CN108715881A - 一种区域、立体选择性生物催化合成普瑞巴林手性中间体的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种区域、立体选择性生物催化合成普瑞巴林手性中间体的制备方法,包括:外消旋异丁基丁二腈(IBSN)在反应介质中,腈水解酶和酰胺酶催化下,20~50℃温度下,反应4~10h,得到(S)‑3‑氰基‑5‑甲基己酸。该方法反应条件温和、操作简单、易行,区域和立体选择性好,由外消旋底物IBSN一锅法合成普瑞巴林关键手性中间体(S)‑3‑氰基‑5‑甲基己酸的转化率可达49.5%,e.e.为99.5%,接近理论转化率50%,同时光学纯度超过99%,对简化普瑞巴林的生产工艺步骤,降低普瑞巴林生产成本具有显著应用价值。
Description
技术领域
本发明涉及生物化工领域,具体地,本发明涉及一种腈水解酶、酰胺酶两步酶法区域、立体选择性生物催化外消旋3-氰基-5-甲基己腈(IBSN)合成普瑞巴林关键手性中间体(S)-3-氰基-5-甲基己酸的方法。
背景技术
普瑞巴林(Pregabalin),化学名(S)-(+)-3-氨甲基-5-甲基己酸(I),是一种新型的γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid,GABA)受体激动剂,能有效阻断电压依赖性钙通道,减少神经递质释放,具有良好的抗焦虑和神经病理性疼痛治疗效果(Angew.Chem.Int.Ed.,2008,47:3500-3504)。
与传统药物相比,普瑞巴林具有服用剂量低、次数少、毒副作用小、持续时间长、耐受性强等优点,被认为是最有希望的抗癫痫治疗药物之一(Expert.Opin.Inv.Drug.,2003,12:663-672)。自上市以来,普瑞巴林的全球销售额快速增长,已跻身全球畅销处方药行列,市场前景十分广阔。
作为手性药物,普瑞巴林合成的关键是构建手性源。生物催化法具有反应条件温和、过程高效、环境友好以及高度化学、区域和立体选择性等优点成为最受瞩目的手性合成技术之一。其中,腈水解酶区域、立体选择性水解外消旋异丁基丁二腈合成普瑞巴林手性中间体(S)-3-氰基-5-甲基己酸路线具有原料廉价、原子经济性高等显著优势(J.Mol.Catal.B:Enzym.,2006,41:75-80)。
然而,腈水解酶生物催化过程中一个挑战性的问题是副产物多,产物纯化过程繁琐,收率和光学纯度难以兼得,如专利CN1942587B利用NIT-101、NIT-102、NIT-103和拟南芥腈水解酶催化异丁基丁二腈制备(S)-3-氰基-5-甲基己酸的产率和光学纯度分别对应为:产率34.2%、光学纯度96.3%e.e.;产率38.6%、光学纯度91.1%e.e.;产率35.5%、光学纯度95.5%e.e.和产率17.5%、光学纯度98.5%e.e.。(e.e.意指“对映异构体过量”);为同时提高(S)-3-氰基-5-甲基己酸的产率和光学纯度,采用NIT-102C2在氮气氛下,50个间隙反应循环累积制备产物的产率最高才提至43.2%,光学纯度提至99.0%e.e.。
专利CN103114054B提供了一种利用节杆菌ZJB-09277立体选择性水解制备普瑞巴林关键手性中间体(S)-3-氰基-5-甲基己酸的方法:以外消旋3-氰基-5-甲基己酸酯为底物,以节杆菌ZJB-09277发酵培养获得的湿菌体或含湿菌体的菌悬液为催化剂,于pH 6.5~8.0的缓冲液构成的转化反应体系中,25~50℃下反应得到(S)-3-氰基-5-甲基己酸,产物的产率及光学纯度与底物酯的种类息息相关,当底物为3-氰基-5-甲基己酸丙酯时转化率高达49.9%,但光学纯度只有86.7%e.e.;当底物为3-氰基-5-甲基己酸乙酯时光学纯度达91.2%,但转化率只有31.8%。
因此,开发能够同步提高普瑞巴林关键手性中间体(S)-3-氰基-5-甲基己酸的收率和纯度,易于工业化的工艺路线,成为降低普瑞巴林生产成本的关键,对抗癫痫治疗医学发展具有重要意义。
发明内容
