CN107012178B

CN107012178B - 一种酶法合成l-2-氨基丁酸的方法

Info

Publication number: CN107012178B
Application number: CN201710331654.6A
Authority: CN
Inventors: 张娟; 冯志彬; 陈国忠
Original assignee: Ludong University
Current assignee: Shandong Yangcheng Biotech Co ltd
Priority date: 2017-05-11
Filing date: 2017-05-11
Publication date: 2020-06-30
Anticipated expiration: 2037-05-11
Also published as: CN107012178A

Abstract

本发明公开了一种酶法合成L‑2‑氨基丁酸的方法，所述方法是利用丙氨酸脱氢酶和甲酸脱氢酶催化2‑酮丁酸生产L‑2‑氨基丁酸。具体是将2‑酮丁酸0.5‑1.5mol、甲酸铵0.5‑1.5mol、NAD 0‑0.5g/L、甲酸脱氢酶和丙氨酸脱氢酶共表达湿菌体20g/L(或甲酸脱氢酶湿菌体10‑30g/L、丙氨酸脱氢酶湿菌体10‑30g/L)置于反应器中混合均匀，调节pH值为7.0‑9.0，温度为30‑37℃，催化反应16‑20h，得到L‑2‑氨基丁酸。该方法反应速率快，且逆向氧化脱氨活性极低，大大减少了产物的损失。

Description

一种酶法合成L-2-氨基丁酸的方法

技术领域

本发明属于领域化学合成技术领域，具体涉及一种酶法合成L-2-氨基丁酸的方法。

背景技术

L-2-氨基丁酸是生产新型抗癫痫药左乙拉西坦的关键中间体，也是合成抑菌抗结核药乙胺丁醇的关键手性前体，是多种手性药物的重要手性中间体。近年来，L-2-氨基丁酸的合成技术成为了基因工程制药的研究热点。很多研究利用FDH构建NADH再生体系，并与亮氨酸脱氢酶共表达，通过构建双酶偶联的催化系统，以2-酮丁酸为底物生成L-2-氨基丁酸，解决了NADH价格昂贵的问题，很大程度上节省了成本。

但是目前合成L-2-氨基丁酸的方法一般成本较高，或者转化率较低，比如申请号为20101014469206的发明专利公开了一种酶法制备L-2-氨基丁酸的方法，其采用的是L-苏氨酸为起始原料，首先通过苏氨酸脱氨酶使其反应转化为L-2酮酸，然后使用亮氨酸脱氢酶使L-2酮酸反应转化为L-2-氨基丁酸，并且反应中加入了用于辅酶再生的甲酸脱氢酶。此方法采用的是“一锅煮”的形式，这种方式虽然操作相对来说比较简单，但是反应中存在未反应物或者反应不彻底，转化率低的问题，因此，需要一种新的方法来解决这个问题。

发明内容

本发明的目的在于提供一种新的酶法合成L-2-氨基丁酸的方法，用以解决现有技术中转化率低的问题。

为实现上述目的，本发明采取如下技术方案：

本发明以2-酮丁酸为底物，通过丙氨酸脱氢酶和甲酸脱氢酶催化生产L-2-氨基丁酸。

具体技术方案如下：以甲酸脱氢酶催化甲酸铵产生过量的NH3，然后2-酮丁酸和NH3在丙氨酸脱氢酶的催化下被还原成L-2-氨基丁酸。其中丙氨酸脱氢酶的还原活性需要辅酶NADH，甲酸脱氢酶的氧化活性需要NAD+，由此形成循环的辅酶再生系统，解决了NADH价格昂贵的问题。

优选地，所述丙氨酸脱氢酶来自于嗜热脂肪土芽孢杆菌，但不局限于此菌，该菌中所含的丙氨酸脱氢酶对氨基丁酸的低亲和力成为其催化2-酮丁酸的一大优势。

本发明中的甲酸脱氢酶来自于酿酒酵母，但不局限于酿酒酵母，用于辅酶NADH的再生。

本发明中一种优选的实施方式，将丙氨酸脱氢酶基因和甲酸脱氢酶基因分别克隆至表达载体，导入到大肠杆菌，实现基因的表达，然后收集表达丙氨酸脱氢酶的细胞和表达甲酸脱氢酶的细胞，菌体放入-80℃保存24h，菌体融化后直接添加于催化体系中催化生产L-2-氨基丁酸。具体地，所述方法如下：

