CN104893989B - 小孢根霉须状变种zjph1308及在制备西他列汀中间体中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种小孢根霉须状变种ZJPH1308及在制备西他列汀中间体中的应用，本发明菌株可用于生物不对称还原4‑氧‑4‑[3‑(三氟甲基)‑5,6‑二氢‑[1,2,4]三唑并[4,3‑a]吡嗪‑7‑(8H)‑基]‑1‑(2,4,5‑三氟苯基)丁‑2‑酮制备(S)‑3‑羟基‑1‑[3‑(三氟甲基)‑5,6‑二氢‑[1,2,4]三唑并[4,3‑a]吡嗪‑7‑(8H)‑基]‑4‑(2,4,5‑三氟苯基)丁‑1‑酮，该菌种具有立体选择性好，产物光学纯度高等优点；本发明通过采用小孢根霉须状变种ZJPH1308经发酵培养获得的湿菌体为手性生物催化剂，当底物浓度为10mmol/L时，所得还原产物的产率最高可达95％，产物e.e.值>99.9％。
Description
(一)技术领域
本发明涉及一种西他列汀中间体的制备，特别涉及一株新菌株--小孢根霉须状变种(Rhizopus microsporus var.rhizopodiformis)ZJPH1308，及其在微生物催化不对称合成西他列汀手性中间体(S)-3-羟基-1-[3-(三氟甲基)-5,6-二氢-[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡嗪-7-(8H)-基]-4-(2,4,5-三氟苯基)丁-1-酮中的应用。
(二)背景技术
西他列汀(Sitagliptin，商品名)，化学名称为(3R)-3-氨基-1-[3-(三氟甲基)-5,6,7,8-四氢-1,2,4-三唑并[4,3-a]吡嗪-7-基]-4-(2,4,5-三氟苯基)丁-1-酮，是Merck Sharp&Dohme Ltd.公司开发的首个二肽基肽酶-4(DPP-4)抑制剂，用于治疗II型糖尿病。该药物在II型糖尿病患者体内具有保护胰岛β细胞、减缓降血糖素类激素的活性抑制、调节血糖等功能，于2006年10月17日经美国食品药品管理局(FDA)批准上市。(S)-3-羟基-1-[3-(三氟甲基)-5,6-二氢-[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡嗪-7-(8H)-基]-4-(2,4,5-三氟苯基)丁-1-酮是合成西他列汀药物的重要手性中间体，其化学结构式为：
目前，文献报道的生物催化合成(S)-3-羟基-1-[3-(三氟甲基)-5,6-二氢-[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡嗪-7-(8H)-基]-4-(2,4,5-三氟苯基)丁-1-酮的方法仅见桑吉夫·库马尔·门迪拉塔等(Mendirata S K,Pandey B,Joshi R,et al.Process for preparingan intermediate of Sitagliptin via enzymatic conversion:U.S.PatentApplication 13/823,300[P].2011-10-10.)报道的酶促不对称还原4-氧-4-[3-(三氟甲基)-5,6-二氢-[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡嗪-7-(8H)-基]-1-(2,4,5-三氟苯基)丁-2-酮制备(S)-3-羟基-1-[3-(三氟甲基)-5,6-二氢-[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡嗪-7-(8H)-基]-4-(2,4,5-三氟苯基)丁-1-酮。他们通过共表达氧化还原酶和葡萄糖脱氢酶的工程菌全细胞催化不对称合成(S)-3-羟基-1-[3-(三氟甲基)-5,6-二氢-[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡嗪-7-(8H)-基]-4-(2,4,5-三氟苯基)丁-1-酮，反应时间为25～30h，产率为72％，e.e.值>99％，反应式如下：
(三)发明内容
本发明目的是提供一株新菌株—小孢根霉须状变种(Rhizopus microsporusvar.rhizopodiformis)ZJPH1308，及其在微生物催化不对称合成(S)-3-羟基-1-[3-(三氟甲基)-5,6-二氢-[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡嗪-7-(8H)-基]-4-(2,4,5-三氟苯基)丁-1-酮中的应用，建立了高立体选择性生物催化法制备西他列汀手性中间体的新方法。
本发明采用的技术方案是：
本发明提供一株新菌株--小孢根霉须状变种(Rhizopus microsporusvar.rhizopodiformis)ZJPH1308，保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号：CCTCC NO：M 2014645，保藏日期为2014年12月14日，地址：中国武汉，武汉大学，邮编430072。
菌种来源：小孢根霉须状变种ZJPH1308由采自浙江省杭州市浙江工业大学朝晖校区土壤中分离筛选获得，经如下流程筛选获得目的菌株：
土样采集→平板培养→菌种分离→斜面培养→种子培养→发酵培养→生物转化反应→液相色谱检测产物→获得目的菌株ZJPH1308。
本发明小孢根霉须状变种ZJPH1308特征如下：
菌落形态：在含PDA培养基的平板上，30℃培养3d后，菌丝体初期呈白色絮状，渐呈灰黑色，孢子囊为浅灰色，成熟后变为棕色，延伸至平板边缘，菌落背面呈米黄色。
细胞形态：孢子囊光滑，球状，浅灰色，成熟后呈棕色，53.2～92.4×54.6～86.8μm。最小直径为36μm，最大的为105μm。囊轴壁光滑，呈梨形，球形或近球形。孢子梗有隔膜，有的有少量假根，有的没有假根，假根为棕色，颜色逐渐变浅。
菌种的ITS序列特性：采用通用引物ITS1和ITS4，对ZJPH1308菌株rDNA的ITS区进行扩增，产生一个大小为672bp的DNA片段，对上述PCR扩增产物进行序列测定。经测定，所述小孢根霉须状变种ZJPH1308的真菌核糖体ITS(Internal Transcribed Spacer)基因序列(SEQ ID NO.1)如下：