本发明提供一种区域、立体选择性生物催化外消旋异丁基丁二腈(IBSN)合成普瑞巴林关键手性中间体(S)-3-氰基-5-甲基己酸的方法。该方法反应条件温和、操作简单、易行,区域和立体选择性高,合成(S)-3-氰基-5-甲基己酸的转化率接近理论转化率,同时光学纯度超过99.0%,对合成高光学纯度普瑞巴林、降低普瑞巴林生产成本具有重要意义。
本发明发现某些特定腈水解酶的腈水解活性和腈水合活性与底物IBSN的β位强电负性氰基取代基具有协同作用,能够将IBSN转化成高光学纯度的(S)-3-氰基-5-甲基己酰胺(II)和(S)-3-氰基-5-甲基己酸(III),催化过程具有高度的立体和区域选择性。
基于上述发现,本发明提供一种普瑞巴林关键手性中间体(S)-3-氰基-5-甲基己酸的合成新方法:将酰胺酶与腈水解酶进行耦联并严格调控其配比,同步消除化合物II的积累,实现一步法完成(S)-3-氰基-5-甲基己酸的区域、立体选择性合成,有效提高普瑞巴林关键手性中间体(S)-3-氰基-5-甲基己酸的收率和光学纯度,同时还减少了后续产物的分离纯化步骤,极大的简化了普瑞巴林的生产工艺步骤,对降低普瑞巴林生产成本具有显著应用价值。
一种区域、立体选择性生物催化合成普瑞巴林手性中间体的方法,包括:
外消旋异丁基丁二腈(IBSN)在反应介质中,腈水解酶和酰胺酶催化下,20~50℃温度下,反应4~10h,得到(S)-3-氰基-5-甲基己酸。
本发明所涉及腈水解酶的来源包括,但不限于十字花科植物芜菁(Brassicarapa)腈水解酶BrNIT(ABM55734.1)、BrNIT2(BAG72074)、拟南芥(Arabidopsis thaliana)腈水解酶AtNIT(NP 851011)和高山南芥(Arabis alpine)腈水解酶AaNIT(KFK44999),对所述腈水解酶的其它氨基酸位点的保守取代形式、增加或缺失一个或几个氨基酸的形式、氨基端截断的形式、羧基端截断的形式,这些突变体形式也包括在本发明的范围内。
实验结果显示:腈水解酶对异丁基丁二腈(IBSN)的催化能力:BrNIT>AaNIT>BrNIT2>AtNIT;腈水解酶催化IBSN反应过程中的产物组成进行分析,结果显示腈水解酶产酰胺的能力为:BrNIT2>BrNIT>AtNIT>AaNIT;综合考量可知,AaNIT对底物IBSN的立体选择性最高,且酰胺含量在产物中占比最少,因此,腈水解酶优选为AaNIT。
本发明所涉及酰胺酶的来源包括,但不仅限于Pantoea sp.YR343、Comamonascomposti和Deftia tsuruhatensis ZJB-05174的酰胺酶基因Pa-Ami(WP_008109374)、Cc-Ami(WP_027015397)和Dt-Ami(KP943494),对所述酰胺酶的其它氨基酸位点的保守取代形式、增加或缺失一个或几个氨基酸的形式、氨基端截断的形式、羧基端截断的形式,这些突变体形式也包括在本发明的范围内。
实验结果显示:酰胺酶活力为Pa-Ami>Dt-Ami>Cc-Ami。
本发明涉及一种双酶体系催化合成(S)-3-氰基-5-甲基己酸的方法,具体地,所述反应体系中的酶催化剂可为完整微生物细胞、微生物细胞破碎液、部分纯化的酶、纯化酶或固定在载体上的酶催化剂等形式。作为优选,所述催化体系中生物催化剂以完整微生物细胞的形式存在。
进一步优选,所述腈水解酶由含腈水解酶的湿菌体细胞提供,所述酰胺酶由含酰胺酶的湿菌体细胞提供。
所述的含腈水解酶的湿菌体细胞/含酰胺酶的湿菌体细胞的制备方法,包括:
(1)设计含酶切位点XhoI和XbaI的腈水解酶基因序列,克隆至空载体pET28b,获得重组质粒,回收后转化至大肠杆菌,培养检测阳性菌,得到腈水解酶基因工程菌;或,
设计含有EcoRI和NcoI位点的酰胺酶基因序列,克隆至空载体pET28b,构建表达载体,热击转化到大肠杆菌,培养检测阳性菌,得到酰胺酶基因工程菌;
(2)将腈水解酶基因工程菌/酰胺酶基因工程菌落接入含有卡那霉素的LB液体培养基中,25~37℃,100~200rpm,培养6~8h后,得菌体种子液;
