CN108060186A - 一种对硝基苄醇丙二酸单酯的生物制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种通过双酶催化制备对硝基苄醇丙二酸单酯的方法,包括如下步骤:以2‑氰基乙酸‑(4‑硝基苯基)甲酯为底物,用粪产碱杆菌来源的腈水解酶和粪产碱杆菌来源的酰胺酶进行联合催化而得。本发明方法的产物收率高,副产物少,反应条件温和,且环境污染小,适用于工业化生产。
Description
技术领域
本发明属于生物催化技术领域,具体地说,涉及通过腈水解酶与酰胺酶的联合催化来制备对硝基苄醇丙二酸单酯的方法。
背景技术
式I所示化合物对硝基苄醇丙二酸单酯(或称对硝基苄醇丙二酸单酸酯)是一种多用途的药物中间体,比如是制备美罗培南的重要原料,其英文名为Mono-4-nitrobenzylMalonate,CAS号为77359-11-6,具有较高的市场需求量和广泛的用途。
对硝基苄醇丙二酸单酯的制备方法主要是化学合成法。化学合成方法比如是以丙二酸和对硝基苄醇为原料,经过酯化、碱酸调和精制等步骤制得(参见发明专利US5087734)。然而,化学合成方法能耗大,后处理程序复杂,产物纯度低,易造成环境污染。生物酶催化法具有反应条件温和、催化效率高、环境污染少等突出优点,越来越引起人们的重视。目前的生物酶催化法制备路线是以对硝基苄醇、丙二酸或丙二酸盐为底物,在脂肪酶的催化作用下形成(参见发明专利CN201310454873.5)。但是该方法容易产生副产物丙二酸二对硝基苄酯,降低了产物的纯度。因此,需要进一步研发一种更为绿色、高效、专一性强的酶催化法。
腈水解酶(nitrilase)是生物化工领域中一种重要的酶催化剂,它能直接将腈类化合物中的氰基直接转化为羧基进而获得羧酸。腈水解酶具有很强的底物特异性,对于不同的底物,其催化效率和立体选择性等性能差异很大。受限于底物的结构特异性,对于给定的某一底物,不同的腈水解酶在活性和选择性等方面差异很大。发明人研究发现,当腈水解酶催化式II所示底物2-氰基乙酸-(4-硝基苯基)甲酯反应时,会显示出较强的腈水合酶活性,得到的主要产物不是式I所示的羧酸化合物,而是式III所示酰胺副产物3-氨基-3-氧代丙酸-(4-硝基苯基)甲酯。由于目的产物即化合物I收率低,该方法不具有经济性。
因此,如何避免式III所示酰胺副产物的产生,提高化合物I的收率,成为腈水解酶催化法制备对硝基苄醇丙二酸单酯的关键问题。
发明内容
为了克服现有技术的不足,发明人对腈水解酶催化法进行了深入研究,发现腈水解酶与酰胺酶的组合能够解决上述问题,从而开发出一种产物收率显著提高、底物浓度提高的双酶催化工艺路线。
具体而言,本发明提供了一种制备对硝基苄醇丙二酸单酯的方法,包括如下步骤:
以式II所示化合物2-氰基乙酸-(4-硝基苯基)甲酯为底物,用腈水解酶或者其表达微生物、和酰胺酶或者其表达微生物进行联合催化而得。
在一种优选的实施方式中,上述腈水解酶是粪产碱杆菌(Alcaligenes faecalis)来源的腈水解酶。
优选地,上述腈水解酶的氨基酸序列为SEQ ID NO:1。
MSKVAVIQAASIPFDSVSSVEKAAAILQRVAANGATLAVFPEAFLGGYPKGISFGSVIGNRRPEGRALYQMYVEGAVTLGGPELEALADAVTQTGVYTVMGVIEKMGRTLYCTALTLAPGQGVVGIHRKLMPTGQERLVWGFGDGSTLGTVDTPMGRIGKVICWENYMPALRQTMYAQGTELYCTPTADDRPTWASSMIHIAVEGRVFVLSACQAIRLNNYPESFQKEFALPGEFAPDSYVMHGGSMIVSPTGEVLAGPVFDEETELYAELDMDLLKQANLDFDVYGHYSRPDIFSLHVDTRAKQVVKLQTEDSGE(SEQ ID NO:1)。