CCTGCGGAAGGATCATTAACTAATGTATTGGCACTTTACTGGGATTTACTTCTCAGTATTGTTTGCTTCTATACTGTGAACCTCTGGCGATGAAGGTCGTAACTGACCTTCGGGAGAGACTCAGGACATATAGGCTATAATGGGTAGGCCTGTTCTGGGGTTTGATCGATGCCAATCAGGATTACCTTTCTTCCTTTGGGAAGGAAGGTGCCTGGTACCCTTTACCATATACCATGAATTCAGAATTGAAAGTATAATATAATAACAACTTTTAACAATGGATCTCTTGGTTCTCGCATCGATGAAGAACGTAGCAAAGTGCGATAACTAGTGTGAATTGCATATTCGTGAATCATCGAGTCTTTGAACGCAGCTTGCACTCTATGGATCTTCTATAGAGTACGCTTGCTTCAGTATCATAACCAACCCACACATAAAATTTATTTTATGTGGTGATGGACAAGCTCGGTTAAATTTAATTATTATACCGATTGTCTAAAATACAGCCTCTTTGTAATTTTCATTAAATTACGAACTACCTAGCCATCGTGCTTTTTTGGTCCAACCAAAAAACATATAATCTAGGGGTTCTGCTAGCCAGCAGATATTTTAATGATCTTTAACTATGATCTGAAGTCAAGTGGGACTACCCGCTGAACTTAAGCATATCAA。
将ZJPH1308菌株的ITS序列在NCBI网站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)上进行同源性比对分析。结果表明：ZJPH1308菌株与Rhizopus microsporusvar.Rhizopodiformis KJ417564.1的同源性达到100％。综上所述结果，该菌种被鉴定为小孢根霉须状变种(Rhizopus microsporus var.Rhizopodiformis)，命名为小孢根霉须状变种ZJPH1308。
通过响应面实验设计优化，得到菌株ZJPH1308较佳的培养基组成为：糊精12.5～25.0g/L，牛肉膏10.0～35.0g/L，硫酸铵1.5～6.0g/L，氯化钙0.1～0.5g/L，氯化钠0.1～0.3g/L，氯化钴0.025～0.05g/L，溶剂为蒸馏水，pH值6.0；优选培养基组成为糊精25.0g/L，牛肉膏30.0g/L，硫酸铵5.0g/L，氯化钙0.4g/L，氯化钠0.3g/L，氯化钴0.05g/L，溶剂为蒸馏水，pH 6.0。
摇瓶培养条件为：初始pH值5.5～7.5，体积接种量1％～11％，装液量70mL～120mL/250mL摇瓶，发酵时间20～24h。
本发明涉及的ZJPH1308菌株通过以下步骤筛选得到：
1)平板分离培养：
取1g土样分别稀释至10-3和10-4，取1μL接种至以底物4-氧-4-[3-(三氟甲基)-5,6-二氢-[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡嗪-7-(8H)-基]-1-(2,4,5-三氟苯基)丁-2-酮为唯一碳源的平板分离培养基，30℃培养7d，之后挑取单菌落转接斜面培养基。平板分离培养基配方如下：4-氧-4-[3-(三氟甲基)-5,6-二氢-[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡嗪-7-(8H)-基]-1-(2,4,5-三氟苯基)丁-2-酮10mmol/L，硫酸铵3g/L，磷酸二氢钾1g/L，氯化钠0.3g/L，琼脂20g/L，以蒸馏水配制，pH 6.0。
2)斜面培养(PDA培养基)：
马铃薯200g/L，葡萄糖20g/L，琼脂20g/L，溶剂为蒸馏水，pH自然。接种斜面后，在30℃培养2～3d，4℃冰箱保存。
3)种子培养：
将培养成熟的斜面菌种接入装有100mL种子培养基的250mL摇瓶中，30℃，200rpm，培养17～24h，种子培养基配方如下：葡萄糖25g/L，蛋白胨27.5g/L，硫酸铵3g/L，磷酸二氢钾1g/L，氯化钠0.3g/L，溶剂为蒸馏水，pH值6.0。
4)发酵培养：
以体积浓度1％～11％的接种量将种子液接种至装有100mL发酵培养基的250mL摇瓶中，30℃，200rpm，培养20～24h，培养结束后，离心，收集湿菌体；发酵培养基配方如下：糊精25.0g/L，牛肉膏30.0g/L，硫酸铵5.0g/L，氯化钙0.4g/L，氯化钠0.3g/L，氯化钴0.05g/L，以蒸馏水配制，pH值6.0。
5)生物转化过程：
将离心所得湿菌体重悬于蒸馏水或磷酸盐缓冲液(pH值为6.0)中，加入一定量的4-氧-4-[3-(三氟甲基)-5,6-二氢-[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡嗪-7-(8H)-基]-1-(2,4,5-三氟苯基)丁-2-酮底物和辅助底物甘油，置30℃摇床反应一定时间。反应结束后，反应液用乙酸乙酯萃取，离心后所得上清液采用液相色谱分析。
6)分析检测：
反应萃取液中的产物和残留底物的浓度采用液相色谱分析，用外标法定量。液相色谱条件：安捷伦1200液相色谱仪，安捷伦液相色谱工作站；色谱柱为Daicel公司多糖衍生物类手性色谱柱Chiralpak ID(250mm×4.6mm，5μm)；流动相:V(正己烷):V(异丙醇)＝65:35；流速0.8mL/min；柱温30℃；检测波长269nm。根据液相色谱检测谱图，通过产物标准曲线计算出反应液中的产物浓度，进而计算出产率和产物e.e.值。
小孢根霉须状变种ZJPH1308菌株生物还原反应产率(Yield)计算式为：
公式(1)
公式(1)中Ci、C0分别为反应结束时产物的摩尔浓度和反应起始时底物的摩尔浓度。
产物的光学纯度由对映体过量值(enantiomeric excess,e.e.)表征。
公式(2)
公式(2)中：CS和CR分别为(S)-3-羟基-1-[3-(三氟甲基)-5,6-二氢-[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡嗪-7-(8H)-基]-4-(2,4,5-三氟苯基)丁-1-酮和(R)-3-羟基-1-[3-(三氟甲基)-5,6-二氢-[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡嗪-7-(8H)-基]-4-(2,4,5-三氟苯基)丁-1-酮的摩尔浓度。
