CN104726513B - 一种酶法制备左旋多巴的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种酶法制备左旋多巴的方法，包括：挑取一环嗜麦芽假单胞菌菌种斜面，接入种子培养基中培养，得一级种子液；将一级种子液以3～10%的接种量接入发酵培养基中，进行发酵培养，发酵结束后离心，收集菌体细胞；在缓冲溶液中加入酪氨酸和菌体细胞，在18～30℃，pH5.0～6.0条件下进行酶促反应，将酪氨酸转化为左旋多巴。本发明在转化过程中采用静息细胞转化技术、优选采用间歇弱通风技术，提高了酶的催化效力，左旋多巴浓度可达27g/L，酪氨酸摩尔转化率可达99%以上，且条件温和，对映体选择性高，无消旋作用发生，更适合工业化生产，具有显著地经济效益和工业应用价值。
Description
技术领域
本发明涉及一种制备左旋多巴的方法，特别涉及到一种酶法制备左旋多巴的方法，属于微生物技术领域。
背景技术
左旋多巴（L-DOPA），化学名称为3，4-二羟基苯基丙氨酸，是L-酪氨酸到儿茶酚或黑色素的生化代谢途径过程中的重要中间产物。L-DOPA的衍生物多巴胺是一种重要的神经递质，由于多巴胺不能透过血脑屏障进入脑组织，所以不能通过补充多巴胺来治疗帕金森氏病，而L-DOPA可以通过血脑屏障，并在脑组织中脱羧形成多巴胺，从而使脑组织中多巴胺含量增加而达到治疗的目的。Birkmayer于1961年用左旋多巴治疗获得明显疗效。L-DOPA及复方左旋多巴（如美多芭）已成为治疗常见老年病帕金森氏病的最有效的药物。左旋多巴还可用来治疗弱视、肝昏迷、心力衰竭等病症；此外，人们还发现L-DOPA有抗衰老的功效。鉴于L-DOPA在医药卫生、保健美容等诸多领域的显著功效，L-DOPA的生产很早就被人们所关注，预计未来几年左旋多巴的全球销售额会超过10亿美元，市场容量巨大。
根据文献报道左旋多巴的生产有天然植物提取法、化学合成法及微生物酶转化法三种主要方法。
1、提取法
天然植物提取是从猫豆、藜豆等种子中提取，虽然猫豆等植物中存在的多巴都是左旋的，提取过程中免去了与手性异构体D-DOPA的拆分工艺，并且L-DOPA的提取得率也相应得到了一些提高，但由于受到原料来源少、产量小的限制，因而生产成本较高，难以大规模生产，远不能满足市场需求。
2、化学法
工业化生产左旋多巴多以香草醛和乙内酰脲为原料，经过 8 步的反应制得。尽管目前商品化左旋多巴主要通过不对称法合成，但化学合成过程中需要大量的金属催化物，并且过程繁杂，产物的转化效率和旋光活性均较低，同时具有成本高、环境污染严重等问题。
3、酶转化法
1）酪氨酸酚解酶
酪氨酸酚解酶（tyrosine phenol lyase，TPL）（EC4.1.99.2）可催化苯酚、丙酮酸和氨水生成酪氨酸，该反应为可逆反应。若将苯酚置换成邻苯二酚，该酶即可催化生成左旋多巴。Yanada等对Erwinia herbicola ATCC21434合成左旋多巴进行了深入的研究，但前体物对酶反应有较强的抑制作用，甚至导致酶的不可逆失活，且产物和原料丙酮酸容易生产副产物，影响产率。
2）转氨酶
转氨酶（transaminase）可将 L-天冬氨酸或 L-谷氨酸中的氨基转移到 3,4-二羟基苯丙酮酸上，进而生成左旋多巴。Nagasaki 等（Agriculture Biology and Chemistry，1975，39：363-369.）研究了 Enterobacter cloacae NB320，Alcaligenes faecalis 转氨基作用生成左旋多巴的能力。然而由于转氨作用存在诸多问题，随后相关利用转氨酶生成左旋多巴的研究比较少见。
3）酪氨酸酶