将上述菌体种子液以2%的体积比转接至新鲜的含卡那霉素的LB液体培养基中,25~37℃,100~200rpm,培养至菌体OD600为0.6~0.8时,加入异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷,25~30℃、100~150rpm发酵10~12h,收集发酵液于0~5℃,6000~9000rpm的条件下离心10~15min,生理盐水洗涤菌体后,得到含腈水解酶的湿菌体细胞/含酰胺酶的湿菌体细胞;
所述卡那霉素的浓度为30~60mg/L;
所述异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷的浓度为0.05~0.2mM。
本发明中酰胺酶的添加不仅可以消除(S)-3-氰基-5-甲基己酰胺的积累,减少后续的分离步骤,还可以提高产物(S)-3-氰基-5-甲基己酸的收率。在不积累(S)-3-氰基-5-甲基己酰胺的前提下,优化酰胺酶的添加量,可减少体系中菌体添加量,有利于降低工艺的生产成本;作为优选,所述含腈水解酶与酰胺酶的湿菌体细胞的质量比为1~12:1。
所述转化体系中,底物IBSN初始浓度为10~150g/L。
所述含酰胺酶的湿菌体细胞与外消旋异丁基丁二腈的质量比为0.05~0.15:1。
作为优选,所述催化体系中的反应温度为30~40℃。
所述反应介质由纯水或缓冲体系组成;所述缓冲体系的pH范围约6.0-11.0,所述的缓冲体系由磷酸钠缓冲液、Tris-HCl缓冲液及Gly-NaOH缓冲液组成,作为优选,所述催化体系中的反应介质为Tris-HCl缓冲液,所述缓冲体系的pH为7.5-9.0。在弱碱性环境中,生物催化剂均保持在较高的活性。
与现有技术相比,本发明具有以下有益效果:
(1)现有技术中,底物IBSN的浓度越大,转化越困难,产率越低,本发明可将底物IBSN的初始浓度提至150g/L。
(2)由外消旋底物IBSN合成普瑞巴林关键手性中间体(S)-3-氰基-5-甲基己酸的转化率可达49.5%,e.e.为99.5%;
(3)实现一步法完成(S)-3-氰基-5-甲基己酸的区域、立体选择性合成,极大缩减了后续产物的分离纯化步骤,对简化普瑞巴林的生产工艺步骤,降低普瑞巴林生产成本具有显著应用价值。
附图说明
图1为本发明实施例4中腈水解酶催化IBSN水解反应液的气相色谱图。
图2为本发明实施例4中腈水解酶AaNIT催化IBSN水解的反应进程图。
图3为本发明实施例6中腈水解酶、酰胺酶双酶耦联催化合成(S)-3-氰基-5-甲基己酸的合成路线图。
图4为本发明实施例6中腈水解酶、酰胺酶双酶耦联一锅法催化IBSN的反应进程图。
图5为本发明实施例7中腈水解酶、酰胺酶双酶耦联一锅法催化IBSN的气相色谱图。
具体实施方式
以下结合具体实施例,对本发明做进一步说明。以下实施例仅用于说明本发明而非限制本发明的范围。
本发明中的实验方法如无特别说明均为常规方法,基因克隆操作具体可参见J.萨姆布鲁克等编著的《分子克隆实验指南》。
实施例1构建重组腈水解酶工程菌
根据NCBI中报道的芜菁(Brassica rapa)腈水解酶BrNIT(ABM55734.1)、BrNIT2(BAG72074)、拟南芥(Arabidopsis thaliana)腈水解酶AtNIT(NP 851011)和高山南芥(Arabis alpine)腈水解酶AaNIT(KFK44999)全合成该基因序列,两端设计酶切位点XhoI和XbaI,克隆至空载体pET28b,获得重组质粒,回收后转化至大肠杆菌BL21(DE3),培养检测阳性菌,得到重组腈水解酶基因工程菌BL21(DE3)/pET28b-BrNIT、BL21(DE3)/pET28b-BrNIT2、BL21(DE3)/pET28b-AtNIT和BL21(DE3)/pET28b-AaNIT。
实施例2构建重组酰胺酶工程菌
根据已报道的来源于Pantoea sp.YR343、Comamonas composti和D.tsuruhatensis ZJB-05174的酰胺酶基因Pa-Ami(WP_008109374)、Cc-Ami(WP_027015397)和Dt-Ami(KP943494),对其基因序列进行全合成。设计含有EcoRI和NcoI位点的上下游引物,扩增基因后插入pET28b中,构建表达载体,热击转化到BL21(DE3)感受态细胞中,得到酰胺酶基因工程菌BL21(DE3)/pET28b-Pa-Ami、BL21(DE3)/pET28b-Cc-Ami和BL21(DE3)/pET28b-Dt-Ami。