本发明还涉及所述的小孢根霉须状变种ZJPH1308在微生物催化不对称合成(S)-3-羟基-1-[3-(三氟甲基)-5,6-二氢-[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡嗪-7-(8H)-基]-4-(2,4,5-三氟苯基)丁-1-酮中的应用，具体所述的应用为：以小孢根霉须状变种ZJPH1308经发酵培养获得的湿菌体为酶源，以4-氧-4-[3-(三氟甲基)-5,6-二氢-[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡嗪-7-(8H)-基]-1-(2,4,5-三氟苯基)丁-2-酮为底物，以蒸馏水或pH 6.0的磷酸盐缓冲液为反应介质构成转化体系，在25～45℃、200rpm条件下进行转化反应，反应完全后，将反应液分离纯化，得到所述(S)-3-羟基-1-[3-(三氟甲基)-5,6-二氢-[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡嗪-7-(8H)-基]-4-(2,4,5-三氟苯基)丁-1-酮。
所述转化体系中，底物4-氧-4-[3-(三氟甲基)-5,6-二氢-[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡嗪-7-(8H)-基]-1-(2,4,5-三氟苯基)丁-2-酮的初始浓度为1～20mmol/L反应介质，湿菌体投入量以菌体湿重计为50～650g/L反应介质(优选250～450g/L)。
为提高反应效率，所述转化体系中还需添加辅助底物，所述辅助底物为下列之一：麦芽糖、蔗糖、葡萄糖、甘油、乙醇、甲醇或异丙醇。所述辅助底物为麦芽糖、蔗糖或葡萄糖时，加入量为10～100g/L反应介质，所述辅助底物为甘油、乙醇、甲醇或异丙醇时，加入体积量为反应介质体积的2～12％。优选的，所述反应以甘油为辅助底物时，所得产物的光学纯度和产率最高。
本发明所述作为酶源的湿菌体按如下方法制备：
(1)斜面培养：
将小孢根霉须状变种ZJPH1308接种至PDA培养基，30℃培养2～3d，4℃冰箱保存；所述PDA培养基组成为：马铃薯200g/L，葡萄糖20g/L，琼脂20g/L，溶剂为蒸馏水，pH自然；
(2)种子培养：
将培养成熟的斜面菌种接入种子培养基，在30℃，200rpm条件下培养，获得种子液；种子培养基组成为：葡萄糖25g/L，蛋白胨27.5g/L，硫酸铵3g/L，磷酸二氢钾1g/L，氯化钠0.3g/L，溶剂为蒸馏水，pH 6.0；
(3)发酵培养：
以体积浓度1％～11％的接种量将种子液接种至发酵培养基，在30℃、200rpm条件下培养，培养结束后，将培养液离心，收集湿菌体；发酵培养基组成为：糊精12.5～25.0g/L，牛肉膏10.0～35.0g/L，硫酸铵1.5～6.0g/L，氯化钙0.1～0.5g/L，氯化钠0.1～0.3g/L，氯化钴0.025～0.05g/L，溶剂为蒸馏水，pH 4.0～7.5。优选发酵培养基配方如下：糊精25.0g/L，牛肉膏30.0g/L，硫酸铵5.0g/L，氯化钙0.4g/L，氯化钠0.3g/L，氯化钴0.05g/L，溶剂为蒸馏水，pH 6.0。
更进一步，优选本发明所述的应用为：以小孢根霉须状变种ZJPH1308经发酵培养获得的湿菌体为酶源，以4-氧-4-[3-(三氟甲基)-5,6-二氢-[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡嗪-7-(8H)-基]-1-(2,4,5-三氟苯基)丁-2-酮为底物，以甘油为辅助底物，以蒸馏水为反应介质构成转化体系，在30℃、200rpm条件下进行转化反应，反应完全后，将反应液分离纯化，得到所述(S)-3-羟基-1-[3-(三氟甲基)-5,6-二氢-[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡嗪-7-(8H)-基]-4-(2,4,5-三氟苯基)丁-1-酮；所述底物的初始浓度为10mmol/L反应介质，所述酶源的投入量以湿菌体重量计为350g/L反应介质，所述甘油加入体积量为反应介质体积的4％。
本发明所述反应液分离纯化的方法如下：将转化液用等体积乙酸乙酯萃取2次，然后通过旋蒸除去溶剂，再通过制备薄层色谱法(展开剂为乙酸乙酯:石油醚:冰醋酸＝80:20:0.1(v/v)；薄层板为GF254；在波长254nm的紫外荧光下显色)进行分离，收集Rf值为0.44的产物，得到(S)-3-羟基-1-[3-(三氟甲基)-5,6-二氢-[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡嗪-7-(8H)-基]-4-(2,4,5-三氟苯基)丁-1-酮。
本发明的有益效果主要体现在：本发明提供一株可用于生物不对称还原4-氧-4-[3-(三氟甲基)-5,6-二氢-[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡嗪-7-(8H)-基]-1-(2,4,5-三氟苯基)丁-2-酮，制备(S)-3-羟基-1-[3-(三氟甲基)-5,6-二氢-[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡嗪-7-(8H)-基]-4-(2,4,5-三氟苯基)丁-1-酮的新菌种--小孢根霉须状变种ZJPH1308，该菌种具有立体选择性好，产物光学纯度高等优点；本发明通过采用小孢根霉须状变种ZJPH1308经发酵培养获得的湿菌体为手性生物催化剂，当底物浓度为10mmol/L时，所得还原产物的产率最高可达95％，产物e.e.值>99.9％。
(四)附图说明
图1为底物与产物标准品的液相色谱图；
图2为小孢根霉须状变种ZJPH1308菌株生物还原反应萃取液的液相色谱图。
(五)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
实施例1：湿菌体的获得
PDA培养基组成为：马铃薯200g/L，葡萄糖20g/L，琼脂20g/L，溶剂为蒸馏水，pH自然；
种子培养基配方如下：葡萄糖25.0g/L，蛋白胨27.5g/L，硫酸铵3.0g/L，磷酸二氢钾1.0g/L，氯化钠0.3g/L，蒸馏水配制，pH 6.0。
