CN114317506A

CN114317506A - 一种腈水解酶、其构建的工程菌及其在烟酸绿色合成中的应用

Info

Publication number: CN114317506A
Application number: CN202210037906.5A
Authority: CN
Inventors: 潘炎烽; 张海峰; 戴柳玲; 姚灵峰; 周中平
Original assignee: BROTEK TECHNOLOGY Inc
Current assignee: BROTEK TECHNOLOGY Inc
Priority date: 2022-01-13
Filing date: 2022-01-13
Publication date: 2022-04-12
Anticipated expiration: 2042-01-13
Also published as: CN114317506B

Abstract

本发明属于生物技术工业应用领域，具体涉及一种腈水解酶、其构建的工程菌及其在烟酸绿色合成中的应用。本发明构建含腈水解酶突变体基因的大肠杆菌重组工程菌，命名为大肠杆菌E.coli PST2‑NL，经诱导表达后获得的湿菌体为酶源，以3‑氰基吡啶为底物，反应获得30%‑50%的烟酸铵反应液，转化率和选择性都达到100%。本发明将烟酸铵反应液经浓缩降温结晶形成烟酸铵晶体，晶体部分进入干燥器中干燥脱氨，干燥温度控制为80‑150℃，干燥时间2‑5h，得到烟酸产物，产物得率99.8%以上。将母液回收套用至浓缩工段，吸收分解产生的氨，制成液氨用于3‑甲基吡啶氨氧化反应，提高全产业链的原子经济性，实现绿色合成。

Description

一种腈水解酶、其构建的工程菌及其在烟酸绿色合成中的应用

技术领域

本发明属于生物技术工业应用领域，具体涉及一种腈水解酶、其构建的工程菌及其在烟酸绿色合成中的应用。

背景技术

烟酸属于维生素B族，又称尼克酸、维生素B₃、抗癞皮病因子，化学名称吡啶-3-甲酸，热稳定性好，能升华，是人体必需的13种维生素之一。目前，烟酸主要用于饲料添加剂，可提高饲料蛋白的利用率，提高奶牛产奶量及鱼、鸡、鸭、牛、羊等禽畜肉产量和质量。医药领域，烟酸可直接作为防治糙皮病等皮肤病和类似的维生素缺乏症的有效药物，还可用于治疗动脉粥样硬化和末梢神经血管痉挛等病症；烟酸可作为医药中间体合成酞胺和酰类药物。此外，烟酸还在发光材料、染料、电镀行业等领域发挥着不可替代的作用。

目前，烟酸工业生产方法主要有液相氧化法、氨氧化法、气相氧化法、电化学氧化法等。前三种方法需要在高温下进行，能耗高，成本高、对环境污染严重等缺点。电化学氧化法制备烟酸反应条件温和，工艺简单，副产物少，污染小，是一种比较理想的烟酸生产工艺，但该方法目前还停留在实验研发阶段，产率还需要进一步提高。因此，寻求一种绿色高效经济的烟酸生产方式是目前面临的重要问题之一。

生物催化法反应条件温和、催化剂特异性高、选择性强、能耗少、催化剂制作成本低廉、工艺环境友好，产生显著的经济效益。因此，生物催化是绿色化学与绿色化工发展的重要趋势之一。但是野生菌普遍存在酶活表达量低，稳定性较差，对底物和产物的耐受性不高等缺点。随着基因工程技术的迅猛发展，通过分子改造构建基因工程菌，提高腈水解酶的活性、稳定性及底物耐受性等催化性能。

江南大学枯草芽孢杆菌NIT-2游离细胞能够在13min内完全转化100mM底物，3-氰基吡啶的转化率可达到100％，HPLC未检测出副产物烟酰胺生成，单位菌体对底物3-氰基吡啶的平均转化速率为16.72g/h。采用固定化小球形式底物3-氰基吡啶投料终浓度从游离细胞的150mM提升至250-550mM，折算26-57.2g/L。

R.rhodochrousJ1的静息细胞转化3-氰基吡啶生成烟酸，其转化率能达到100％，采用分批补料的方式添加底物连续转化26h后，烟酸的产量达到172g·L^-1，折算6.6g(烟酸)·h^-1·g(细胞)^-1。

