CN117844874A - 一种利用单加氧酶催化合成麦芽糖酸的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种利用单加氧酶催化合成麦芽糖酸的方法，该方法使用能够表达单加氧酶的菌种,催化醛基的氧化，利用生物酶催化麦芽糖转化为麦芽糖酸。该方法经济可靠，安全可控，简化生产工艺和降低成本。
Description
技术领域
本发明属于生物催化转化技术领域，涉及一种利用单加氧酶进行氧化的方法,具体涉及一种以麦芽糖为底物，以单加氧酶为生物催化剂，实现合成麦芽糖酸的高效催化的工艺方法。
背景技术
麦芽糖酸作为一种在食品，保健品，化妆品领域应用广泛的原料，一直有着很高的市场热度。
关于麦芽糖酸的制备，在传统工艺中，往往以麦芽糖的原料，通过化学合成法得到麦芽糖酸，期间需要用到强腐蚀性、易爆炸的危险化学品次氯酸作为辅剂，这导致该反应有极高的安全风险，并且产生较大的环境污染隐患。
为了解决上述问题，在现有的工艺中尝试使用生物合成法来生产麦芽糖酸，该方法具有非常广阔的前景，例如：用假单孢菌进行发酵生产麦芽糖酸。然而，经研究发现，细菌发酵法存在产物浓度不高，发酵效率不稳定，产物生物质残留过大等等缺点。
故而，发展一种安全可靠，环保，且能够稳定生产的麦芽糖酸的制备方法显得极为迫切。
发明内容
本发明旨在克服上述缺陷，提供一种利用单加氧酶进行醛基氧化的方法，该方法使用能够表达单加氧酶的菌种,催化醛基的氧化，利用生物酶催化麦芽糖转化为麦芽糖酸。该方法经济可靠，安全可控，简化生产工艺和降低成本。
为达到上述发明目的，本发明采用的技术方案是：
本发明提供了一种利用单加氧酶催化合成麦芽糖酸的方法，其特征在于：以麦芽糖为底物，以单加氧酶为催化剂，催化醛基向羧基的转化；
具体反应方程式如下所示：
上述单加氧酶的制备方法如下所示：
S1.克隆单加氧酶基因，构建酶表达的载体，并转移到大肠杆菌中，获得过表达单加氧酶的工程菌；
S2.对S1的工程菌进行诱导表达后获得催化用途的酶溶液；
其中，单加氧酶基因来源于牛、大鼠或小鼠的基因片段。
进一步地，本发明提供的一种利用单加氧酶催化合成麦芽糖酸的方法，其特征还在于：
上述步骤S1的具体过程如下:
将单加氧酶基因两端加上Ndel和Xohl酶切位点，通过双酶切、连接，基因片段插入表达载体pET22b相应的酶切位点中，置于T7启动子的控制之下构建质粒,其后将其转化到DE3中。
进一步地，本发明提供的一种利用单加氧酶催化合成麦芽糖酸的方法，其特征还在于：
上述步骤S2的具体过程如下:
取S1所得工程菌于LB液体培养基中，培养过夜后，接种至LB液体培养基中，培养至0D600为0.6-0.8时，加入诱导剂IPTG,诱导表达后，菌液离心弃上清，沉淀经洗涤、悬浮、超声、离心，取上清即为酶溶液。
进一步地，本发明提供的一种利用单加氧酶催化合成麦芽糖酸的方法，其特征还在于：
上述单加氧酶，具有如SEQ ID NO：1所示的基因序列。
进一步地，本发明提供的一种利用单加氧酶催化合成麦芽糖酸的方法，其特征还在于：
上述单加氧酶，具有如SEQ ID NO：2所示的基因序列。
进一步地，本发明提供的一种利用单加氧酶催化合成麦芽糖酸的方法，其特征还在于：
上述单加氧酶，具有如SEQ ID NO：3所示的基因序列。
进一步地，本发明提供的一种利用单加氧酶催化合成麦芽糖酸的方法，其特征还在于：
麦芽糖的反应浓度为2-10g/L；
单加氧酶的酶蛋白浓度为2-20mg/mL。
进一步地，本发明提供的一种利用单加氧酶催化合成麦芽糖酸的方法，其特征还在于：
转化反应温度为30-40℃,反应时间为12-48h。
进一步地，本发明提供的一种利用单加氧酶催化合成麦芽糖酸的方法，其特征还在于：
转化反应采用水相体系，酶溶液在pH 6-8的缓冲溶液中进行生物转化。
