CN105143457A - 发酵生产烃 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及发酵生产烃的方法，其中在发酵罐中在液体发酵培养基中培养生产烃的微生物，其中将包含氧气的入口气体补料到发酵罐中并且入口气体在引入发酵罐中之前的总压力为约1.5巴至约15巴(约150kPa至约1500kPa),其中在发酵废气中的气态中获得烃，并且其中将发酵废气中氧气的浓度控制为低于约10vol-％。本方法是特别有成本效益的，消除或降低了发酵废气燃烧的风险，并且协助从发酵废气中分离烃。

Description

发酵生产烃
本发明涉及使用在发酵罐中培养的微生物发酵生产烃(诸如异丁烯)的方法。
发酵生产方法在多种烃的供应中起重要作用并且通常构成化学方法的重要备选方法。因为发酵方法的运行成本可以是巨大的，对提供更加有成本效益的方法有不断的需求。降低运行成本的尝试包括，例如，开发使用显示降低的能量消耗的代谢途径用于生产想要的化合物的重组微生物，开发具有较高活性的酶，增加底物转化效率，使用较便宜的底物等。在过去十年中，在发酵方法的帮助下生产具有工业兴趣(例如作为生物燃料或作为聚合物的组分)的烃类化合物的尝试已经增加并且同时已经描述了用于在微生物中生产此类化合物的多种酶促反应。相应的发酵方法的开发涉及其本身的问题因为其通常使用涉及不寻常酶促转化的完全新的代谢途径。某些烃类的发酵生产描述于，例如，vanLeeuwenBN等人,ApplMicrobiolBiotechnol,2012,93(4):1377-1387和WO2012/052427中。压力对细菌的影响和相应的生物技术应用在FollonierS等人,ApplMicrobiolBiotechnol,2012,93(5):1805-1815中进一步描述。
本发明解决了提供改善的发酵生产烃的方法的需求。特别地，本发明的方法是有利的，在于其允许消除或降低发酵废气燃烧的风险，所述发酵废气含有想要的气态烃与氧气的组合并且因此是可能易燃的。本发明的方法还允许想要的烃的提高的生产效率改善的产率(关于补料入发酵罐中的氧气的量)，以及易化随后从发酵废气分离烃。
因此，本发明提供了发酵生产烃的方法，其中在发酵罐中的液体发酵培养基中培养生产烃的微生物，其中将包含氧气的入口气体补料入发酵罐中并且入口气体在引入发酵罐中之前的总压力为约1.5巴至约15巴(约150kPa至约1500kPa)，其中在发酵废气的气态中获得烃，并且其中将氧气在发酵废气中的浓度控制到低于约10vol-％
在本文提供的方法中，发酵在高压进行。特别地，入口气体在引入发酵罐中之前的总压力为约1.5巴至约15巴(约150kPa至约1500kPa)。优选地，其为约1.5巴至约10巴(约150kPa至约1000kPa)。其也可以是，例如，约2巴至约10巴(约200kPa至约1000kPa)。更优选地，入口气体在引入发酵罐中之前的总压力为约1.5巴至约8巴(约150kPa至约800kPa),甚至更优选地其为约1.5巴至约6巴(约150kPa至约600kPa)，甚至更优选地其为约2巴至约6巴(约200kPa至约600kPa)，甚至更优选地其为约3巴至约6巴(约300kPa至约600kPa)，并且还甚至更优选地其为约3.5巴至约6巴(约350kPa至约600kPa)。
通常将入口气体直接补料到液体发酵培养基中，优选地通过发酵罐底部的补料孔，并经过液体培养基进入发酵罐的顶部空间(即，发酵罐内液体发酵培养基上方的气相)，从这里回收发酵废气。尽管发酵罐中顶部空间气体的压力将与入口气体引入前的压力大致相同，液体发酵培养基(以及液体发酵培养基中分散的气相)的压力将进一步取决于液体的深度(即，发酵罐中液体培养基的高度)和液体培养基的密度。液体发酵培养基和液体发酵培养基中分散的气相将因此具有压力梯度，朝向发酵罐底部显示较高压力。
如果，例如，使用具有20m的液体发酵培养基高度的发酵罐，发酵罐的底部的总压力将为约2巴(约200kPa)加上液体发酵培养基上方的顶部空间气体的压力。在这种情况下，如果在发酵罐的底部将在引入发酵罐中之前具有约4巴(约400kPa)的压力的入口气体补料到液体发酵培养基中，在20m的液体深度处入口气体流的压力将为约6巴(约600kPa)而在10m的液体深度处其将为约5巴(约500kPa)并且在发酵罐的顶部空间中为约4巴(约400kPa)。
在发酵过程中，液体发酵培养基中的压力可能由于微生物的生长、其消耗养分及其排泄代谢产物而稍微改变。入口气体将流过液体发酵培养基进入发酵罐的顶部空间，从这里将获得发酵废气。顶部空间气体的压力和，因此，发酵废气的压力将基本上对应于引入发酵罐中之前入口气体的压力但可能与之稍有不同，例如，由于微生物消耗包含在入口气体中的氧气以及微生物的气态代谢产物释放，所述代谢产物包括想要的烃和可能由微生物生产的其他气态物质(诸如二氧化碳)。
引入发酵罐中之前约1.5巴至约15巴(约150kPa至约1500kPa)的入口气体的增加的压力是有利的因为其导致包含在入口气体中的氧气转移到液体发酵培养基中增加，这转而允许微生物的提高的氧气利用。提高的氧气利用显著地降低了发酵废气中的氧气浓度并从而协助控制发酵废气中的氧气浓度低于约10vol-％。这是有利的因为其消除或大大降低了发酵废气燃烧的风险，如以下更详细地解释。入口气体的增加的压力因此对本发明的方法所实现的关于易燃性的安全性提高有贡献。
由于入口气体的增加的压力所导致的微生物的提高的氧气利用，还能够实现想要的烃的提高的生产效率和提高的产率(相对于补料入发酵罐中的氧气的量)，特别地因为在发酵生产过程中氧气供应通常是限制性因素。此外，补料到发酵罐中的氧气的增加的利用也降低了所需要的携带氧气的入口气体的总体积并将导致较小体积的待处理的气体并导致烃在发酵废气中更高的浓度，这帮助烃回收。此外，通过在高压运行，尽管在发酵废气中氧气浓度将低于10vol-％，氧气的分压将很可能超过大气条件时空气中氧气的分压(210mbar)。
在本发明的方法中使用在引入发酵罐中之前具有约1.5巴至约15巴(约150kPa至约1500kPa)的增加的压力的入口气体还是有利的因为其协助回收或分离在发酵废气中获得的烃的随后步骤，所述步骤通常在升高的(高于大气)压力下进行。可以使用本领域已知的技术，诸如，例如，具有或不具有蒸馏的物理吸收、具有或不具有蒸馏的反应性吸收、吸附、凝聚、冷冻技术，和/或基于膜的分离从发酵废气中回收或分离烃。优选地，使用具有蒸馏的物理吸收从发酵废气中回收或分离烃。如果，例如，在本发明的方法中待生产的烃是异丁烯，优选地在约4巴或更高(约400kPa或更高)的压力下进行随后的从发酵废气中回收/分离异丁烯。因此，如果在本发明的方法中入口气体在引入发酵罐中之前的总压力是约4巴(约400kPa)并且待生产的烃是异丁烯，可以进一步处理获得的发酵废气以分离想要的异丁烯而不用压缩发酵废气。这是特别有优势的因为含有想要的烃与氧气的组合的发酵废气可能是易燃的并且因此理想地应当不需要进一步压缩用于随后分离。因此，使用引入发酵罐中之前压力为约1.5巴至约15巴(约150kPa至约1500kPa)的入口气体的本发明的方法是有利的在于进一步的、可能是危险的发酵废气的压缩不是必要的或仅较低程度地要求以从发酵废气分离或纯化想要的烃。此外，将入口气体压缩至约1.5巴至约15巴(约150kPa至约1500kPa)的总压力在成本效益方面也是有利的，因为其避免了对压缩可能较大体积的发酵废气的需求。
引入发酵罐中之前约1.5巴至约15巴(约150kPa至约1500kPa)的入口气体的升高的压力的额外的优势在于使得可能在导致想要的烃的代谢途径中形成的气态中间物的蒸发最小化。因此，可以防止或减少此类气态中间物由于蒸发进入发酵废气的损失，并且可以促进随后从发酵废气回收或分离想要的烃，因为在发酵废气中没有或有较少的气态中间物。相应的示例性气态中间物是丙酮，其在导致异丁烯的代谢途径中形成，也如，例如vanLeeuwenBN等人,ApplMicrobiolBiotechnol,2012,93(4):1377-1387和WO2011/032934中所述。后一参考文献，WO2011/032934，描述了从丙酮和提供活化的乙酰基团的化合物生产3-羟基-3-甲基丁酸(也称为β-羟基异戊酸或HIV)的酶促方法；如此生产的3-羟基-3-甲基丁酸可以通过酶促催化的脱羧反应进一步转化为异丁烯，如例如，WO2010/001078或WO2012/052427中所述。
入口气体包含氧气并且，尽管其组成不受特别地限制，其应当优选不含有任何将破坏培养的微生物生产想要的烃的能力的组分。入口气体中氧气的浓度优选地在约10vol-％至约40vol-％的范围内，更优选地在约15vol-％至约40vol-％的范围内，甚至更优选地在约17vol-％至约40vol-％的范围内，甚至更优选地在约19vol-％至约35vol-％的范围内，甚至更优选地在约21vol-％至约35vol-％的范围内，并且还甚至更优选地在约21％vol-％至约30vol-％的范围内。入口气体中二氧化碳的浓度优选地低于或等于约10vol-％，更优选地低于或等于约5vol-％，甚至更优选地低于或等于约600vol-ppm，甚至更优选地低于或等于约400vol-ppm，并且还甚至更优选地低于或等于约350vol-ppm，入口气体中二氧化碳的最低浓度为，例如，约35vol-ppm或更高。
入口气体可以，例如，选自(i)空气，(ii)包含约78vol-％氮气和约21vol-％氧气的气体混合物，(iii)包含氮气和约15vol-％至约40vol-％氧气的气体混合物，其中气体混合物中氮气和氧气的浓度共同构成约95vol-％或更多，(iv)包含氮气和约17vol-％至约40vol-％氧气的气体混合物，其中气体混合物中氮气和氧气的浓度共同构成约95vol-％或更多，(v)包含氮气和约19vol-％至约35vol-％氧气的气体混合物，其中气体混合物中氮气和氧气的浓度共同构成约95vol-％或更多，(vi)包含氮气和约21vol-％至约35vol-％氧气的气体混合物，其中气体混合物中氮气和氧气的浓度共同构成约95vol-％或更多，(vii)包含氮气和约21vol-％至约30vol-％氧气的气体混合物，其中气体混合物中氮气和氧气的浓度共同构成约95vol-％或更多，(viii)包含氮气，约15vol-％至约40vol-％氧气，和低于或等于约10vol-％二氧化碳的气体混合物，其中气体混合物中氮气，氧气和二氧化碳的浓度共同构成约95vol-％或更多，(ix)包含氮气，约17vol-％至约40vol-％氧气，和低于或等于约10vol-％二氧化碳的气体混合物，其中气体混合物中氮气，氧气和二氧化碳的浓度共同构成约95vol-％或更多，(x)包含氮气，约19vol-％至约35vol-％氧气，和低于或等于约5vol-％二氧化碳的气体混合物，其中气体混合物中氮气，氧气和二氧化碳的浓度共同构成约95vol-％或更多，(xi)包含氮气，约21vol-％至约35vol-％氧气，和低于或等于约5vol-％二氧化碳的气体混合物，其中气体混合物中氮气，氧气和二氧化碳的浓度共同构成约95vol-％或更多，或(xii)包含氮气，约21vol-％至约30vol-％氧气，和低于或等于约5vol-％二氧化碳的气体混合物，其中气体混合物中氮气，氧气和二氧化碳的浓度共同构成约95vol-％或更多。例如，可以通过混合空气或富含氧气的空气与从其中已经完全或部分移除待生产的烃的发酵废气获得上述气体混合物(viii)至(xii)中的二氧化碳浓度，如以下进一步描述。
