CN102762734B - (s)-1,1,1-三氟-2-丙醇的工业制造方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开的是通过使选自由多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)、异常毕赤酵母(Pichia anomala)、近平滑假丝酵母(Candida parapsilosis)、假丝酵母(Candida mycoderma)、纳加毕赤酵母(Pichia naganishii)、Can dida saitoana、弯曲隐球酵母(Cryptococcus curvatus)、二孢接合酵母(Saturnospora dispora)、贝酵母(Saccharomyces bayanus)和膜醭毕赤酵母(Pichia membranaefaciens)组成的组中的至少1种微生物对1,1,1-三氟丙酮作用而以高光学纯度和良好的收率制造(S)-1,1,1-三氟-2-丙醇的方法。该方法使从自然界发现的微生物在天然状态下作用,因此能避免使用转化体等时的问题,工业上实施容易。
Description
技术领域
本发明涉及作为医药农药中间体而言重要的(S)-1,1,1-三氟-2-丙醇的工业制造方法。
背景技术
(S)-1,1,1-三氟-2-丙醇是作为各种医药农药中间体而言重要的化合物。迄今,在使用化学催化剂的方法以外,研究了使微生物的酶对1,1,1-三氟丙酮作用而使其还原成(S)-1,1,1-三氟-2-丙醇的生物学方法。例如,专利文献1中公开了通过使用了乙醇脱氢酶的1,1,1-三氟丙酮的对映选择性还原来制造具有99%ee以上的对映体过剩率的(S)-1,1,1-三氟-2-丙醇的方法;专利文献2中公开了通过利用市售的干燥面包酵母还原1,1,1-三氟丙酮来制造93~99%ee的(S)-1,1,1-三氟-2-丙醇的方法;专利文献3中公开了一种(S)-1,1,1-三氟-2-丙醇的制造方法,该方法包括使表现乙醇脱氢酶、羰基还原酶等酶的功能的微生物、或转化体、或它们的处理物对1,1,1-三氟丙酮作用的工序。
另一方面,非专利文献1中公开了:通过使用干燥面包酵母还原1,1,1-三氟丙酮,从而可以以约80%ee的光学纯度得到(S)-1,1,1-三氟-2-丙醇,而非专利文献2中公开了通过使用乙醇脱氢酶还原1,1,1-三氟丙酮来得到(S)-1,1,1-三氟-2-丙醇的制造方法。
现有技术文献
专利文献
专利文献1:国际公开2007/054411号
专利文献2:国际公开2007/006650号
专利文献3:国际公开2007/142210号
非专利文献
非专利文献1:M.Buccierelli et al.,Synthesis,11卷,897-899页,1983年
非专利文献2:T.C.Rosen et al.,Chimica Oggi Suppl,43-45页,2004年
发明内容
专利文献1、专利文献3、非专利文献2的方法通过使用在微生物中导入了特定基因的转化体而得到了高光学纯度的(S)-1,1,1-三氟-2-丙醇。然而,转化体由于基因的随机导入而有时会伴随预料不到的性状,也担心来源于其的产物作为杂质而混入产品的危险性、其扩散至自然界时对野生动植物的影响,因此需要证实安全性、用于防止该微生物扩散的特殊设备,实施未必容易。
专利文献2的方法由于使用市售的干燥面包酵母而不需要自行准备培养设备,可以简单地获取微生物。然而,反应需要相对于基质10倍量的微生物,因此很难说所期望的还原反应的效率高,大量的废弃物也成为问题。此外,为了以高光学纯度得到目标产物,需要加热处理微生物,在设想大规模生产时,所要求的微妙的温度调整非常困难,是工业上难以采用的方法。
非专利文献1的方法中的光学纯度低至约80%ee,而且需要相对于基质300倍量以上的微生物,从实用性和生产率的角度来看是难以采用的方法。
本发明的课题在于提供能够经济且简便地以工业规模制造(S)-1,1,1-三氟-2-丙醇的方法。
本发明人等为了解决上述课题而进行了深入研究,结果发现了通过使特定的微生物对1,1,1-三氟丙酮作用而能够以可以在工业上采用的生产量以高光学纯度和良好的收率制造(S)-1,1,1-三氟-2-丙醇的方法,从而完成了本发明。