发酵培养基配方如下：糊精25.0g/L，牛肉膏30.0g/L，硫酸铵5.0g/L，氯化钙0.4g/L，氯化钠0.3g/L，氯化钴0.05g/L，以蒸馏水配制，pH 6.0。
将小孢根霉须状变种ZJPH1308接种至PDA培养基，30℃培养2～3d；然后将培养成熟的斜面菌种接入装有100mL种子培养基的250mL摇瓶中，30℃，200rpm，培养22h，再以体积浓度9％的接种量将种子液转接至装有100mL发酵液的250mL摇瓶中，30℃，200rpm振荡培养22h。培养结束后，将发酵液离心，沉淀用蒸馏水洗涤，收集湿菌体，备用。
实施例2：
将实施例1所得湿菌体重悬于100mmol/L、pH 6.0的磷酸盐缓冲液中，湿菌体以缓冲液体积计为350g/L，加入浓度为1mmol/L的4-氧-4-[3-(三氟甲基)-5,6-二氢-[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡嗪-7-(8H)-基]-1-(2,4,5-三氟苯基)丁-2-酮底物，并加入反应介质体积6％(v/v)的甘油作为辅助底物，30℃，200rpm，摇床振荡反应24h。采用液相色谱方法检测，产物(S)-3-羟基-1-[3-(三氟甲基)-5,6-二氢-[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡嗪-7-(8H)-基]-4-(2,4,5-三氟苯基)丁-1-酮的浓度为0.233mmol/L，e.e.值>99.9％，产率为23.3％。底物和产物标准品液相色谱图见图1，小孢根霉须状变种ZJPH1308菌株生物还原反应萃取液液相色谱图见图2；产物1H-NMR核磁共振光谱结果如下：1H-NMR(400MHz.DMSO-d6)δ/ppm:7.46-7.41(q,2H)，5.02-4.83(m,3H)，4.22(s,1H)，4.09(s,2H)，4.02-3.90(m,2H)，2.78-2.68(m,3H)，2.50-2.46(m,1H)。
生物转化反应结束后，反应液用等体积的乙酸乙酯萃取，萃取液中的产物和未反应底物的浓度采用液相色谱分析，用外标法定量。液相色谱条件为：安捷伦1200液相色谱仪，安捷伦液相色谱工作站；色谱柱为Daicel公司多糖衍生物类手性色谱柱Chiralpak ID(250mm×4.6mm，5μm)；流动相:V(正己烷):V(异丙醇)＝65:35；流速0.8mL/min；柱温:30℃；检测波长:269nm。根据液相色谱检测谱图，通过产物标准曲线计算出反应液中的产物浓度，进而计算出产率和产物e.e.值。
实施例3：
将实施例2中100mmol/L、pH 6.0的磷酸缓冲液替换为相同体积的蒸馏水，其他操作同实施例2，产物(S)-3-羟基-1-[3-(三氟甲基)-5,6-二氢-[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡嗪-7-(8H)-基]-4-(2,4,5-三氟苯基)丁-1-酮的浓度为0.801mmol/L，e.e.值>99.9％，产率为80.1％。
实施例4：
将实施例1所得湿菌体重悬于蒸馏水中，湿菌体以蒸馏水体积计为350g/L，加入浓度为1mmol/L的4-氧-4-[3-(三氟甲基)-5,6-二氢-[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡嗪-7-(8H)-基]-1-(2,4,5-三氟苯基)丁-2-酮底物，不加辅助底物，30℃，200rpm，摇床振荡反应24h。采用液相色谱方法检测，产物(S)-3-羟基-1-[3-(三氟甲基)-5,6-二氢-[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡嗪-7-(8H)-基]-4-(2,4,5-三氟苯基)丁-1-酮的浓度为0.555mmol/L，e.e.值>99.9％，产率为55.5％。
实施例5：
将实施例1所得湿菌体重悬于蒸馏水中，湿菌体以蒸馏水体积计为350g/L，加入浓度为1mmol/L的4-氧-4-[3-(三氟甲基)-5,6-二氢-[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡嗪-7-(8H)-基]-1-(2,4,5-三氟苯基)丁-2-酮底物，并加入60g/L的麦芽糖，30℃，200rpm，摇床振荡反应24h。采用液相色谱方法检测，产物(S)-3-羟基-1-[3-(三氟甲基)-5,6-二氢-[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡嗪-7-(8H)-基]-4-(2,4,5-三氟苯基)丁-1-酮的浓度为0.759mmol/L，e.e.值>99.9％，产率为75.9％。
实施例6：
将实施例1所得湿菌体重悬于蒸馏水中，湿菌体以蒸馏水体积计为350g/L，加入浓度为1mmol/L的4-氧-4-[3-(三氟甲基)-5,6-二氢-[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡嗪-7-(8H)-基]-1-(2,4,5-三氟苯基)丁-2-酮底物，并加入60g/L的蔗糖，30℃，200rpm，摇床振荡反应24h。采用液相色谱方法检测，产物(S)-3-羟基-1-[3-(三氟甲基)-5,6-二氢-[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡嗪-7-(8H)-基]-4-(2,4,5-三氟苯基)丁-1-酮的浓度为0.769mmol/L，e.e.值>99.9％，产率为76.9％。
实施例7：
将实施例1所得湿菌体悬浮于蒸馏水中，湿菌体以蒸馏水体积计为350g/L，加入浓度为1mmol/L的4-氧-4-[3-(三氟甲基)-5,6-二氢-[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡嗪-7-(8H)-基]-1-(2,4,5-三氟苯基)丁-2-酮底物，并加入60g/L的葡萄糖，30℃，200rpm，摇床振荡反应24h。采用液相色谱方法检测，产物(S)-3-羟基-1-[3-(三氟甲基)-5,6-二氢-[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡嗪-7-(8H)-基]-4-(2,4,5-三氟苯基)丁-1-酮的浓度为0.586mmol/L，e.e.值>99.9％，产率为58.6％。