从其中已经完全或部分分离/移除想要的烃的发酵废气也可以反向循环到待引入到发酵罐中的入口气体中。这可以是有利的，因为氧气浓度和，因此，入口气体中的氧气分压可以因而以特别有成本效益的方式降低。在本发明的方法中，入口气体因此可以包含从其中已经分离/移除想要的烃的循环的发酵废气。循环的发酵废气优选是这样的发酵废气，从其中已经分离/移除了至少70vol-％,更优选至少80vol-％,甚至更优选地至少90vol-％,并且还甚至更优选地至少95vol-％的最初在发酵废气中获得的烃。例如，上述气体混合物(i)至(vii)中的任何可以，例如，以20:80(体积/体积),30:70(体积/体积),40:60(体积/体积),50:50(体积/体积),60:40(体积/体积),70:30(体积/体积),或80:20(体积/体积)的比例与从其中已经完全或部分分离/移除了待生产的烃的残余发酵废气(例如，从其中已经分离/移除了至少70vol-％,优选至少80vol-％,更优选地至少90vol-％,并且甚至更优选地至少95vol-％的最初在发酵废气中获得的烃的发酵废气)混合，以获得待在本发明的方法中使用的入口气体。
特别地，从其中已经完全或部分分离/移除了待生产的烃的发酵废气(如上述)可以以这样的量与空气混合，使得获得的气体混合物(其在本发明的方法中用作入口气体)含有约15vol-％至约20vol-％氧气，优选地约17vol-％至约20vol-％氧气。因此，在本发明的方法中，入口气体可以是空气和从其中已经分离/移除烃的循环的发酵废气的混合物，所述混合物包含氮气,约15vol-％至约20vol-％氧气，和低于或等于约10vol-％二氧化碳,其中气体混合物中氮气,氧气和二氧化碳的浓度共同构成约95vol-％或更多。优选地，入口气体是空气和从其中已经分离/移除烃的循环的发酵废气的混合物，所述混合物包含氮气,约17vol-％至约20vol-％氧气,和低于或等于约10vol-％二氧化碳,其中气体混合物中氮气,氧气和二氧化碳的浓度共同构成约95vol-％或更多。更优选地,入口气体是空气和从其中已经分离/移除烃的循环的发酵废气的混合物，所述混合物包含氮气，约17vol-％至约20vol-％氧气,和低于或等于约5vol-％二氧化碳,其中气体混合物中氮气,氧气和二氧化碳的浓度共同构成约95vol-％或更多。如本段落所称的“从其中已经分离/移除了烃的循环的发酵废气”,优选地是从其中已经分离/移除了至少70vol-％,更优选至少80vol-％,甚至更优选地至少90vol-％,并且还甚至更优选地至少95vol-％的最初在发酵废气中获得的烃的发酵废气。
空气作为入口气体的用途在成本效益方面是有利的。因此，入口气体优选地包含空气，特别是浓度等于或大于约70vol-％,更优选地浓度等于或大于约90vol-％,并且甚至更优选地浓度等于或大于约95vol-％。还更优选地,入口气体是空气(即，由空气组成)。取决于微生物生产想要的烃的代谢途径，使用具有增加的浓度的氧气(例如，约21vol-％至约30vol-％氧气)的空气作为入口气体也可以是有利的。
此处描述的入口气体优选地是整个本发明方法中补料到发酵罐中(即，进入发酵罐的液体发酵培养基)的唯一气体。因此，在本发明的方法中，优选没有除了入口气体以外的其他气体引入到发酵罐的液体发酵培养基中。尽管能够对发酵废气添加惰性气体(诸如，例如，氮气)，例如，通过将惰性气体直接补料到发酵罐的顶部空间中，优选没有其他气体添加到发酵罐的顶部空间中获得的发酵废气，特别地不在想要的烃从发酵废气中分离出之前。
包含在引入发酵罐中之前的入口气体中的氧气的分压优选地为约315mbar至约5.25巴(约31.5kPa至约525kPa)并且更优选地为约315mbar至约4.5巴(约31.5kPa至约450kPa)。如果入口气体在引入发酵罐中之前的总压力为约1.5巴至约8巴(约150kPa至约800kPa),那么包含在引入发酵罐中之前的入口气体中的氧气的分压优选地为约315mbar至约2.8巴(约31.5kPa至约280kPa)并且更优选地为约315mbar至约2.4巴(约31.5kPa至约240kPa)。如果入口气体在引入发酵罐中之前的总压力为约3.5巴至约6巴(约350kPa至约600kPa),包含在引入发酵罐中之前的入口气体中的氧气的分压优选地为约735mbar至约2.1巴(约73.5kPa至约210kPa)并且更优选地为约735mbar至约1.8巴(约73.5kPa至约180kPa)。
包含在引入发酵罐中之前的入口气体中的二氧化碳的分压优选地为约52.5μbar至约1.5巴(约5.25Pa至约150kPa),更优选地为约52.5μbar至约9mbar(约5.25Pa至约900Pa),并且甚至更优选地约52.5μbar至约6mbar(约5.25Pa至约600Pa)。如果入口气体在引入发酵罐中之前的总压力为约1.5巴至约8巴(约150kPa至约800kPa),那么包含在引入发酵罐中之前的入口气体中的二氧化碳的分压优选地为约0.0525mbar至约0.8巴(约5.25Pa至约80kPa),更优选地为约0.0525mbar至约4.8mbar(约5.25Pa至约480Pa),甚至更优选地为约0.0525mbar至约3.2mbar(约5.25Pa至约320Pa),并且还甚至更优选地约0.0525mbar至约2.8mbar(约5.25Pa至约280Pa)。如果入口气体在引入发酵罐中之前的总压力为约3.5巴至约6巴(约350kPa至约600kPa),包含在引入发酵罐中之前的入口气体中的二氧化碳的分压优选地为约0.1225mbar至约0.6巴(约12.25Pa至约60kPa),更优选地为约0.1225mbar至约3.6mbar(约12.25Pa至约360Pa),甚至更优选地为约0.1225mbar至约2.4mbar(约12.25Pa至约240Pa),并且还甚至更优选地约0.1225mbar至约2.1mbar(约12.25Pa至约210Pa)。
如以上所解释的，发酵废气的压力与引入到发酵罐中之前的入口气体的压力基本上相同。在本发明的方法中，因此优选控制发酵废气的压力为约1.5巴至约10巴(约150kPa至约1000kPa)。其也可以控制为，例如，约2巴至约10巴(约200kPa至约1000kPa)。更优选地,发酵废气的压力控制为约1.5巴至约8巴(约150kPa至约800kPa),甚至更优选地约1.5巴至约6巴(约150kPa至约600kPa),甚至更优选地约2巴至约6巴(约200kPa至约600kPa),甚至更优选地约3巴至约6巴(约300kPa至约600kPa),并且还甚至更优选地约3.5巴至约6巴(约350kPa至约600kPa)。这可以通过相应地调整引入发酵罐中之前入口气体的压力实现。
含有想要的气态烃与氧气的组合的发酵废气可能是可燃烧的并且因此是危险的。特别地，随着包含氧气的入口气体补料到发酵罐中并且从底部喷射系统向上运行至发酵罐的顶部，其携带了由液体发酵培养基中的微生物生产的想要的烃(例如，异丁烯)，并且在某点，其将进入易燃性包裹层并将成为易燃混合物(由于氧气和烃的高含量)。此气体混合物作为被液体发酵培养基包围的非常细小的泡存在，所述液体发酵培养基形成非常大的散热器，防止分散到液体培养基中时气体混合物的任何燃烧。然而，一旦此气体混合物离开液体发酵培养基(作为发酵废气)，其不再遇到液体发酵培养基的散热器并且将可能是易燃的。
本发明的方法是有利的在于其通过将发酵废气中的氧气的浓度控制为低于约10vol-％并且，因此，低于烃燃烧所需的最小氧气浓度(MOC)而消除或大大降低了发酵废气燃烧的风险。烃的MOC值描述于文献中(例如，在ZabetakisMG,FlammabilityCharacteristicsofCombustibleGasesandVapors,U.S.DepartmentoftheInterior,BureauofMines,Bulletin627,1965中)并且大多数在10vol-％至11.5vol-％氧气的范围。因此，在根据本发明的方法中控制发酵废气中氧气的浓度有利地提高了方法的安全性并协助发酵废气的随后加工。
发酵废气中氧气的较低的最大浓度是优选的因为其进一步降低了燃烧的风险并因而增加了安全性。因此，在根据本发明的方法中发酵废气中氧气的浓度优选地控制为低于约8vol-％,更优选地低于约7vol-％,并且甚至更优选地等于或低于约6vol-％。发酵废气中氧气的这些最大浓度显著低于常规的好氧发酵方法中获得的对应的浓度，后者通常达到在发酵废气中约18vol-％氧气。
发酵废气中氧气的最低浓度不特别地受限制。然而，经济上有利的是控制发酵废气中氧气浓度大于约1vol-％或，甚至更有利地，大于约3vol-％。因此，优选发酵废气中氧气的浓度控制为等于或大于约1vol-％,更优选地等于或大于约2vol-％,并且甚至更优选地等于或大于约3vol-％。特别优选的是发酵废气中氧气的浓度控制为约2vol-％至约8vol-％,更优选地为约3vol-％至约7vol-％,并且最优选地为约4vol-％至约6vol-％。
如果补料到发酵罐中的入口气体是包含约15vol-％至约40vol-％氧气的气体混合物(例如，空气、稀释的空气或富含氧气的空气)，其将随着其移动穿过液体发酵培养基携带由微生物生产的烃，并将最后成为易燃混合物(如以上所解释的，其被形成极大的散热器的液体发酵培养基所包含)。同时，随着此气体混合物移动穿过液体发酵培养基，其氧气浓度将由于微生物的氧气消耗而降低。移动穿过液体发酵培养基的气体混合物将因此在某些点离开易燃包裹层并将作为具有低于约10vol-％,或甚至更低的氧气浓度的发酵废气退出液体发酵培养基(如上所描述)。补料到发酵罐中并且带走想要的烃的入口气体因此通过易燃包裹层，这是由于气体混合物中烃的浓度增加并且氧气的浓度降低。根据本发明的方法因此不同于已知的方法，所述已知的方法为了消除发酵废气的易燃性风险，集中于整个发酵过程中处于易燃性包裹层之外(例如，US2013/0164809)。然而，此类方法承担了比本发明的方法显著更高的运行成本。
例如，可以通过调整入口气体的流动速度和/或通过调整发酵罐中液体发酵培养基的搅拌速度和/或通过调整入口气体中氧气的分压，实现上述对发酵废气中氧气浓度的控制。根据本发明，可以通过这些措施中的任何一种或多种控制发酵废气中氧气的浓度。特别优选的是通过调整入口气体的流动速度和/或通过调整发酵罐中液体发酵培养基的搅拌速度控制发酵废气中氧气的浓度。