此外，本发明还提供了一种单加氧酶，用于在化学反应中起到催化氧化的用途，其特征在于：
具有如SEQ ID NO：1、或SEQ ID NO：2、或SEQ ID NO：3所示的基因序列。
具体实施方式
实施例1
1.1.表达单加氧酶基因的大肠杆菌的构建
所有以下质粒均购买于“addgene.org”。分别将来源于爪蟾(pSP64TXAR1-myc)(SEQ ID NO：5)，大鼠(pcDNA5FRT/TO-p97-RH-mycStrep，BGH-rev5'-TAGAAGGCACAGTCGAGG-3')(SEQ ID NO：6)，小鼠(pGEX PLCg1(C)-SH2)(SEQ ID NO：7)两端加上Ndel和Xohl酶切位点，通过双酶切、连接，基因片段插入表达载体pET22b相应的酶切位点中，置于T7启动子的控制之下，构建质粒pET22b-pSP64T XAR1-myc,pET22b-NM_019363,pET22b-AAH26132。分别将其转化到E.coliBL21(DE3)(SEQ ID NO：4)中，即得到分别表达3种氮加氧酶基因的工程菌E.coliBL21(DE3)/pET22b-pSP64T XAR1-myc(SEQ ID NO：2),E.coliBL21(DE3)/pET22b-pcDNA5FRT/TO-p97-RH-mycStrep(SEQ ID NO：1),E.coliBL21(DE3)/pET22b-pGEX PLCg1(C)-SH2(SEQ ID NO：3)。
1.2.大肠杆菌工程菌发酵产酶
分别挑取工程菌E.coliBL21(DE3)/pET22b-pSP64T XAR1-myc,E.coliBL21(DE3)/pET22b-pcDNA5FRT/TO-p97-RH-mycStrep,E.coliBL21(DE3)/pET22b-pGEX PLCg1(C)-SH2至含100μg/mL氨苇青霉素的LB液体培养基,37℃,200rpm培养过夜后，按1％(v/v)接种量接种至LB液体培养基中(含100μg/mL氨苇青霉素),37℃、200rpm培养至0D600为0.60.8时(约3h),加入诱导剂IPTG(1mM),诱导表达6h后，菌液于8000rpm,4℃离心5min,弃上清，沉淀备用。
1.3.表达单加氧酶的大肠杆菌粗酶液的制备
取实施例2中的菌体沉淀，用磷酸钾缓冲液(100mmol/L,pH7.2)洗涤两次,洗涤后的沉淀悬浮于磷酸钾缓冲液中，超声处理细胞(130W,超声2s,间歇2s,共10min),破碎后的液体于8000rpm,4c离心20min,取上清即为酶溶液(50mg/L)。
实施例2
实施例2.1.水相体系中2g/L麦芽糖为底物酶法催化合成麦芽糖酸
在反应体系中分别加入三种单加氧酶的适量粗酶液(10mg/ml蛋白量)，随后在三种体系中依次加入0.04g麦芽糖及0.1mol/L磷酸缓冲液(pH6.8)至终体积20ml,混合均匀后置于35℃加热搅拌器中，200rpm,搅拌反应24h。
反应结束后，取1ml反应液，12000rpm离心2min,取上清液过滤膜后用高效液相色谱检测底物消耗，HPLC检测产物生成。得到三种酶的转化率分别为65％、85％、57％。
HPLC法色谱分析条件如下，以下实施例中底物消耗的检测方法相同：
色谱柱：C18柱；流动相为乙腈：水(70：30，V:V)；流速：1mL/min；柱温：30℃；检测器：CAD
1H NMR(400MHz,Deuterium Oxide)δ5.22(d,J＝4.0Hz,1H),5.00(d,J＝3.8Hz,2H),4.32(s,2H),4.13–3.92(m,3H),3.82–3.52(m,8H),3.43(q,J＝4.0Hz,2H),3.28(tt,J＝9.5,4.9Hz,3H).