实施例8：
将实施例1所得湿菌体重悬于蒸馏水中，湿菌体以蒸馏水体积计为350g/L，加入浓度为1mmol/L的4-氧-4-[3-(三氟甲基)-5,6-二氢-[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡嗪-7-(8H)-基]-1-(2,4,5-三氟苯基)丁-2-酮底物，并加入体积为蒸馏水体积6％(v/v)的乙醇，30℃，200rpm，摇床振荡反应24h。采用液相色谱方法检测，产物(S)-3-羟基-1-[3-(三氟甲基)-5,6-二氢-[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡嗪-7-(8H)-基]-4-(2,4,5-三氟苯基)丁-1-酮的浓度为0.608mmol/L，e.e.值>99.9％，产率为60.8％。
实施例9：
将实施例1所得湿菌体重悬于蒸馏水中，湿菌体以蒸馏水体积计为350g/L，加入浓度为1mmol/L的4-氧-4-[3-(三氟甲基)-5,6-二氢-[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡嗪-7-(8H)-基]-1-(2,4,5-三氟苯基)丁-2-酮底物，并加入体积为蒸馏水体积6％(v/v)的甲醇，30℃，200rpm，摇床振荡反应24h。采用液相色谱方法检测，产物(S)-3-羟基-1-[3-(三氟甲基)-5,6-二氢-[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡嗪-7-(8H)-基]-4-(2,4,5-三氟苯基)丁-1-酮的浓度为0.758mmol/L，e.e.值>99.9％，产率为75.8％。
实施例10：
将实施例1所得湿菌体重悬于蒸馏水中，湿菌体以蒸馏水体积计为350g/L，加入浓度为1mmol/L的4-氧-4-[3-(三氟甲基)-5,6-二氢-[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡嗪-7-(8H)-基]-1-(2,4,5-三氟苯基)丁-2-酮底物，并加入体积为蒸馏水体积6％(v/v)的异丙醇，30℃，200rpm，摇床振荡反应24h。采用液相色谱方法检测，产物(S)-3-羟基-1-[3-(三氟甲基)-5,6-二氢-[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡嗪-7-(8H)-基]-4-(2,4,5-三氟苯基)丁-1-酮的浓度为0.468mmol/L，e.e.值>99.9％，产率为46.8％。
实施例11：
将实施例1所得湿菌体重悬于蒸馏水中，湿菌体以蒸馏水体积计浓度为350g/L，加入浓度为1mmol/L的4-氧-4-[3-(三氟甲基)-5,6-二氢-[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡嗪-7-(8H)-基]-1-(2,4,5-三氟苯基)丁-2-酮底物，并加入体积为蒸馏水体积2％(v/v)的甘油作为辅助底物，30℃，200rpm，摇床振荡反应24h。采用液相色谱方法检测，产物(S)-3-羟基-1-[3-(三氟甲基)-5,6-二氢-[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡嗪-7-(8H)-基]-4-(2,4,5-三氟苯基)丁-1-酮的浓度为0.86mmol/L，e.e.值>99.9％，产率为86.0％。
实施例12：
将实施例1所得湿菌体重悬于蒸馏水中，湿菌体加入量以蒸馏水体积计为350g/L，加入浓度为1mmol/L的4-氧-4-[3-(三氟甲基)-5,6-二氢-[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡嗪-7-(8H)-基]-1-(2,4,5-三氟苯基)丁-2-酮底物，并加入体积为蒸馏水体积4％(v/v)的甘油作为辅助底物，30℃，200rpm，摇床振荡反应24h。采用液相色谱的检测方法，产物(S)-3-羟基-1-[3-(三氟甲基)-5,6-二氢-[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡嗪-7-(8H)-基]-4-(2,4,5-三氟苯基)丁-1-酮的浓度为0.88mmol/L，e.e.值>99.9％，产率为88.0％。
实施例13：
将实施例1所得湿菌体重悬于蒸馏水中，湿菌体加入量以蒸馏水体积计为350g/L，加入浓度为1mmol/L的4-氧-4-[3-(三氟甲基)-5,6-二氢-[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡嗪-7-(8H)-基]-1-(2,4,5-三氟苯基)丁-2-酮底物，并加入体积为蒸馏水体积8％(v/v)的甘油作为辅助底物，30℃，200rpm，摇床振荡反应24h。采用液相色谱方法检测，产物(S)-3-羟基-1-[3-(三氟甲基)-5,6-二氢-[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡嗪-7-(8H)-基]-4-(2,4,5-三氟苯基)丁-1-酮的浓度为0.742mmol/L，e.e.值>99.9％，产率为74.2％。
实施例14：
将实施例1所得湿菌体重悬于蒸馏水中，湿菌体加入量以蒸馏水体积计为350g/L，加入浓度为1mmol/L的4-氧-4-[3-(三氟甲基)-5,6-二氢-[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡嗪-7-(8H)-基]-1-(2,4,5-三氟苯基)丁-2-酮底物，并加入体积为蒸馏水体积10％(v/v)的甘油作为辅助底物，30℃，200rpm，摇床振荡反应24h。采用液相色谱方法检测，产物(S)-3-羟基-1-[3-(三氟甲基)-5,6-二氢-[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡嗪-7-(8H)-基]-4-(2,4,5-三氟苯基)丁-1-酮的浓度为0.712mmol/L，e.e.值>99.9％，产率为71.2％。
实施例15：
