CN107254429B - 一种高产重组腈水解酶的枯草芽孢杆菌及其应用方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种高产腈水解酶的重组枯草芽孢杆菌及其在烟酸合成中的应用，属于生物工程技术领域。该方法通过PCR扩增恶臭假单胞菌Pseudomonas putida CGMCC 3830腈水解酶基因编码序列并与pMA5质粒相连，构建得到重组质粒pMA5‑NIT，转化至Bacillus subtilis WB600中得到可高效表达腈水解酶的重组菌B.subtilis WB600(pMA5‑NIT)，命名为枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis NIT‑2，现保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.14255。以重组枯草芽孢杆菌游离细胞为催化剂，可将3‑氰基吡啶完全转化生成烟酸。本发明提供了一种高产重组腈水解酶的枯草芽孢杆菌菌株，具有突出的腈水解酶活性，重组菌发酵周期短，催化效率高，具有良好的应用前景。

Description

一种高产重组腈水解酶的枯草芽孢杆菌及其应用方法

技术领域

本发明属于基因工程及酶工程技术领域，具体涉及一种高产重组腈水解酶的枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis NIT-2的构建及其在烟酸合成中的应用。

背景技术

烟酸，又称维生素PP或维生素B3，是人体必需的13种维生素之一，作为药物中间体可合成多种用于治疗皮肤性疾病、高血压症和冠心病等的药物，如异烟肼、尼可刹米及烟酸肌醇酯等，还可以用做饲料或食品添加剂，具有广泛的国内外市场。据统计，世界上年消耗烟酸8万吨以上，目前都采用化学法生产，欧美产能约4万吨。目前，我国生产烟酸的原料3-甲基吡啶和3-氰基吡啶基本依赖进口，其产品生产主要被几个国际合资或独资企业，如龙沙公司等垄断。由于生产原料供应受限，我国一些化学法生产烟酸的厂家无论在生产装置规模、产品质量和生产成本等方面也都难以与国外大公司抗衡，面临严峻的技术和市场挑战。

传统的化学法生产烟酸需要消耗昂贵的氧化剂及贵金属催化剂，并存在较为严重的环境污染。如，早期烟酸是通过氧化尼古丁制备获得，后来逐渐发展到以2-甲基-5-乙基吡啶、3-甲基吡啶以及喹啉等为原料进行制备；我国目前工业生产中主要以3-甲基吡啶为原料，通过氧化反应制备获得烟酸，而其中氧化方法主要分为液相氧化法和气相氧化法，以上方法具有氧化剂价格昂贵，过程复杂，产物难分离，污染较严重及对生产设备要求高等不足之处。腈水解酶介导的微生物催化合成烟酸是近年来快速发展的可替代性颠覆技术，具有污染排放少、高效生物催化、生产成本低等比较优势。

枯草芽孢杆菌作为一种传统的、安全可靠的表达宿主，在工业、农业以及医药等领域有着广泛应用，传统的重组表达产腈水解酶多数需进行体外诱导，增加了工艺步骤和生产成本。构建高产腈水解酶的枯草芽孢杆菌表达体系，无需添加诱导剂，可降低生产成本及缓解对菌体或酶蛋白造成的毒害作用，对于工业规模烟酸的生物合成具有重要的研究意义和实践价值。

发明内容

本发明的目的是构建一种无需进行体外诱导并且高产腈水解酶的枯草芽孢杆菌表达体系，并应用于烟酸的生物转化合成。

本发明采用的技术方案是：一种产重组腈水解酶的枯草芽孢杆菌NIT-2构建，方法如下：

1)腈水解酶基因NIT的制备：提取恶臭假单胞菌Pseudomonas putida CGMCC 3830基因组，利用引物设计软件Oligo 7设计引物2PU和A5D，PCR扩增得到两端携带Nde I和MluI酶切位点的腈水解酶基因NIT，引物序列如下：

2PU：5'-GGAATTCCATATGATGGTTACGTACACGAATAAGTT-3'

A5D：5'-CGACGCGTTCAGCTCTCTTCATGGACCTTAA-3'

2)含Nde I和Mlu I酶切位点pMA5质粒的制备：利用Nde I和Mlu I限制酶对pMA5质粒进行双酶切；

3)腈水解酶基因与pMA5质粒的连接：连接经过Nde I和Mlu I限制酶酶切后的腈水解酶基因NIT与pMA5质粒，得到重组质粒pMA5-NIT；

4)重组质粒的转化：将重组质粒pMA5-NIT转入B.subtilis WB600中，构建获得可产重组腈水解酶的枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis NIT-2。该菌株保藏在位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏时间2017年6月19日，分类命名枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，保藏编号为CGMCC No.14255。