即,本发明提供以下的[技术方案1]~[技术方案7]所述的技术方案。
[技术方案1]
一种(S)-1,1,1-三氟-2-丙醇的制造方法,其特征在于,该制造方法通过使从自然界中发现的微生物在天然状态下对式[1]所示的1,1,1-三氟丙酮作用,从而得到式[2]所示的(S)-1,1,1-三氟-2-丙醇,
作为所述微生物,使用选自由多形汉逊酵母(Hansenulapolymorpha)、异常毕赤酵母(Pichia anomala)、近平滑假丝酵母(Candida parapsilosis)、假丝酵母(Candida mycoderma)、纳加毕赤酵母(Pichia naganishii)、Candida saitoana、弯曲隐球酵母(Cryptococcus curvatus)、二孢接合酵母(Saturnosporadispora)、贝酵母(Saccharomyces bayanus)和膜醭毕赤酵母(Pichia membranaefaciens)组成的组中的至少1种微生物。
[技术方案2]
根据技术方案1所述的(S)-1,1,1-三氟-2-丙醇的制造方法,其特征在于,微生物具有以下所示的保藏号。
[表1]
[技术方案3]
根据技术方案1或2所述的(S)-1,1,1-三氟-2-丙醇的制造方法,其特征在于,制备从自然界中发现的微生物的天然状态的悬浊液以使微生物的密度达到107~1011cfu/ml,向制备后的该悬浊液中添加1,1,1-三氟丙酮以使该丙酮的浓度达到0.05~3%(w/v)。
[技术方案4]
根据技术方案1~3中任一项所述的(S)-1,1,1-三氟-2-丙醇的制造方法,其特征在于,在反应温度为20~30℃的范围下进行。
[技术方案5]
根据技术方案1~4中任一项所述的(S)-1,1,1-三氟-2-丙醇的制造方法,其特征在于,在反应时的pH为6.0~9.0的范围下进行。
[技术方案6]
根据技术方案1~5中任一项所述的(S)-1,1,1-三氟-2-丙醇的制造方法,其特征在于,还原反应中利用的辅酶NAD(P)H通过微生物自身的脱氢酶再生,而不从外部新加入辅酶NAD(P)H。
[技术方案7]
根据技术方案1~6中任一项所述的(S)-1,1,1-三氟-2-丙醇的制造方法,其特征在于,使用葡萄糖作为辅酶NAD(P)H的再生过程中的脱氢酶的基质。
如前所述,使微生物对1,1,1-三氟丙酮作用来还原得到(S)-1,1,1-三氟-2-丙醇的制造方法是迄今为止广为人知的方法,但为了获得高光学纯度,需要利用转化体、加热处理微生物,而且有时在反应时需要大量的微生物,作为工业制造方法是难以采用的。因此,本发明人等新发现了,通过从自然界中发现的微生物中选出生来就具有将1,1,1-三氟丙酮以高光学纯度还原成(S)-1,1,1-三氟-2-丙醇的能力的特定微生物(也称为“菌体”。),向制备成106~1012cfu/ml的密度的、该微生物的天然状态的悬浊液中添加1,1,1-三氟丙酮以使其浓度达到0.01~5%(w/v),在反应温度5~40℃、pH4.0~10.0下反应,从而能够简便地以工业规模制造高光学纯度的(S)-1,1,1-三氟-2-丙醇。此外,本发明能够将还原反应中利用的辅酶NAD(P)H通过微生物自身的脱氢酶再生,因此不需要从外部新加入辅酶NAD(P)H,是优选的实施方式之一(当然,也可以加入辅酶NAD(P)H来进行反应)。
这里所说的“从自然界中发现的微生物”是指未实施转化等基因操作的菌体,表示保藏于各种微生物保藏机构的野生株。此外,“天然状态”是指将所培养的微生物直接使用,表示不进行将微生物破碎来分离酶的操作,加热处理、化学药剂处理等菌体处理。
在此,获得了如下的非常有用的认识:通过将微生物的密度和1,1,1-三氟丙酮设定为特定的浓度,每批制造的生产量与现有技术相比明显提高,能以大量规模经济地制造。
在本发明中,1,1,1-三氟丙酮的浓度是指该丙酮在该微生物的悬浊液中的浓度(w/v)(不考虑(排除)还原的产物的浓度),并非规定该丙酮在整个反应中的添加总量。