酪氨酸酶（tyrosinase）可以酪氨酸直接作为底物，催化合成左旋多巴。1973年，日本的Yoshida等（Agriculture Biology and Chemistry，1973，37：2121-2126.）用Vibriotyrosinaticus ATCC19378,1989年武汉大学的彭珍荣等(氨基酸和生物资源，1996,4:1-4.)用假单胞菌属细菌以酪氨酸为前体生产左旋多巴。彭珍荣的方法中酪氨酸酶的活性低，最高仅能将8.6g/L的酪氨酸转化为7.8g/L的左旋多巴，再加入高含量的酪氨酸无法实现有效转化，产物浓度较低，分离提取困难。日本的Yoshitake Tanaka（Agi. Biol. Chem. 38(3),633-639,1974）还以诱变育种的方法提高了产酶性能，转化后左旋多巴在转化液中的浓度为21g/L，但是该方法酪氨酸摩尔转化率不足70%，底物酪氨酸大量残留，分离提取困难，距离工业应用具有相当的距离。
由此可以看出，目前公开的酪氨酸酶转化酪氨酸制备左旋多巴的方法存在产量低或者转化率低的问题，使产品收率低、分离提取困难，生产成本高，操作工艺较复杂，不利于产业化。
发明内容
针对现有技术中酪氨酸酶转化酪氨酸制备左旋多巴方法存在的不足，本发明提供了一种酶法制备左旋多巴的方法，该方法酪氨酸转化率高，左旋多巴浓度也高，具有工业化实用价值。
本发明可以通过以下技术方案实现：
一种酶法制备左旋多巴的方法，包括以下步骤：
（1）挑取一环嗜麦芽假单胞菌(Pseudomonas maltophilia )的菌种斜面，接入种子培养基中培养，得一级种子液；
（2）将一级种子液以3～10%的接种量接入发酵培养基中，进行发酵培养，发酵结束后离心，收集菌体细胞；
（3）在缓冲溶液中加入酪氨酸和菌体细胞，在18～30℃，pH5.0～6.0 条件下进行酶促反应，将酪氨酸转化为左旋多巴。
上述方法中，优选采用嗜麦芽假单胞菌(Pseudomonas maltophilia )ATCC17806作为产酪氨酸酶的菌种。
上述方法中，所用种子培养基由以下重量百分比的组分组成：葡萄糖1.2-2.0%，蛋白胨 0.3-0.8%，氯化钠 0.3-0.8%，氯化铵0.1-0.5%，玉米浆0.8-1.2%，豆饼水解液0.5-1.5%，水余量，pH7.0。
上述方法中，所用发酵培养基由以下重量百分比的组分组成：葡萄糖1.5-2.5%,氯化铵0.5-1%，硫酸镁0.02-0.05%，磷酸二氢钾 0.08-0.12%，氯化钙 0.008-0.012%，硫酸铜0.01-0.03%，玉米浆0.5-1.5%，豆饼水解液（又名豆浓） 0.1-0.5%，水余量，pH7.0。
上述方法中，种子培养基优选由以下重量百分比的组分组成：葡萄糖1.5%，蛋白胨0.5%，氯化钠 0.5%，氯化铵0.3%，玉米浆 1%，豆饼水解液1%，水余量，pH7.0。发酵培养基优选由以下重量百分比的组分组成：葡萄糖 2%,氯化铵0.7%，硫酸镁0.04%，磷酸二氢钾0.1%，氯化钙 0.01%，硫酸铜0.02%，玉米浆1%，豆饼水解液 0.3%，水余量，pH7.0。当采用优选的种子培养基和发酵培养基时，会提高左旋多巴的含量和酪氨酸的转化率。
上述方法中，步骤（1）种子培养时，优选采用以下条件：28～32℃,150～200r/min培养24～26h。
上述方法中，步骤（2）发酵培养时，优选采用以下条件：搅拌转速200～700r/min，溶氧20～50体积%，温度28～30℃，培养36～38h。
上述方法中，步骤（2）中，发酵结束后将发酵液用冷冻离心机在0℃、8000r/min离心10min，收集菌体细胞。
上述方法中，步骤（3）中的缓冲溶液可以选自：乙酸-乙酸盐缓冲溶液或Na2HPO4-NaH2PO4缓冲溶液。
上述方法中，每1000ml缓冲溶液中加入10-25g的酪氨酸。采用优选菌种时，10-25g/L的酪氨酸的转化率可达到90%以上，例如每1000ml缓冲溶液中加入20-25g的酪氨酸时，酪氨酸的转化率也能达到90%以上。
上述方法中，每1000ml缓冲溶液中加入40-60g菌体细胞，用于转化酪氨酸。
上述方法中，步骤（3）中，采用的表面活性剂为曲拉通X100或吐温-80，还原保护剂为亚硫酸钠或抗坏血酸。
步骤（3）中，表面活性剂在缓冲溶液中的浓度为0.01～0.3wt%,还原保护剂在缓冲溶液中的浓度为 0.1～2wt%，硫酸铜在缓冲溶液中的浓度为0.01～0.1wt%。
上述步骤（3）中，酪氨酸可以一次性加入缓冲溶液中，也可以分多次加入缓冲溶液中。
