH诱导后破壁上清液；泳道4是E.coli BL21-FDH/LDH诱导后破壁沉淀物；泳道5是E.coliBL21-FDH/LDH诱导前产物上清液；泳道6是E.coli BL21-FDH/LDH诱导前产物沉淀；泳道7是蛋白质marker；

图4A-4B显示了化合物1的HPLC分析，其中图4A是化合物1标准品溶液(0.125mg/ml)的HPLC分析；图B是共催化体系反应液的HPLC分析。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，下面结合附图及实施例对本发明作进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

下面通过具体的实施例来对本发明进行解释。

本发明中使用的色谱仪是美国Waters公司生产的1525型高效液相色谱仪。

本发明所使用的材料如下：大肠杆菌E.coli DH5α、E.coli BL21(DE3)与TD酶液(酶活力6.67u/ml)均可购自宝生物工程(大连)有限公司；PrimerSTAR HS DNA聚合酶和T4DNA连接酶等试剂购自TaKaRa公司；2-羰基丁酸标准品(美国Sigma-Aldrich公司)；标准相对分子量(Mr)DNA(即DNA marker，Mr 250～10 000)、氨苄霉素(Amp)、卡那霉素(Kan)和NAD+均购自北京鼎国生物技术有限公司；标准Mr蛋白质(即蛋白质marker，北京天根生化科技有限公司，Mr 14 400～94 000)；蛋白胨和酵母提取物(英国Oxoid公司)；苏氨酸、L-2-氨基丁酸(化合物1)标准品及其他试剂均购自国药试剂有限公司。

LB培养基/g·L-1：蛋白胨10，酵母提取物5，氯化钠10，pH 7.0。

实施例1：

一种生物催化制备L-2-氨基丁酸的方法包括以下步骤：

第一步，甲酸脱氢酶FDH和亮氨酸脱氢酶LDH的异源表达：

(a)FDH的异源表达与测活：

(1)获得FDH基因片段

根据甲酸脱氢酶(FDH)基因序列(基因库登录号：XM_001525495和AAB18593)及其前后序列设计引物，经过筛选获得的较佳的甲酸脱氢酶(FDH)上游引物为5’-AAACATATGAAAATCGTTCTCGTTTTGTACTCC-3’(划线处为NdeI酶切位点，SEQ ID NO.:1)；下游引物为5’-AAACTCGAGTGCGACCTTTTTGTCATTAC-3’(划线处为XhoI酶切位点，SEQ ID NO.:2)。以上述上下游引物扩增可以高效的获得FDH基因片段。

(2)PCR反应体系

PrimeSTAR HS DNA聚合酶PCR反应体系如下所示：

(3)PCR反应程序

PCR反应程序：共30个循环，FDH基因片段大小约为1300bp。

步骤1: 98℃，10s变性

步骤2: 65℃，10s退火

步骤3: 72℃，1.5min延伸

将FDH基因连入使用核酸内切酶Nde Ⅰ和Xho Ⅰ双酶切的pET28a载体(可以购自宝生物工程(大连)有限公司)，构建得到重组表达FDH的质粒pFDH-pET28a。使用Nde Ⅰ和Xho Ⅰ双酶切验证所构建的质粒，电泳检测酶切产物，得到2条条带(5.3和1.2kb)，与预期相符(图2)。将pFDH-pET28a转化入E.coli BL21(DE3)，得到FDH表达菌株E.coli BL21-FDH。

将表达菌株E.coli BL21-FDH接入LB培养基(含Kan 100g/ml)中37℃培养。当D₆₀₀值达到0.6～0.8时，加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)至终浓度为0.02mmol/L，22℃诱导16h，SDS-PAGE电泳检测可溶性蛋白的表达。结果表明加入IPTG后，FDH(Mr约4.7×104)有明显表达条带，与预期大小相符。大部分目的蛋白存在于上清液中，为可溶性蛋白。少部分以包涵体形式存在于沉淀中。IPTG诱导前后FDH表达的SDS-PAGE检测结果见图2。