此外,还获得了如下的可喜认识:通过将葡萄糖设定为特定的浓度来添加,反应会顺利进行;细节在后面详述。
如本发明这样,通过从自然界中发现的微生物中选出生来就以高光学纯度提供目标产物的微生物,将所培养的菌体直接用于反应,且使制备成特定密度范围的菌体的悬浊液与1,1,1-三氟丙酮在特定的浓度范围下反应,从而能够以工业规模制造高光学纯度(~100%ee)的(S)-1,1,1-三氟-2-丙醇的这种认识是迄今为止完全不为人所知的。
具体实施方式
能够在工业上简便且效率良好地制造作为医药农药中间体而言重要的(S)-1,1,1-三氟-2-丙醇。
本发明中使用的微生物能够立体有择且效率良好地将1,1,1-三氟丙酮的羰基还原成羟基,通过思考将作为基质的1,1,1-三氟丙酮以适合于反应的浓度添加的方法,能够以高光学纯度和高生产率提供此前难以工业生产的(S)-1,1,1-三氟-2-丙醇。
以下对本发明进行详细说明。本发明中使用的1,1,1-三氟丙酮是公知的化合物,可以由本领域技术人员依据现有技术适当制备,也可以使用在市场上销售的产品。
在本发明中,1,1,1-三氟丙酮理所当然可以使用该化合物自身,除此以外也可以同等地使用与水或碳数1~4的醇的加成物。对于通过采用前述反应条件能够得到(S)-1,1,1-三氟-2-丙醇的微生物,可列举出选自由多形汉逊酵母(Hansenulapolymorpha)、异常毕赤酵母(Pichia anomala)、近平滑假丝酵母(Candida parapsilosis)、假丝酵母(Candida mycoderma)、纳加毕赤酵母(Pichia naganishii)、Candida saitoana、弯曲隐球酵母(Cryptococcus curvatus)、二孢接合酵母(Saturnosporadispora)、贝酵母(Saccharomyces bayanus)和膜醭毕赤酵母(Pichia membranaefaciens)组成的组中的至少1种,优选多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)、近平滑假丝酵母(Candidaparap silosis)、二孢接合酵母(Saturnospora dispora)、贝酵母(Saccharomyces bayanus)、膜醭毕赤酵母(Pichiamembranaefaciens),更优选多形汉逊酵母(Hansenulapolymorpha)或膜醭毕赤酵母(Pichia membranaefaciens)。
对于这些微生物,分别获得了以下所示的保藏号,保藏于各种机构。另外,这些微生物是通常在市场上销售的产品,本领域技术人员可以容易地获取。
[表2]
前述微生物的培养可以使用包含一般微生物的培养所使用的营养成分的培养基(固体培养基或液体培养基),在进行水溶性的1,1,1-三氟丙酮的还原反应时,优选液体培养基。对于培养基,作为碳源,可使用葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖、果糖、海藻糖、甘露糖、甘露糖醇、右旋糖等糖类,甲醇、乙醇、丙醇、丁醇、戊醇、己醇、甘油等醇类,柠檬酸、谷氨酸、苹果酸等有机酸类,然后,作为氮源,可使用铵盐、胨、聚胨、酪蛋氨基酸、尿素、酵母提取物、麦芽提取物、玉米浆等。进而,可以适当添加磷酸二氢钾、磷酸氢二钾等其它无机盐等营养源。
在这些碳源、氮源、无机盐当中,对于碳源,优选加入微生物充分增殖的量且不会阻碍增殖的量,一般相对于1L培养基,加入5~80g,优选加入10~40g。对于氮源也同样,优选加入微生物充分增殖的量且不会阻碍增殖的量,一般相对于1L培养基,加入5~60g,优选加入10~50g,对于作为营养源的无机盐,需要加入微生物增殖所需的元素,但高浓度时会阻碍增殖,因此,一般相对于1L培养基,加入0.001~10g。予以说明,这些可以根据微生物将多个种类组合使用。