固定化B.pallidus Dac521细胞转化3-氰基吡啶获得烟酸，采用柱式反应器，连续注入100mmol·L^-1底物，分别在50℃和60℃获得转化效率为0.104g(底物)·h^-1·g(细胞)^-1和0.208g(底物)·h^-1·g(细胞)^-1。

Sharma等在1L体系的分批补料转化中，利用4.2g小球诺卡氏菌(N.globerula)NHB-2的静息细胞用于转化共1M的3-氰基吡啶，98.6％的3-氰基吡啶被转化为烟酸，其产率为3.21g(烟酸)·h^-1·g(细胞)^-1。

腈水解酶反应专一性的调控对腈水解酶的工业化应用有着重要的意义。提高腈水解酶的水解活性，专一性生成羧酸有利于产率的提高以及后期产物的分离纯化，为腈水解酶工业化生产提供便利。

江南大学、江西省德兴市百勤异VC钠有限公司、山东昆达生物科技有限公司通过基因工程改造得到的真菌腈水解酶。以3-氰基吡啶为底物，定点突变的基因工程腈水解酶较未突变的天然腈水解酶比酶活提高了80％以上，比酶活达到5.1U/mg；酰胺生成量降低了30％，仅为1.75％。

Gong等通过定点突变构建了双突变体I128L-N161Q，催化3-氰基吡啶时，产物中羧酸含量提高至99.1％，催化活力提高1.98倍(Catalysis Science&Technology,2016,6(12):4134-4141)。

因此，开发能够高效水解3-氰基吡啶，且能减少甚至消除副产物产生的腈水解酶具有重要工业应用价值。

发明内容

本发明的目的是构建一种高产腈水解酶的重组工程菌E.coli PST2-NL，该重组工程菌在提高酶活性的同时，提高羧酸含量，并经高密度发酵工艺，最终实现其在烟酸绿色合成中的应用。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：

一种腈水解酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

一种编码腈水解酶的编码基因，所述编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。该腈水解酶基因(Genebank ID：WP_093971852，简称PST2-NL)，来源于极小单胞菌属(Pusillimonas sp.T2)。

一种由所述的腈水解酶基因构建的大肠杆菌重组工程菌，命名为大肠杆菌E.coliPST2-NL。

一种所述的高产腈水解酶的重组工程菌E.coli PST2-NL的构建，方法如下：

1)腈水解酶基因PST2-NL序列的扩增：以极小单胞菌属(Pusillimonas sp.T2)中腈水解酶基因的DNA序列信息，全基因合成腈水解酶基因PST2-NL；(涉及到的步骤：引物的设计、合成，引物的拼接和PCR扩增，最后将目的基因连接到相应的载体，并通过酶切进行QC鉴定，DNA测序验证确保序列的正确性)；

2)利用限制性内切酶对pET21a(+)进行双酶切，经琼脂糖凝胶电泳分析回收获得经酶切的pET21a(+)质粒；将经同样酶切后的腈水解酶基因与pET21a(+)质粒连接，得到重组质粒pET21a(+)-PST2-NL；

3)将重组质粒pET21a(+)-PST2-NL经热激转化导入E.coli BL21(DE3)感受态细胞中，构建获得可高产重组腈水解酶的大肠杆菌E.coli PST2-NL。

一种重组工程菌E.coli PST2-NL的高密度发酵方法，该方法步骤如下：

1)将E.coli PST2-NL接种到含终浓度为0.1g/L氨苄青霉素的200ml LB液体培养基中，37℃，160rpm/min震荡培养8-10小时，OD₆₀₀＝4.0-6.0时移种，培养液以3-10％体积比接种到含有0.1g/L氨苄青霉素的发酵培养基中进行发酵培养；

2)通过调节搅拌转速、通气量的方式，控制发酵全程DO在30％±2％；

3)通过补加氨水的方式来控制pH在7.0±0.2；

4)当DO出现明显回升时，开始流加补料，培养至OD₆₀₀＝30-50时加入终浓度为0.2mmol/L的IPTG诱导培养8-12h，菌体浓度达到100-140g/L，放料OD₆₀₀达到100-140，发酵液离心后得到湿菌体。一般的，发酵液在4℃下4000rpm/min离心10min，得到湿菌体。