在一种优选的实施方式中,上述酰胺酶是粪产碱杆菌(Alcaligenes faecalis)来源的酰胺酶。
优选地,上述酰胺酶的氨基酸序列为SEQ ID NO:2。
MLATITELQRALDRGETTSVELTQQALDRIQDESRDGAAAFIEVFAEQALAAAKASDILRAAGLSRSLVEGLPMSVKNLHDIAGYVTLGGSAVLKDAEPAERHATIVERLLRAGAILIGSTNMTEFAFSGLGINPHYGTPRSVWDRDNARIPGGSSSGAGVAVAQGMSVFSIGTDTGGSIRIPSAFNGLTGFKPTAERVPSEGTMPLSRSLDSNGPLAASVECCAIVDSILTDQPYVPVATPALDTLRLAVPKTFVFDGIDETVRAAFDRAITLLREQGAVVEEINLPEFDQLPQINRKGGFVCAEAWSVHRDTLQSKGEQYDPRVASRILRGKDIDCADYIELQDTRQAWISAVESRLERYDAVLMPTVPVVAPRIADLQASDEVYFATNGLVLRNPTLINFLDGCALSLPCHAADEAPVGLMVAAPAYHDEHLLAVGAAIERVLPLRKR(SEQ ID NO:2)。
在一种优选的实施方式中,上述微生物是大肠杆菌。
在一种实施方式中,上述步骤为:以2-氰基乙酸-(4-硝基苯基)甲酯为底物,用表达腈水解酶SEQ ID NO:1的大肠杆菌和表达酰胺酶SEQ ID NO:2的大肠杆菌进行联合催化而得。
优选地,上述大肠杆菌是大肠杆菌BL21(DE3)。
在一种实施方式中,反应体系为pH 3.0~8.0的缓冲溶液体系,其中缓冲溶液为Tris-HCl缓冲液、KH2PO4/K2HPO4缓冲液、或者乙酸钠缓冲液。优选缓冲液是浓度为5~500mM的Tris-HCl缓冲液。优选地,缓冲溶液体系的pH为5~7.5,进一步优选pH 6~7。
在一种优选的实施方式中,上述反应体系中添加有底物助溶剂,所述底物助溶剂选自甲醇、乙醇、二甲基亚砜、乙酸乙酯、丙酮、丁酮、正已烷、正戊烷、环已烷、或者它们两种以上的混合物。
优选地,上述底物助溶剂为甲醇,甲醇的添加量根据底物2-氰基乙酸-(4-硝基苯基)甲酯的加入量而定,使得底物能够溶解于反应体系,比如为缓冲溶液的0.5%~50%(v/v)。
上述反应体系中,底物2-氰基乙酸-(4-硝基苯基)甲酯的加入量为0.5~100g/L,比如为1~90g/L,2~80g/L,3~70g/L,4~65g/L,或者5~60g/L。优选地,底物可以一次性加入反应体系中,也可以分批多次加入或流加。
上述反应体系的反应温度为适合于酶反应的温度,比如为10~50℃,优选为15~40℃,更优选为20~40℃,更优选为25~35℃。
上述腈水解酶、酰胺酶可以呈现酶的形式或者包涵酶的菌体形式。
相应地,就催化体系而言,腈水解酶与酰胺酶的组合可以是酶+酶的形式、酶+菌体的形式、或者菌体+菌体的形式。
本发明的方法用于生产化合物I时,相比单独使用腈水解酶的催化,联合催化体系可以有效地降低酰胺副产物III的产生,并显著提高目的产物化合物I的收率,有利于实现酶法生产对硝基苄醇丙二酸单酯的工业化。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。应理解,以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。
本文中涉及到多种物质的添加量、含量及浓度,其中所述的百分含量,除特别说明外,皆指质量百分含量。
在本文中,术语“式I所示化合物”、“化合物I”和“产物化合物I”表示相同的意义,都是指目的化合物对硝基苄醇丙二酸单酯。类似地,术语“式II所示化合物”、“底物II”和“化合物II”表示相同的意义,都是指作为酶促反应底物的2-氰基乙酸-(4-硝基苯基)甲酯。“式III所示化合物”、“化合物III”和“副产物III”表示相同的意义,都是指腈水解酶表现为腈水合酶活性时所产生的酰胺副产物3-氨基-3-氧代丙酸-(4-硝基苯基)甲酯、或称3-氨基-丙酮酸-(4-硝基苯基)甲酯。