培养基中的pH需要在适宜于微生物增殖的范围内进行调整,一般以4.0~10.0进行,优选以6.0~9.0进行。培养中的温度范围需要在适宜于微生物增殖的范围内进行调整,一般以10~50℃进行,优选以20~40℃进行。培养过程中需要给培养基通入空气,优选以0.3~4vvm进行(“vvm”是指每分钟每培养基体积的通气量。volume/volume/minute),更优选以0.5~2vvm进行。对于氧气的需求量多的微生物,可以使用氧气发生器等通入提高了氧气浓度的空气。此外,对于试管、烧瓶等难以设定任意的通气量的器具,将培养基量设定为该器具的容积的20%以下,并安装棉塞、硅塞等通气塞即可。为了顺利地进行培养,优选搅拌培养基,为发酵槽时,对于该装置的搅拌能力,优选以10~100%进行,更优选以20~90%进行。另一方面,为试管、烧瓶等小型器具时,可以使用振荡器进行,优选以50~300rpm进行,更优选以100~250rpm进行。培养时间为微生物的增殖收敛的时间即可,以6~72小时进行,优选以12~48小时进行。
为了使前述微生物对作为基质的1,1,1-三氟丙酮作用,一般可以将培养了微生物的悬浊液直接用于反应。在培养过程中产生的成分会对还原反应产生不良影响时,可以用离心分离等操作将菌体从培养液中分离1次,使用所得菌体(湿菌体)再次制备悬浊液来用于反应。
为了有效地进行反应,需要提高这些悬浊液中的菌体的密度,如果密度过高,有时会因自溶酶的产生、最终代谢产物的蓄积等而阻碍反应,通常以106~1012cfu/ml进行(“cfu”是指形成在琼脂培养基上的菌落的数量,菌落形成单位(colony formingunits)),优选以107~1011cfu/ml进行,更优选以108~1010cfu/ml进行。
在向这些悬浊液中添加1,1,1-三氟丙酮的过程中,该丙酮的浓度需要维持还原反应顺利进行且不会对微生物的生存产生不良影响的浓度,例如,在高于5%(w/v)的浓度下,有时微生物会死亡或光学纯度会降低,因此以该数值以下的浓度进行,即,一般以0.01~5%(w/v)进行,优选以0.05~3%(w/v)进行。关于该丙酮浓度计算的容量的依据,例如,在实施例1中将分装在蒸汽灭菌前的试管中的培养液量作为基准考虑即可,在实施例3中将培养后的微生物的悬浊液总量作为基准考虑即可。此外,对于向该悬浊液中添加1,1,1-三氟丙酮的方法,优选在监测还原反应的条件下逐次添加以维持优选的范围。此外,对于1,1,1-三氟丙酮的添加总量,由于存在因产物的蓄积而使反应收敛的浓度,因此需要根据微生物调整适宜的范围,相对于这些悬浊液,优选为0.1~30%(w/v),更优选为0.2~20%(w/v)。
反应温度需要维持适宜于所选出的微生物的酶反应的范围,一般在5~40℃进行,优选在20~30℃进行。此外,反应时的pH也需要维持适宜于所选出的微生物的酶反应的范围,一般在4.0~10.0进行,优选在6.0~9.0进行。
悬浊液处于静置状态时,微生物沉降、反应效率降低,因此反应时一边搅拌悬浊液一边进行。此外,为了供给微生物的呼吸所需的氧气而需要进行通气,但通气量过多时,1,1,1-三氟丙酮和(S)-1,1,1-三氟-2-丙醇会以气体的形式飞散到体系外,因此优选以0.3vvm以下进行,更优选以0.1vvm以下进行。反应时间根据目标产物的生成情况而决定,一般以6~312小时进行。
本发明中,还原反应中利用的辅酶NAD(P)H(供氢体)通过利用微生物所具有的脱氢酶由辅酶NAD(P)而再生,因此优选使悬浊液中另外存在葡萄糖来进行还原反应,在此,也可使用除了葡萄糖以外的糖类、醇类,例如可使用如微生物的培养部分所述的作为碳源记载的糖类、醇类。葡萄糖可以直接添加到菌体的悬浊液中,也可以预先与作为基质的1,1,1-三氟丙酮混合而添加到悬浊液中。对于辅酶NAD(P)H,也可以另外加入在市场上销售的产品来进行还原反应,但因其非常昂贵而是不经济的。
本发明人等获得了如下的非常可喜的认识:通过不从外部新加入辅酶NAD(P)H而由微生物自身使其再生,从而使每株菌体的还原次数增加,能够经济地以高生产率制造目标产物。微生物自身将细胞中所拥有的辅酶NAD(P)H直接用于还原反应,可通过微生物自身的脱氢酶将反应后生成的NAD(P)再生为辅酶NAD(P)H。予以说明,这里所说的“不从外部新加入辅酶NAD(P)H”是指相对于培养液的辅酶NAD(P)H的量为少于1μmol/L的状态,更优选少于0.1μmol/L(其中,菌体所拥有的辅酶除外)。