入口气体的流动速度对应于每单位时间补料到发酵罐中的入口气体的体积。如果入口气体的流动速度增加，发酵废气中的氧气浓度也将增加，因为更多的包含在入口气体中的氧气将穿过发酵罐而未被微生物所消耗，反之亦然。典型的入口气体流动速度可以是，例如，在约0.05vvm至约0.5vvm(每分钟容器体积,即每液体发酵培养基体积每分钟在标准条件(101.325kPa,20℃)下入口气体流动的体积)的范围内并将尤其取决于发酵培养基中的糖浓度，培养基中的微生物浓度，反应途径需求，和每单位浓度微生物每单位时间的糖消耗的比速度。
可以通过提高搅拌器搅拌培养基的速度增加液体发酵培养基的搅拌速度。较高的搅拌速度将增加氧气从入口气体转移到液体发酵培养基中并将因此降低发酵废气中的氧气浓度。相反地，降低液体发酵培养基的搅拌速度将增加发酵废气中的氧气浓度。一般优选至少每1000L液体发酵培养基约0.15kWh的搅拌速度以允许有利的氧气转移到液体培养基中。因此，搅拌速度可以是，例如，每1000L液体发酵培养基约0.15至约4kWh。
入口气体可以是，例如，空气或补充了氧气从而获得较高的氧分压的空气。可以以不同方式调节入口气体中氧气的分压，例如，通过调整入口气体中氧气浓度(vol-％O2)和/或通过调整引入到发酵罐中之前入口气体的总压力。在后一种情况中，入口气体中氧气分压的调整是通过增加或降低引入到发酵罐中之前入口气体的总压力实现的。在引入发酵罐中之前入口气体的较高的总压力将导致发酵罐中相应地增加的系统压力并从而将增加氧气从入口气体转移到液体发酵培养基中，导致发酵废气中降低的氧气浓度。增加液体发酵培养基中溶解的氧气的浓度也可以刺激微生物的生长和微生物发酵生产烃，并从而实现发酵废气中氧气浓度的额外的降低。相反地，降低在引入发酵罐中之前入口气体的总压力将导致较不明显的氧气从入口气体转移到液体发酵培养基中并且，因此，发酵废气中氧气浓度的增加。
如上所述，入口气体中氧气的分压也可以通过增加或降低入口气体中氧气浓度调整。这可以，例如，通过混合或共同补充入口气体与较之入口气体具有更低或更高的氧气浓度的另一种气体实现(例如，通过混合惰性气体，诸如氮气、或氩，或从其中想要的烃产物已经部分或全部移除的发酵废气，以降低入口气体中氧气浓度，或通过混合富含氧气的空气或纯氧气以增加入口气体中氧气浓度)。通过混合惰性气体调整入口气体中氧气浓度在成本效益方面是较不有利的。还可以通过使用相应的膜(例如，氮气移除膜)从入口气体移除惰性气体(例如，氮气)的一部分，或使用氧气移除膜从入口气体移除氧气的一部分，调整入口气体中氧气浓度。合适的气体分离膜描述于，例如，KorosWJ等人,JournalofMembraneScience,1993,83(1):1-80；KorosWJ等人,JournalofMembraneScience,2000,175(2):181-196；RobesonLM,CurrentOpinioninSolidStateandMaterialsScience,1999,4(6):549-552；YampolskiiY,Macromolecules,2012,45(8):3298–3311；BakerRW,IndEngChemRes,2002,41(6):1393-1411；BernardoP等人,IndEngChemRes,2009,48(10):4638-4663；和IsmailAF等人,JournalofMembraneScience,2001,193(1):1-18。
将理解发酵废气中氧气的浓度也将取决于其他因素，包括微生物生产烃的化学/化学计量学，特别是每分子烃所需要的氧气的量，以及每单位消耗的糖(例如葡萄糖)的烃产量，和每单位时间微生物消耗糖的速度(也由氧气摄取速度，OUR反映)。考虑这些其他因素能够协助实施根据本发明的方法。例如，测定每单位时间烃(产物)形成的全局速度和每单位形成的烃需要的氧气的量提供了每单位时间的氧气消耗速度，这将协助调整在入口气体中给定的氧气浓度时在发酵废气中达到想要的氧气浓度所需的入口气体流动速度。
在根据本发明的方法中，微生物的氧气消耗(即，入口气体中氧气含量减去发酵废气中氧气含量与入口气体中氧气含量的比率)优选地等于或大于约20％，更优选地等于或大于约30％，并且甚至更优选地等于或大于约40％。一旦测定了每单位时间微生物所需的总体氧气，本领域技术人员能够利用标准质量传递关系(诸如Van'tRiet等式，即Van'tRietK,IndEngChemProcessDesDev,1979,18(3):357-364中给出的等式8)以定义混合强度，其与具体的携带氧气的入口气体流动速度的参数，氧气浓度和压力的组合，将导致想要的最少氧气消耗和发酵废气中最大氧气出口浓度。
特别地，基于每单位时间烃(产物)形成的全局速度，每单位形成的烃所需要的氧气的量，和入口气体的氧气分压和流动速度，本领域技术人员能够通过物料平衡计算废气的氧气分压。因此，调整入口气体流动速度以达到想要的百分比氧气消耗和发酵废气中的氧气分压。为了确保此氧气消耗将实际上在发酵罐中发生，调整引入发酵罐中之前入口气体的压力和液体发酵培养基的搅拌速度以确保适当的质量传递系数和浓度驱动力以满足全局氧气质量运输需求。
高氧气消耗是有利的因为其协助调整发酵废气中的氧气浓度至想要的低值，诸如低于约10vol-％。此外，每单位体积的入口气体消耗的氧气越多，入口气体所需量将越少。因此，更大的氧气消耗允许以更高的浓度获得发酵废气中想要的烃，这将使得随后从发酵废气回收/分离烃的步骤更加有成本效益并更容易实现。
在实践中，本领域技术人员能够基于代谢途径化学，细胞密度和比速度信息测定全局氧气需求，指定入口气体中氧气的浓度，决定发酵废气中允许的氧气的浓度，并然后基于前述信息从物料平衡得出相应的入口气体流动速度。补料到发酵罐中的氧气的总量等于发酵罐中的微生物消耗的氧气的量加上在发酵废气中离开发酵罐的氧气的总量，其是理论的物料平衡，即微生物将消耗那么多的氧气只要为其提供那么多的氧气。为了使之付诸实践，需要充足的从气相到液相的氧气的质量传递。因此，一旦定义了引入发酵罐中之前入口气体的具体压力和液体发酵培养基中的具体溶解的氧气浓度，可以得出确保足够的氧气从气相转移到液相所需的搅拌速度，例如，使用Van'tRiet等式。
待在本发明的方法中使用的发酵罐优选是塞流发酵罐(也称为塞流设计的发酵罐)。因此，优选至少70％，更优选地至少90％，并且最优选地100％的存在发酵罐中的搅拌器的总数是诱导径向混合(与气流方向垂直)和显著降低的垂直/轴向混合(气流方向)的搅拌器。待在塞流发酵罐中使用的此类搅拌器可以，例如，为Rushton涡轮类型搅拌器。发酵罐可因此包含至少两个(优选地至少三个,更优选地至少四个,甚至更优选地至少五个)可以在搅拌轴上垂直安排的Rushton涡轮类型搅拌器，并且优选至少70％，更优选地至少90％，并且最优选地100％的存在发酵罐中的搅拌器的总数是Rushton涡轮类型搅拌器。Rushton涡轮类型搅拌器通常为具有叶片，特别是半管叶片的平盘的形式，所述叶片垂直地固定并且提供优秀的径向混合(与搅拌轴和气流方向垂直)和显著降低的垂直/轴向混合(气流方向)，从而创造每个搅拌器两个混合区。因此，当包含氧气的入口气体补料到塞流发酵罐中时(优选地在发酵罐的底部)，其将形成分散在液体发酵培养基中的气相，所述气相将朝着发酵罐的顶部空间向上移动，像一系列的薄“塞”，即基本没有垂直混合。
在本发明的方法中使用塞流发酵罐(即，塞流设计的发酵罐)的结果是，移动通过液体发酵培养基的气相基本上将没有反相混合(其从补料到发酵罐中的入口气体形成)并且，因此，分散在液体发酵培养基中的气相将是高度分级的。朝着发酵罐的顶部，在液体发酵培养基中分散的气相的氧气浓度将逐渐降低，因为培养的微生物的氧气消耗以及因为防止气相的反向混合。使用塞流发酵罐将因此增强由于培养的微生物的氧气消耗的发酵废气中氧气浓度的降低(较之入口气体中氧气浓度)。在本发明的方法中这是高度有利的，因为其大大协助了控制发酵废气中氧气浓度低于约10vol-％(或，例如，低于约8,7或6vol-％，如上所述)。
塞流发酵罐的混合概念在根本上不同于通常在发酵生产方法中使用的搅拌器设计，其中，例如，一个Rushton涡轮类型搅拌器可以在发酵罐的底部上使用并且3至5个斜叶涡轮可以沿垂直轴在Rushton涡轮类型搅拌器上方放置。此类常规的搅拌器设计目标在于最大化径向以及垂直/轴向混合以最大化氧气从入口气体运输到液体发酵培养基中并且在液体发酵培养基中维持高氧气含量。在此类发酵罐中，移动通过液体发酵培养基的气相将沿着发酵罐中的气流方向具有基本上均匀的组成。与之相对，在本发明的方法中使用塞流发酵罐(即，塞流设计的发酵罐)并不通过最大化整个发酵罐气相中氧气浓度而最大化氧气运输到液体发酵培养基中，然而，其允许最大化微生物引起的发酵废气中氧气浓度的降低。
因此优选待在本发明的方法中使用的发酵罐是塞流发酵罐(即，塞流设计的发酵罐)或，换言之，优选发酵罐中的气流以使得其非常接近塞流的方式分级。此类分级的实例描述于PaulEL,Atiemo-ObengV,和KrestaSM(编辑),HandbookofIndustrialMixing:ScienceandPractice,JohnWiley&Sons,Inc.,2004中显示的图6-24中。与之相对，常规的发酵方法通常使用导致分散在液体发酵培养基中的气相的显著反向混合的搅拌装置。此类搅拌装置的实例可见于上述参考文献“HandbookofIndustrialMixing”的图5-25,6-20和11-2中。
塞流发酵罐的额外的优势是CO2分压也是分级的，这导致发酵罐中比使用反向混合发酵罐的情况下更低的碳酸氢盐水平。在反向混合发酵罐的情况下，CO2的浓度(vol-％)主要是恒定的并且CO2分压实际上上升，在液体发酵培养基中进一步下降，即朝着分布器方向。塞流发酵罐符合相反的情形。CO2的浓度(vol-％)和CO2分压在分布器区域最低并且随着气泡上升而上升。当在塞流发酵罐中使用空气作为入口气体时CO2的平均分压为在反向混合发酵罐中的约一半。这导致液体发酵培养基中较低的碳酸氢盐水平，因为碳酸氢盐化学相对于液体混合时间是缓慢的并且与平均而并非出口CO2分压平衡。
根据本发明待生产的烃是以发酵废气中的气体形式获得的。因此，待生产的烃优选地是这样的烃，其当作为纯化合物存在时，在1巴(100kPa)时具有低于120℃的沸点。
优选地，待生产的烃是选自IA类别易燃液体的化合物(即，具有低于73°F(22.8℃)的闪点和低于100°F(37.8℃)的沸点的化合物)，选自IB类别易燃液体的化合物(即，具有低于73°F(22.8℃)的闪点和大于或等于100°F(37.8℃)的沸点的化合物)，选自IC类别易燃液体的化合物(即，具有大于或等于73°F(22.8℃)和低于100°F(37.8℃)的闪点的化合物)，或选自II类可燃烧液体的化合物(即，具有大于或等于100°F(37.8℃)和低于140°F(60℃)的闪点的化合物)，如U.S.NationalFireProtectionAssociation的出版物“NFPA30,FlammableandCombustibleLiquidsCode,2012版”中所定义(包括其中提供的闪点和沸点的定义)。更优选地，烃是选自IA类别易燃液体、IB类别易燃液体，或IC类别易燃液体的化合物。