实施例3基因工程菌的表达培养
挑取单菌落接入5mL液体LB培养基中,卡那霉素终浓度为50mg/L。培养条件为37℃,200rpm,培养6-8h。将上述种子液以2%的体积比转接至新鲜的含有终浓度为50mg/L卡那霉素的LB液体培养基中,37℃、150rpm培养至菌体OD600约为0.6-0.8时,向上述LB液体培养基中加入异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG,终浓度为0.1mM),28℃、150rpm诱导培养10-12h,收集发酵液于4℃,8000rpm的条件下离心10min,然后加入生理盐水洗涤菌体一次,将离心所得菌体置于-20℃冰箱保存,应用于以下实施例中。
实施例4重组腈水解酶催化IBSN及产物组成分析
(a)重组腈水解酶的活力及立体选择性
对实施例3中培养得到的重组腈水解酶基因工程菌进行活力和立体选择性测定,具体内容如下:
含腈水解酶重组大肠杆菌活力检测反应体系(10mL):Tris-HCl缓冲溶液(50mM,pH8.0),外消旋异丁基丁二腈30g/L,湿菌体10g/L;反应液于30℃、200rpm条件下反应4h,取样500μL,加入200μL 2M HCl终止反应。
结果显示腈水解酶对异丁基丁二腈(IBSN)的催化能力:BrNIT>AaNIT>BrNIT2>AtNIT,具体数据如表1所示:
表1重组腈水解酶催化IBSN水解结果
注:E意指“对映体选择率,enantiomeric ratio”,是表征酶立体选择性的参数。
(b)重组腈水解酶催化IBSN反应过程中产物组成分析
对重组腈水解酶催化IBSN反应产物进行气相色谱分析,结果显示除底物、产物峰外有另一色谱峰存在,如图1所示。为了确定该物质结构,对该物质进行了分离、纯化。具体步骤如下:收集反应液置于沸水中加热20min,利用减压抽滤去除截留的杂蛋白及部分底物。再加入2倍体积乙酸乙酯进行萃取,去除反应液中的底物(该步骤重复两次以确保底物有效去除),收集下层水相并利用NaOH调pH至12.0,再次加入2倍体积乙酸乙酯萃取。收集上层有机相,旋蒸后得到浅黄色油状化合物,经结构鉴定为(S)-3-氰基-5-甲基己酰胺。
NMR表征结果:1H NMR(500MHz,CDCl3-d1):δ5.73(d,J=37.8Hz,2H),3.21-3.13(m,1H),2.65-2.57(m,1H),2.45(dd,J=15.3,6.6Hz,1H),1.95-1.81(m,1H),1.67-1.59(m,1H),1.39(tdd,J=13.5,9.9,5.5Hz,1H),1.02-0.95(m,6H);13C NMR(126MHz,CDCl3-d1):δ170.77,121.60,40.80,38.49,26.23,26.02,22.93,21.25;
质谱表征结果:MS(ESI):m/z 155.1[M+H]+。
参照上述步骤(a),对重组腈水解酶催化IBSN反应过程中的产物组成进行分析,结果显示腈水解酶产酰胺的能力为:BrNIT2>BrNIT>AtNIT>AaNIT,具体数据如表2所示。
表2重组腈水解酶催化IBSN反应过程产物组成
(c)重组腈水解酶催化IBSN的反应进程
据表1和表2数据结果显示,AaNIT对底物IBSN的立体选择性最高,且酰胺含量在产物中占比最少,因此对其催化IBSN的反应进程进行研究。将0.25g的含有腈水解酶的湿菌体BL21(DE3)/pET28b-AaNIT加入到10mL Tris-HCl缓冲液(50mM,pH=8.0)中,并加入底物IBSN 0.5g。于30℃、200rpm条件下反应,每隔0.5h取样,对反应进程进行检测,反应进程如图2所示。8h后,底物IBSN转化为产物(S)-3-氰基-5-甲基己酸(记为(S)-CMHA)的转化率为49.5%,e.e.为99.5%,(S)-3-氰基-5-甲基己酰胺(记为(S)-CMHM,相对于目标产物,可视为副产物)含量为0.7g/L。