作为优选，发酵和补料培养采用的培养基为：

1)所述发酵培养基(g/L)：甘油20-50，酵母粉10-20，磷酸二氢钾5-10，磷酸氢二钾10-15，硫酸铵5-10，一水柠檬酸1-3，以及微量元素5-20mL/L；

2)所述补料培养基组分为(g/L)：甘油500-800，硫酸铵10-20，硫酸镁5-10，以及微量元素2-5mL/L；

3)微量元素溶液g/L：FeCl₃·6H₂O：1.6，CoCl₂·6H₂O：0.37，CuCl₂·2H₂O：0.13，ZnCl₂·4H₂O：0.2，NaMoO₄·2H₂O：0.2，H₃BO₃：0.05，EDTA·2Na：0.2，以及HCl：10mL。

一种所述的大肠杆菌E.coli PST2-NL在烟酸铵生产中的应用，具体是：以重组工程菌经诱导表达后获得的湿菌体为酶源，以3-氰基吡啶为反应底物，底物浓度控制浓度在250-420g/L，体系pH控制在7.90-8.00，在30-40℃条件下反应制备烟酸铵。反应后获得约30％-50％的烟酸铵反应液，转化率和选择性都达到100％。湿菌体用量为3-5g/L，反应底物一般通过流加方式添加。

本发明中以烟酸铵为原料合成烟酸的方法，具体为：将30％-50％的烟酸铵反应液减压浓缩至60-80％，投入到反应釜中，搅拌速度为80-150rpm，梯度降温结晶形成烟酸铵晶体，晶体部分进入干燥器中干燥脱氨，干燥温度控制为80-150℃，干燥时间2-5h，得到烟酸产物，产物得率99.8％以上。将母液回收套用，吸收分解产生的氨，制成液氨用于3-甲基吡啶氨氧化反应。

作为优选，该应用包括如下步骤：

1)以重组工程菌经诱导表达后获得的湿菌体为酶源，以3-氰基吡啶为反应底物，底物浓度控制浓度在250-420g/L，体系pH控制在7.90-8.00，在30-40℃条件下反应，得到含有质量分数30％-50％烟酸铵的反应液；

2)所述的反应液经浓缩降温结晶形成烟酸铵晶体，离心得到晶体和母液，晶体进入干燥器中干燥脱氨，干燥温度控制在80-150℃，干燥时间2-5h，得到烟酸。本发明中，烟酸产品得率达到99.8％以上。

作为优选，将离心得到的母液回收套用至浓缩工段，吸收分解产生的氨，制成液氨用于3-甲基吡啶氨氧化制备3-氰基吡啶。母液主要成分为饱和的烟酸铵水溶液，回收套用至浓缩工段。3-甲基吡啶与氨、氧气反应生成3-氰基吡啶，产物3-氰基吡啶为本发明所述烟酸铵生产的原材料，具体流程如图2所示。氨的回用实现了产业链上的原子经济性。

现有技术中，以3-氰基吡啶为原料经生物催化一般生成烟酸铵，需经进一步中和结晶生成烟酸，而中和结晶工艺需引入过量的强酸(硫酸、烟酸)等与烟酸铵反应生成烟酸及铵盐，同时为控制成品中Cl^-/SO^4-等阴离子的残留(控制值为＜200ppm)需利用大量(1：5-8w/w)的纯化水进行洗涤，该部分洗涤水在洗涤铵盐的同时会溶解部分产品，因此需对洗涤液中的产品进行浓缩回收，浓缩单元产生了巨大的能耗同时产生了大量的废水，形成的铵盐中因含有有机物，无法成为高品质的副产盐，甚至因为有机物超标被认定为危险固废带来巨大的处理成本。