如此,不特意向反应体系内添加辅酶NAD(P)H地制造目标产物的方式是“以微生物自身的脱氢酶再生辅酶NAD(P)H,而不从外部新加入辅酶NAD(P)H”的典型,是极为优选的。
对于这里所添加的葡萄糖,需要以不妨碍反应的量添加,优选以将在悬浊液中的浓度维持在0.1~10%(w/v)的方式添加。例如,如后述的实施例4中所示的那样,使用带有糖浓度传感器的浓度控制装置等、在反应体系内的葡萄糖浓度总是保持在2%的条件下进行反应的方式从反应顺利进行的方面来看,也是本发明中特别优选的方式之一。
本发明的方法在从1,1,1-三氟丙酮转换成(S)-1,1,1-三氟-2-丙醇时,以工业制造方法为目标,通过采用适宜的反应条件,可以进行大量制造。
予以说明,本发明能够以作为在实用上也可以采用的光学纯度的85%ee以上、特别优选以98%ee以上得到S构型体的醇、即(S)-1,1,1-三氟-2-丙醇。
为了从反应结束液中回收所生成的(S)-1,1,1-三氟-2-丙醇,可以采用有机合成中的常规的分离方法。反应结束后,通过进行利用有机溶剂的萃取等常规的后处理操作,可以得到粗产物。尤其是,可以通过将反应结束液、或根据需要除去了菌体之后的滤洗液直接付诸蒸馏,可以简便地以良好的收率进行回收。所得粗产物可以根据需要而进行脱水、活性炭、蒸馏、重结晶、柱层析等纯化操作。此外,也可进行用于进一步提高所得产物的光学纯度的操作。
下面示出实施例,但本发明并不受以下实施例的限定。
实施例1
[对1,1,1-三氟丙酮的反应性的研究(筛选)结果]
制备包含1000ml离子交换水、10g葡萄糖、5g聚胨、3g酵母提取物、3g麦芽提取物、3g磷酸二氢钾、2g磷酸氢二钾的组成的液体培养基,以每份5ml分装到试管(φ1.4cm×18cm)中,在121℃下进行15分钟的蒸汽灭菌。
在这些液体培养基中接种表3所示的微生物,在28℃下振荡培养24小时,制备1.0×109~5.0×109cfu/ml的范围的悬浊液。向各菌体悬浊液中添加0.5%(25μl)1,1,1-三氟丙酮、250μl 1M葡萄糖,进一步在28℃下振荡培养24小时,使其反应。反应后,向各反应液中加入醋酸正丁酯并混合后,通过离心分离进行醋酸正丁酯层的分离。对于所得醋酸正丁酯层,通过后述的分析条件测定产物的光学纯度并示于表3。
[表3]
如此,在使用多形汉逊酵母(Hansenula polymorphaNBRC0799)、二孢接合酵母(Saturnospora dispora NBRC0035)、Candida saitoana NBRC0380、弯曲隐球酵母(Cryptococcuscurvatus NBRC 1159)、贝酵母(Saccharomyces bayanusNBRC0676)、膜醭毕赤酵母(Pichia membranaefaciensNBRC0128)时,均可确认(S)-1,1,1-三氟-2-丙醇以高的对映体过剩率生成。
[分析条件]
光学纯度的分析通过气相色谱法进行。气相色谱法的色谱柱使用BGB公司制造的BGB-174(30m×0.25mm×0.25mm),由在载气为氦气、压力为100kPa、柱温为60~85℃(1℃/min)~110℃(5℃/min)、汽化室/检测器(FID)温度为230℃的分析条件下得到的峰面积算出光学纯度。1,1,1-三氟-2-丙醇的各个对映体的保持时间为R构型体22.1min、S构型体23.9min。
实施例2
[对1,1,1-三氟丙酮的反应性的研究(筛选)结果]
制备包含1000ml离子交换水、10g葡萄糖、5g聚胨、3g酵母提取物、3g麦芽提取物、3g磷酸二氢钾、2g磷酸氢二钾的组成的液体培养基(pH 6.5),以每份5ml分装到试管(φ1.4cm×18cm)中,在121℃下进行20分钟的蒸汽灭菌。
在这些液体培养基中接种表4所示的微生物,在30℃下振荡培养24小时,制备1.0×109~5.0×109cfu/ml的范围的悬浊液。向各菌体悬浊液中添加5%(250μl)1,1,1-三氟丙酮、250μl 20%葡萄糖水溶液,进一步在30℃下振荡培养24小时,使其反应。反应后,向各反应液中加入醋酸正丁酯萃取2次,通过气相色谱法(色谱柱:BGB公司制造的BGB-174(30m×0.25mm×0.25mm))测定产物的光学纯度并示于表4。