在本文中,术语“联合催化体系”是指腈水解酶与酰胺酶的组合,包括但不限于酶表达菌株的组合。
本发明中使用的腈水解酶SEQ ID NO:1、酰胺酶SEQ ID NO:2结构明确,因此本领域技术人员能够容易地获得其编码基因、包含这些基因的表达盒和质粒、以及包含该质粒的转化体。这些基因、表达盒、质粒、转化体可以通过本领域技术人员所熟知的基因工程构建方式获得。
当作为生物催化剂用于生产化合物I时,本发明的腈水解酶SEQ ID NO:1、酰胺酶SEQ ID NO:2可以呈现酶的形式或者菌体的形式。所述酶的形式包括游离酶、固定化酶,包括纯化酶、粗酶、发酵液、载体固定的酶等。而且这些酶的分离纯化、包括固定化酶制备技术也是本领域技术人员所熟知的。所述菌体的形式包括存活菌体和死亡菌体,包括冻融的菌体、固定化的菌体。
本文中所述的腈水解酶选自但不限于粪产碱杆菌(Alcaligenesfaecalis)来源、拟南芥(Arabidopsis thaliana)来源、恶臭假单胞菌来源(Pseudomonas putia)、弗氏红球菌(Rhodococcuswratislaviensis)来源、荧光假单胞菌来源(Pseudomonas fluorescens)、敏捷食酸菌(Acidovoraxfacilis)来源、产酸克雷伯氏菌(Kelbsiellaocytoca)来源或紫红红球菌(Rhodococcusrhodochrous)来源的腈水解酶。优选腈水解酶是粪产碱杆菌来源,尤其是腈水解酶SEQ ID NO:1。
本文中所述的酰胺酶选自但不限于粪产碱杆菌(Alcaligenesfaecalis)来源、拟南芥(Arabidopsis thaliana)来源、恶臭假单胞菌来源(Pseudomonas putia)、弗氏红球菌(Rhodococcuswratislaviensis)来源、荧光假单胞菌来源(Pseudomonas fluorescens)、敏捷食酸菌(Acidovoraxfacilis)来源、产酸克雷伯氏菌(Kelbsiellaocytoca)来源或紫红红球菌(Rhodococcusrhodochrous)来源的酰胺酶。优选酰胺酶是粪产碱杆菌来源,尤其是酰胺酶SEQ ID NO:2。
实施例
材料和方法
本文中的全基因合成、引物合成及测序皆由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。
如无特别说明,实施例中使用的原料、试剂和标准品均通过商业途径购买。
本文中的分子生物学实验包括质粒构建、酶切、感受态细胞制备、转化等主要参照《分子克隆实验指南》(第三版),J.萨姆布鲁克,D.W.拉塞尔(美)编著,黄培堂等译,科学出版社,北京,2002)进行。可按照试剂盒说明书操作,必要时可以通过简单试验确定具体实验条件。
LA固体培养基:10g/L胰蛋白胨,5g/L酵母提取物,10g/L氯化钠,0.1mg/mlAmpicillin,20g/L琼脂粉,pH7.0,121℃灭菌20min。
LB培养基:10g/L胰蛋白胨、5g/L酵母提取物、10g/L氯化钠,pH7.0,121℃灭菌20min。
反应底物及产物的HPLC测定条件:
色谱柱为InertSustain AQ-C18(4.6x250mm);
缓冲液配制:1ml磷酸加入400ml水中;
流动相为缓冲液:乙腈=50:50(v:v);
进样量:20μL;
流速1ml/min;
检测波长254nm;
柱温30℃。
实施例1腈水解酶SEQ ID NO:1表达菌株的构建