本发明的重组工程菌PST2-NL通过高密度发酵制备大量菌体，用于生物催化反应，降低了工艺的生产成本。本发明以重组工程菌生物催化得到的含有烟酸铵的反应液为原料，直接浓缩冷却结晶后将烟酸铵进行热分解得到烟酸，分解产生的氨制备成氨水或进一步制成液氨回用至前道工艺。无需进行酸中和，节省原材料的使用成本，不产生相应的盐，因此无需进行水洗涤，大大降低了废水及废固的产生量。本发明将母液回收套用，吸收分解产生的氨，制成液氨用于3-甲基吡啶氨氧化反应，提高全产业链的原子经济性，实现了产品的绿色合成。

本发明的有益效果主要体现在：

(1)本发明成功构建了产腈水解酶的大肠杆菌重组工程菌，体外诱导其高效表达腈水解酶，并实现其高密度发酵，降低了生产成本；

(2)本发明将构建的重组工程菌用于生物催化生产烟酸铵，结果表明，该菌可有效生物催化3-氰基吡啶生产烟酸铵，转化率和选择性可达到100％。该菌株对底物3-氰基吡啶的耐受性显著增加，相应的烟酸产量显著提高。

(3)以烟酸铵为原料，经浓缩降温结晶析出烟酸铵，烟酸铵干燥脱氨后得到产品烟酸，产物得率99.8％以上。母液回收套用，分解产生的氨，吸收制备氨水，制成液氨用于3-甲基吡啶氨氧化反应生成烟酸铵，提高全产业链的原子经济性，实现烟酸的绿色合成。

附图说明

图1是本发明重组工程菌E.coli PST2-NL构建策略图；

图2是本发明母液回收套用至浓缩工段产生的氨用于3-甲基吡啶氨氧化制备3-氰基吡啶的绿色合成路线。

具体实施方式

下面通过具体实施例，对本发明的技术方案作进一步的具体说明。应当理解，本发明的实施并不局限于下面的实施例，对本发明所做的任何形式上的变通和/或改变都将落入本发明保护范围。

在本发明中，若非特指，所有的份、百分比均为重量单位，所采用的设备和原料等均可从市场购得或是本领域常用的。下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。

实施例1:重组工程菌E.coli PST2-NL构建

本发明所述的重组工程菌E.coli PST2-NL构建策略图如图1所示，具体过程如下：

1、重组腈水解酶质粒的构建：简称pET21a(+)-PST2-NL

1)分别酶切质粒载体pET21a(+)和腈水解酶合成基因并进行胶纯化

对密码子优化的来源于极小单胞菌属(Pusillimonas sp.T2)的腈水解酶合成基因(Genebank ID：WP_093971852，简称PST2-NL)和pET21a(+)进行双酶切，行成粘性末端而用于后续的连接反应。限制性内切酶购自New England Biolabs(NEB)。

DNA	100ng
		10×2.1 Buffer	1.0μL
NdeI	8.0U
		HindIII	8.0U
加ddH2O	总体积10.0μL

配制上述酶切反应，在37℃反应30～60分钟，加入1.0μl的10×DNA LoadingBuffer进行跑胶，然后切胶并使用天根生化科技的胶纯化试剂盒进行纯化，测定纯化DNA的浓度。

2)腈水解酶基因PST2-NL与载体pET21a(+)的连接、转化和测序确认

配制下述连接反应液，在25℃连接2.0小时。取4.0μL上述连接反应液与冰上融化的DH5α感受态细胞混合，冰上放置10分钟，42℃热激60秒，冰浴2分钟后加入1.0mL的LB液体培养基37℃摇床培养1.0小时，取150μL菌液涂平板，37℃培养箱培养12-14小时得到单菌落。分别接种4～6个单菌落到3.0～5.0mL的LB液体培养基(含0.1g/L氨苄青霉素)中，37℃摇床培养过夜，送样测序确认(南京擎科生物)。

酶切的载体	10ng
		酶切的目的片段	10ng
5×T4 Ligase Buffer	2.0μL
		T4 DNA Ligase(NEB，1U/μl)	0.8μL
加ddH2O	总体积10.0μL