按文献方法，以甲酸铵为底物，测定FDH破菌上清液中的酶活力，结果表明，FDH破菌上清液催化产生NADH的活性约10u/ml。一个酶活力单位(u)定义为在测定条件下，每分钟产生1mol产物所需的酶量。

(b)LDH的异源表达与测活：

根据LDH的基因序列(基因库登录号：WP_016086354)委托英潍捷基生物公司合成基因序列片段。将LDH基因连入使用核酸内切酶XhoⅠ和NdeⅠ酶切的pET21a载体(Amp)(可以购自宝生物工程(大连)有限公司)，构建得到重组表达质粒pLDH-pET21a。

使用Nde Ⅰ和Xho Ⅰ双酶切验证质粒，电泳检测酶切产物，得到2条条带(5.3和1.1kb)，与预期相符(图3)。

(c)构建同时表达FDH和LDH的基因工程菌：

pLDH-pET21a质粒送测序比对无突变后，将其与质粒pFDH-pET28a共转入E.coli BL21(DE3)，得到FDH与LDH共表达菌株E.coliBL21-FDH/LDH。

将共表达菌株E.coli BL21-FDH/LDH在LB液体培养基(含Amp和Kan各100g/ml)中培养，加入IPTG至终浓度为0.02mmol/L，22℃诱导表达16h。

SDS-PAGE结果表明，分别在Mr 4.7×104和4.2×104位置有明显的表达条带，与FDH和LDH预期大小相符。共表达的FDH和LDH大部分存在于上清液中，为可溶性蛋白(图3)。

按文献方法，以2-羰基丁酸为底物，测定共表达菌株中LDH破菌上清液中的酶活力，结果表明LDH破菌上清液催化合成1的活性约7.38u/ml。

第二步，配制共表达体系，并进行反应催化制备化合物1：

按第一步中的方法构建FDH和LDH共表达菌株E.coliBL21-FDH/LDH，在LB培养基(含Amp和Kan各100g/ml)100ml中培养，加入IPTG至终浓度为0.02mmol/L，22℃诱导表达16h。将培养液于4℃，转速为3800r/min离心15min，弃去上清液，收集菌体，用适量预冷的0.1mol/L PBS(pH 8.0)洗涤。最后用0.1mol/L PBS(pH 8.0)20ml重悬后超声破碎。细胞破碎液于4℃，转速为3800r/min离心15min，收集上清液即为FDH和LDH粗酶液。

向250ml三角瓶中依次加入苏氨酸2.1g，甲酸铵3.0g及0.1mol/L PBS(pH 8.0)18ml，再加入TD粗酶液6ml(6-10U/ml)，FDH/LDH共表达粗酶液6ml(酶活以FDH计为8-15U/ml)，NAD+10mg和磷酸吡哆醛3.215mg。反应体系pH为8.0，在30℃条件下转化20h。所得产物产率为95.0％。将反应液置70℃水浴中加热1h，抽滤后将滤液减压旋干，加入等体积乙醇溶解洗去杂质，抽滤后即得到化合物1固体。再次醇洗后，产物用于HPLC检测与结构鉴定。

共催化体系中产物化合物1的检测：

使用2,4-二硝基氟苯衍生化-HPLC法测定1。色谱条件：色谱柱C18柱(4.6mm×250mm，5m)；流动相0.02mol/L磷酸氢二钠缓冲液(PBS，pH7.2)：乙腈(70∶30)；流速1.0ml/min；柱温30℃；检测波长360nm。在上述条件下，1的保留时间为6.0min(图4)。采用外标法测定产物生成量，分别配制0.0625、0.125、0.25、0.5和1mg/ml系列浓度标准溶液，依法衍生后进样测定。以溶液浓度c为横坐标，峰面积A为纵坐标，进行线性回归，得回归方程A＝31730c+2444.7(r2＝0.9992)。