全基因合成编码腈水解酶SEQ ID NO:1的基因序列,通过Nde I和Xho I双酶切位点与载体质粒pET21a(购自Novagen)连接,获得重组质粒。用氯化钙法转化大肠杆菌DH5α感受态,经培养并抽提质粒后获得DNA序列正确、且能表达腈水解酶的基因工程质粒。用氯化钙法将上述构建的基因工程质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态,涂布LA平板,置于37℃恒温培养箱,倒置培养过夜。次日,从LA平板上挑取3~5个阳性克隆,并对阳性克隆进行IPTG诱导产酶试验。对于上述鉴定阳性的,即为能产生腈水解酶SEQ ID NO:1的大肠杆菌工程菌株。
实施例2酰胺酶SEQ ID NO:2表达菌株的构建
全基因合成编码酰胺酶SEQ ID NO:2的基因序列,通过Nde I和Xho I双酶切位点与载体质粒pET21a(购自Novagen)连接,获得重组质粒。用氯化钙法转化大肠杆菌DH5α感受态,经培养并抽提质粒后获得DNA序列正确、且能表达酰胺酶的基因工程质粒。用氯化钙法将上述构建的基因工程质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态,涂布LA平板,置于37℃恒温培养箱,倒置培养过夜。次日,从LA平板上挑取3~5个阳性克隆,并对阳性克隆进行IPTG诱导产酶试验。对于上述鉴定阳性的,即为能产生酰胺酶SEQ ID NO:2的大肠杆菌工程菌株。
实施例3大肠杆菌工程菌株摇瓶发酵
3.1将实施例1得到的产腈水解酶的大肠杆菌工程菌株接种到LB培养基中,置于37℃、200rpm的恒温摇床上进行摇瓶培养过夜。次日,加IPTG至终浓度为0.5mmol/L,于30℃、200rpm诱导6~8小时。随后,通过4℃离心(6000rpm,5min)收集含腈水解酶的菌体。用0.9%的氯化钠溶液清洗含腈水解酶的菌体两遍。弃去最后一次清洗的氯化钠溶液,将含腈水解酶的菌体置于-80℃冰箱保藏。
3.2将实施例2得到的产酰胺酶的大肠杆菌工程菌株接种到LB培养基中,置于37℃、200rpm的恒温摇床上进行摇瓶培养过夜。次日,加IPTG至终浓度为0.5mmol/L,于30℃、200rpm诱导6~8小时。随后,通过4℃离心(6000rpm,5min)收集含酰胺酶的菌体。用0.9%的氯化钠溶液清洗含酰胺酶的菌体两遍。弃去最后一次清洗的氯化钠溶液,将含酰胺酶的菌体置于-80℃冰箱保藏。
实施例4用腈水解酶菌体与酰胺酶菌体联合催化法制备化合物I
在100ml锥形瓶中加入9ml的Tris-HCl缓冲液(50mM,pH6.0)、10mg底物2-氰基乙酸-(4-硝基苯基)甲酯、1ml甲醇、0.09g湿重实施例3.1得到的含腈水解酶菌体和0.03g湿重实施例3.2得到的含酰胺酶菌体,置于30℃、150rpm的恒温摇床反应3小时。反应结束,加入4ml 2M盐酸和6ml的甲醇,混匀,4℃离心(6000rpm,5min),取上清进行高效液相色谱(HPLC)检测。每个实验做3次,取平均值,结果表1所示。
对比例1用腈水解酶菌体催化制备化合物I
按照实施例4所述的方法进行酶催化反应,不同的是,用0.03g湿重实施例3.1得到的含腈水解酶菌体代替0.03g湿重实施例3.2得到的含酰胺酶菌体,即采用0.12g湿重实施例3.1得到的含腈水解酶菌体作为单一催化剂。每个实验做3次,取平均值,结果如表1所示。
表1.含酶菌体催化实验结果
底物II | 副产物III | 其他副产物 | 产物I | |
腈水解酶 | 1.38% | 58.45% | 0.96% | 39.20% |
腈水解酶+酰胺酶 | 1.97% | 1.26% | 1.16% | 95.61% |
上述实验结果表明,单独使用腈水解酶进行催化反应时,副产物III的收率要高于产物I的收率,接近60%,产物I的收率不到40%,可能是腈水解酶显示出较强的腈水合酶活性之故。相反,腈水解酶与酰胺酶的联合催化可使目的产物对硝基苄醇丙二酸单酯的收率大大提高,达到95%以上,副产物III的收率显著降低。尽管其他副产物(研究表明主要是对硝基苄醇)含量高于单独使用腈水解酶时的含量,但在后处理过程中还是比较容易除去的。