2、重组腈水解酶菌株的构建和酶的诱导表达

取上述测序确认的菌液，使用天根生化科技的质粒抽提试剂盒提取重组质粒。取1.0μL重组质粒，热激转化入BL21(DE3)感受态细胞(方法见：1(2))，取100μL菌液涂平板，37℃培养12～14小时得到重组腈水解酶菌株(单菌落)。将上述单菌落接种在小体积的LB液体培养基(含0.1g/L氨苄青霉素)中，30～37℃过夜培养后，以5-10％的接种量接入相应体积的LB液体培养基(含0.1g/L氨苄青霉素)中，继续在30～37℃培养直至OD600达到1.0。加入终浓度为0.1～0.2mM的IPTG，在25～30℃下诱导表达3～5小时后离心收集细胞。

实施例2：重组工程菌E.coli PST2-NL的高密度发酵制备菌体

取重组工程菌E.coli PST2-NL甘油管，于含0.1g/L氨苄青霉素的LB固体培养基上划线，37℃倒置过夜培养15h，于平板上挑取4个单菌落，接种于含0.1g/L氨苄青霉素的200ml LB液体培养基中，37℃，160rpm/min震荡培养10小时OD600＝5.10时移种，培养液以5％体积比接种到含有0.1g/L氨苄青霉素的发酵培养基中；通过调节搅拌转速、通气量的方式，控制发酵全程DO在30％左右；通过补加氨水的方式来控制pH在7.0左右。发酵培养至11h左右，当DO出现明显回升时，迅速降低搅拌转速，防止DO过高造成菌体死亡；同时开始流加补料，补料速度为0-0.5h：33ml/h，0.5-1.5h：67ml/h，1.5-放料：100ml/h。培养至OD600＝30-50时加入终浓度为0.2mmol/L的IPTG诱导培养10h，放料时OD600达到122。将发酵液在4℃下4000rpm/min离心10min，收集沉淀，得到湿菌体。

实施例3：生物催化3-氰基吡啶合成烟酸铵，底物为液体熔融态连续进料

将600g水和实施例1中制备的3g湿菌体混合投入到反应釜中，水浴保温30℃，搅拌转速300rpm。将216g 3-氰基吡啶以液体熔融态连续进料至反应釜中，进料时间为4h，用5％氨水将反应过程pH控制在7.90-8.00。用HPLC检测烟酸、烟酰胺和3-氰基吡啶含量。

实施例4：生物催化3-氰基吡啶合成烟酸铵，底物为液体熔融态连续进料

将600g水和实施例1中制备的3g湿菌体混合投入到反应釜中，水浴保温30℃，搅拌转速300rpm。将300g3-氰基吡啶以液体熔融态连续进料至反应釜中，进料时间为6h，用5％氨水将反应过程pH控制在7.90-8.00。用HPLC检测烟酸、烟酰胺和3-氰基吡啶含量。

实施例5：生物催化3-氰基吡啶合成烟酸铵，底物为液体熔融态连续进料

将600g水和实施例1中制备的3g湿菌体混合投入到反应釜中，水浴保温30℃，搅拌转速300rpm。将400g 3-氰基吡啶以液体熔融态连续进料至反应釜中，进料时间为10h，用5％氨水将反应过程pH控制在7.90-8.00。用HPLC检测烟酸、烟酰胺和3-氰基吡啶含量。

为了进一步说明本发明的有益效果，选用实施例3，4，5中制备的烟酸产物高效液相色谱法测定其含量，并将检测结果记录在表1内。

表1

批次	烟酸％	烟酰胺％	3-氰基吡啶％	转化率％	选择性％
						实施例3	31.31	0	0	100	100
实施例4	39.42	0	0	100	100
						实施例5	47.30	0	0	100	100

表1中的检测结果表明利用实施例2发酵得到的菌体依据实施例3、4、5进行3-氰基吡啶水解制备烟酸铵实验，底物的转化率可达到100％，同时选择性也达到100％。水解反应中菌体的加量＜0.5％。