(1)甲酸脱氢酶FDH和丙氨酸脱氢酶alaD的异源表达：分别构建FDH和alaD的基因工程菌，经发酵分别制得表达FDH和alaD的菌体——甲酸脱氢酶湿菌体和丙氨酸脱氢酶湿菌体；

(2)然后将2-酮丁酸0.5-1.5mol、甲酸铵0.5-1.5mol、甲酸脱氢酶湿菌体10-30g/L、丙氨酸脱氢酶湿菌体10-30g/L置于反应器中混合均匀，调节pH值为7.0-9.0，温度为30-37℃，催化反应16-20h，得到L-2-氨基丁酸。

其中步骤(1)的具体方法如下：

(a)构建alaD载体：

利用BamHI和EcoRI分别将alaD基因和pET32a载体双酶切，然后二者进行连接构建得到重组表达alaD的质粒pET32a-alaD；

(b)构建FDH载体：

利用BamHI和EcoRI分别将FDH基因和pET28a载体双酶切，然后二者进行连接构建得到重组表达FDH的质粒pET28a-FDH；

(c)构建分别表达alaD和FDH的基因工程菌；

将质粒pET32a-alaD和质粒pET28a-FDH分别转入E.coli BL21，得到分别重组表达alaD和FDH的菌株BL21-alaD和BL21-FDH；

(d)将菌株BL21-alaD在发酵培养基中培养，加入0.1-0.5％的乳糖25-30℃诱导表达16h，离心收集菌体即得所述alaD表达菌体；

(e)将菌株BL21-FDH在发酵培养基中培养，加入0.1-0.5％的乳糖25-30℃诱导表达16h，离心收集菌体即得所述FDH表达菌体。

其中，所述发酵培养基配方为：葡萄糖2％、硫酸铵0.3％、蛋白胨0.5％、酵母浸粉2％、KH₂PO₄ 1.25％、MgSO₄ 0.1％、柠檬酸0.15％和乳糖0.1-0.5％，发酵条件：pH7.0，温度37℃，诱导后降温至25-30℃，发酵结束后再以6000rpm转速离心10min，-20℃保存菌体备用。

本发明中的一种优选的实施方式，将丙氨酸脱氢酶基因和甲酸脱氢酶基因分别克隆至表达载体，然后转入到大肠杆菌进行基因的共表达，然后收集共表达丙氨酸脱氢酶和甲酸脱氢酶细胞的菌体，-80℃冻融后直接添加于催化体系中催化生产L-2-氨基丁酸。具体地，所述方法如下：

(1)甲酸脱氢酶FDH和丙氨酸脱氢酶alaD的共表达：构建FDH和alaD的共表达的基因工程菌，经发酵制得共表达FDH和alaD的菌体；

(2)然后将2-酮丁酸0.5-1.5mol、甲酸铵0.5-1.5mol、NAD 0-0.5g/L、甲酸脱氢酶和丙氨酸脱氢酶共表达湿菌体15-20g/L置于反应器中混合均匀，调节pH值为7.0-9.0，温度为30-37℃，催化反应16-20h，得到L-2-氨基丁酸。

其中，步骤(1)的具体方法如下：

(a)构建alaD载体：

(b)构建FDH载体：

(c)构建共表达alaD和FDH的基因工程菌：

将质粒pET32a-alaD和质粒pET28a-FDH转入同一株E.coli BL21(DE3)，得到共表达alaD和FDH的菌株BL21-alaD/FDH；

(d)将菌株BL21-alaD/FDH在发酵培养基中培养，加入0.1-0.5％的乳糖25-30℃诱导表达16h，离心收集菌体即得所述alaD/FDH共表达菌体。

更进一步地，其中所述alaD基因的克隆方法为：以嗜热脂肪土芽孢杆菌总DNA为模板，分别以上下游引物进行PCR扩增，从而得到所述alaD基因，其中，上游引物为5’-aaGGATCCatgaagatcggcattccaaaag-3’(大写处为BamHI酶切位点)，如SEQ NO.1所示；下游引物为5’-ttGAATTCtcatccctgcagcaacgaatgaac-3’(大写处为EcoRI酶切位点)，如SEQNO.2所示。所述alaD基因序列的基因库登录号为：EF154460。