13C NMR(101MHz,Deuterium Oxide)δ173.34,99.86,81.45,80.72,75.42,72.52,71.79,71.37,69.94,69.18,61.95,60.33
MS:[M+Na]＝381.10005
实施例2.2.水相体系中5g/L麦芽糖为底物酶法催化合成麦芽糖酸
在反应体系中分别加入三种单加氧酶的适量粗酶液(10mg/ml蛋白量)，随后在三种体系中依次加入0.1g麦芽糖及0.1mol/L磷酸缓冲液(pH6.8)至终体积20ml,混合均匀后置于35℃加热搅拌器中，200rpm,搅拌反应24h。反应结束后，取1ml反应液，12000rpm离心2min,取上清液过滤膜后用高效液相色谱检测底物消耗，HPLC检测产物生成。得到三种酶的转化率分别为65％、88％、61％。
实施例2.3.水相体系中10g/L麦芽糖为底物酶法催化合成麦芽糖酸
在反应体系中分别加入三种单加氧酶的适量粗酶液(10mg/ml蛋白量)，随后在三种体系中依次加入0.2g麦芽糖及0.1mol/L磷酸缓冲液(pH6.8)至终体积20ml,混合均匀后置于35℃加热搅拌器中，200rpm,搅拌反应24h。反应结束后，取1ml反应液，12000rpm离心2min,取上清液过滤膜后用高效液相色谱检测底物消耗，HPLC检测产物生成。得到三种酶的转化率分别为55％、75％、48％。
实施例2.4.水相体系中5g/L麦芽糖为底物酶法催化合成麦芽糖酸
在反应体系中分别加入三种单加氧酶的适量粗酶液(2mg/ml蛋白量)，随后在三种体系中依次加入0.1g麦芽糖及0.1mol/L磷酸缓冲液(pH6.8)至终体积20ml,混合均匀后置于35℃加热搅拌器中，200rpm,搅拌反应24h。反应结束后，取1ml反应液，12000rpm离心2min,取上清液过滤膜后用高效液相色谱检测底物消耗，HPLC检测产物生成。得到三种酶的转化率分别为54％、70％、42％。
实施例2.5.水相体系中5g/L麦芽糖为底物酶法催化合成麦芽糖酸
在反应体系中分别加入三种单加氧酶的适量粗酶液(20mg/ml蛋白量)，随后在三种体系中依次加入0.1g麦芽糖及0.1mol/L磷酸缓冲液(pH6.8)至终体积20ml,混合均匀后置于35℃加热搅拌器中，200rpm,搅拌反应24h。反应结束后，取1ml反应液，12000rpm离心2min,取上清液过滤膜后用高效液相色谱检测底物消耗，HPLC检测产物生成。得到三种酶的转化率分别为65％、87％、66％。
实施例2.6.水相体系中5g/L麦芽糖为底物酶法催化合成麦芽糖酸
在反应体系中分别加入三种单加氧酶的适量粗酶液(10mg/ml蛋白量)，随后在三种体系中依次加入0.1g麦芽糖及0.1mol/L磷酸缓冲液(pH6.8)至终体积20ml,混合均匀后置于30℃加热搅拌器中，200rpm,搅拌反应24h。反应结束后，取1ml反应液，12000rpm离心2min,取上清液过滤膜后用高效液相色谱检测底物消耗，HPLC检测产物生成。得到三种酶的转化率分别为30％、61％、48％。
实施例2.7.水相体系中5g/L麦芽糖为底物酶法催化合成麦芽糖酸
在反应体系中分别加入三种单加氧酶的适量粗酶液(10mg/ml蛋白量)，随后在三种体系中依次加入0.1g麦芽糖及0.1mol/L磷酸缓冲液(pH6.8)至终体积20ml,混合均匀后置于40℃加热搅拌器中，200rpm,搅拌反应24h。反应结束后，取1ml反应液，12000rpm离心2min,取上清液过滤膜后用高效液相色谱检测底物消耗，HPLC检测产物生成。得到三种酶的转化率分别为58％、76％、53％。
实施例2.8.水相体系中5g/L麦芽糖为底物酶法催化合成麦芽糖酸
在反应体系中分别加入三种单加氧酶的适量粗酶液(10mg/ml蛋白量)，随后在三种体系中依次加入0.1g麦芽糖及0.1mol/L磷酸缓冲液(pH6.8)至终体积20ml,混合均匀后置于35℃加热搅拌器中，200rpm,搅拌反应12h。反应结束后，取1ml反应液，12000rpm离心2min,取上清液过滤膜后用高效液相色谱检测底物消耗，HPLC检测产物生成。得到三种酶的转化率分别为61％、70％、39％。
实施例2.9.水相体系中5g/L麦芽糖为底物酶法催化合成麦芽糖酸
在反应体系中分别加入三种单加氧酶的适量粗酶液(10mg/ml蛋白量)，随后在三种体系中依次加入0.1g麦芽糖及0.1mol/L磷酸缓冲液(pH6.8)至终体积20ml,混合均匀后置于35℃加热搅拌器中，200rpm,搅拌反应48h。反应结束后，取1ml反应液，12000rpm离心2min,取上清液过滤膜后用高效液相色谱检测底物消耗，HPLC检测产物生成。得到三种酶的转化率分别为65％、86％、61％。