实施例6：以烟酸铵为原料合成烟酸

在负压下，将实施例3中初始浓度在31.31％的烟酸铵溶液浓缩至浓度为62％；将浓缩后的烟酸铵溶液投入反应釜中，控制搅拌速度为150rpm，降温梯度为80℃-60℃-40℃-20℃，在20℃温度下实现降温结晶；将完成降温结晶的物料离心，离心速度为4000rpm/min，离心20min；晶体部分进入干燥器中干燥，控制干燥器内的温度为120℃，干燥2h，得到烟酸产物。母液回收套用至烟酸铵溶液的浓缩工段；控制干燥器工作氛围为负压，抽气用水吸收氨，制成液氨用于3-甲基吡啶氨氧化反应生成烟酸铵。

实施例7：以烟酸铵为原料合成烟酸

在负压下，将实施例3中初始浓度在31.31％的烟酸铵溶液浓缩至浓度为62％；将浓缩后的烟酸铵溶液投入反应釜中，控制搅拌速度为150rpm，降温梯度为80℃-60℃-40℃-20℃，在20℃温度下实现降温结晶；将完成降温结晶的物料离心，离心速度为4000rpm/min，离心20min；晶体部分进入干燥器中干燥，控制干燥器内的温度为110℃，干燥3h，得到烟酸产物。母液回收套用至烟酸铵溶液的浓缩工段；控制干燥器工作氛围为负压，抽气用水吸收氨，制成液氨用于3-甲基吡啶氨氧化反应生成烟酸铵。

实施例8：以烟酸铵为原料合成烟酸

在负压下，将实施例3中初始浓度在31.31％的烟酸铵溶液浓缩至浓度为62％；将浓缩后的烟酸铵溶液投入反应釜中，控制搅拌速度为150rpm，降温梯度为80℃-60℃-40℃-20℃，在20℃温度下实现降温结晶；将完成降温结晶的物料离心，离心速度为4000rpm/min，离心20min；晶体部分进入干燥器中干燥，控制干燥器内的温度为100℃，干燥4h，得到烟酸产物。母液回收套用至烟酸铵溶液的浓缩工段；控制干燥器工作氛围为负压，抽气用水吸收氨，制成液氨用于3-甲基吡啶氨氧化反应生成烟酸铵。

为了进一步说明本发明的有益效果，选用实施例6-8中制备的烟酸产物分别用高氯酸电位滴定法、中和滴定法、高效液相色谱法测定其含量、氨氮仪测定其铵根含量，测定其干燥失重，并将检测结果记录在表2内。

表2

表2中的检测结果表明3-氰基吡啶经酶催化水解得到烟酸铵水溶液，再经浓缩降温结晶离心得到烟酸铵湿品，采用干燥热分解的方式得到的烟酸成品含量＞99.5％。可满足饲料、食品、医药等各个级别产品的含量要求。

本发明人对各菌种产业化可行性进行了对比，依据相关文献公开数据整理汇总，结果见表3和表4。

表3各菌种产业化可行性对比

表4

根据表3和表4的数据可知，除R.rhodochrousJ1菌株底物浓度达到147g/L，具备一定的产业化基础外其余各菌株虽然转化率水平较高，但其催化水合的底物浓度均较低，表明菌株对于底物及产物的耐受性有限，对于底物或产物的低耐受度成为菌株应用于生产的巨大障碍。同时各菌株的转化效率均在0.1-6.6g·h^-1·g(细胞)^-1，较低的生产效率同样阻碍着菌株的产业化应用。

本发明构建的腈水合酶重组工程菌通过高密度发酵制备大量菌体用于生物催化反应，底物投料浓度在250-420g/L，转化率可达到100％，转化效率为23.4-37.4g(烟酸)·h^-1·g(细胞)^-1，相较其他工程菌底物浓度和转化效率都有明显提升。

本发明构建的工程菌选择性达到100％。利用该菌株进行水解反应得到的烟酸铵水溶液无需进行副产物的分离，仅需通过膜过滤、浓缩、结晶及干燥分解等单元即可得到高纯度的烟酸产品。满足饲料、食品、医药各等级产品质量需求。工艺路线简单，生产效率高，三废产生量少，大大降低了生产成本。