本发明还提供所述产重组腈水解酶的枯草芽孢杆菌NIT-2在转化合成烟酸中的应用，所述应用为：以枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis NIT-2在TB培养基中发酵获得的菌体为催化剂，以3-氰基吡啶为底物，在pH 7.2的磷酸盐缓冲液中构成转化反应体系，在30℃条件下进行转化反应，采用HPLC检测转化液中底物残留情况，反应完全后，获得的转化液中即含有烟酸。

所述反应体系中底物投料浓度为50-200mM。

所述枯草芽孢杆菌经发酵培养获得的含酶菌体的质量用量以菌体干重计为1.0～4.0g/L。

本发明所述检测底物3-氰基吡啶和产物烟酸的高效液相色谱条件为：Dionex3000型高效液相色谱仪，色谱柱为WATERS公司的XBridge dC 18柱(5.0μm，250mm×4.6mm)，柱温30℃，流速为0.5mL/min，紫外检测波长268nm，流动相为乙腈/0.02％三氟乙酸(3/2)。

本发明的有益效果主要体现在：(1)本发明首次成功构建了产恶臭假单胞菌重组腈水解酶的枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis NIT-2，其无需进行体外诱导便可高效表达腈水解酶，降低了生产成本，提高了工艺效率，可为生物催化合成烟酸提供廉价的催化剂；(2)枯草芽孢杆菌作为一种传统的基因工程菌株，不仅生长周期较短，而且在工、农、医等领域均具有重要应用价值，其作为宿主菌表达的目的蛋白安全、可靠，本发明中所构建的含腈水解酶的枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis NIT-2，在生物催化生产烟酸中，提升了生产的烟酸的安全层级，能够满足该烟酸产品在食品、医药等安全较高领域的应用；(3)本发明将枯草芽孢杆菌NIT-2用于生物催化生产烟酸，结果表明，该菌可有效生物催化生产烟酸，3-氰基吡啶转化率可达到100％，在生物催化生产烟酸领域具有良好的应用前景。

附图说明

图1为枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis NIT-2用于生物催化生产烟酸过程曲线。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此。

实施例1：产重组腈水解酶的枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis NIT-2的构建

1)腈水解酶基因NIT序列的扩增：从恶臭假单胞菌Pseudomonas putida CGMCC3830中提取基因组DNA，作为模版，设计上下游引物2PU及A5D，在两端分别添加Nde I和MluI酶切位点，进行PCR扩增，引物：

2PU：5'-GGAATTCCATATGATGGTTACGTACACGAATAAGTT-3'

A5D：5'-CGACGCGTTCAGCTCTCTTCATGGACCTTAA-3'

PCR扩增体系：

PCR反应程序：在95℃预变性3min后开始循环，95℃变性30s，59℃退火30s，72℃延伸90s，共30个循环；于72℃下终延伸5min；12℃保温获得两端携带Nde I和Mlu I酶切位点的腈水解酶基因NIT。

2)含Nde I和Mlu I酶切位点pMA5质粒的制备：利用Nde I和Mlu I限制酶对pMA5质粒进行双酶切，酶切体系设计如下：

经琼脂糖凝胶电泳分析回收获得两端携带Nde I和Mlu I酶切位点的pMA5质粒。

3)腈水解酶基因与pMA5质粒的连接：连接经过Nde I和Mlu I限制酶酶切后的腈水解酶基因与pMA5质粒，得到重组质粒pMA5-NIT，连接体系设计如下：

4)重组质粒的转化：将重组质粒pMA5-NIT转入B.subtilis WB600中，得到可产腈水解酶的枯草芽孢杆菌NIT-2。

实施例2：枯草芽孢杆菌NIT-2游离细胞的制备

将于TB培养基中培养8～10h的发酵液于12000×g离心1min后弃去上清液，再用pH7.2、100mM磷酸钠缓冲液(PBS)重悬菌体并洗涤2～3次，得到除去培养基残液的菌体，最后用相同的磷酸钠缓冲液重悬菌体得到游离细胞悬浮液，测定菌体浓度后保存于4℃冰箱中备用。