将实施例1所得湿菌体重悬于蒸馏水中，湿菌体加入量以蒸馏水体积计为350g/L，加入浓度为1mmol/L的4-氧-4-[3-(三氟甲基)-5,6-二氢-[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡嗪-7-(8H)-基]-1-(2,4,5-三氟苯基)丁-2-酮底物，并加入体积为蒸馏水体积12％(v/v)的甘油作为辅助底物，30℃，200rpm，摇床振荡反应24h。采用液相色谱方法检测，产物(S)-3-羟基-1-[3-(三氟甲基)-5,6-二氢-[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡嗪-7-(8H)-基]-4-(2,4,5-三氟苯基)丁-1-酮的浓度为0.706mmol/L，e.e.值>99.9％，产率为70.6％。
实施例16：
将实施例1所得湿菌体重悬于蒸馏水中，湿菌体以蒸馏水计为50g/L，加入浓度为1mmol/L的4-氧-4-[3-(三氟甲基)-5,6-二氢-[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡嗪-7-(8H)-基]-1-(2,4,5-三氟苯基)丁-2-酮底物，并加入体积为蒸馏水体积4％(v/v)的甘油作为辅助底物，30℃，200rpm，摇床振荡反应24h。采用液相色谱方法检测，产物(S)-3-羟基-1-[3-(三氟甲基)-5,6-二氢-[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡嗪-7-(8H)-基]-4-(2,4,5-三氟苯基)丁-1-酮的浓度为0.36mmol/L，e.e.值>99.9％，产率为36.0％。
实施例17：
将实施例1所得湿菌体重悬于蒸馏水中，湿菌体以蒸馏水计为150g/L，加入浓度为1mmol/L的4-氧-4-[3-(三氟甲基)-5,6-二氢-[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡嗪-7-(8H)-基]-1-(2,4,5-三氟苯基)丁-2-酮底物，并加入体积为蒸馏水体积4％(v/v)的甘油作为辅助底物，30℃，200rpm，摇床振荡反应24h。采用液相色谱方法检测，产物(S)-3-羟基-1-[3-(三氟甲基)-5,6-二氢-[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡嗪-7-(8H)-基]-4-(2,4,5-三氟苯基)丁-1-酮的浓度为0.77mmol/L，e.e.值>99.9％，产率为77.0％。
实施例18：
将实施例1所得湿菌体重悬于蒸馏水中，湿菌体以蒸馏水计为250g/L，加入浓度为1mmol/L的4-氧-4-[3-(三氟甲基)-5,6-二氢-[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡嗪-7-(8H)-基]-1-(2,4,5-三氟苯基)丁-2-酮底物，并加入体积为蒸馏水体积4％(v/v)的甘油作为辅助底物，30℃，200rpm，摇床振荡反应24h。采用液相色谱方法检测，产物(S)-3-羟基-1-[3-(三氟甲基)-5,6-二氢-[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡嗪-7-(8H)-基]-4-(2,4,5-三氟苯基)丁-1-酮的浓度为0.81mmol/L，e.e.值>99.9％，产率为81.0％。
实施例19：
将实施例1所得湿菌体重悬于蒸馏水中，湿菌体以蒸馏水体积计为450g/L，加入浓度为1mmol/L的4-氧-4-[3-(三氟甲基)-5,6-二氢-[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡嗪-7-(8H)-基]-1-(2,4,5-三氟苯基)丁-2-酮底物，并加入体积为蒸馏水体积4％(v/v)的甘油作为辅助底物，30℃，200rpm，摇床振荡反应24h。采用液相色谱方法检测，产物(S)-3-羟基-1-[3-(三氟甲基)-5,6-二氢-[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡嗪-7-(8H)-基]-4-(2,4,5-三氟苯基)丁-1-酮的浓度为0.88mmol/L，e.e.值>99.9％，产率为88.0％。
实施例20：
将实施例1所得湿菌体重悬于蒸馏水中，湿菌体以蒸馏水计为550g/L，加入浓度为1mmol/L的4-氧-4-[3-(三氟甲基)-5,6-二氢-[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡嗪-7-(8H)-基]-1-(2,4,5-三氟苯基)丁-2-酮底物，并加入体积为蒸馏水体积4％(v/v)的甘油作为辅助底物，30℃，200rpm，摇床振荡反应24h。采用液相色谱方法检测，产物(S)-3-羟基-1-[3-(三氟甲基)-5,6-二氢-[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡嗪-7-(8H)-基]-4-(2,4,5-三氟苯基)丁-1-酮的浓度为0.87mmol/L，e.e.值>99.9％，产率为87.0％。
实施例21：
将实施例1所得湿菌体重悬于蒸馏水中，湿菌体以蒸馏水体积计为650g/L，加入浓度为1mmol/L的4-氧-4-[3-(三氟甲基)-5,6-二氢-[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡嗪-7-(8H)-基]-1-(2,4,5-三氟苯基)丁-2-酮底物，并加入体积为蒸馏水体积4％(v/v)的甘油作为辅助底物，30℃，200rpm，摇床振荡反应24h。采用液相色谱方法检测，产物(S)-3-羟基-1-[3-(三氟甲基)-5,6-二氢-[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡嗪-7-(8H)-基]-4-(2,4,5-三氟苯基)丁-1-酮的浓度为0.86mmol/L，e.e.值>99.9％，产率为86.0％。
实施例22：