本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其它实施例的不同之处，各个实施例之间相同或相似部分互相参见即可。对于实施例公开的装置而言，由于其与实施例公开的方法相对应，所以描述的比较简单，相关之处参见方法部分说明即可。

以上对本发明所提供的一种腈水解酶、其构建的工程菌及其在烟酸绿色合成中的应用进行了详细介绍。本文中应用了具体个例对本发明的原理及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。

序列表

<110> 兄弟科技股份有限公司

<120> 一种腈水解酶、其构建的工程菌及其在烟酸绿色合成中的应用

<130> 20210206

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1113

<212> DNA

<213> 人工合成(腈水解酶)

<400> 1

atggtgacct acaccaacaa gttcaaagcg gcgaccgtgc aagcggagcc ggtttggttt 60

gatgcggcgg cgaccgtgga gaagaccatc ggtctgatta aagaagcggc ggataacaac 120

gcgcagatca ttgcgttccc ggaagtgttt attccgggct acccgtatca catctggctg 180

gacagcccgt ttgcgggtat gggcaagttt gcgacccgtt atcacgaaca gagcctgccg 240

atcgatagcc cgctgatcac ccgtattcaa gaggcggcgg aaaacaacaa catctgcgtg 300

gttattggtt tcagcgaacg tgacggtggc agcctgtaca tgagccaact gatcattgat 360

gagaagggcg aaattgtgag ccaccgtcgt aagctgaaac cgacccacgt ggagcgtacc 420

gtttatggca aaggtgacgg cagcgatatc gcggtgcacg acatgccgcg gggtcgtgtt 480

ggcgcgctga actgctggga gcacttccag accccgacca aatacgcgat gtatgcgatg 540

cacgaacaaa tccacattgc ggagtggccg ggtatgagcc tgtaccagcc ggaagtgttc 600

gcgtttagca gcgaagcgca gctggttgcg acccaaatgt atgcgatgga gggtcagacc 660

tttgttctgt gcagcaccca agtggttggc aaggcggcgc tggagttctt ttgcgagaac 720

gaaatgcacg aaaaactgat tggttacggt ggcggtttcg cgcagatttt cggtccggat 780

ggtcgtccgc tggcggaacg tatgccggcg gatggcgagg gtatcctgta cgcggaaatt 840

gatctggcgc agatcaccat ggcgaagcaa gcggcggacc cggtgggtca ctatagccgt 900

ccggatgttt tcagcctgca atttaacaac caggcgcaaa gcccggtgaa gcgtctgaaa 960

gatatcggca aacacattga gagcgaggaa gtttttagca gcgtgagcca ggttaccggt 1020

ccgggtctga cctatagcct ggaagcgccg ggtctgagcc tgcagaagcc gctggtgcaa 1080

cacgagcgtg ttaacggcca caaagaaagc taa 1113

<210> 2

<211> 370

<212> PRT

<213> 人工合成(腈水解酶)