所述FDH基因的克隆方法为：以酿酒酵母总DNA为模板，分别以上下游引物进行PCR扩增，从而获得所述FDH基因，其中，上游引物为5’-aaGGATCCatgtcgaagggaaaggttttgc-3’(大写处为BamHI酶切位点)，如SEQ NO.3所示；下游引物为5’-aaGAATTCttatttcttctgtccataagctc-3’(大写处为EcoRI酶切位点)，如SEQ NO.4所示。进一步地，所述FDH基因序列的基因库登录号为：NM_001183808。

更进一步地，重组蛋白alaD表达的检测方法：将上述得到的表达菌株BL21-alaD在含有Amp的LB液体培养基中37℃培养，菌体OD600达到0.4-0.6后，加入IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)至终浓度为0.1mM，25℃诱导表达16h，分别收集加入IPTG诱导前和诱导结束后的菌体，利用聚丙烯胺凝胶电泳检测重组蛋白alaD的表达。

其中重组蛋白FDH表达的检测方法：所得到的表达菌株BL21-FDH在含有Kana的LB液体培养基中37℃培养，菌体OD600达到0.4-0.6后，加入IPTG至终浓度为0.1mM，25℃诱导表达16h，分别收集加入IPTG诱导前和诱导结束后的菌体，利用聚丙烯胺凝胶电泳检测重组蛋白FDH的表达。

本发明具有如下优点：

本发明采用的来源于嗜热脂肪土芽孢杆菌的丙氨酸脱氢酶在氧化脱氨反应和还原反应中对底物专一性各不相同，在氧化脱氨反应中，除了L-丙氨酸外，对其它氨基酸具有极低的活性，尤其对L-2-氨基丁酸的几乎没有活性。但是在还原氨化反应中，该酶对2-羰基2-酮丁酸具有一定的活性，并且其反应速率大于以丙酮酸为底物时的反应速率，该酶以2-酮丁酸为底物还原氨化形成L-2-氨基丁酸的优点在于：反应速率快，且逆向氧化脱氨活性极低，大大减少了产物的损失。

本发明采用丙氨酸脱氢酶和甲酸脱氢酶以2-酮丁酸和甲酸铵为底物生产L-2-氨基丁酸，转化率为95％。没有副产物的影响，适合工业生产。

附图说明

图1显示了质粒pET32a-alaD和质粒pET28a-FDH的双酶切验证，其中泳道1是BamHI/EcoRI双酶切验证质粒pET32a-alaD；泳道2DNA marker；泳道3是BamHI/EcoRI双酶切验证质粒pET28a-FDH。

图2显示了alaD重组蛋白的SDS-PAGE检测，泳道1是蛋白质Marker，泳道2是BL21-alaD诱导前产物，泳道3是BL21-alaD诱导后产物。

图3显示了FDH重组蛋白的SDS-PAGE检测，泳道1是BL21-FDH诱导后产物，泳道2是BL21-FDH诱导前产物，泳道3是蛋白质Marker。

图4显示了2，4-二硝基氟苯衍生化-HPLC法测定化合物1的保留时间；

图5显示了共表达alaD/FDH重组蛋白的SDS-PAGE检测，泳道1是蛋白质Marker，泳道2是BL21-alaD/FDH诱导前产物，泳道3是BL21-alaD/FDH诱导后产物。

具体实施方式

下面将通过具体实施例对本发明进行详细的描述。提供这些实施例是为了能够更透彻地理解本发明，并且能够将本发明的范围完整的传达给本领域的技术人员。

如在通篇说明书及权利要求当中所提及的“包含”或“包括”为一开放式用语，故应解释成“包含但不限定于”。说明书后续描述为实施本发明的较佳实施方式，然所述描述乃以说明书的一般原则为目的，并非用以限定本发明的范围。本发明的保护范围当视所附权利要求所界定者为准。