特别优选烃是烯，并且更优选地是C2-8烯，例如，以下式(I)的C2-8烯:
其中R1、R2、R3和R4彼此独立地选自氢、C1-6烷基或C2-6链烯基，条件是式(I)的化合物中碳原子的总数是2至8的整数，优选地2至6的整数(即，2、3、4、5或6)，并且更优选地3至5的整数(即，3、4、或5)。
因此，待由微生物生产的烃优选地是选自乙烯、丙烯、丁烯(例如，异丁烯、1-丁烯或2-丁烯)、戊烯、己烯、庚烯、辛烯、丁二烯(例如，1,3-丁二烯)、戊二烯(例如，异戊二烯或2-甲基-1,3-丁二烯)、己二烯、庚二烯、或辛二烯的烯。更优选地,烃是选自丙烯、丁烯(例如，异丁烯,1-丁烯或2-丁烯)、戊烯、丁二烯(例如，1,3-丁二烯)、或戊二烯(例如，异戊二烯或2-甲基-1,3-丁二烯)的烯。甚至更优选地，烃是选自丙烯、异丁烯、1-丁烯、2-丁烯(例如，顺-2-丁烯、反-2-丁烯，或其混合物)、1,3-丁二烯,或异戊二烯的烯。甚至更优选地，烃是选自丙烯、异丁烯、1,3-丁二烯，或异戊二烯的烯。甚至更优选地，烃是异丁烯或1,3-丁二烯，并且最优选地其为异丁烯。
在特别优选的实施方案中，待生产的烃是异丁烯并且入口气体在引入发酵罐中之前的总压力为约3.5巴至约6巴(约350kPa至约600kPa),这协助随后从发酵废气分离异丁烯，例如，通过物理吸收。在另一个特别的实施方案中，待生产的烃是丙烯并且入口气体在引入发酵罐中之前的总压力为约14巴至约15巴(约1400kPa至约1500kPa),这协助随后从发酵废气分离丙烯，例如，通过物理吸收。
在本发明的方法中，在发酵废气中以气态获得待生产的烃。因此，入口气体在引入发酵罐中之前的总压力和液体发酵培养基的温度的选择将尤其取决于待生产的烃的物理化学性质。例如，一般规则是，烃中所包含的碳原子数越大，入口气体在引入发酵罐中之前的总压力将越低。因此，如果待生产的烃是丙烯，特别优选的入口气体在引入发酵罐中之前的总压力将为约5巴至约15巴。如果待生产的烃是异丁烯，特别优选的入口气体在引入发酵罐中之前的总压力将为约3巴至约5巴。如果待生产的烃是异戊二烯，特别优选的入口气体在引入发酵罐中之前的总压力将为约2巴至约4巴。如果待生产的烃是己烯，特别优选的入口气体在引入发酵罐中之前的总压力将为约1.5巴至约3巴。
待在本发明的方法中使用的微生物可以是能够在发酵培养基中培养的任何微生物，诸如,例如，细菌细胞、真菌细胞、动物细胞，或植物细胞。优选地，根据本发明待使用的微生物是细菌或真菌。细菌优选地选自埃希氏菌属(Escherichia)、发酵单胞菌属(Zymomonas)、红球菌属(Rhodococcus)、假单胞菌属(Pseudomonas)、芽孢杆菌属(Bacillus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、肠球菌属(Enterococcus)、片球菌属(Pediococcus)、产碱杆菌属(Alcaligenes)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、类芽孢杆菌属(Paenibacillus)、节杆菌属(Arthrobacter)、棒状杆菌属(Corynebacterium)或短杆菌属(Brevibacterium)。更优选地，细菌选自大肠杆菌、真养产碱杆菌(Alcaligeneseutrophus)、地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)、浸麻类芽孢杆菌(Paenibacillusmacerans)、红串红球菌(Rhodococcuserythropolis)、恶臭假单胞菌(Pseudomonasputida)、植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)、屎肠球菌(Enterococcusfaecium)、鹑鸡肠球菌(Enterococcusgallinarium)、粪肠球菌(Enterococcusfaecalis)、戊糖片球菌(Pediococcuspentosaceus)、乳酸片球菌(Pediococcusacidilactici)、运动发酵单胞菌(Zymomonasmobilis)、谷氨酸棒状杆菌(Corynebacteriumglutamicum)，或枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)，并且甚至更优选地细菌是大肠杆菌。真菌优选地是酵母，并且更优选地选自酵母属(Saccharomyces)、毕赤酵母属(Pichia)、假丝酵母属(Candida)、汉逊酵母属(Hansenula)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)或克鲁维酵母菌属(Kluyveromyces)。甚至更优选地，真菌或酵母选自酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)、白假丝酵母(Candidaalbicans)、多形汉逊酵母(Hansenulapolymorpha)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)、马克斯克鲁维酵母(Kluyveromycesmarxianus)、或乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyceslactis)。还甚至更优选地，真菌/酵母是酿酒酵母。因此，特别优选微生物是大肠杆菌或酿酒酵母，并且最优选微生物是大肠杆菌。
微生物优选地使用导致烃的代谢途径中的氧气生产想要的烃和/或微生物优选地使用氧气用于其生长。因此，微生物优选地是好氧微生物，诸如，例如，专性好氧微生物，兼性厌氧微生物，或微量需氧微生物。
在特别优选的实施方案中，待生产的想要的烃是异丁烯并且由微生物生产异丁烯的酶促途径涉及丙酮和乙酰辅酶A酶促转化为3-羟基-3甲基丁酸。可以如WO2011/032934中所述实现此转化。例如，可以通过采用具有HMGCoA合酶(EC2.3.3.10)的活性的酶或具有C-C键切割/缩合裂合酶活性的酶，诸如HMGCoA裂合酶(EC4.1.3.4)，或PksG蛋白，实现丙酮和乙酰辅酶A酶促转化为3-羟基-3甲基丁酸。在优选的实施方案中，HMGCoA合酶(EC2.3.3.10)用于此转化。然后可以在两步中将3-羟基-3甲基丁酸进一步转化为异丁烯。第一步，即3-羟基-3甲基丁酸与ATP反应形成3-甲基-3-膦酰基氧-丁酸(3-膦酰基氧-异戊酸)，优选地是通过如例如，WO2012/052427中所描述的酶促催化的磷酸化反应实现的。第二步优选地是通过如例如，WO2010/001078或WO2012/052427中所描述的酶促催化的脱羧反应实现的。特别优选提供异丁烯的脱羧作用是通过使用甲羟戊酸二磷酸脱羧酶实现的。微生物因此优选地是这样的大肠杆菌，其能够合成丙酮，将其转化为3-羟基-3甲基丁酸，并将3-羟基-3甲基丁酸转化为异丁烯(优选地通过磷酸化和脱羧反应)。
在其他优选的实施方案中，待生产的想要的烃是丙烯并且由微生物生产丙烯的酶促途径涉及第一步为由第二醇脱氢酶将丙酮酶促转化为丙-2-醇(Hanai等人,ApplEnvironMicrobiol,2007,73:7814-7818)并且随后的步骤为由水合酶将丙-2-醇脱水为丙烯，如例如，WO2011/076691和WO2011/076689中所述。优选通过油酸水合酶(EC4.2.1.53)、kievitone水合酶(EC4.2.1.95)、或phaseollidin水合酶(EC4.2.1.97)实现丙-2-醇脱水为丙烯。
在其他优选的实施方案中，待生产的想要的烃是1,3-丁二烯并且由微生物生产1,3-丁二烯的酶促途径涉及2-丁烯-1-醇(巴豆醇)或3-丁烯-2-醇酶促转化为1,3-丁二烯。3-丁烯-2-醇转化为1,3-丁二烯优选地是通过酶促催化的脱水反应实现的。优选转化是通过使用油酸水合酶(EC4.2.1.53)、kievitone水合酶(EC4.2.1.95)、或phaseollidin水合酶(EC4.2.1.97)实现的。2-丁烯-1-醇(巴豆醇)转化为1,3-丁二烯优选地是通过使用巴豆醇激酶，2-丁烯基-4-磷酸激酶，和丁二烯合酶实现的，如例如WO2012/106516中所描述。
在其他优选的实施方案中，待生产的想要的烃是异戊二烯并且由微生物生产异戊二烯的酶促途径涉及3-甲基-2-丁烯-1-醇(prenol)、2-甲基-3-丁烯-2-醇、3-甲基-3-丁烯-1-醇(isoprenol)或3-甲基-3-丁烯-2-醇酶促转化为异戊二烯。这些转化优选地通过酶促催化的脱水反应实现。优选通过使用油酸水合酶(EC4.2.1.53)、kievitone水合酶(EC4.2.1.95)、或phaseollidin水合酶(EC4.2.1.97)实现转化。
通过在液体发酵培养基中培养微生物实施根据本发明的方法。使用允许待培养的微生物的生长和待生产的烃的生产的发酵培养基。适当的培养基的选择属于本领域技术人员的普通知识。
一般而言，发酵培养基含有合适的碳源。合适的碳源的实例为，但不限于，单糖诸如葡萄糖或果糖，寡糖诸如乳糖或蔗糖，多糖诸如淀粉或纤维素或其混合物，以及来自可再生原料的未纯化的混合物诸如干酪乳清渗透物、玉米浆、甜菜糖浆，和大麦麦芽。
碳源也可以是一碳底物，诸如二氧化碳或甲醇，已经展示了其代谢转化为关键的生物化学中间物。例如，在甲基营养型酵母中(YamadaK等人,Agric.Biol.Chem.1989,53:541-543)以及在细菌中(Hunter等人,Biochemistry1985,24:4148-4155)已经报告了从单碳源(例如，甲醇、甲醛或甲酸)生产甘油。这些生物能够同化氧化态范围从甲烷到甲酸的单碳化合物，并生产甘油。碳同化的途径可以通过核酮糖单磷酸、通过丝氨酸、或通过木酮糖-单磷酸(Gottschalk,BacterialMetabolism,第二版,Springer-Verlag:NewYork1986)。核酮糖单磷酸途径涉及甲酸与核酮糖-5-磷酸缩合形成六碳糖，所述六碳糖成为果糖并最终成为三碳产物甘油醛-3-磷酸。类似地，丝氨酸途径将一碳化合物经由亚甲基四氢叶酸同化进入糖酵解途径。