实施例5用腈水解酶与酰胺酶联合催化法制备化合物I
在100ml锥形瓶中加入9ml的Tris-HCl缓冲液(50mM,pH6.0)、10mg底物2-氰基乙酸-(4-硝基苯基)甲酯、1ml甲醇、0.09g湿重实施例3.1所得含腈水解酶菌体经匀浆处理得到的粗酶液和0.03g湿重实施例3.2所得含酰胺酶菌体经匀浆处理得到的粗酶液,置于35℃、150rpm的恒温摇床反应2小时。反应结束,加入4ml 2M盐酸和6ml的甲醇,混匀,4℃离心(6000rpm,5min),取上清进行高效液相色谱(HPLC)检测。每个实验做3次,取平均值,结果如表2所示。
对比例2用腈水解酶催化制备化合物I
按照实施例5所述的方法进行酶催化反应,不同的是,用0.03g湿重实施例3.1所得含腈水解酶菌体经匀浆处理得到的粗酶液代替0.03g湿重实施例3.2所得含酰胺酶菌体经匀浆处理得到的粗酶液,即采用0.12g湿重实施例3.1所得含腈水解酶菌体经匀浆处理得到的粗酶液作为单一催化剂。每个实验做3次,取平均值,结果表2所示。
表2.粗酶液催化实验结果
底物II | 副产物III | 其他副产物 | 产物I | |
腈水解酶 | 0.29% | 60.13% | 0.96% | 38.61% |
腈水解酶+酰胺酶 | 2.62% | 0.68% | 1.28% | 95.43% |
上述实验结果表明,单独使用腈水解酶进行催化反应时,副产物III的收率要高于产物I的收率,超过60%,产物I的收率不到40%。相反,腈水解酶与酰胺酶的联合催化可使目的产物对硝基苄醇丙二酸单酯的收率大大提高,达到95%以上,大大降低了副产物的产生,对于后处理和产品的纯化极为有利。
总之,相比单独使用腈水解酶催化,腈水解酶与酰胺酶联合催化底物2-氰基乙酸-(4-硝基苯基)甲酯反应有效地降低了副产物III的产生,并显著提高了目的产物对硝基苄醇丙二酸单酯的收率,且后处理容易,产品容易纯化,因而具有工业化应用前景。
Claims (10)
1.一种制备对硝基苄醇丙二酸单酯的方法,包括如下步骤:
以2-氰基乙酸-(4-硝基苯基)甲酯为底物,用腈水解酶或者其表达微生物、和酰胺酶或者其表达微生物进行联合催化而得。
2.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述腈水解酶是粪产碱杆菌来源的腈水解酶。
3.如权利要求2所述的方法,其特征在于,所述腈水解酶的氨基酸序列为SEQ ID NO:1。
4.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述酰胺酶是粪产碱杆菌来源的酰胺酶。
5.如权利要求4所述的方法,其特征在于,所述酰胺酶的氨基酸序列为SEQ ID NO:2。
6.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述微生物是大肠杆菌。
7.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述步骤为:以2-氰基乙酸-(4-硝基苯基)甲酯为底物,用表达腈水解酶SEQ ID NO:1的大肠杆菌和表达酰胺酶SEQ ID NO:2的大肠杆菌进行联合催化而得。
8.如权利要求1所述的方法,其特征在于,反应体系为pH 3.0~8.0的缓冲溶液体系,其中缓冲溶液为Tris-HCl缓冲液、KH2PO4/K2HPO4缓冲液、或者乙酸钠缓冲液。
9.如权利要求1所述的方法,其特征在于,反应体系中添加有底物助溶剂,所述底物助溶剂选自甲醇、乙醇、二甲基亚砜、乙酸乙酯、丙酮、丁酮、正已烷、正戊烷、环已烷、或者它们两种以上的混合物。
10.如权利要求8所述的方法,其特征在于,反应体系中底物2-氰基乙酸-(4-硝基苯基)甲酯的加入量为0.5~100g/L。
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