本发明中使用的色谱仪是美国Agilent公司生产的1200型高效液相色谱仪。

本发明中使用的材料如下：大肠杆菌E.coli DH5α、E.coli BL21(DE3)、TransTaqDNA聚合酶、T4DNA连接酶、标准相对分子量(Mr)DNA(即DNA marker，Mr 250～10，000)、标准Mr蛋白质等试剂均可购置于北京全式金生物技术有限公司；酮丁酸和L-2-氨基丁酸标准品(美国Sigma-Aldrich公司)；氨苄霉素(Amp)、卡那霉素(Kana)和NAD+均购自上海生工生物技术有限公司；蛋白胨和酵母提取物(英国Oxoid公司)；其他试剂均购自国药试剂有限公司。

LB培养基/g·L^-1：蛋白胨10，酵母提取物5，氯化钠10，pH 7.0。

实施例1一种酶法合成2-氨基丁酸的方法，具体步骤如下：

一、丙氨酸脱氢酶alaD和甲酸脱氢酶FDH的异源表达：

1、丙氨酸脱氢酶alaD的异源表达与酶活测定：

(1)获得alaD基因片段

根据丙氨酸脱氢酶(alaD)基因序列(基因库登录号：EF154460，SEQ ID NO.1)及前后序列设计引物，经过筛选获得的较佳的丙氨酸脱氢酶(alaD)上游引物为上游引物为5’-aaGGATCCatgaagatcggcattccaaaag-3’(大写处为BamHI酶切位点，SEQ ID NO.2)；下游引物为5’-ttGAATTCtcatccctgcagcaacgaatgaac-3’(大写处为EcoRI酶切位点，SEQ ID NO.3)。以上述上下游引物扩增可以高效的获得alaD基因片段。

(2)PCR反应体系

Trans Taq DNA聚合酶PCR反应体系如下所示：

模板(嗜热脂肪土芽孢杆菌总DNA)200ng，上游引物(10μM)1μL，下游引物(10μM)1μL，dNTP(10mM)0.4μL，10×缓冲液2μL，Trans Taq DNA聚合酶0.2μL，ddH20补足20μL。

(3)PCR反应程序

PCR反应程序：共30个循环，alaD基因片段大小约为1122bp。

步骤1：94℃，40s变性

步骤2：56℃，40s退火

步骤3：72℃，1.5min延伸

将alaD基因连入使用BamHI和EcoRI双酶切的pET32a载体，构建得到重组表达alaD的质粒pET32a-alaD。使用BamHI和EcoRI双酶切验证所构建的质粒，电泳检测酶切产物得到2条条带(5.9kb和1.1kb)，与预期相符(见图1，泳道1为pET32a-alaD酶切电泳，泳道2为DNA分子量Marker)。将pET32a-alaD转化入E.coli BL21(DE3)，得到alaD表达菌株BL21-alaD。

将表达菌株BL21-alaD接入LB培养基(含Amp 100ng/ml)中，37℃培养。当OD600值达到0.4～0.6时，加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)至终浓度为0.1mmol/L，25℃诱导16h，SDS-PAGE电泳检测可溶性蛋白的表达。结果表明加入IPTG后，alaD(Mr约3.95×104D)有明显表达条带，与预期大小相符。IPTG诱导前后alaD表达的SDS-PAGE检测结果见图2(泳道3箭头所示为诱导蛋白，泳道2为空载体阴性对照，泳道1为蛋白质分子量Marker)。

按文献方法，以2-酮丁酸为底物，测定alaD破菌上清液的酶活力，结果表明，alaD破菌上清液催化产生NAD+的活性约为8.12U/mL。一个酶活力单位(U)定义为在测定条件下，每分钟产生1moL产物所需的酶量。

2、FDH的异源表达和酶活测定：

(1)获得FDH基因片段

根据FDH的基因序列(基因库登录号：NM_001183808，SEQ ID NO.4)设计引物，经过筛选获得较佳的甲酸脱氢酶(FDH)上游引物为5’-aaGGATCCatgtcgaagggaaaggttttgc-3’(大写处为BamHI酶切位点，SEQ ID NO.5)；下游引物为5’-aaGAATTCttatttcttctgtccataagctc-3’(大写处为EcoRI酶切位点，SEQ ID NO.6)。以上述上下游引物扩增可以高效的获得FDH基因片段。