<400> 2

Met Val Thr Tyr Thr Asn Lys Phe Lys Ala Ala Thr Val Gln Ala Glu

1 5 10 15

Pro Val Trp Phe Asp Ala Ala Ala Thr Val Glu Lys Thr Ile Gly Leu

20 25 30

Ile Lys Glu Ala Ala Asp Asn Asn Ala Gln Ile Ile Ala Phe Pro Glu

35 40 45

Val Phe Ile Pro Gly Tyr Pro Tyr His Ile Trp Leu Asp Ser Pro Phe

50 55 60

Ala Gly Met Gly Lys Phe Ala Thr Arg Tyr His Glu Gln Ser Leu Pro

65 70 75 80

Ile Asp Ser Pro Leu Ile Thr Arg Ile Gln Glu Ala Ala Glu Asn Asn

85 90 95

Asn Ile Cys Val Val Ile Gly Phe Ser Glu Arg Asp Gly Gly Ser Leu

100 105 110

Tyr Met Ser Gln Leu Ile Ile Asp Glu Lys Gly Glu Ile Val Ser His

115 120 125

Arg Arg Lys Leu Lys Pro Thr His Val Glu Arg Thr Val Tyr Gly Lys

130 135 140

Gly Asp Gly Ser Asp Ile Ala Val His Asp Met Pro Arg Gly Arg Val

145 150 155 160

Gly Ala Leu Asn Cys Trp Glu His Phe Gln Thr Pro Thr Lys Tyr Ala

165 170 175

Met Tyr Ala Met His Glu Gln Ile His Ile Ala Glu Trp Pro Gly Met

180 185 190

Ser Leu Tyr Gln Pro Glu Val Phe Ala Phe Ser Ser Glu Ala Gln Leu

195 200 205

Val Ala Thr Gln Met Tyr Ala Met Glu Gly Gln Thr Phe Val Leu Cys

210 215 220

Ser Thr Gln Val Val Gly Lys Ala Ala Leu Glu Phe Phe Cys Glu Asn

225 230 235 240

Glu Met His Glu Lys Leu Ile Gly Tyr Gly Gly Gly Phe Ala Gln Ile

245 250 255

Phe Gly Pro Asp Gly Arg Pro Leu Ala Glu Arg Met Pro Ala Asp Gly

260 265 270

Glu Gly Ile Leu Tyr Ala Glu Ile Asp Leu Ala Gln Ile Thr Met Ala

275 280 285

Lys Gln Ala Ala Asp Pro Val Gly His Tyr Ser Arg Pro Asp Val Phe

290 295 300

Ser Leu Gln Phe Asn Asn Gln Ala Gln Ser Pro Val Lys Arg Leu Lys

305 310 315 320

Asp Ile Gly Lys His Ile Glu Ser Glu Glu Val Phe Ser Ser Val Ser

325 330 335

Gln Val Thr Gly Pro Gly Leu Thr Tyr Ser Leu Glu Ala Pro Gly Leu

340 345 350

Ser Leu Gln Lys Pro Leu Val Gln His Glu Arg Val Asn Gly His Lys

355 360 365

Glu Ser

370

Claims

1.一种腈水解酶，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

2.一种编码如权利要求1所述的腈水解酶的编码基因，其特征在于，所述编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

3.一种由权利要求1所述的腈水解酶基因构建的大肠杆菌重组工程菌，命名为大肠杆菌E.coli PST2-NL。

4.一种权利要求3所述大肠杆菌E.coli PST2-NL的构建方法，其特征在于构建步骤如下：

1)腈水解酶基因PST2-NL的基因合成：以极小单胞菌属(Pusillimonas sp.T2)中腈水解酶基因的DNA序列信息，全基因合成腈水解酶基因PST2-NL；

5.一种大肠杆菌E.coli PST2-NL的高密度发酵方法，其特征在于该方法步骤如下：

3)通过补加氨水的方式来控制pH在7.0±0.2；

4)当DO出现明显回升时，开始流加补料，培养至OD₆₀₀＝30-50时加入终浓度为0.2mmol/L的IPTG诱导培养8-12h，菌体浓度达到100-140g/L，放料OD₆₀₀达到100-140，发酵液离心后得到湿菌体。

6.根据权利要求5所述的高密度发酵方法，其特征在于发酵和补料培养采用的培养基为：

7.一种权利要求3所述的大肠杆菌E.coli PST2-NL在烟酸铵生产中的应用，其特征在于：

以重组工程菌经诱导表达后获得的湿菌体为酶源，以3-氰基吡啶为反应底物，底物浓度控制浓度在250-420g/L，体系pH控制在7.90-8.00，在30-40℃条件下反应制备烟酸铵。

8.根据权利要求7所述的大肠杆菌E.coli PST2-NL在烟酸铵生产中的应用，其特征在于该应用包括如下步骤：

2)所述的反应液经浓缩降温结晶形成烟酸铵晶体，离心得到晶体和母液，晶体进入干燥器中干燥脱氨，干燥温度控制在80-150℃，干燥时间2-5h，得到烟酸。

9.根据权利要求7所述的大肠杆菌E.coli PST2-NL在烟酸铵生产中的应用，其特征在于：将离心得到的母液回收套用至浓缩工段，吸收分解产生的氨，制成液氨用于3-甲基吡啶氨氧化制备3-氰基吡啶。