进一步的，为了更好的提高酪氨酸的转化率和左旋多巴的产量，在步骤（3）酶促反应将酪氨酸转化为左旋多巴的过程中，本发明采用间歇弱通风的方式辅助酶促反应的进行，所述间歇弱通风的方式是指：反应过程中每小时通空气15-20min，通气量为0.1vvm～0.5vvm（vvm的意思是每分钟通气量与罐体实际料液体积的比值）。通过在酶促反应过程中间歇弱通风，可以提高酪氨酸的转化率和左旋多巴的产量。
上述方法中，采用优选菌种时，所得左旋多巴的含量可以达到10.5-27g/L。左旋多巴含量采用高效液相色谱法进行测定，色谱条件如下：色谱柱：C18（4.0×250mm）；流动相为甲醇和0.01mol/L KH2PO4混合液，体积比为25：75，pH3.0 ；流速1mL/min ；进样量20μL ；柱温室温；紫外检测器，检测波长280nm。
上述方法中，步骤（3）中的酶促反应时间为8-15h。
本发明具有如下优点：
1、本发明以L-酪氨酸为原料转化制备左旋多巴，原料酪氨酸来源丰富、价格相对低廉，转化周期短、操作方便，工艺流程简单，生产成本低，经济效益显著。
2、本发明酪氨酸转化率高且左旋多巴含量高，反应中无副产物产生，产物便于分离提取，产品纯度高。
3、本发明以嗜麦芽假单胞菌(Pseudomonas maltophilia )生产酪氨酸酶，在转化过程中采用静息细胞转化技术、优选采用间歇弱通风技术，提高了酶的催化效力，使酪氨酸转化率和左旋多巴含量均能大大提高。当采用优选的菌种时，左旋多巴浓度可达27g/L，酪氨酸摩尔转化率可达99%以上，且条件温和，对映体选择性高，无消旋作用发生，更适合工业化生产，具有显著地经济效益和工业应用价值。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明进行进一步的说明，下述说明仅是示例性的，并不对其内容进行限制。
实施例1
（1）挑取一环嗜麦芽假单胞菌(Pseudomonas maltophilia )ATCC17806（市购，下同）的菌种斜面接入装有50ml种子培养基的500ml三角瓶中，30℃,180r/min培养24h，成为一级种子；
（2）将种子液以5%的接种量接入装有3L发酵培养基的自动发酵罐中，发酵期间主要参数控制如下：搅拌转速500～700r/min，溶氧40～50%，温度30℃，pH7.0，培养36h得发酵液,8000r/min、0℃离心10min收获湿细胞（即菌体细胞，下同）210g；
（3）配制1000mL 0.2mol乙酸-乙酸钠缓冲液，pH5.0，加入10g酪氨酸、50g湿细胞混合均匀，再依次加入曲拉通1g、抗坏血酸10g、硫酸铜0.2g，在30℃，pH5.0 条件下进行酶促反应8h,取样酸溶后HPLC测左旋多巴含量为10.5g/L，对酪氨酸摩尔转化率为96.4%。色谱条件如下：色谱柱：C18（4.0×250mm）；流动相为甲醇和0.01mol/L KH2PO4混合液，体积比为25：75，pH3.0 ；流速1mL/min ；进样量20μL ；柱温室温；紫外检测器，检测波长280nm。
种子培养基为（wt%）：葡萄糖1.5%，蛋白胨 0.5%，氯化钠 0.5%，氯化铵0.3%，玉米浆 1%，豆饼水解液1%，水余量，pH7.0。
发酵培养基为（wt%）：葡萄糖 2%,氯化铵0.7%，硫酸镁0.04%，磷酸二氢钾 0.1%，氯化钙 0.01%，硫酸铜0.02%，玉米浆1%，豆饼水解液 0.3%，水余量，pH7.0。
实施例2
（1）挑取一环嗜麦芽假单胞菌(Pseudomonas maltophilia )ATCC17806的菌种斜面接入装有50ml种子培养基的500ml三角瓶中，30℃,180r/min培养24h，成为一级种子；
（2）将种子液以10%的接种量接入装有3L发酵培养基的自动发酵罐中，发酵期间主要参数控制如下：搅拌转速200～300r/min，溶氧20～30%，温度30℃，pH7.0，培养36h得发酵液，8000r/min、0℃离心10min收获湿细胞220g；