(2)PCR反应体系

Trans Taq DNA聚合酶PCR反应体系如下所示：

模板(酿酒酵母总DNA)200ng，上游引物(10μM)1μL，下游引物(10μM)1μL，dNTP(10mM)0.4μL，10×缓冲液2μL，Trans Taq DNA聚合酶0.2μL，ddH2O补足20μL。

(3)PCR反应程序

PCR反应程序：共30个循环，FDH基因片段大小约为1131bp。

步骤1：94℃，40s变性；

步骤2：56℃，40s退火；

步骤3：步骤3：72℃，1.5min延伸。

将FDH基因连入使用BamHI和EcoRI双酶切的pET28a载体，构建得到重组表达FDH的质粒pET28a-FDH。使用BamHI和EcoRI双酶切验证所构建的质粒，电泳检测酶切产物得到2条条带(5.9kb和1.1kb)，与预期相符(如图1，泳道3为pET28a-FDH酶切电泳，泳道2为DNA分子量标准)。将pET28a-FDH转化入E.coli BL21(DE3)，得到FDH表达菌株BL21-FDH。

将表达菌株BL21-FDH接入LB培养基(含Kana 50ng/ml)中，37℃培养。当OD600值达到0.4～0.6时，加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)至终浓度为0.1mmol/L，25℃诱导16h，SDS-PAGE电泳检测可溶性蛋白的表达。结果表明加入IPTG后，FDH(Mr约4.18×104D)有明显表达条带，与预期大小相符。IPTG诱导前后FDH表达的SDS-PAGE检测结果见图3(泳道1为箭头所示为诱导蛋白，泳道2为空载体阴性对照，泳道3为蛋白质分子量标准)。

按文献方法，以甲酸铵为底物，测定FDH破菌上清液中的酶活力，结果表明，FDH破菌上清液催化产生NADH的活性约为10.5U/mL。一个酶活力单位(U)定义为在测定条件下，每分钟产生1mol产物所需的酶量。

3、分别发酵所述菌株BL21-alaD和BL21-FDH

将菌株BL21-alaD在发酵培养基中培养，加入0.1％的乳糖30℃诱导表达16h，离心收集菌体即得所述alaD表达菌体，表达菌体保存于-20℃；将菌株BL21-FDH在发酵培养基中培养，加入0.1％的乳糖30℃诱导表达16h，离心收集菌体即得所述FDH表达菌体，表达菌体保存于-20℃。

二、配制催化反应体系制备化合物1：

按步骤一中的方法得到alaD和FDH的表达菌体，向250ml三角瓶中依次加入以下药品配制催化体系：2-酮丁酸0.5mol，甲酸铵0.5mol，NAD 0.2g/L，甲酸脱氢酶湿菌体10g/L、丙氨酸脱氢酶湿菌体10g/L，氨水调节反应体系pH8.0，在30℃条件下转化16h。所得2-氨基丁酸含量为48.9g/L，产物光学纯度ee为99％，转化率大于95％。，将反应液置70℃水浴中加热1h，抽滤后将滤液减压旋干，加入等体积乙醇溶解洗去杂质，抽滤后即得到化合物1固体。再次醇洗后，产物用于HPLC检测与结构鉴定，催化体系中产物化合物1的检测。

使用2，4-二硝基氟苯衍生化-HPLC法测定化合物1。色谱条件：色谱柱C₁₈柱(4.6mm×250mm，5m)；流动相0.02mol/L磷酸氢二钠缓冲液(PBS，pH 7.2)∶乙腈(70∶30)；流速1.0ml/min；柱温30℃；检测波长360nm。在上述条件下，化合物1的保留时间为16.513min(图4，红色箭头所示)。采用外标法测定产物生成量，分别配制0.0625、0.125、0.25、0.5和1mg/ml系列浓度标准溶液(2-氨基丁酸溶液)，衍生后进样测定。以溶液浓度c为横坐标，峰面积A为纵坐标，进行线性回归，得回归方程A＝31700c+2450.7(r²＝0.9992)。