也已知一些生物，诸如甲基营养型生物，利用多种其他含碳化合物诸如甲胺、葡萄糖胺和多种氨基酸用于代谢活性。例如，已知甲基营养型酵母利用来自甲胺的碳形成海藻糖或甘油(Bellion等人,Microb.GrowthC1Compd.,[Int.Symp.],7th(1993),415-432.编辑:Murrell,J.Collin；Kelly,DonP.Publisher:Intercept,Andover,UK)。相似地，假丝酵母属的多个物种代谢丙氨酸或油酸(Sulter等人,Arch.Microbiol.1990,153,485-489)。因此，在根据本发明的方法的液体发酵培养基中所含有的碳源可以涵盖多种含碳底物并将仅受微生物的选择以及可能受待产生的想要的烃的选择限制。
包含在液体发酵培养基中的优选的碳源是葡萄糖、果糖、蔗糖、源自纤维素的或木质纤维素原料的糖混合物，或甲醇。更优选地，液体发酵培养基包含葡萄糖作为碳源。
可以在液体发酵培养基中以例如，约1g/l至约20g/l，特别地约5g/l至约15g/l，或备选地约10g/l的浓度提供碳源(例如，葡萄糖)。
除了适当的碳源以外，发酵培养基一般也含有本领域技术人员已知的适当的矿物质、盐、辅因子、缓冲剂和其他组分，其对于微生物的生长和对生产想要的烃所必需的酶促途径的促进是适当的。
待使用的发酵培养基不是关键的，但其必须支持所用的微生物的生长并且促进生产想要的烃所必需的生物合成途径。可以使用常规的发酵培养基，包括，但不限于，含有有机氮源诸如酵母提取物或蛋白胨和至少一种可发酵的碳源的复合培养基；基本培养基；和确定成分培养基。本发明中优选的生长培养基是常见的商业制备的培养基诸如LuriaBertani(LB)肉汤、沙氏葡萄糖(SD)肉汤或酵母培养基(YM)肉汤。也可使用其他确定成分或合成的生长培养基并且用于特别的微生物的生长的适当培养基将是微生物或发酵科学领域的技术人员知晓的。调节发酵培养基的pH值以符合方法中使用的微生物的生长需求。发酵的适当pH范围通常在pH5.0至pH9.0之间，其中pH6.0至pH8.0是优选的起始条件。
在取决于特定微生物的需求的适当的温度下在液体发酵培养基中培养微生物。典型的发酵条件采用约25℃至约45℃，优选地约30℃至约37℃的温度。然而，如果在本发明的方法中采用嗜热微生物，可以使用更高的温度。
可以在任何适当的发酵罐中实施根据本发明的方法。此类发酵罐包括，例如，搅拌釜式发酵罐，气升式发酵罐、鼓泡塔发酵罐，或其任意组合。如上所述，发酵罐优选地为塞流发酵罐(即，塞流设计的发酵罐)。待在本发明的方法中使用的发酵罐(例如，搅拌釜式发酵罐或，特别地，塞流发酵罐)可任选地装备有pH电极、氧传感器电极、二氧化碳传感器电极、葡萄糖传感器电极(例如，酶促葡萄糖传感器电极或非酶促葡萄糖传感器电极)，和/或温度控制单元。
通常地并且优选地，本发明的方法是以分批方法实施的。经典的分批发酵是封闭的系统，其中培养基的组成在发酵开始时设定并且在发酵过程中不受人工改变。因此，在发酵开始时用想要的一种或多种微生物接种培养基并且允许发酵进行而不对系统添加任何。然而，通常，“分批”发酵是关于添加碳源的分批方法，并且通常进行控制因子诸如pH和氧气浓度的尝试。在分批系统中，系统的代谢物和生物质组成不断改变，直至发酵停止时。在分批培养中微生物细胞缓和通过静止停滞期至高生长对数期并最终至稳定期，在稳定期生长速度降低或停止。如果未受处理，稳定期中的细胞将最终死亡。对数期中的细胞一般负责大量烃生产。
最优选地，以补料-分批方法进行根据本发明的方法，即在补料-分批条件下在发酵罐中在液体发酵培养基中培养微生物。补料-分批方法包含典型的分批系统，例外是随着发酵过程增量添加底物。当分解代谢阻抑倾向于抑制微生物细胞的代谢时以及想要在培养基中具有有限量的底物时补料-分批系统是特别有用的。分批和补料-分批发酵是常用的并且是本领域中公知的并且在ThomasD.Brock的Biotechnology:ATextbookofIndustrialMicrobiology,第二版(1989),SinauerAssociates,Inc.,Sunderland,Mass.,或在Deshpande,MukundV.,ApplBiochemBiotechnol,1992,36,227中可以找到实例。
尽管本发明优选地以分批模式(且最优选地以补料分批模式)实施，原则上也能够使用连续发酵实施该方法。连续发酵是开放的系统，其中向生物反应器连续地添加确定成分发酵培养基并且同时移出相等量的条件培养基用于处理。连续发酵通常将培养物维持在恒定的高密度，此时细胞主要处于对数期生长。连续发酵的一个优势是其允许调节影响细胞生长或终产物浓度的一个因子或任何数量的因子。通过连续发酵尝试维持稳态生长条件并因此由于培养基被抽去的细胞损失必须与发酵中的细胞生长速度平衡。调节连续发酵方法的养分和生长因子的方法以及最大化产物形成速度的技术是工业微生物学领域中公知的并且由Brock(见上文)详述了多种方法。
在特别优选的实施方案中，待在根据本发明的方法中生产的烃是C2-8烯烃并且入口气体中氧气的浓度在约15vol-％至约40vol-％的范围内。在此实施方案中，C2-8烯烃优选地选自乙烯、丙烯、异丁烯、1-丁烯、2-丁烯、1,3-丁二烯，或异戊二烯，并且更优选地是异丁烯。入口气体中氧气的浓度优选地在约17vol-％至约40vol-％的范围内，更优选地在约19vol-％至约35vol-％的范围内，并且甚至更优选地在约21vol-％至约35vol-％的范围内。还甚至更优选地，入口气体是包含氮气和约21vol-％至约35vol-％氧气的气体混合物，其中气体混合物中氮气和氧气的浓度共同构成约95vol-％或更多。入口气体在引入发酵罐中之前的总压力优选地为约1.5巴至约10巴(约150kPa至约1000kPa),更优选地为约1.5巴至约8巴(约150kPa至约800kPa),甚至更优选地为约1.5巴至约6巴(约150kPa至约600kPa),甚至更优选地为约2巴至约6巴(约200kPa至约600kPa),甚至更优选地为约3巴至约6巴(约300kPa至约600kPa),并且还甚至更优选地为约3.5巴至约6巴(约350kPa至约600kPa)。在此实施方案中，还优选将发酵废气中氧气的浓度控制为低于约8vol-％,并且更优选地控制为等于或低于约6vol-％。发酵罐优选地是塞流发酵罐。微生物优选地是大肠杆菌。本发明特别地涉及前述此实施方案的一般的和/或优选的特征的每种和每个组合。
在其它特别优选的实施方案中，待在根据本发明的方法中生产的烃是C2-8烯烃并且入口气体中氧气的浓度在约17vol-％至约40vol-％的范围内。在此实施方案中，C2-8烯烃优选地选自乙烯、丙烯、异丁烯、1-丁烯、2-丁烯、1,3-丁二烯，或异戊二烯，并且更优选地是异丁烯。入口气体中氧气的浓度优选地在约19vol-％至约35vol-％的范围内，并且更优选地在约21vol-％至约35vol-％的范围内。甚至更优选地，入口气体是包含氮气和约21vol-％至约35vol-％氧气的气体混合物，其中气体混合物中氮气和氧气的浓度共同构成约95vol-％或更多。入口气体在引入发酵罐中之前的总压力优选地为约1.5巴至约10巴(约150kPa至约1000kPa),更优选地为约1.5巴至约8巴(约150kPa至约800kPa),甚至更优选地为约1.5巴至约6巴(约150kPa至约600kPa),甚至更优选地为约2巴至约6巴(约200kPa至约600kPa),甚至更优选地为约3巴至约6巴(约300kPa至约600kPa),并且还甚至更优选地为约3.5巴至约6巴(约350kPa至约600kPa)。在此实施方案中，还优选将发酵废气中氧气的浓度控制为低于约8vol-％,并且更优选地控制为等于或低于约6vol-％。发酵罐优选地是塞流发酵罐。微生物优选地是大肠杆菌。本发明特别地涉及前述此实施方案的一般的和/或优选的特征的每种和每个组合。
在其它特别优选的实施方案中，待在根据本发明的方法中生产的烃是C2-8烯烃，入口气体中氧气的浓度在约15vol-％至约40vol-％的范围内，并且引入发酵罐之前入口气体的总压力为约1.5bar至约10bar(约150kPa至约1000kPa)。在此实施方案中，C2-8烯烃优选地选自乙烯、丙烯、异丁烯、1-丁烯、2-丁烯、1,3-丁二烯，或异戊二烯，并且更优选地是异丁烯。入口气体中氧气的浓度优选地在约17vol-％至约40vol-％的范围内，更优选地在约19vol-％至约35vol-％的范围内，并且甚至更优选地在约21vol-％至约35vol-％的范围内。还甚至更优选地，入口气体是包含氮气和约21vol-％至约35vol-％氧气的气体混合物，其中气体混合物中氮气和氧气的浓度共同构成约95vol-％或更多。入口气体在引入发酵罐中之前的总压力优选地为约1.5巴至约8巴(约150kPa至约800kPa),更优选地为约1.5巴至约6巴(约150kPa至约600kPa),甚至更优选地为约2巴至约6巴(约200kPa至约600kPa),甚至更优选地为约3巴至约6巴(约300kPa至约600kPa),并且还甚至更优选地为约3.5巴至约6巴(约350kPa至约600kPa)。在此实施方案中，还优选将发酵废气中氧气的浓度控制为低于约8vol-％,并且更优选地控制为等于或低于约6vol-％。发酵罐优选地是塞流发酵罐。微生物优选地是大肠杆菌。本发明特别地涉及前述此实施方案的一般的和/或优选的特征的每种和每个组合。
在其它特别优选的实施方案中，待在根据本发明的方法中生产的烃是C2-8烯烃，入口气体中氧气的浓度在约17vol-％至约40vol-％的范围内，并且引入发酵罐之前入口气体的总压力为约1.5bar至约10bar(约150kPa至约1000kPa)。在此实施方案中，C2-8烯烃优选地选自乙烯、丙烯、异丁烯、1-丁烯、2-丁烯、1,3-丁二烯，或异戊二烯，并且更优选地是异丁烯。入口气体中氧气的浓度优选地在约19vol-％至约35vol-％的范围内，并且更优选地在约21vol-％至约35vol-％的范围内。甚至更优选地，入口气体是包含氮气和约21vol-％至约35vol-％氧气的气体混合物，其中气体混合物中氮气和氧气的浓度共同构成约95vol-％或更多。入口气体在引入发酵罐中之前的总压力优选地为约1.5巴至约8巴(约150kPa至约800kPa),更优选地为约1.5巴至约6巴(约150kPa至约600kPa),甚至更优选地为约2巴至约6巴(约200kPa至约600kPa),甚至更优选地为约3巴至约6巴(约300kPa至约600kPa),并且还甚至更优选地为约3.5巴至约6巴(约350kPa至约600kPa)。在此实施方案中，还优选将发酵废气中氧气的浓度控制为低于约8vol-％,并且更优选地控制为等于或低于约6vol-％。发酵罐优选地是塞流发酵罐。微生物优选地是大肠杆菌。本发明特别地涉及前述此实施方案的一般的和/或优选的特征的每种和每个组合。