将实施例1所得湿菌体重悬于蒸馏水中，湿菌体以蒸馏水体积计为350g/L，加入浓度为1mmol/L的4-氧-4-[3-(三氟甲基)-5,6-二氢-[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡嗪-7-(8H)-基]-1-(2,4,5-三氟苯基)丁-2-酮底物，并加入体积为蒸馏水体积4％(v/v)的甘油作为辅助底物，25℃，200rpm，摇床振荡反应24h。采用液相色谱方法检测，产物(S)-3-羟基-1-[3-(三氟甲基)-5,6-二氢-[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡嗪-7-(8H)-基]-4-(2,4,5-三氟苯基)丁-1-酮的浓度为0.754mmol/L，e.e.值>99.9％，产率为75.4％。
实施例23：
将实施例1所得湿菌体重悬于蒸馏水中，湿菌体以蒸馏水体积计为350g/L，加入浓度为1mmol/L的4-氧-4-[3-(三氟甲基)-5,6-二氢-[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡嗪-7-(8H)-基]-1-(2,4,5-三氟苯基)丁-2-酮底物，并加入体积为蒸馏水体积4％(v/v)的甘油作为辅助底物，30℃，200rpm，摇床振荡反应24h。采用液相色谱方法检测，产物(S)-3-羟基-1-[3-(三氟甲基)-5,6-二氢-[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡嗪-7-(8H)-基]-4-(2,4,5-三氟苯基)丁-1-酮的浓度为0.882mmol/L，e.e.值>99.9％，产率为88.2％。
实施例24：
将实施例1所得湿菌体重悬于蒸馏水中，湿菌体以蒸馏水体积计为350g/L，加入浓度为1mmol/L的4-氧-4-[3-(三氟甲基)-5,6-二氢-[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡嗪-7-(8H)-基]-1-(2,4,5-三氟苯基)丁-2-酮底物，并加入体积为蒸馏水体积4％(v/v)的甘油作为辅助底物，35℃，200rpm，摇床振荡反应24h。采用液相色谱方法检测，产物(S)-3-羟基-1-[3-(三氟甲基)-5,6-二氢-[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡嗪-7-(8H)-基]-4-(2,4,5-三氟苯基)丁-1-酮的浓度为0.901mmol/L，e.e.值>99.9％，产率为90.1％。
实施例25：
将实施例1所得湿菌体重悬于蒸馏水中，湿菌体以蒸馏水体积计为350g/L，加入浓度为1mmol/L的4-氧-4-[3-(三氟甲基)-5,6-二氢-[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡嗪-7-(8H)-基]-1-(2,4,5-三氟苯基)丁-2-酮底物，并加入体积为蒸馏水体积4％(v/v)的甘油作为辅助底物，40℃，200rpm，摇床振荡反应24h。采用液相色谱方法检测，产物(S)-3-羟基-1-[3-(三氟甲基)-5,6-二氢-[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡嗪-7-(8H)-基]-4-(2,4,5-三氟苯基)丁-1-酮的浓度为0.962mmol/L，e.e.值>99.9％，产率为96.2％。
实施例26：
将实施例1所得湿菌体重悬于蒸馏水中，湿菌体以蒸馏水体积计为350g/L，加入浓度为1mmol/L的4-氧-4-[3-(三氟甲基)-5,6-二氢-[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡嗪-7-(8H)-基]-1-(2,4,5-三氟苯基)丁-2-酮底物，并加入体积为蒸馏水体积4％(v/v)的甘油作为辅助底物，45℃，200rpm，摇床振荡反应24h。采用液相色谱方法检测，产物(S)-3-羟基-1-[3-(三氟甲基)-5,6-二氢-[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡嗪-7-(8H)-基]-4-(2,4,5-三氟苯基)丁-1-酮的浓度为0.915mmol/L，e.e.值>99.9％，产率为91.5％。
实施例27：
将实施例1所得湿菌体重悬于蒸馏水中，湿菌体以蒸馏水体积计为350g/L，加入浓度为5mmol/L的4-氧-4-[3-(三氟甲基)-5,6-二氢-[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡嗪-7-(8H)-基]-1-(2,4,5-三氟苯基)丁-2-酮底物，并加入体积为蒸馏水体积4％(v/v)的甘油作为辅助底物，40℃，200rpm，摇床振荡反应18h。采用液相色谱方法检测，产物(S)-3-羟基-1-[3-(三氟甲基)-5,6-二氢-[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡嗪-7-(8H)-基]-4-(2,4,5-三氟苯基)丁-1-酮的浓度为4.8mmol/L，e.e.值>99.9％，产率为96.0％。
实施例28：
将实施例1所得湿菌体重悬于蒸馏水中，湿菌体以蒸馏水体积计为350g/L，加入浓度为10mmol/L的4-氧-4-[3-(三氟甲基)-5,6-二氢-[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡嗪-7-(8H)-基]-1-(2,4,5-三氟苯基)丁-2-酮底物，并加入体积为蒸馏水体积4％(v/v)的甘油作为辅助底物，40℃，200rpm，摇床振荡反应40h。采用液相色谱方法检测，产物(S)-3-羟基-1-[3-(三氟甲基)-5,6-二氢-[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡嗪-7-(8H)-基]-4-(2,4,5-三氟苯基)丁-1-酮的浓度为9.5mmol/L，e.e.值>99.9％，产率为95.0％。
实施例29：
将实施例1所得湿菌体重悬于蒸馏水中，湿菌体以蒸馏水体积计为350g/L，加入浓度为15mmol/L的4-氧-4-[3-(三氟甲基)-5,6-二氢-[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡嗪-7-(8H)-基]-1-(2,4,5-三氟苯基)丁-2-酮底物，并加入体积为蒸馏水体积4％(v/v)的甘油作为辅助底物，40℃，200rpm，摇床振荡反应48h。采用液相色谱方法检测，产物(S)-3-羟基-1-[3-(三氟甲基)-5,6-二氢-[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡嗪-7-(8H)-基]-4-(2,4,5-三氟苯基)丁-1-酮的浓度为12.75mmol/L，e.e.值>99.9％，产率为85.0％。