实施例2.10.水相体系中10g/L麦芽糖为底物酶法催化合成麦芽糖酸
在反应体系中分别加入三种单加氧酶的适量粗酶液(10mg/ml蛋白量)，随后在三种体系中依次加入0.2g麦芽糖及0.1mol/L磷酸缓冲液(pH6.8)至终体积20ml,混合均匀后置于35℃加热搅拌器中，200rpm,搅拌反应24h。反应结束后，取1ml反应液，12000rpm离心2min,取上清液过滤膜后用高效液相色谱检测底物消耗，HPLC检测产物生成。得到三种酶的转化率分别为55％、75％、48％。
实施例2.11.水相体系中5g/L麦芽糖为底物酶法催化合成麦芽糖酸
在反应体系中分别加入三种单加氧酶的适量粗酶液(10mg/ml蛋白量)，随后在三种体系中依次加入0.1g麦芽糖及0.1mol/L磷酸缓冲液(pH6.0)至终体积20ml,混合均匀后置于35℃加热搅拌器中，200rpm,搅拌反应24h。反应结束后，取1ml反应液，12000rpm离心2min,取上清液过滤膜后用高效液相色谱检测底物消耗，HPLC检测产物生成。得到三种酶的转化率分别为15％、45％、31％。
实施例2.12.水相体系中5g/L麦芽糖为底物酶法催化合成麦芽糖酸
在反应体系中分别加入三种单加氧酶的适量粗酶液(10mg/ml蛋白量)，随后在三种体系中依次加入0.1g麦芽糖及0.1mol/L磷酸缓冲液(pH8.0)至终体积20ml,混合均匀后置于35℃加热搅拌器中，200rpm,搅拌反应24h。反应结束后，取1ml反应液，12000rpm离心2min,取上清液过滤膜后用高效液相色谱检测底物消耗，HPLC检测产物生成。得到三种酶的转化率分别为21％、66％、41％。
实施例2.13.水相体系中5g/L麦芽糖为底物酶法催化合成麦芽糖酸
在反应体系中加入Peroxidase(POD)10108090001(10mg/mL)约1mL，随后再依次加入0.1g麦芽糖及0.1mol/L磷酸缓冲液(pH6.8)至终体积20ml,混合均匀后置于35℃加热搅拌器中，200rpm,搅拌反应10，24，48h。取中间样本反应液，12000rpm离心2min,取上清液过滤膜后用高效液相色谱检测底物消耗，HPLC检测不到产物生成。
Claims (10)
1.一种利用单加氧酶催化合成麦芽糖酸的方法，其特征在于：以麦芽糖为底物，以单加氧酶为催化剂，催化醛基向羧基的转化；
所述单加氧酶的制备方法如下所示：
S1.克隆单加氧酶基因，构建酶表达的载体，并转移到大肠杆菌中，获得过表达单加氧酶的工程菌；
S2.对S1的工程菌进行诱导表达后获得催化用途的酶溶液；
其中，单加氧酶基因来源于牛、大鼠或小鼠的基因片段。
2.如权利要求1所述的一种利用单加氧酶催化合成麦芽糖酸的方法，其特征在于：
所述步骤S1的具体过程如下:
将单加氧酶基因两端加上Ndel和Xohl酶切位点，通过双酶切、连接，基因片段插入表达载体pET22b相应的酶切位点中，置于T7启动子的控制之下构建质粒,其后将其转化到DE3中。
3.如权利要求1所述的一种利用单加氧酶催化合成麦芽糖酸的方法，其特征在于：
所述步骤S2的具体过程如下:
取S1所得工程菌于LB液体培养基中，培养过夜后，接种至LB液体培养基中，培养至0D600为0.6-0.8时，加入诱导剂IPTG,诱导表达后，菌液离心弃上清，沉淀经洗涤、悬浮、超声、离心，取上清即为酶溶液。
4.如权利要求1所述的一种利用单加氧酶催化合成麦芽糖酸的方法，其特征在于：
所述单加氧酶，具有如SEQ ID NO：1所示的基因序列。
5.如权利要求1所述的一种利用单加氧酶催化合成麦芽糖酸的方法，其特征在于：
所述单加氧酶，具有如SEQ ID NO：2所示的基因序列。
6.如权利要求1所述的一种利用单加氧酶催化合成麦芽糖酸的方法，其特征在于：
所述单加氧酶，具有如SEQ ID NO：3所示的基因序列。
7.如权利要求1所述的一种利用单加氧酶催化合成麦芽糖酸的方法，其特征在于：
麦芽糖的反应浓度为2-10g/L；
单加氧酶的酶蛋白浓度为2-20mg/mL。
8.如权利要求1所述的一种利用单加氧酶催化合成麦芽糖酸的方法，其特征在于：
转化反应温度为30-40℃,反应时间为12-48h。
9.如权利要求1所述的一种利用单加氧酶催化合成麦芽糖酸的方法，其特征在于：
转化反应采用水相体系，酶溶液在pH 6-8的缓冲溶液中进行生物转化。
10.一种单加氧酶，用于在化学反应中起到催化氧化的用途，其特征在于：
具有如SEQ ID NO：1、或SEQ ID NO：2、或SEQ ID NO：3所示的基因序列。
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