在其他特别优选的实施方案中，待在根据本发明的方法中生产的烃选自乙烯、丙烯、异丁烯、1-丁烯、2-丁烯、1,3-丁二烯、或异戊二烯，入口气体中氧气的浓度在约17vol-％至约40vol-％的范围内，入口气体在引入发酵罐中之前的总压力为约1.5巴至约10巴(约150kPa至约1000kPa),并且将发酵废气中氧气的浓度控制为低于约8vol-％。在此实施方案中，待生产的烃优选地为异丁烯。入口气体中氧气的浓度优选地在约19vol-％至约35vol-％的范围内，并且更优选地在约21vol-％至约35vol-％的范围内。甚至更优选地，入口气体是包含氮气和约21vol-％至约35vol-％氧气的气体混合物，其中气体混合物中氮气和氧气的浓度共同构成约95vol-％或更多。入口气体在引入发酵罐中之前的总压力优选地为约1.5巴至约8巴(约150kPa至约800kPa)，更优选地为约1.5巴至约6巴(约150kPa至约600kPa)，甚至更优选地为约2巴至约6巴(约200kPa至约600kPa)，甚至更优选地为约3巴至约6巴(约300kPa至约600kPa)，并且还甚至更优选地为约3.5巴至约6巴(约350kPa至约600kPa)。在此实施方案中，还优选将发酵废气中氧气的浓度控制为等于或低于约6vol-％。发酵罐优选地为塞流发酵罐。微生物优选地为大肠杆菌。本发明特别地涉及此实施方案的前述一般的和/或优选的特征的每种和每个组合。
在其他特别优选的实施方案中，待在根据本发明的方法中生产的烃选自乙烯、丙烯、异丁烯、1-丁烯、2-丁烯、1,3-丁二烯、或异戊二烯，入口气体中氧气的浓度在约17vol-％至约40vol-％的范围内，入口气体在引入发酵罐中之前的总压力为约1.5巴至约8巴(约150kPa至约800kPa),并且将发酵废气中氧气的浓度控制为低于约8vol-％。在此实施方案中，待生产的烃优选地为异丁烯。入口气体中氧气的浓度优选地在约19vol-％至约35vol-％的范围内，并且更优选地在约21vol-％至约35vol-％的范围内。甚至更优选地，入口气体是包含氮气和约21vol-％至约35vol-％氧气的气体混合物，其中气体混合物中氮气和氧气的浓度共同构成约95vol-％或更多。入口气体在引入发酵罐中之前的总压力优选地为约1.5巴至约6巴(约150kPa至约600kPa)，更优选地为约2巴至约6巴(约200kPa至约600kPa)，甚至更优选地为约3巴至约6巴(约300kPa至约600kPa)，并且还甚至更优选地为约3.5巴至约6巴(约350kPa至约600kPa)。在此实施方案中，还优选将发酵废气中氧气的浓度控制为等于或低于约6vol-％。发酵罐优选地为塞流发酵罐。微生物优选地为大肠杆菌。本发明特别地涉及此实施方案的前述一般的和/或优选的特征的每种和每个组合。
在其他特别优选的实施方案中，待在根据本发明的方法中生产的烃选自乙烯、丙烯、异丁烯、1-丁烯、2-丁烯、1,3-丁二烯、或异戊二烯，入口气体中氧气的浓度在约19vol-％至约35vol-％的范围内，入口气体在引入发酵罐中之前的总压力为约1.5巴至约10巴(约150kPa至约1000kPa),并且将发酵废气中氧气的浓度控制为低于约8vol-％。在此实施方案中，待生产的烃优选地为异丁烯。入口气体中氧气的浓度优选地在约21vol-％至约35vol-％的范围内。更优选地，入口气体是包含氮气和约21vol-％至约35vol-％氧气的气体混合物，其中气体混合物中氮气和氧气的浓度共同构成约95vol-％或更多。入口气体在引入发酵罐中之前的总压力优选地为约1.5巴至约8巴(约150kPa至约800kPa)，更优选地为约1.5巴至约6巴(约150kPa至约600kPa)，甚至更优选地为约2巴至约6巴(约200kPa至约600kPa)，甚至更优选地为约3巴至约6巴(约300kPa至约600kPa)，并且还甚至更优选地为约3.5巴至约6巴(约350kPa至约600kPa)。在此实施方案中，还优选将发酵废气中氧气的浓度控制为等于或低于约6vol-％。发酵罐优选地为塞流发酵罐。微生物优选地为大肠杆菌。本发明特别地涉及此实施方案的前述一般的和/或优选的特征的每种和每个组合。
在其他特别优选的实施方案中，待在根据本发明的方法中生产的烃选自乙烯、丙烯、异丁烯、1-丁烯、2-丁烯、1,3-丁二烯、或异戊二烯，入口气体中氧气的浓度在约19vol-％至约35vol-％的范围内，入口气体在引入发酵罐中之前的总压力为约1.5巴至约8巴(约150kPa至约800kPa),并且将发酵废气中氧气的浓度控制为低于约8vol-％。在此实施方案中，待生产的烃优选地为异丁烯。入口气体中氧气的浓度优选地在约21vol-％至约35vol-％的范围内。更优选地，入口气体是包含氮气和约21vol-％至约35vol-％氧气的气体混合物，其中气体混合物中氮气和氧气的浓度共同构成约95vol-％或更多。入口气体在引入发酵罐中之前的总压力优选地为约1.5巴至约6巴(约150kPa至约600kPa)，更优选地为约2巴至约6巴(约200kPa至约600kPa)，甚至更优选地为约3巴至约6巴(约300kPa至约600kPa)，并且还甚至更优选地为约3.5巴至约6巴(约350kPa至约600kPa)。在此实施方案中，还优选将发酵废气中氧气的浓度控制为等于或低于约6vol-％。发酵罐优选地为塞流发酵罐。微生物优选地为大肠杆菌。本发明特别地涉及此实施方案的前述一般的和/或优选的特征的每种和每个组合。
在其他特别优选的实施方案中，待在根据本发明的方法中生产的烃为异丁烯，入口气体中氧气的浓度在约19vol-％至约35vol-％的范围内，入口气体在引入发酵罐中之前的总压力为约1.5巴至约6巴(约150kPa至约600kPa),并且将发酵废气中氧气的浓度控制为低于约8vol-％。在此实施方案中，入口气体中氧气的浓度优选地在约21vol-％至约35vol-％的范围内。更优选地，入口气体是包含氮气和约21vol-％至约35vol-％氧气的气体混合物，其中气体混合物中氮气和氧气的浓度共同构成约95vol-％或更多。入口气体在引入发酵罐中之前的总压力优选地为约2巴至约6巴(约200kPa至约600kPa)，更优选地为约3巴至约6巴(约300kPa至约600kPa)，并且甚至更优选地为约3.5巴至约6巴(约350kPa至约600kPa)。优选将发酵废气中氧气的浓度控制为等于或低于约6vol-％。发酵罐优选地为塞流发酵罐。微生物优选地为大肠杆菌。本发明特别地涉及此实施方案的前述一般的和/或优选的特征的每种和每个组合。
如本文所用，术语“烃”指这样的化合物，其由碳原子和氢原子组成并且可以是饱和的或不饱和的、直链的、支链的或环状的、脂肪族的或芳香族的。
术语“烯烃”指不饱和的脂肪族(即，非芳族)非环烃，其可以为直链的或支链的并且包含至少一个(例如，一或二个)碳碳双键然而其不包含任何碳碳叁键。“C2-8烯烃”指具有2至8个碳原子的烯烃。此定义中也特别包括具有两个碳碳双键的烯烃(即，二烯烃)，诸如,例如，1,3-丁二烯或异戊二烯。
术语“烷基”指单价饱和的脂肪族非环烃基团(即由碳原子和氢原子组成的基团)，其可为直链的或支链的并且不包含任何碳碳双键或任何碳碳叁键。
术语“烯基”指单价不饱和的脂肪族非环烃基团，其可为直链的或支链的并且包含至少一个碳碳双键然而其不包含任何碳碳叁键。
术语“发酵生产”指通过培养的微生物生产化合物。
术语“约/大约”指所示的数值的±10％，并且特别地指所示数值的±5％。每当使用术语“约/大约”时，也包括对提示的准确数值的具体参考。例如，表述“约100”指90至110的范围，特别地95至105的范围，并且优选地指具体值100。
应理解本发明具体地涉及此处描述的特征和方法参数的每种组合，包括一般的和/或优选的特征/参数的任何组合。特别地，本发明具体地涉及此处提供的方法的优选特征(包括全部优选程度)的全部组合。
在本说明书中，引用了包括专利申请的多份文件。尽管这些文件的公开内容不被认为与本发明的可专利性相关，其以整体并入本文作为参考。更具体而言，全部引用的文件以如同每份单独文件具体和单独地并入本文作为参考的程度并入本文作为参考。
本发明现将参照以下实施例描述，所述实施例仅为说明性的并且不应被理解为是对本发明的范围的限制。
实施例
实施例1：从葡萄糖发酵生产异丁烯(在4巴下)
此实施例意为说明性的，但不包括将葡萄糖经发酵转化为异丁烯的多种方法。适合维持和生长细菌培养物的材料和方法是本领域公知的并且将不在此实施例中详细描述。适于使用的技术可见于ThomasD.Brock的Biotechnology:ATextbookofIndustrialMicrobiology,第二版(1989),SinnauerAssociates,Inc,Sunderland,Mass中。培养物在摇瓶中从冷冻的储液开始并在培养基中生长直到达到约1.0吸收单位(AU)的OD550，此时将内容物转移至1000升种子发酵罐。在种子发酵罐中进一步培养微生物直到其达到约10AU的OD550，此时将其转移到10,000升生产发酵罐中。
在添加种子发酵罐的内容物之前，在生产发酵罐中对消泡剂、中盐(含有磷酸盐、硫酸盐和柠檬酸盐)和6000升水消毒。通过添加氢氧化铵将pH调节至6.8并且添加足量浓缩的葡萄糖溶液(60-70wt％)使得葡萄糖浓度为10克/升。在整个发酵中将葡萄糖浓度维持在0至10克/升。将温度控制在32℃。发酵罐顶部空间中的压力在整个发酵过程中完全维持在4巴。
将空气流动速度设定为使得出口氧气浓度总低于约13％水平的速度，所述水平是在CO2和N2混合物存在下异丁烯的可燃最低氧气浓度(MOC)值(ZabetakisMG,FlammabilityCharacteristicsofCombustibleGasesandVapors,U.S.DepartmentoftheInterior,BureauofMines,Bulletin627,1965,第52页)。通常出口浓度维持在低于8％。基于反应的化学，这对应于在发酵循环结束时低于1700标准升/分钟的空气的空气流动速度。维持搅拌强度使得确保补料至发酵罐的氧气的利用大于45％。通常这意味着搅拌强度在发酵循环的早期阶段(即，微生物生长期)期间将为约0.7KW并且在发酵循环结束时将升至7KW。
由于异丁烯在水中的低溶解性(在1巴和20℃时约260ppm)，在整个发酵过程中异丁烯连续不断汽化并随着发酵废气连续不断排出。异丁烯不在发酵液中积累至任何可察觉的程度。
由于丙酮的较高沸点，尽管其也连续不断地排气到发酵废气中，其也在发酵肉汤中积累。由于丙酮转换步骤缓慢并且高速度依赖于高丙酮浓度，这对于整体的发酵罐生产力是有利的。在起始微生物生长期的过程中，丙酮将积累至20至50克/升浓度。积累和消耗/排气之间将达到平衡并且在发酵循环的剩余过程中丙酮水平将维持在此范围内。发酵将继续直到污染或者抑制性化合物的积累引起总体异丁烯生产速度的显著降低。这通常在循环的第60至第80小时出现。
实施例2：从葡萄糖发酵生产1,3-丁二烯(在3巴下)
此实施例意为说明性的，但不包括将葡萄糖经发酵转化为1,3-丁二烯的多种方法。适合维持和生长细菌培养物的材料和方法是本领域公知的并且将不在此实施例中详细描述。适于使用的技术可见于ThomasD.Brock的Biotechnology:ATextbookofIndustrialMicrobiology,第二版(1989),SinnauerAssociates,Inc,Sunderland,Mass中。培养物在摇瓶中从冷冻的储液开始并在培养基中生长直到达到约1.0AU的OD550，此时将内容物转移至1000升种子发酵罐。在种子发酵罐中进一步培养微生物直到其达到约10AU的OD550，此时将其转移到10,000升生产发酵罐中。