实施例2一种酶法合成2-氨基丁酸的方法

除了以下步骤不同之外，其余步骤同实施例1。

构建alaD和FDH共表达的基因工程菌，经发酵制得共表达FDH和alaD的菌体。其中质粒pET32a-alaD和pET28a-FDH构建与实施例1相同，将质粒pET32a-alaD和pET28a-FDH转入同一株E.coli BL21(DE3)，得到共表达alaD和FDH的菌株BL21-alaD/FDH，共表达菌株的重组蛋白诱导见图5(泳道3箭头所示为共表达的诱导蛋白，诱导2为空载体阴性对照，诱导1为蛋白质分子量标准)。

(1)共表达菌的发酵与实施例1相同。

(2)向250ml三角瓶中依次加入以下药品配制催化体系：2-酮丁酸0.5mol，甲酸铵0.5mol，甲酸脱氢酶和丙氨酸脱氢酶共表达湿菌体20g/L，氨水调节反应体系pH8.0，在30℃条件下转化16h。所得L-2-氨基丁酸含量为49.5g/L，产物光学纯度ee为99％，转化率大于96％。

实施例3一种酶法合成2-氨基丁酸的方法

除了下述步骤中“将菌株BL21-alaD在发酵培养基中培养，加入0.1％的乳糖30℃诱导表达16h，离心收集菌体即得所述alaD表达菌体，表达菌体保存于-20℃；将菌株BL21-FDH在发酵培养基中培养，加入0.1％的乳糖30℃诱导表达16h，离心收集菌体即得所述FDH表达菌体，表达菌体保存于-20℃”中诱导温度均为30℃改为25℃，其余同实施例1。

然后按第一步中的方法得到alaD和FDH的表达菌体，向250ml三角瓶中依次加入以下药品配制催化体系：2-酮丁酸0.5mol，甲酸铵0.5mol，甲酸脱氢酶湿菌体20g/L、丙氨酸脱氢酶湿菌体20g/L，氨水调节反应体系pH8.0，在30℃条件下转化20h。所得2-氨基丁酸含量为48.5g/L，产物光学纯度ee为99％，转化率大于94％。

实施例4

除了以下步骤不同之外，其余步骤同实施例1。

按实施例1中的方法得到alaD和FDH的表达菌体，向250ml三角瓶中依次加入以下药品配制催化体系：2-酮丁酸1mol，甲酸铵lmol，NAD 0.3g/L，甲酸脱氢酶湿菌体20g/L、丙氨酸脱氢酶湿菌体20g/L，氨水调节反应体系pH7.5，在30℃条件下转化20h。所得2-氨基丁酸含量为98.9g/L，产物光学纯度ee为99％，转化率大于96％。

实施例5

然后按实施例1中的方法得到alaD和FDH的表达菌体，向250ml三角瓶中依次加入以下药品配制催化体系：2-酮丁酸1.5mol，甲酸铵1.5mol，NAD 0.5g/L，甲酸脱氢酶湿菌体20g/L、丙氨酸脱氢酶湿菌体20g/L，氨水调节反应体系pH7.5，在30℃条件下转化20h。所得2-氨基丁酸含量为143.6g/L，产物光学纯度ee为99％，转化率大于93％。

实施例6：

除了下述步骤中“将菌株BL21-alaD在发酵培养基中培养，加入0.1％的乳糖30℃诱导表达16h，离心收集菌体即得所述alaD表达菌体，表达菌体保存于-20℃；将菌株BL21-FDH在发酵培养基中培养，加入0.1％的乳糖30℃诱导表达16h，离心收集菌体即得所述FDH表达菌体，表达菌体保存于-20℃”中诱导温度均为30℃改为28℃，其余同实施例1。

然后按照实施例1中的方法得到alaD和FDH的表达菌体，向250ml三角瓶中依次加入以下药品配制催化体系：2-酮丁酸1.0mol，甲酸铵1.0mol，甲酸脱氢酶湿菌体25g/L、丙氨酸脱氢酶湿菌体25g/L，氨水调节反应体系pH8.0，在37℃条件下转化20h。所得2-氨基丁酸含量为99.9g/L，产物光学纯度ee为99％，转化率大于97％。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施例对本发明作了详尽的描述，但在本因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 鲁东大学