实施例2：

步骤均与实施例1相同，区别在于第二步中反应温度为25℃。所得产物产率为53.5％。

实施例3：

步骤均与实施例1相同，区别在于第二步中反应温度为28℃。所得产物产率为65.8％。

实施例4：

步骤均与实施例1相同，区别在于第二步中反应温度为35℃。所得产物产率为87.3％。

实施例5：

步骤均与实施例1相同，区别在于第二步中反应温度为37℃。所得产物产率为82.4％。

实施例6：

步骤均与实施例1相同，区别在于第二步中反应体系pH为7.0。所得产物产率为84.0％。

实施例7：

步骤均与实施例1相同，区别在于第二步中反应体系pH为7.5。所得产物产率为85.8％。

实施例8：

步骤均与实施例1相同，区别在于第二步中反应体系pH为8.5。所得产物产率为87.9％。

实施例9：

步骤均与实施例1相同，区别在于第二步中反应体系pH为9.0。所得产物产率为73.8％。

实施例10：

步骤均与实施例1相同，区别在于第二步中反应原料及条件有所差别，具体如下：向250ml三角瓶中依次加入苏氨酸1.5g，甲酸铵2.5g及0.1mol/LPBS(pH 8.0)18ml，再加入TD粗酶液6ml(6-8U/ml)，FDH/LDH共表达粗酶液6ml(酶活以FDH计为8-10U/ml)，NAD+8mg和磷酸吡哆醛2.5mg。反应体系pH为8.0，在30℃条件下转化12h。

实施例11：

步骤均与实施例1相同，区别在于第二步中反应原料及条件有所差别：向250ml三角瓶中依次加入苏氨酸2.5g，甲酸铵3.5g及0.1mol/L PBS(pH8.0)18ml，再加入TD粗酶液6ml(6-8U/ml)，FDH/LDH共表达粗酶液6ml(酶活以FDH计为8-10U/ml)，NAD+12mg和磷酸吡哆醛3.5mg。反应体系pH为8.0，在30℃条件下转化15h。

实施例12：

步骤均与实施例1相同，区别在于第二步中反应原料及条件有所差别，具体在于：向250ml三角瓶中依次加入苏氨酸7g，甲酸铵10g，0.1mol/L PBS(pH 8.0)60ml，用浓氨水将溶液调至pH 8.0。加入TD酶液20ml，FDH/LDH共表达粗酶液20ml，NAD+25mg和磷酸吡哆醛15mg。置30℃恒温箱中，磁力搅拌，以自动电位滴定仪检测pH值，用0.2mol/L氢氧化钠溶液滴定。反应至20h时终止反应。所得产物产率为95.0％。

实施例12所得的化合物1的检测与结构鉴定如下：

用等体积乙醇洗涤1次后，化合物1纯度为86.78％，收率为93.52％；第2次洗涤后，纯度为97％，收率为80.65％。ESI-MS(m/z)：104.08[M+H]⁺,207.18[2M+H]⁺；¹H NMR(400MHz,D₂O)δ：0.99(t,J＝7.6Hz,3H,CH3),1.80～2.00(m,2H,CH₂),3.71(t,J＝5.8Hz,1H,CH)。比旋光度结构与标准品一致。

实施例13：

步骤均与实施例1相同，区别在于第二步中反应原料及条件有所差别，具体在于：向250ml三角瓶中依次加入苏氨酸7g，甲酸铵10g，0.1mol/L PBS(pH 8.0)60ml，用浓氨水将溶液调至pH 8.0。加入TD酶液20ml，FDH/LDH共表达粗酶液20ml，NAD+25mg和磷酸吡哆醛15mg。置30℃恒温箱中，磁力搅拌，以自动电位滴定仪检测pH值，用0.2mol/L氢氧化钠溶液滴定。反应至4h时终止反应。所得产物产率为15.1％。

实施例14：

步骤均与实施例1相同，区别在于第二步中反应原料及条件有所差别，具体在于：向250ml三角瓶中依次加入苏氨酸7g，甲酸铵10g，0.1mol/L PBS(pH 8.0)60ml，用浓氨水将溶液调至pH 8.0。加入TD酶液20ml，FDH/LDH共表达粗酶液20ml，NAD+25mg和磷酸吡哆醛15mg。置30℃恒温箱中，磁力搅拌，以自动电位滴定仪检测pH值，用0.2mol/L氢氧化钠溶液滴定。反应至8h时终止反应。所得产物产率为40.0％。