（3）配制1000mL 0.2mol乙酸-乙酸钠缓冲液，pH5.4，加入20g酪氨酸、50g湿细胞混合均匀，再依次加入曲拉通1g、抗坏血酸16g、硫酸铜0.2g，在30℃，pH5.5 条件下进行酶促反应14h, 取样酸溶后HPLC测左旋多巴含量为19.6g/L，对酪氨酸摩尔转化率为90%。色谱条件同实施例1。
种子培养基和发酵培养基同实施例1。
实施例3
（1）挑取一环嗜麦芽假单胞菌(Pseudomonas maltophilia )ATCC17806的菌种斜面接入装有50ml种子培养基的500ml三角瓶中，30℃,180r/min培养24h，成为一级种子；
（2）将种子液以7%的接种量接入装有2L发酵培养基的自动发酵罐中，发酵期间主要参数控制如下：搅拌转速200～700r/min，溶氧20～50%，温度30℃，pH7.0，培养36h，发酵结束8000r/min、0℃离心10min收获湿细胞150g；
（3）配制1000mL 0.2mol乙酸-乙酸钠缓冲液，pH5.4，加入20g酪氨酸（酪氨酸分5次加入，毎2.5h加1次，每次4g）、40g湿细胞混合均匀，再依次加入曲拉通1g、抗坏血酸15g、硫酸铜0.2g，在25℃，pH5.4 条件下进行酶促反应14h, 取样酸溶后HPLC测左旋多巴含量为20.1g/L，对酪氨酸摩尔转化率为92.3%。色谱条件同实施例1。
种子培养基和发酵培养基同实施例1。
实施例4
（1）挑取一环嗜麦芽假单胞菌(Pseudomonas maltophilia )ATCC17806的菌种斜面接入装有50ml种子培养基的500ml三角瓶中，30℃,180r/min培养24h，成为一级种子；
（2）将种子液以5%的接种量接入装有2L发酵培养基的自动发酵罐中，发酵期间主要参数控制如下：搅拌转速200～700r/min，溶氧20～50%，温度30℃，pH7.0，培养36h, 发酵结束8000r/min、0℃离心10min收获湿细胞130g；
（3）配制1000mL 0.2mol乙酸-乙酸钠缓冲液，pH5.8，加入25g酪氨酸（酪氨酸分5次加入，毎2.5h加1次，每次5g）、60g湿细胞混合均匀，再依次加入曲拉通1g、抗坏血酸15g、硫酸铜0.2g，在25℃，pH5.8 条件下进行酶促反应, 反应过程中间歇弱通风，每小时通空气15min，通气量0.2vvm，反应15h, 取样酸溶后HPLC测左旋多巴含量为26.8g/L，对酪氨酸摩尔转化率为98.4%。色谱条件同实施例1。
种子培养基和发酵培养基同实施例1。
实施例5
（1）挑取一环嗜麦芽假单胞菌(Pseudomonas maltophilia )ATCC17806的菌种斜面接入装有50ml种子培养基的500ml三角瓶中，30℃,180r/min培养24h，成为一级种子；
（2）将种子液以10%的接种量接入装有3L发酵培养基的自动发酵罐中，发酵期间主要参数控制如下：搅拌转速200～700r/min，溶氧20～50%，温度30℃，pH7.0，培养36h, 发酵结束8000r/min、0℃离心10min收获湿细胞200g；
（3）配制1000mL 0.2mol乙酸-乙酸钠缓冲液，pH5.4，加入25g酪氨酸（酪氨酸分5次加入，毎2.5h加1次，每次5g）、60g湿细胞混合均匀，再依次加入曲拉通1g、抗坏血酸20g、硫酸铜0.2g，在26℃，pH5.4 条件下进行酶促反应, 反应过程中间歇弱通风，每小时通空气20min，通气量0.2vvm，反应15h, 取样酸溶后HPLC测左旋多巴含量为27g/L，对酪氨酸摩尔转化率为99.2%。色谱条件同实施例1。
种子培养基和发酵培养基同实施例1。
实施例6
按照实施例3的方法转化制备左旋多巴，不同的是，步骤（3）按照以下方式进行：配制1000mL 0.2mol乙酸-乙酸钠缓冲液，pH5.4，加入20g酪氨酸（酪氨酸分5次加入，毎2.5h加1次，每次4g）、40g湿细胞混合均匀，再依次加入曲拉通1g、抗坏血酸15g、硫酸铜0.2g，在25℃，pH5.4 条件下进行酶促反应,反应过程中间歇弱通风，每小时通空气15min，通气量为0.5vvm，反应14h,, 取样酸溶后HPLC测左旋多巴含量为21.2g/L，对酪氨酸摩尔转化率为97.4%。色谱条件同实施例1。