<120> 一种酶法合成L-2-氨基丁酸的方法

<130> 2017

<160> 6

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1119

<212> DNA

<213> Alanine Dehydrogenase

<400> 1

atgaagatcg gcattccaaa agaaatcaaa aacaatgaaa accgcgtcgc catcactccg 60

gcaggcgtga tgacgctcgt caaagcgggg catgacgtgt atgtggagac ggaagccggc 120

gctgggtcgg gtttttccga ttccgagtat gaaaaagccg gggcagtgat cgtgacgaaa 180

gcggaagatg cctgggcggc ggagatggtg ttgaaagtga aagaaccgct ggctgaggag 240

ttccgctatt ttcgccccgg attgattttg tttacgtatt tgcatttagc cgcggccgaa 300

gcgctcacga aagcgctcgt cgagcaaaaa gtggtcggca tcgcttacga gacggtgcag 360

cttgcgaacg gctcgctgcc gctgttgacg ccgatgagtg aagtcgccgg ccgcatgtcg 420

gtgcaagtcg gcgcccagtt tctcgagaag ccgcacggcg ggaaaggcat tttgcttggc 480

ggcgtgcccg gggtgcggcg cggcaaagtg acgatcatcg gcggcggcac agcggggacg 540

aacgcggcga aaatcgcggt cggcctcggg gcggacgtga cgattttgga cattaacgcc 600

gagcggctgc gcgagctcga tgatttgttc ggcgaccaag tgacgacgtt gatgtccaac 660

tcgtatcata tcgccgagtg cgtgcgcgaa tccgatttgg tcgtcggcgc cgtcttgatc 720

ccgggggcga aagcgccgaa gcttgtgacg gaagagatgg tgcgctcgat gacgccaggc 780

tcggtgttgg tcgacgtcgc cattgaccaa ggcggcattt ttgaaacgac cgaccgcgtc 840

acgacgcacg acgatccgac atacgtcaag cacggcgtcg tccattacgc cgtcgcgaac 900

atgccgggcg ctgtgccgcg tacgtcaaca ttcgcgctta cgaacgtcac gatcccatac 960

gccttgcaaa tcgccaacaa aggctaccgc gccgcttgcc tcgacaatcc ggcgctgtta 1020

aaagggatca acacgctcga cgggcacatc gtgtacgaag cggtcgcggc ggcgcacaac 1080

atgccgtata cggatgttca ttcgttgctg cagggatga 1119

<210> 2

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 2

aaggatccat gaagatcggc attccaaaag 30

<210> 3

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 3

ttgaattctc atccctgcag caacgaatga ac 32

<210> 4

<211> 1131

<212> DNA

<213> Formate dehydrogenase

<400> 4

atgtcgaagg gaaaggtttt gctggttctt tacgaaggtg gtaagcatgc tgaagagcag 60

gaaaagttat tggggtgtat tgaaaatgaa cttggtatca gaaatttcat tgaagaacag 120

ggatacgagt tggttactac cattgacaag gaccctgagc caacctcaac ggtagacagg 180

gagttgaaag acgctgaaat tgtcattact acgccctttt tccccgccta catctcgaga 240

aacaggattg cagaagctcc taacctgaag ctctgtgtaa ccgctggcgt cggttcagac 300

catgtcgatt tagaagctgc aaatgaacgg aaaatcacgg tcaccgaagt tactggttct 360

aacgtcgttt ctgtcgcaga gcacgttatg gccacaattt tggttttgat aagaaactat 420