实施例15：

步骤均与实施例1相同，区别在于第二步中反应原料及条件有所差别：向250ml三角瓶中依次加入苏氨酸7g，甲酸铵10g，0.1mol/L PBS(pH 8.0)60ml，用浓氨水将溶液调至pH 8.0。加入TD酶液20ml，FDH/LDH共表达粗酶液20ml，NAD+25mg和磷酸吡哆醛15mg。置30℃恒温箱中，磁力搅拌，以自动电位滴定仪检测pH值，用0.2mol/L氢氧化钠溶液滴定。反应至12h时终止反应。所得产物产率为78.0％。

实施例16：

步骤均与实施例1相同，区别在于第二步中反应原料及条件有所差别，具体在于：向250ml三角瓶中依次加入苏氨酸7g，甲酸铵10g，0.1mol/L PBS(pH 8.0)60ml，用浓氨水将溶液调至pH 8.0。加入TD酶液20ml，FDH/LDH共表达粗酶液20ml，NAD+25mg和磷酸吡哆醛15mg。置30℃恒温箱中，磁力搅拌，以自动电位滴定仪检测pH值，用0.2mol/L氢氧化钠溶液滴定。反应至16h时终止反应。所得产物产率为83.6％。

在NADH作为电子供体的酶催化反应中，如何高效且低成本地提供NADH的循环再生是需要解决的主要问题。本发明使用共表达FDH/LDH的酶液催化反应，构建了一个双酶偶联的催化系统，可以高效转化制备化合物1。投料量达到了7g/100ml，产率可达95％。

以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术人员无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。

Claims

1.一种生物催化制备L-2-氨基丁酸的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

(1)甲酸脱氢酶FDH和亮氨酸脱氢酶LDH的异源表达：

(2)配制反应体系并进行反应：

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)包括以下步骤：

(a)构建FDH载体：

将FDH基因连入使用核酸内切酶NdeⅠ和XhoⅠ双酶切的pET28a载体，构建得到重组表达FDH的质粒pFDH-pET28a；

(b)构建LDH载体：

将LDH基因连入使用核酸内切酶XhoⅠ和NdeⅠ双酶切的pET21a载体，构建得到重组表达质粒pLDH-pET21a；

(c)构建同时表达FDH和LDH的基因工程菌：

将质粒pFDH-pET28a和质粒pLDH-pET21a共转入E.coliBL21(DE3)，得到共表达FDH与LDH的菌株E.coli BL21-FDH/LDH。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)还包括以下步骤：

4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤(a)中以假丝酵母总DNA为模板，分别以上下游引物进行PCR扩增，从而获得所述FDH基因，其中，上游引物为5’-AAACATATGAAAATCGTTCTCGTTTTGTACTCC-3’，划线处为Nde I酶切位点；下游引物为5’-AAACTCGAGTGCGACCTTTTTGTCATTAC-3’，划线处为Xho I酶切位点。

5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述FDH基因序列的基因库登录号为XM_001525495。

6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述LDH基因序列的基因库登录号为WP_016086354，通过合成获得所述LDH基因。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中，每30ml反应体系含：苏氨酸1.5-2.5g，甲酸铵2.5-3.5g，0.1mol/L PBS 18ml，TD酶液6ml，FDH/LDH共表达粗酶液6ml，NAD+8-12mg和磷酸吡哆醛2.5-3.5mg，

其中TD酶液为6-10U/ml，FDH/LDH共表达粗酶液中酶活以FDH计为8-15U/ml。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中，每30ml反应体系含：苏氨酸2.1g，甲酸铵3.0g，0.1mol/L PBS 18ml，TD酶液6ml，FDH/LDH共表达粗酶液6ml，NAD+10mg和磷酸吡哆醛3.215mg，

其中TD酶液为6-8U/ml，FDH/LDH共表达粗酶液中酶活以FDH计为8-10U/ml。

9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中，反应温度为28-35℃，反应体系pH为7.5-8.5，反应时间为12-22h。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中，反应温度为30℃，反应体系pH为8.0，反应时间为20h。