实施例7
按照实施例5的方法转化制备左旋多巴，不同的是，步骤（3）按照以下方式进行：配制1000mL 0.2mol乙酸-乙酸钠缓冲液，pH5.4，加入25g酪氨酸（酪氨酸分5次加入，毎2.5h加1次，每次5g）、60g湿细胞混合均匀，再依次加入曲拉通1g、抗坏血酸20g、硫酸铜0.2g，在26℃，pH5.4 条件下进行酶促反应15h, 取样酸溶后HPLC测左旋多巴含量为24.5g/L，对酪氨酸摩尔转化率为90%。色谱条件同实施例1。
实施例8
（1）挑取一环嗜麦芽假单胞菌(Pseudomonas maltophilia )ATCC17806（市购，下同）的菌种斜面接入装有50ml种子培养基的500ml三角瓶中，32℃,200r/min培养24h，成为一级种子；
（2）将种子液以3%的接种量接入装有3 L发酵培养基的自动发酵罐中，发酵期间主要参数控制如下：搅拌转速500～700r/min，溶氧40～50%，温度30℃，pH7.0，培养36h, 发酵结束8000r/min、0℃离心10min收获湿细胞197g；
（3）配制1000mL 0.2molNa2HPO4- NaH2PO4缓冲溶液，pH6.0，加入10g酪氨酸、50g湿细胞混合均匀，再依次加入曲拉通1g、抗坏血酸10g、硫酸铜0.2g，在30℃，pH6.0 条件下进行酶促反应8h,取样酸溶后HPLC测左旋多巴含量为9.6g/L，对酪氨酸摩尔转化率为88.2%。色谱条件同实施例1。
种子培养基为（wt%）：葡萄糖1.2%，蛋白胨 0.8%，氯化钠 0.3%，氯化铵0.5%，玉米浆0.8%，豆饼水解液1.5%，水余量，pH7.0。
发酵培养基为（wt%）：葡萄糖1.5%,氯化铵1%，硫酸镁0.02%，磷酸二氢钾 0.12%，氯化钙 0.008%，硫酸铜0.03%，玉米浆0.5%，豆饼水解液 0.5%，水余量，pH7.0。
实施例9
（1）挑取一环嗜麦芽假单胞菌(Pseudomonas maltophilia )ATCC17806（市购，下同）的菌种斜面接入装有50ml种子培养基的500ml三角瓶中，28℃,150r/min培养24h，成为一级种子；
（2）将种子液以5%的接种量接入装有3 L发酵培养基的自动发酵罐中，发酵期间主要参数控制如下：搅拌转速500～700r/min，溶氧40～50%，温度28℃，pH7.0，培养36h，发酵结束8000r/min、0℃离心10min收获湿细胞189g；
（3）配制1000mL 0.2mol乙酸-乙酸钠缓冲液，pH5.4，加入10g酪氨酸、50g湿细胞混合均匀，再依次加入曲拉通3g、抗坏血酸20g、硫酸铜0.5g，在30℃，pH5.4 条件下进行酶促反应，反应过程中间歇弱通风，每小时通空气20min，通气量为0.3vvm ，反应8h,取样酸溶后HPLC测左旋多巴含量为9.8g/L，对酪氨酸摩尔转化率为90%。色谱条件同实施例1。
种子培养基为（wt%）：葡萄糖2.0%，蛋白胨 0.3%，氯化钠0.8%，氯化铵0.1%，玉米浆1.2%，豆饼水解液0.5%，水余量，pH7.0。
发酵培养基为（wt%）：葡萄糖2.5%,氯化铵0.5%，硫酸镁0.05%，磷酸二氢钾 0.08%，氯化钙 0.012%，硫酸铜0.01%，玉米浆1.5%，豆饼水解液 0.1%，水余量，pH7.0。
对比例
（1）挑取一环嗜麦芽假单胞菌(Pseudomonas maltophilia )ATCC17806（市购，下同）的菌种斜面接入装有50ml种子培养基的500ml三角瓶中，30℃,180r/min培养24h，成为一级种子；
（2）将种子液以5%的接种量接入装有发酵培养基的自动发酵罐中，发酵期间主要参数控制如下：搅拌转速500～700r/min，溶氧40～50%，温度30℃，pH7.0，培养36h得发酵液；
（3）将10g酪氨酸直接加入1000mL发酵液中，再加入曲拉通1g、抗坏血酸10g、硫酸铜0.2g，在30℃，pH5.0 条件下进行酶促反应8h,取样酸溶后HPLC测左旋多巴含量为9.42g/L，对酪氨酸摩尔转化率为86.5%。色谱条件和培养基同实施例1。