产物3-氰基-5-甲基己酸含量的测定:利用液相色谱(岛津LC-16)外标法测定转化液中(S)-3-氰基-5-甲基己酰胺的含量。色谱柱为C-18Column(250mm×4.6mm,5μm),流动相为缓冲液(0.58g/L磷酸氢二铵,1.83g/L高氯酸钠,高氯酸调节pH为1.8):乙腈=60:40(v/v),流速为1mL/min,紫外检测波长225nm,柱温30℃。
底物外消旋异丁基丁二腈、产物3-氰基-5-甲基己酸和3-氰基-5-甲基己酰胺的对映体过量值由气相色谱测定。气相色谱型号为7890N(安捷伦),毛细管柱型号为BGB-174(BGB Analytik Switzerland)。色谱条件为:进样量1.0μL,进样口、检测器温度均为250℃,柱温为170℃保持10min,10℃/min升温至200℃,保持5min。载气为高纯氦气,流速为1.0mL/min,分流比为50:1。
对映体过量值(e.e.)、转化率(c)的计算参考Rakels等的计算方法(EnzymeMicrob.Technol.,1993,15:1051)。
实施例5重组酰胺酶催化(S)-3-氰基-5-甲基己酰胺水解
(a)重组酰胺酶活力的测定
对实施例3中培养得到的重组酰胺酶基因工程菌进行活力的检测,具体步骤如下所示。
含酰胺酶重组大肠杆菌活力检测反应体系(10mL):Tris-HCl缓冲溶液(50mM,pH8.0),(S)-3-氰基-5-甲基己酰胺30g/L,湿菌体10g/L。反应液于30℃、200rpm条件下反应30min。取样500μL,加入200μL 2M HCl终止反应后,参照实施例4中的液相色谱法对转化液中的(S)-3-氰基-5-甲基己酸含量进行测定。结果如表3所示。
表3重组酰胺酶催化(S)-3-氰基-5-甲基己酰胺水解
(b)酰胺酶添加量的优化
转化体系组成及操作如下:在20mL Tris-HCl缓冲液(pH=8.0)中加入2g的外消旋异丁基丁二腈(IBSN)及1g的湿菌体细胞,菌体细胞为含腈水解酶BrNIT与含酰胺酶Pa-Ami的细胞混合体,且两者之间的质量比分别设为1:1、3:1、5:1、7:1、9:1、12:1及15:1),于30℃、200rpm条件下反应,反应3h后取样进行检测,检测方法参照实施例4。结果显示,在比值达到12:1、9:1、7:1及更小比值时,副产物(S)-3-氰基-5-甲基己酰胺无积累。比值为15:1和不添加酰胺酶时,副产物(S)-3-氰基-5-甲基己酰胺无法完全被水解,且随着酰胺酶用量的减少,积累量逐渐增加。
实施例6双酶耦联一锅法催化IBSN合成普瑞巴林关键手性中间体(S)-3-氰基-5-甲基己酸
重组基因工程菌一锅法催化IBSN合成(S)-3-氰基-5-甲基己酸
合成路线图如图3所示,将100mL Tris-HCl缓冲液(50mM,pH=8.0)加入到250mL的三口烧瓶中,同时加入底物IBSN 8g、含腈水解酶的工程菌BL21(DE3)/pET28b-BrNIT和含酰胺酶的工程菌BL21(DE3)/pET28b-Pa-Ami共6g(wcw,二者质量比为5:1)。加入完毕后,混匀并于30℃水浴反应4.5h,转化率达到49.0%,e.e.为99.2%,反应过程中未检测到(S)-3-氰基-5-甲基己酰胺的积累(图4)。
实施例7重组基因工程菌一锅法催化IBSN合成(S)-3-氰基-5-甲基己酸
分别称取5g实施例3中获得的重组腈水解酶基因工程菌BL21(DE3)/pET28b-BrNIT和0.6g重组酰胺酶基因工程菌BL21(DE3)/pET28b-Dt-Ami的湿菌体,投入到含有100g/LIBSN的100mL Tris-HCl缓冲液中(50mM,pH=8.0),混匀并于30℃水浴反应8h,转化率达到47.5%,e.e.为99.1%,反应过程中未检测到(S)-3-氰基-5-甲基己酰胺的生成(图5)。
实施例8双酶耦联一锅法催化IBSN合成(S)-3-氰基-5-甲基己酸
将10mL Tris-HCl缓冲液(50mM,pH=8.0)加入到50mL的具塞反应瓶中,同时加入底物IBSN 1.2g、含腈水解酶的工程菌BL21(DE3)/pET28b-BrNIT2和含酰胺酶的工程菌BL21(DE3)/pET28b-Pa-Ami共0.6g(wcw,二者质量比为9:1)。加入完毕后,混匀并于30℃水浴反应10h,转化率达到49.1%,e.e.为98.7%,反应过程中未检测到(S)-3-氰基-5-甲基己酰胺的生成。