实施例3：生物转化合成烟酸

将制备的游离细胞菌悬液(100mL，菌体干重为2.87g/L)与1.04g 3-氰基吡啶(3-氰基吡啶初始浓度为100mM)混合，在30℃、220rpm条件下进行转化反应，通过HPLC检测转化液中残留底物情况，当底物被完全转化时，即获得含烟酸的转化液。

枯草芽孢杆菌NIT-2游离细胞能够在13min内完全转化100mM底物，3-氰基吡啶的转化率可达到100％，HPLC未检测出副产物烟酰胺生成，单位菌体对底物3-氰基吡啶的平均转化速率为16.72 g/h。

SEQ ID NO:1

Composition 262 A; 293 C; 276 G; 282 T; 0 OTHER

Percentage: 23.5% A; 26.3% C; 24.8% G; 25.3% T; 0.0%OTHER

Molecular Weight (kDa): ssDNA: 343.21 dsDNA: 686.18

ORIGIN

1 TCAGCTCTCT TCATGGACCT TAACCGGCTC AAATTGAGCG AGCGACTTTT GTAAGAAAGG

61 ACCGGGGACT TCCAAGCTAT ACGTTAAGCC GGGTACCGTA CCCTGCGATA TTGAGGAAAA

121 GACTTCCTCC GACTCAATAT GTTTGCCCAT ATCCTTCAGA CGTTTGACGG GAGATTGGGC

181 CTGGTTATTG AACTGCAATG AAAAAACATC GGGCCGGGAA TAATGGCCCA CAGGGTCTGC

241 AGCCTGTTTA GCCATCGTGA TTTGGGCCAG ATCGATCTCG GCGTAGAGGA TCCCCTCTCC

301 ATCCGCAGGC AGCCGCTCGG CTAATGGCCG ACCGTCCGGT CCGAATATTT GAGCGAATCC

361 CCCGCCATAG CCGATAAGCT TTTTGTGCAT TTCGTTTTCG CAGAAAAACT CAAGTGCAGC

421 TTTTCCCACA ACCTGAGTCG AGCACAACAC GAAGGTTTGA CCTTCCATTG CGTACATTTG

481 GGTGGCAACA AGCTGTGCTT CGGAACTGAA GGCGAACACT TCAGGCTGAT ATAAGGACAT

541 CCCAGGCCAT GCCGCGATGT GGACCTGTTC ATGTCATCGC GTACATCGCG TATTTGGTTG

601 GGGTCTGGAA ATGTTCCCAA CAGTTCAAAG CGCCGACCCT ACCAATAGGC ATGTCGTGAA

661 CTGCGATGTC CGAGCCATCA CCTTCGCCAT AGACGGTACG CTCTACATGA GTGGGTTTCA

721 GCTTTCGTCT GTGAGCAACG ATCTTCCCTT TTTCATCAAT AATCAGTTGG CTCATGTAGA

781 GGCTGCCGCC ATCGCGCTCA CTGAATCCGA TCACCACACA TATATTATTG CTCTCGGCAG

841 CTTCCTGAAT CCGTGTGATC AACGGGCTGT CAATCGACAG GGATTGTTCA TGATAGCGTG

901 TGGCGAACTT GCCCATCCCC GCGAAGGGGC TATCCAGCCA GATGTGATAC GGATATCCGG

961 GAATAAAAAC CTCAGGAAAT GCGATGATCT GAGCATTGTT GTCGGCTGCT TCTTTTATTA

1021 GGCCGATAGT TTCTCGACAG TAGCCGCGGC ATCAAACCAG ACGGGTTCAGCTTGAACCGT

1081 AGCCGCTTTG AACTTATTCG TGTACGTAAC CAT

Claims (4)

1.一株能表达重组腈水解酶、并转化3-氰基吡啶合成烟酸的枯草芽孢杆菌，其特征为，分类命名为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)NIT-2，现保藏于位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.14255，保藏日期2017年6月19日。

2.一种权利要求1所述的枯草芽孢杆菌NIT-2在生物转化合成烟酸中的应用，其特征在于：以含枯草芽孢杆菌NIT-2的游离细胞菌悬液作为催化剂，以3-氰基吡啶为底物，在30℃条件下进行转化反应，采用HPLC检测转化液中底物3-氰基吡啶的残留情况，反应完全后，获得含烟酸的转化液。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于所述底物投料浓度为50-200mM。

4.如权利要求2所述的应用，其特征在于枯草芽孢杆菌NIT-2的游离细胞用量，以菌体干重计为1.0～4.0g/L。

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