Claims (8)
1.一种酶法制备左旋多巴的方法，其特征是包括以下步骤：
（1）挑取一环嗜麦芽假单胞菌(Pseudomonas maltophilia)的菌种斜面，接入种子培养基中培养，得一级种子液；
（2）将一级种子液以3～10%的接种量接入发酵培养基中，进行发酵培养，发酵结束后离心，收集菌体细胞；
（3）在缓冲溶液中加入酪氨酸和菌体细胞，在18～30℃，pH5.0～6.0 条件下进行酶促反应，将酪氨酸转化为左旋多巴；
步骤（3）中，每升缓冲溶液中加入10-25g酪氨酸；每升缓冲溶液中加入40-60g菌体细胞；
步骤（3）中，采用间歇弱通风的方式辅助酶促反应的进行，间歇弱通风的方式是指：反应过程中每小时通空气15-20min，通气量为0.1vvm～0.5vvm。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征是：步骤（1）中，所述种子培养基由以下重量百分比的组分组成：葡萄糖1.2-2.0%，蛋白胨 0.3-0.8%，氯化钠 0.3-0.8%，氯化铵0.1-0.5%，玉米浆0.8-1.2%，豆饼水解液0.5-1.5%，水余量，pH7.0。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征是：步骤（2）中，所述发酵培养基由以下重量百分比的组分组成：葡萄糖1.5-2.5%,氯化铵0.5-1%，硫酸镁0.02-0.05%，磷酸二氢钾0.08-0.12%，氯化钙 0.008-0.012%，硫酸铜0.01-0.03%，玉米浆0.5-1.5%，豆饼水解液0.1-0.5%，水余量，pH7.0。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征是：步骤（1）中，所述种子培养基由以下重量百分比的组分组成：葡萄糖1.5%，蛋白胨 0.5%，氯化钠 0.5%，氯化铵0.3%，玉米浆 1%，豆饼水解液1%，水余量，pH7.0；步骤（2）中，所述发酵培养基由以下重量百分比的组分组成：葡萄糖2%,氯化铵0.7%，硫酸镁0.04%，磷酸二氢钾 0.1%，氯化钙 0.01%，硫酸铜0.02%，玉米浆1%，豆饼水解液 0.3%，水余量，pH7.0。
5.根据权利要求1或2所述的方法，其特征是：步骤（1）中，培养条件为：28-32℃,150-200r/min培养24-26h；步骤（2）中，培养条件为：搅拌转速200～700r/min，溶氧20～50体积百分比，温度28-30℃，培养36-38h。
6.根据权利要求1或2所述的方法，其特征是：步骤（3）中，反应8-15h。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征是：步骤（3）中，向缓冲溶液中加入酪氨酸后，再进一步的加入表面活性剂、还原保护剂和硫酸铜，然后进行酶促反应。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征是：步骤（3）中，表面活性剂在缓冲溶液中的浓度为0.01～0.3wt%,还原保护剂在缓冲溶液中的浓度为0.1～2wt%，硫酸铜在缓冲溶液中的浓度为0.01～0.1wt%。
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| L-酪氨酸合成L-多巴的研究;彭珍荣，万品珍;《氨基酸杂志》;19891231(第4期);第1-3页 * |
| 嗜麦芽假单胞菌生产L-DOPA发酵条件的研究;唐兵，彭珍荣;《氨基酸杂志》;19911231(第4期);前言，材料与方法，表1 * |
| 静息细胞连续两批次生物催化生产氢化可的松;易奎星等;《生物加工过程》;20051230(第4期);摘要，第41页第1.5节，第42页第2.1节 * |
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