另一方面,另外进行除了不向在本实施例所示的条件下制备的菌体悬浊液中加入葡萄糖以外均与上述同样的反应操作,通过前述分析方法测定产物的光学纯度,一并示于表4。
[表4]
如此,在使用异常毕赤酵母(Pichia anomala NBRC0120)、多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha NBRC0799)、近平滑假丝酵母(Candida parapsilosis NBRC0708)、假丝酵母(Candidamycoderma NBRC 1247)、纳加毕赤酵母(Pichia naganishiiNBRC1670)时,也均可确认(S)-1,1,1-三氟-2-丙醇以高的对映体过剩率生成。
接着,使用在实施例1和实施例2中记载的微生物中光学纯度高且以高收率提供目标产物的多形汉逊酵母(Hansenulapolymorpha NBRC0799),使1,1,1-三氟丙酮的相对于菌体悬浊液的总量分别达到2%(w/v)(实施例3)、5%(w/v)(实施例4)的方式添加该丙酮,并将其反应结果示于以下。
实施例3
[(S)-1,1,1-三氟-2-丙醇的制造(2%(w/v))]
制备包含2000ml离子交换水、40g葡萄糖、20g胨、12g酵母提取物、12g麦芽提取物、12g磷酸二氢钾、8g磷酸氢二钾的组成的液体培养基,倒入5L容量的发酵槽(Marubishi Co.,Ltd.制造、MDN型5L(S)),在121℃下进行60分钟的蒸汽灭菌。向该液体培养基接种80ml以同样组成的100ml进行初始培养(preliminary culture)而成的多形汉逊酵母(Hansenulapolymorpha NBRC0799)的1.4×109cfu/ml的悬浊液,在28℃、通气1vvm、搅拌500rpm下培养24小时,制备1.7×109cfu/ml(按湿菌重计为41g/L)的悬浊液。此时的pH的调整使用氨水进行,调整至6.5。培养结束后,将通气变更为0.1vvm、搅拌变更为50rpm,使用蠕动泵将在其它容器中准备的在200ml的离子交换水中溶解50.08g 1,1,1-三氟丙酮、90g葡萄糖而成的溶液逐次添加到菌体悬浊液中。每隔24小时监测由微生物进行的基质的还原,确认到78小时后的收率达到79.1%。将该反应液回收到3L的锥形瓶中,在20℃下静置5天进行追加反应。5天后的收率为91.4%。
为了从反应结束后的反应液中回收所生成的1,1,1-三氟-2-丙醇,而进行了蒸馏。回收到344ml馏出液,通过19F-NMR的内标法判明其中含有44.72g的1,1,1-三氟-2-丙醇。通过前述分析条件测定光学纯度,确认到为98.7%ee(S构型体)。
实施例4
[(S)-1,1,1-三氟-2-丙醇的制造(5%(w/v))]
制备包含2000ml离子交换水、60g葡萄糖、30g胨、50g酵母提取物、4.8g磷酸二氢钾、2.5g磷酸氢二钾的组成的液体培养基,倒入5L容量的发酵槽(Marubishi Co.,Ltd.制造、MDN型5L(S)),在121℃下进行60分钟的蒸汽灭菌。向该液体培养基接种80ml以同样组成的100ml进行初始培养而成的多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha NBRC0799)的2.0×109cfu/ml的悬浊液,在28℃、通气1vvm、搅拌500rpm下培养24小时,制备4.3×109cfu/ml(按湿菌重计为86g/L)的悬浊液。此时的pH的调整使用氨水进行,调整至6.5。培养结束后,将通气变更为0.1vvm、搅拌变更为50rpm,使用在线的糖浓度传感器(在线生物传感器BF-410、Biott Co.,Ltd.制造),用计算机程序以葡萄糖浓度维持在2%的方式自动地向悬浊液中添加在其它容器中准备的向300ml的离子交换水中溶解125.2g 1,1,1-三氟丙酮、200g葡萄糖而成的溶液。每隔24小时监测由微生物进行基质的还原,确认到168小时后的收率达到94.9%,结束反应。