在添加种子发酵罐的内容物之前，在生产发酵罐中对消泡剂、中盐(含有磷酸盐、硫酸盐和柠檬酸盐)和6000升水消毒。通过添加氢氧化铵将pH调节至6.8并且添加足量浓缩的葡萄糖溶液(60-70wt％)使得葡萄糖浓度为10克/升。在整个发酵中将葡萄糖浓度维持在0至10克/升。将温度控制在32℃。发酵罐顶部空间中的压力在整个发酵过程中完全维持在3巴。
将空气流动速度设定为使得出口氧气浓度总低于约10.5％水平的速度，所述水平是在CO2和N2混合物存在下1,3-丁二烯的可燃最低氧气浓度(MOC)值(ZabetakisMG,FlammabilityCharacteristicsofCombustibleGasesandVapors,U.S.DepartmentoftheInterior,BureauofMines,Bulletin627,1965,第55页)。通常出口浓度维持在低于8％。基于反应的化学，这对应于在发酵循环结束时低于1,100标准升/分钟的空气的空气流动速度。维持搅拌强度使得确保补料至发酵罐的氧气的利用大于45％。通常这意味着搅拌强度在发酵循环的早期阶段(即，微生物生长期)期间将为约0.4KW并且在发酵循环结束时将升至6KW。
由于1,3-丁二烯在水中的低溶解性(在1巴和20℃时约735ppm)，在整个发酵过程中1,3-丁二烯连续不断汽化并随着发酵废气连续不断排出。1,3-丁二烯不在发酵液中积累至任何可察觉的程度。
由于巴豆醇的较高沸点，尽管其也连续不断地排气到发酵废气中，其也在发酵肉汤中积累。由于巴豆醇转换步骤缓慢并且高速度依赖于高巴豆醇浓度，这对于整体的发酵罐生产力是有利的。在起始微生物生长期的过程中，巴豆醇将积累至约5至10克/升浓度。积累和消耗/排气之间将达到平衡并且在发酵循环的剩余过程中巴豆醇水平将维持在此范围内。发酵将继续直到污染或者抑制性化合物的积累引起总体1,3-丁二烯生产速度的显著降低。这通常在循环的第60至第80小时出现。
实施例3：从葡萄糖发酵生产1,3-丁二烯(在2巴下)
此实施例意为说明性的，但不包括将葡萄糖经发酵转化为1,3-丁二烯的多种方法。适合维持和生长细菌培养物的材料和方法是本领域公知的并且将不在此实施例中详细描述。适于使用的技术可见于ThomasD.Brock的Biotechnology:ATextbookofIndustrialMicrobiology,第二版(1989),SinnauerAssociates,Inc,Sunderland,Mass中。培养物在摇瓶中从冷冻的储液开始并在培养基中生长直到达到约1.0吸光单位(AU)的OD550，此时将内容物转移至1000升种子发酵罐。在种子发酵罐中进一步培养微生物直到其达到约10AU的OD550，此时将其转移到10,000升生产发酵罐中。
在添加种子发酵罐的内容物之前，在生产发酵罐中对消泡剂、中盐(含有磷酸盐、硫酸盐和柠檬酸盐)和6000升水消毒。通过添加氢氧化铵和/或苛性钠将pH调节至6.8并且添加足量浓缩的葡萄糖溶液(60-70wt％)使得葡萄糖浓度为10克/升。在整个发酵中将葡萄糖浓度维持在0至10克/升。将温度控制在32℃。发酵罐顶部空间中的压力在整个发酵过程中完全维持在2巴。
将空气流动速度设定为使得出口氧气浓度总低于约10.5％水平的速度，所述水平是在CO2和N2混合物存在下1,3-丁二烯的可燃最低氧气浓度(MOC)值(ZabetakisMG,FlammabilityCharacteristicsofCombustibleGasesandVapors,U.S.DepartmentoftheInterior,BureauofMines,Bulletin627,1965,第55页)。通常出口浓度维持在低于8％。基于反应的化学，这对应于在发酵循环结束时低于1,100标准升/分钟的空气的空气流动速度。维持搅拌强度使得确保补料至发酵罐的氧气的利用大于45％。通常这意味着搅拌强度在发酵循环的早期阶段(即，微生物生长期)期间将为约0.4KW并且在发酵循环结束时将升至14KW。
由于1,3-丁二烯在水中的低溶解性(在1巴和20℃时约735ppm)，在整个发酵过程中1,3-丁二烯连续不断汽化并随着发酵废气连续不断排出。1,3-丁二烯不在发酵液中积累至任何可察觉的程度。
由于巴豆醇的较高沸点，尽管其也连续不断地排气到发酵废气中，其也在发酵肉汤中积累。由于巴豆醇转换步骤缓慢并且高速度依赖于高巴豆醇浓度，这对于整体的发酵罐生产力是有利的。在起始微生物生长期的过程中，巴豆醇将积累至约5至10克/升浓度。积累和消耗/排气之间将达到平衡并且在发酵循环的剩余过程中巴豆醇水平将维持在此范围内。发酵将继续直到污染或者抑制性化合物的积累引起总体1,3-丁二烯生产速度的显著降低。这通常在循环的第60至第80小时出现。
实施例4：从葡萄糖发酵生产丙烯(在3巴下)
此实施例意为说明性的，但不包括将葡萄糖经发酵转化为丙烯的多种方法。适合维持和生长细菌培养物的材料和方法是本领域公知的并且将不在此实施例中详细描述。适于使用的技术可见于ThomasD.Brock的Biotechnology:ATextbookofIndustrialMicrobiology,第二版(1989),SinnauerAssociates,Inc,Sunderland,Mass中。培养物在摇瓶中从冷冻的储液开始并在培养基中生长直到达到约1.0吸光单位(AU)的OD550，此时将内容物转移至1000升种子发酵罐。在种子发酵罐中进一步培养微生物直到其达到约10AU的OD550，此时将其转移到10,000升生产发酵罐中。
在添加种子发酵罐的内容物之前，在生产发酵罐中对消泡剂、中盐(含有磷酸盐、硫酸盐和柠檬酸盐)和6000升水消毒。通过添加氢氧化铵和/或苛性钠将pH调节至6.8并且添加足量浓缩的葡萄糖溶液(60-70wt％)使得葡萄糖浓度为10克/升。在整个发酵中将葡萄糖浓度维持在0至10克/升。将温度控制在32℃。发酵罐顶部空间中的压力在整个发酵过程中完全维持在3巴。
将空气流动速度设定为使得出口氧气浓度总低于约13％水平的速度，所述水平是在CO2和N2混合物存在下丙烯的可燃最低氧气浓度(MOC)值(ZabetakisMG,FlammabilityCharacteristicsofCombustibleGasesandVapors,U.S.DepartmentoftheInterior,BureauofMines,Bulletin627,1965,第51页)。通常出口浓度维持在低于4％。基于反应的化学，这对应于在发酵循环结束时低于560标准升/分钟的空气的空气流动速度。维持搅拌强度使得确保补料至发酵罐的氧气的利用大于55％。通常这意味着搅拌强度在发酵循环的早期阶段(即，微生物生长期)期间将为约0.4KW并且在发酵循环结束时将升至7.5KW。
由于丙烯在水中的低溶解性(在1巴和20℃时约400ppm)，在整个发酵过程中丙烯连续不断蒸发并随着发酵废气连续不断排出。丙烯不在发酵液中积累至任何可察觉的程度。
由于丙酮和异丙醇的较高沸点，尽管其也连续不断地排气到发酵废气中，其也在发酵肉汤中积累。由于丙酮和异丙醇转换步骤不是瞬时的并且高的速度依赖于高丙酮和异丙醇浓度；这对于整体的发酵罐生产力是有利的。在起始微生物生长和早期生产期的过程中，丙酮将积累至约10-15克/升浓度并且异丙醇将积累至约20-30克/升浓度。积累和消耗/排气之间将达到平衡并且在发酵循环的剩余过程中丙酮和异丙醇水平将维持在此范围内。
实施例5：从葡萄糖发酵生产丙烯(在10巴下)
此实施例意为说明性的，但不包括将葡萄糖经发酵转化为丙烯的多种方法。适合维持和生长细菌培养物的材料和方法是本领域公知的并且将不在此实施例中详细描述。适于使用的技术可见于ThomasD.Brock的Biotechnology:ATextbookofIndustrialMicrobiology,第二版(1989),SinnauerAssociates,Inc,Sunderland,Mass中。培养物在摇瓶中从冷冻的储液开始并在培养基中生长直到达到约1.0吸光单位(AU)的OD550，此时将内容物转移至1000升种子发酵罐。在种子发酵罐中进一步培养微生物直到其达到约10AU的OD550，此时将其转移到10,000升生产发酵罐中。
在添加种子发酵罐的内容物之前，在生产发酵罐中对消泡剂、中盐(含有磷酸盐、硫酸盐和柠檬酸盐)和6000升水消毒。通过添加氢氧化铵和/或苛性钠将pH调节至6.8并且添加足量浓缩的葡萄糖溶液(60-70wt％)使得葡萄糖浓度为10克/升。在整个发酵中将葡萄糖浓度维持在0至10克/升。将温度控制在32℃。发酵罐顶部空间中的压力在整个发酵过程中完全维持在10巴。
将空气流动速度设定为使得出口氧气浓度总低于约13％水平的速度，所述水平是在CO2和N2混合物存在下丙烯的可燃最低氧气浓度(MOC)值(ZabetakisMG,FlammabilityCharacteristicsofCombustibleGasesandVapors,U.S.DepartmentoftheInterior,BureauofMines,Bulletin627,1965,第51页)。通常出口浓度维持在低于1％。基于反应的化学，这对应于在发酵循环结束时低于380标准升/分钟的空气的空气流动速度。维持搅拌强度使得确保补料至发酵罐的氧气的利用大于85％。通常这意味着搅拌强度在发酵循环的早期阶段(即，微生物生长期)期间将为约0.4KW并且在发酵循环结束时将升至6.6KW。
由于丙烯在水中的低溶解性(在1巴和20℃时约400ppm)，在整个发酵过程中丙烯连续不断蒸发并随着发酵废气连续不断排出。丙烯不在发酵液中积累至任何可察觉的程度。
由于丙酮和异丙醇的较高沸点，尽管其也连续不断地排气到发酵废气中，其也在发酵肉汤中积累。由于丙酮和异丙醇转换步骤不是瞬时的并且高的速度依赖于高丙酮和异丙醇浓度；这对于整体的发酵罐生产力是有利的。在起始微生物生长和早期生产期的过程中，丙酮将积累至约10-15克/升浓度并且异丙醇将积累至约20-30克/升浓度。积累和消耗/排气之间将达到平衡并且在发酵循环的剩余过程中丙酮和异丙醇水平将维持在此范围内。
实施例6：从葡萄糖发酵生产丙烯(在15巴下)
此实施例意为说明性的，但不包括将葡萄糖经发酵转化为丙烯的多种方法。适合维持和生长细菌培养物的材料和方法是本领域公知的并且将不在此实施例中详细描述。适于使用的技术可见于ThomasD.Brock的Biotechnology:ATextbookofIndustrialMicrobiology,第二版(1989),SinnauerAssociates,Inc,Sunderland,Mass中。培养物在摇瓶中从冷冻的储液开始并在培养基中生长直到达到约1.0吸光单位(AU)的OD550，此时将内容物转移至1000升种子发酵罐。在种子发酵罐中进一步培养微生物直到其达到约10AU的OD550，此时将其转移到10,000升生产发酵罐中。