需要指出的是,上述实验实例仅为说明本发明的构思及特点,其目的是让熟悉本发明的人了解本实验并据以实施,并不能限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质做出的等效变化或修饰,都应涵盖在本发明的保护范围内。
Claims (10)
1.一种区域、立体选择性生物催化合成普瑞巴林手性中间体的方法,包括:
外消旋异丁基丁二腈在反应介质中,腈水解酶和酰胺酶催化下,20~50℃温度下,反应4~10h,得到(S)-3-氰基-5-甲基己酸。
2.根据权利要求1所述的区域、立体选择性生物催化合成普瑞巴林手性中间体的方法,其特征在于,所述的腈水解酶为芜菁腈水解酶BrNIT、BrNIT2、拟南芥腈水解酶AtNIT或高山南芥腈水解酶AaNIT中的一种或几种。
3.根据权利要求2所述的区域、立体选择性生物催化合成普瑞巴林手性中间体的方法,其特征在于,所述的腈水解酶为AaNIT。
4.根据权利要求1所述的区域、立体选择性生物催化合成普瑞巴林手性中间体的方法,其特征在于,所述的酰胺酶为Pa-Ami、Cc-Ami或Dt-Ami中的一种或几种,所述的酰胺酶的选用顺序为Pa-Ami>Dt-Ami>Cc-Ami。
5.根据权利要求1~4任一项所述的区域、立体选择性生物催化合成普瑞巴林手性中间体的方法,其特征在于,所述腈水解酶由含腈水解酶的湿菌体细胞提供,所述酰胺酶由含酰胺酶的湿菌体细胞提供;所述含腈水解酶与酰胺酶的湿菌体细胞的质量比为1~12:1。
6.根据权利要求1所述的区域、立体选择性生物催化合成普瑞巴林手性中间体的方法,其特征在于,所述外消旋异丁基丁二腈的浓度为10~150g/L。
7.根据权利要求5或6所述的区域、立体选择性生物催化合成普瑞巴林手性中间体的方法,其特征在于,所述含酰胺酶的湿菌体细胞与外消旋异丁基丁二腈的质量比为0.05~0.15:1。
8.根据权利要求5所述的区域、立体选择性生物催化合成普瑞巴林手性中间体的方法,其特征在于,所述的含腈水解酶的湿菌体细胞/含酰胺酶的湿菌体细胞的制备方法,包括:
(1)设计含酶切位点XhoI和XbaI的腈水解酶基因序列,克隆至空载体pET28b,获得重组质粒,回收后转化至大肠杆菌,培养检测阳性菌,得到腈水解酶基因工程菌;或,
设计含有EcoRI和NcoI位点的酰胺酶基因序列,克隆至空载体pET28b,构建表达载体,热击转化到大肠杆菌,培养检测阳性菌,得到酰胺酶基因工程菌;
(2)将腈水解酶基因工程菌/酰胺酶基因工程菌落接入含有卡那霉素的LB液体培养基中,25~37℃,100~200rpm,培养6~8h后,得菌体种子液;
将上述菌体种子液以2%的体积比转接至新鲜的含卡那霉素的LB液体培养基中,25~37℃,100~200rpm,培养至菌体OD600为0.6~0.8时,加入异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷,25~30℃、100~150rpm发酵10~12h,收集发酵液于0~5℃,6000~9000rpm的条件下离心10~15min,生理盐水洗涤菌体后,得到含腈水解酶的湿菌体细胞/含酰胺酶的湿菌体细胞;
所述卡那霉素的浓度为30~60mg/L;
所述异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷的浓度为0.05~0.2mM。
9.根据权利要求1所述的区域、立体选择性生物催化合成普瑞巴林手性中间体的方法,其特征在于,所述的反应介质由纯水或缓冲体系组成。
10.根据权利要求9所述的区域、立体选择性生物催化合成普瑞巴林手性中间体的方法,其特征在于,所述的缓冲体系为磷酸钠缓冲液体系、Tris-HCl缓冲液体系或Gly-NaOH缓冲液体系,所述缓冲液体系的pH范围为6.0~11.0。
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