为了从反应结束后的反应液中回收所生成的1,1,1-三氟-2-丙醇,而进行了蒸馏。回收到188ml馏出液,通过19F-NMR的内标法判明其中含有109.2g的1,1,1-三氟-2-丙醇。通过前述分析条件测定光学纯度,确认到为98.7%ee(S构型体)。
实施例5
[(S)-1,1,1-三氟-2-丙醇的制造(5%(w/v))、1000L规模]
作为先期培养(further preliminary culture),制备包含200ml水、6g葡萄糖、3g胨、5g酵母提取物、0.48g磷酸二氢钾、0.25g磷酸氢二钾的组成的液体培养基,分装到500mL容量的带缓冲板的锥形瓶中,在121℃下进行15分钟的蒸汽灭菌。在该液体培养基中接种2ml多形汉逊酵母(Hansenula polymorphaNBRC0799)的冷冻保藏菌种,使用旋转式摇床在28℃、160rpm下培养72小时,制备1.6×109cfu/ml的菌体悬浊液。
作为初始培养,将按同样的组成比制备的5000ml的液体培养基倒入10L容量的发酵槽(Marubishi Co.,Ltd.制造),在121℃下进行60分钟的蒸汽灭菌。在其中接种180ml先期培养中制备的菌体悬浊液,在28℃、通气1vvm、搅拌250rpm下培养27小时,制备1.2×109cfu/ml的悬浊液。培养中的pH的调整使用氨水进行,调整至6.5。
进行本培养的1000L发酵槽使用小松川化工机株式会社制造的通气搅拌型培养装置。向培养槽中倒入370L水,溶解9kg酵母提取物、6kg胨、0.96kg磷酸二氢钾、0.5kg磷酸氢二钾,在121℃下进行60分钟的蒸汽灭菌。向其中投入在其它容器中制备的含有30L水、13kg含水结晶葡萄糖的葡萄糖溶液,接种在初始培养中制备的5000ml菌体悬浊液,在28℃、通气100L/min、搅拌200rpm下培养24小时。对于培养结束后的增殖至2.7×109cfu/ml的菌体悬浊液,将通气变更为20L/min、搅拌变更为50rpm,在适当对糖浓度进行测定的条件下,以葡萄糖浓度维持在2%的方式添加在其它容器中准备的向56.5kg的离子交换水中溶解25kg1,1,1-三氟丙酮、43.5kg含水结晶葡萄糖而成的水溶液。每隔24小时监测由微生物进行的基质的还原,确认到168小时后的转换率达到了91.4%,结束反应。培养和反应时的pH使用氨水调整至6.5。
通过19F-NMR的内标法对反应结束后的反应液进行分析,结果判明其中含有13kg的1,1,1-三氟-2-丙醇。通过前述分析条件测定光学纯度,确认到为97.4%ee(S构型体)。
Claims (4)
1.一种(S)-1,1,1-三氟-2-丙醇的制造方法,其特征在于,该制造方法通过使从自然界中发现的微生物在天然状态下对式[1]所示的1,1,1-三氟丙酮作用,从而得到式[2]所示的(S)-1,1,1-三氟-2-丙醇,
作为所述微生物,使用选自由多形汉逊酵母(Hansenulapolymorpha)、弯曲隐球酵母(Cryptococcus curvatus)、二孢接合酵母(Saturnospora dispora)组成的组中的至少1种微生物,
所述微生物具有以下所示的保藏号,
其中,制备微生物的悬浊液以使微生物的密度达到108~1010cfu/ml,向制备后的该悬浊液中添加1,1,1-三氟丙酮以使该丙酮的浓度达到0.05~3%(w/v),
还原反应中利用的辅酶NAD(P)H通过微生物自身的脱氢酶再生,而不从外部新加入辅酶NAD(P)H。
2.根据权利要求1所述的(S)-1,1,1-三氟-2-丙醇的制造方法,其特征在于,在反应温度为20~30℃的范围下进行。
3.根据权利要求1或2所述的(S)-1,1,1-三氟-2-丙醇的制造方法,其特征在于,在反应时的pH为6.0~9.0的范围下进行。
4.根据权利要求1或2所述的(S)-1,1,1-三氟-2-丙醇的制造方法,其特征在于,使用葡萄糖作为辅酶NAD(P)H的再生过程中的脱氢酶的基质。
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