在添加种子发酵罐的内容物之前，在生产发酵罐中对消泡剂、中盐(含有磷酸盐、硫酸盐和柠檬酸盐)和6000升水消毒。通过添加氢氧化铵和/或苛性钠将pH调节至6.8并且添加足量浓缩的葡萄糖溶液(60-70wt％)使得葡萄糖浓度为10克/升。在整个发酵中将葡萄糖浓度维持在0至10克/升。将温度控制在32℃。发酵罐顶部空间中的压力在整个发酵过程中完全维持在15巴。
将空气流动速度设定为使得出口氧气浓度总低于约13％水平的速度，所述水平是在CO2和N2混合物存在下丙烯的可燃最低氧气浓度(MOC)值(ZabetakisMG,FlammabilityCharacteristicsofCombustibleGasesandVapors,U.S.DepartmentoftheInterior,BureauofMines,Bulletin627,1965,第51页)。通常出口浓度维持在低于1％。基于反应的化学，这对应于在发酵循环结束时低于370标准升/分钟的空气的空气流动速度。维持搅拌强度使得确保补料至发酵罐的氧气的利用大于85％。通常这意味着搅拌强度在发酵循环的早期阶段(即，微生物生长期)期间将为约0.4KW并且在发酵循环结束时将升至4.2KW。
由于丙烯在水中的低溶解性(在1巴和20℃时约400ppm)，在整个发酵过程中丙烯连续不断蒸发并随着发酵废气连续不断排出。丙烯不在发酵液中积累至任何可察觉的程度。
由于丙酮和异丙醇的较高沸点，尽管其也连续不断地排气到发酵废气中，其也在发酵肉汤中积累。由于丙酮和异丙醇转换步骤不是瞬时的并且高的速度依赖于高丙酮和异丙醇浓度；这对于整体的发酵罐生产力是有利的。在起始微生物生长和早期生产期的过程中，丙酮将积累至约10-15克/升浓度并且异丙醇将积累至约20-30克/升浓度。积累和消耗/排气之间将达到平衡并且在发酵循环的剩余过程中丙酮和异丙醇水平将维持在此范围内。
实施例7：从葡萄糖发酵生产异戊二烯(在3巴下)
此实施例意为说明性的，但不包括将葡萄糖经发酵转化为异戊二烯的多种方法。适合维持和生长细菌培养物的材料和方法是本领域公知的并且将不在此实施例中详细描述。适于使用的技术可见于ThomasD.Brock的Biotechnology:ATextbookofIndustrialMicrobiology,第二版(1989),SinnauerAssociates,Inc,Sunderland,Mass中。培养物在摇瓶中从冷冻的储液开始并在培养基中生长直到达到约1.0吸光单位(AU)的OD550，此时将内容物转移至1000升种子发酵罐。在种子发酵罐中进一步培养微生物直到其达到约10AU的OD550，此时将其转移到10,000升生产发酵罐中。
在添加种子发酵罐的内容物之前，在生产发酵罐中对消泡剂、中盐(含有磷酸盐、硫酸盐和柠檬酸盐)和6000升水消毒。通过添加氢氧化铵和/或苛性钠将pH调节至6.8并且添加足量浓缩的葡萄糖溶液(60-70wt％)使得葡萄糖浓度为10克/升。在整个发酵中将葡萄糖浓度维持在0至10克/升。将温度控制在32℃。发酵罐顶部空间中的压力在整个发酵过程中完全维持在3巴。
将空气流动速度设定为使得出口氧气浓度总低于约9.7％水平的速度，所述水平是在CO2和N2混合物存在下异戊二烯的可燃最低氧气浓度(MOC)值，如US8,420,360B2所给出的。通常出口浓度维持在低于5％。基于反应的化学，这对应于在发酵循环结束时低于750标准升/分钟的空气的空气流动速度。维持搅拌强度使得确保补料至发酵罐的氧气的利用大于50％。通常这意味着搅拌强度在发酵循环的早期阶段(即，微生物生长期)期间将为约0.6KW并且在发酵循环结束时将升至大约7KW。
由于异戊二烯在水中的低溶解性(在1巴和25℃时约642ppm)，在整个发酵过程中异戊二烯连续不断蒸发并随着发酵废气连续不断排出。异戊二烯不在发酵液中积累至任何可察觉的程度。
实施例8：高二氧化碳分压对在葡萄糖上培养的大肠杆菌的生长和代谢的影响
在装备有温度、pH和dO(溶解氧)控制的1.4LMultifors发酵罐(InforsAG,Basel,瑞士)中以分批模式生长大肠杆菌，菌株MG1655(ATCC编号700926；美国典型培养物保藏中心(ATCC),Manassas,VA)。起初，发酵罐在1L总体积中含有：KH2PO4,7.5g/L；MgSO4.7H2O,2.0g/L；柠檬酸,1.83g/L；柠檬酸铁铵,0.3g/L；CaCl2.2H2O,0.2g/L；硫酸(98％),1.2mL/L；酵母提取物,5g/L；和葡萄糖(10g/L)。灭菌后，添加10mL的痕量金属混合物和1mL的硫胺溶液(150mM)并用3MNaOH将培养基调节至想要的pH(见下)。痕量金属混合物含有：MnSO4.H2O,3g/L；NaCl,1g/L；FeSO4.7H2O,0.1g/L；CoCl2.6H2O,0.1g/L；ZnSO4.7H2O,0.1g/L；CuSO4.5H2O,0.0064g/L；H3BO3,0.01g/L；和Na2MoO4.2H2O,0.01g/L。在一组3个发酵罐中，气流(空气)固定为0.5VVM(体积/体积/分钟)并且通过添加3MNaOH将pH自动维持在pH6.2、pH6.5和6.8。在第二组三个发酵罐中，气流(合成的气体，21％O2和79％CO2)固定为0.5VVM并且如上述将pH自动维持在pH6.2、pH6.5和6.8，对于每个发酵罐，各个携带氧气的入口气体在引入发酵罐中前具有大气压(约1.013巴)，温度控制设为37℃并且dO控制设为20％，没有反压。搅拌器速度初始设为400rpm(1200rpm最大)。
在用气体平衡后(通过停止添加NaOH表明)，在初始约0.4吸收单位(AU)的OD600时接种发酵罐。在接种后多个时间时，直到消耗至少60％的葡萄糖，取出等份试样用于生物质、葡萄糖，和副产物组成分析，使用本领域技术人员公知的技术。
在空气补料的发酵罐中观察到的初始生长速度不受pH影响，生长速度(μ)＝0.62±0.02h-1。在合成气体补料的发酵罐中观察到的初始生长速度也不受pH影响，生长速度(μ)＝0.39±0.03h-1。在空气补料的发酵罐中观察到的生物质产量也不受pH影响(生物质产量＝0.55±0.02克生物质/克消耗的葡萄糖)。对于维持在pH6.2、pH6.5和6.8的发酵罐在合成气体补料的发酵罐中观察到的生物质产量分别为0.47、0.48和0.35克生物质/克消耗的葡萄糖。每个发酵罐的最大比葡萄糖消耗速度为约1克消耗的葡萄糖/克干细胞重量/小时。生产的副产物是在葡萄糖过量条件下对于大肠杆菌通常观察到的那些，包含乙酸盐、琥珀酸盐、乳酸盐，甲酸盐和乙醇。
这些结果证实细菌，诸如大肠杆菌，可以在高二氧化碳分压(pCO2～800mbar)下培养，仅对生长速度具有轻微损害。这一发现是令人惊讶的，考虑到文献中的主要观点即低至pCO2～300mbar的二氧化碳分压显著抑制微生物生长(BaezA等人,BiotechnolBioeng,2009,104(1):102-110)，导致在pCO2～800mbar时预期完全的抑制。因此已经确认根据本发明的方法可以实现。

Claims (27)

1.发酵生产烃的方法，
其中在发酵罐中在液体发酵培养基中培养生产烃的微生物，
其中将包含氧气的入口气体补料到发酵罐中并且入口气体在引入发酵罐中之前的总压力为约1.5巴至约15巴，
其中在发酵废气中在气态中获得烃，并且其中将发酵废气中氧气的浓度控制为低于约10vol-％。
2.权利要求1的方法，其中入口气体在引入发酵罐中之前的总压力为约1.5巴至约10巴。
3.权利要求1或2的方法，其中入口气体在引入发酵罐中之前的总压力为约3.5巴至约6巴。
4.权利要求1至3中任一项的方法，其中包含在引入发酵罐中之前的入口气体中的氧气分压为约315mbar至约5.25巴。
5.权利要求1至4中任一项的方法，其中入口气体中氧气的浓度在约15vol-％至约40vol-％的范围内。
6.权利要求1至5中任一项的方法，其中入口气体中氧气的浓度在约21vol-％至约35vol-％的范围内。
7.权利要求1至6中任一项的方法，其中包含在引入发酵罐中之前的入口气体中的二氧化碳分压为约52.5μbar至约1.5巴。
8.权利要求1至7中任一项的方法，其中入口气体是包含氮气和约15vol-％至约40vol-％氧气的气体混合物，其中气体混合物中氮气和氧气的浓度共同构成约95vol-％或更多。
9.权利要求1至8中任一项的方法，其中入口气体是包含氮气和约21vol-％至约35vol-％氧气的气体混合物，其中气体混合物中氮气和氧气的浓度共同构成约95vol-％或更多。
10.权利要求1至9中任一项的方法，其中入口气体包含浓度等于或大于约90vol-％的空气。
11.权利要求1至10中任一项的方法，其中入口气体为空气。
12.权利要求1至7中任一项的方法，其中入口气体包含从其中已经分离出烃的循环的发酵废气。
13.权利要求12的方法,其中入口气体是空气和从其中已经分离出烃的循环的发酵废气的混合物，所述混合物包含氮气,约15vol-％至约20vol-％氧气,和低于或等于约10vol-％二氧化碳,其中混合物中氮气、氧气和二氧化碳的浓度共同构成约95vol-％或更多。
14.权利要求1至13中任一项的方法，其中将发酵废气中氧气的浓度控制为低于约8vol-％。
15.权利要求1至14中任一项的方法，其中将发酵废气中氧气的浓度控制为约4vol-％至约6vol-％。
16.权利要求1至15中任一项的方法，其中发酵废气中氧气的浓度通过调节入口气体的流动速度和/或通过调节发酵罐中液体发酵培养基的搅拌速度和/或通过调节入口气体中氧气的分压来控制。
17.权利要求1,16中任一项的方法，其中微生物的氧气消耗等于或大于约30％。
18.权利要求1至17中任一项的方法，其中发酵罐为塞流发酵罐。
19.权利要求18的方法，其中发酵罐至少包含两个Rushton涡轮类型搅拌器。
20.权利要求18或19的方法，其中存在于发酵罐中的全部搅拌器是Rushton涡轮类型搅拌器。
21.权利要求1至20中任一项的方法，其中烃为烯烃。
22.权利要求1至21中任一项的方法，其中烃为以下式(I)的烯烃：
其中R1、R2、R3和R4彼此独立地选自氢、C1-6烷基或C2-6链烯基，条件是式(I)的化合物中碳原子的总数是2至8的整数。
23.权利要求21或22的方法，其中烯烃为丙烯、异丁烯、1,3-丁二烯，或异戊二烯。
24.权利要求21至23中任一项的方法，其中烯烃为异丁烯。
25.权利要求1至24中任一项的方法，其中微生物是细菌或真菌。
26.权利要求25的方法,其中微生物是大肠杆菌。
27.权利要求1至26中任一项的方法,其中液体发酵培养基的温度为约30℃至约37℃。
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