aatggtggtc atcaacaagc aattaatggt gagtgggata ttgccggcgt ggctaaaaat 480

gagtatgatc tggaagacaa aataatttca acggtaggtg ccggtagaat tggatatagg 540

gttctggaaa gattggtcgc atttaatccg aagaagttac tgtactacga ctaccaggaa 600

ctacctgcgg aagcaatcaa tagattgaac gaggccagca agcttttcaa tggcagaggt 660

gatattgttc agagagtaga gaaattggag gatatggttg ctcagtcaga tgttgttacc 720

atcaactgtc cattgcacaa ggactcaagg ggtttattca ataaaaagct tatttcccac 780

atgaaagatg gtgcatactt ggtgaatacc gctagaggtg ctatttgtgt cgcagaagat 840

gttgccgagg cagtcaagtc tggtaaattg gctggctatg gtggtgatgt ctgggataag 900

caaccagcac caaaagacca tccctggagg actatggaca ataaggacca cgtgggaaac 960

gcaatgactg ttcatatcag tggcacatct ctggatgctc aaaagaggta cgctcaggga 1020

gtaaagaaca tcctaaatag ttacttttcc aaaaagtttg attaccgtcc acaggatatt 1080

attgtgcaga atggttctta tgccaccaga gcttatggac agaagaaata a 1131

<210> 5

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 5

aaggatccat gtcgaaggga aaggttttgc 30

<210> 6

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 6

aagaattctt atttcttctg tccataagct c 31

Claims

1.一种酶法合成L-2-氨基丁酸的方法，其特征在于，所述方法是利用丙氨酸脱氢酶和甲酸脱氢酶催化2-酮丁酸生产L-2-氨基丁酸；所述丙氨酸脱氢酶选自嗜热脂肪土芽孢杆菌；所述方法具体包括如下步骤：

(1)甲酸脱氢酶(FDH)和丙氨酸脱氢酶(alaD)的异源表达：分别构建FDH和alaD的基因工程菌，经发酵分别制得表达FDH和alaD的菌体——甲酸脱氢酶湿菌体和丙氨酸脱氢酶湿菌体；

2.根据权利要求1所述的酶法合成L-2-氨基丁酸的方法，其特征在于，所述方法还可以用如下步骤代替：

(2)然后将2-酮丁酸0.5-1.5mol、甲酸铵0.5-1.5mol、甲酸脱氢酶和丙氨酸脱氢酶共表达湿菌体15-20g/L置于反应器中混合均匀，调节pH值为7.0-9.0，温度为30-37℃，催化反应16-20h，得到L-2-氨基丁酸。

3.根据权利要求1所述的酶法合成L-2-氨基丁酸的方法，其特征在于，所述甲酸脱氢酶选自酿酒酵母。

4.根据权利要求1所述的酶法合成L-2-氨基丁酸的方法，其特征在于，所述步骤(1)具体如下：

(a)构建alaD载体：

(b)构建FDH载体：

(c)构建分别表达alaD和FDH的基因工程菌；

5.根据权利要求4所述的酶法合成L-2-氨基丁酸的方法，其特征在于，所述发酵培养基配方为：葡萄糖2％、硫酸铵0.3％、蛋白胨0.5％、酵母浸粉2％、KH₂PO₄ 1.25％、MgSO₄0.1％、柠檬酸0.15％和乳糖0.1-0.5％，发酵条件：pH7.0，温度37℃，诱导后降温至25-30℃，发酵结束后再以6000rpm转速离心10min，-20℃保存菌体备用。

6.根据权利要求4所述的酶法合成L-2-氨基丁酸的方法，其特征在于，所述alaD基因的克隆方法为：以嗜热脂肪土芽孢杆菌总DNA为模板，分别以上下游引物进行PCR扩增，从而得到所述alaD基因；

其中,上游引物为5’-aaGGATCCatgaagatcggcattccaaaag-3’，引物中字母大写处为BamHI酶切位点；下游引物为5’-ttGAATTCtcatccctgcagcaacgaatgaac-3’，引物中字母大写处为EcoRI酶切位点。

7.根据权利要求4所述的酶法合成L-2-氨基丁酸的方法，其特征在于，所述FDH基因的克隆方法为：以酿酒酵母总DNA为模板，分别以上下游引物进行PCR扩增，从而获得所述FDH基因，

其中，上游引物为5’-aaGGATCCatgtcgaagggaaaggttttgc-3’，引物中字母大写处为BamHI酶切位点；下游引物为5’-aaGAATTCttatttcttctgtccataagctc-3’，引物中字母大写处为EcoRI酶切位点。