实施例30：
将实施例1所得湿菌体重悬于蒸馏水中，湿菌体以蒸馏水体积计为350g/L，加入浓度为20mmol/L的4-氧-4-[3-(三氟甲基)-5,6-二氢-[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡嗪-7-(8H)-基]-1-(2,4,5-三氟苯基)丁-2-酮底物，并加入体积为蒸馏水体积4％(v/v)的甘油作为辅助底物，40℃，200rpm，摇床振荡反应48h。采用液相色谱方法检测，产物(S)-3-羟基-1-[3-(三氟甲基)-5,6-二氢-[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡嗪-7-(8H)-基]-4-(2,4,5-三氟苯基)丁-1-酮的浓度为14.4mmol/L，e.e.值>99.9％，产率为72.0％。
Claims (9)
1.小孢根霉须状变种(Rhizopus microsporus var. rhizopodiformis)ZJPH1308，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号：CCTCC NO：M 2014645，保藏日期为2014年12月14日，地址：中国武汉，武汉大学，邮编430072。
2.一种权利要求1所述小孢根霉须状变种ZJPH1308在微生物催化不对称合成(S)-3-羟基-1-[3-(三氟甲基)-5,6-二氢-[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡嗪-7-(8H)-基]-4-(2,4,5-三氟苯基)丁-1-酮中的应用。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于所述的应用为：以小孢根霉须状变种ZJPH1308经发酵培养获得的湿菌体为酶源，以4-氧-4-[3-(三氟甲基)-5,6-二氢-[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡嗪-7-(8H)-基]-1-(2,4,5-三氟苯基)丁-2-酮为底物，以蒸馏水或pH 6.0的磷酸盐缓冲液为反应介质构成转化体系，在25～45℃、200rpm条件下进行转化反应，反应完全后，将反应液分离纯化，得到所述(S)-3-羟基-1-[3-(三氟甲基)-5,6-二氢-[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡嗪-7-(8H)-基]-4-(2,4,5-三氟苯基)丁-1-酮。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述底物的初始浓度为1～20mmol/L反应介质，所述酶源的投入量以湿菌体重量计为50～650g/L反应介质。
5.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述转化体系中添加有辅助底物，所述辅助底物为下列之一：麦芽糖、蔗糖、葡萄糖、甘油、乙醇、甲醇或异丙醇。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于所述辅助底物为麦芽糖、蔗糖或葡萄糖时，加入量为10～100g/L反应介质，辅助底物为甘油、乙醇、甲醇或异丙醇时，加入体积量为反应介质体积的2～12％。
7.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述湿菌体按如下方法制备：
(1)斜面培养：
将小孢根霉须状变种ZJPH1308接种至PDA培养基，30℃培养2～3d，4℃冰箱保存；所述PDA培养基组成为：马铃薯200g/L，葡萄糖20g/L，琼脂20g/L，溶剂为蒸馏水，pH自然；
(2)种子培养：
将培养成熟的斜面菌种接入种子培养基，在30℃，200rpm条件下培养，获得种子液；种子培养基组成为：葡萄糖25g/L，蛋白胨27.5g/L，硫酸铵3g/L，磷酸二氢钾1g/L，氯化钠0.3g/L，溶剂为蒸馏水，pH 6.0；
(3)发酵培养：
以体积浓度1％～11％的接种量将种子液接种至发酵培养基，在30℃、200rpm条件下培养，培养结束后，将培养液离心，收集湿菌体；发酵培养基组成为：糊精12.5～25.0g/L，牛肉膏10.0～35.0g/L，硫酸铵1.5～6.0g/L，氯化钙0.1～0.5g/L，氯化钠0.1～0.3g/L，氯化钴0.025～0.05g/L，溶剂为蒸馏水，pH 4.0～7.5。
8.如权利要求5所述的应用，其特征在于所述的应用为：以小孢根霉须状变种ZJPH1308经发酵培养获得的湿菌体为酶源，以4-氧-4-[3-(三氟甲基)-5,6-二氢-[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡嗪-7-(8H)-基]-1-(2,4,5-三氟苯基)丁-2-酮为底物，以甘油为辅助底物，以蒸馏水为反应介质构成转化体系，在30℃、200rpm条件下进行转化反应，反应完全后，将反应液分离纯化，得到所述(S)-3-羟基-1-[3-(三氟甲基)-5,6-二氢-[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡嗪-7-(8H)-基]-4-(2,4,5-三氟苯基)丁-1-酮；所述底物的初始浓度为10mmol/L反应介质，所述酶源的投入量以湿菌体重量计为350g/L反应介质，所述甘油加入体积量为反应介质体积的4％。
9.如权利要求5所述的应用，其特征在于所述反应液分离纯化的方法为：将转化液用等体积乙酸乙酯萃取2次，然后通过旋蒸除去溶剂，以体积比80:20:0.1的乙酸乙酯、石油醚和冰醋酸的混合液为展开剂进行薄层色谱分离，得到产物(S)-3-羟基-1-[3-(三氟甲基)-5,6-二氢-[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡嗪-7-(8H)-基]-4-(2,4,5-三氟苯基)丁-1-酮。
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