CN105821091A - 一种制备左旋多巴的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于微生物酶法合成领域，涉及一种制备左旋多巴的方法，采用重组菌大肠埃希氏菌FDop（Escherichia coli FDop）发酵产生，FDop已保存于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2016年2月19日，保藏编号为CCTCC NO：M 2016064。具体包括如下步骤：（1）菌种活化，得到一级种子；（2）扩大培养，得到二级种子；（3）发酵培养：将所述二级种子接种到发酵培养基中，同时加入葡萄糖，转速350‑450rpm，风量3‑5L/min，控制pH6.0‑6.5进行发酵，溶氧控制在15‑30%，得到发酵液；（4）诱导：所述发酵液的OD600达到8‑10，加入IPTG至终浓度为0.03‑0.06mM，同时开始流加左旋酪氨酸溶液，诱导48‑72小时，纯化得到左旋多巴。本发明制备左旋多巴的工艺易于控制，稳定性好，副产物少，左旋多巴的产率高。
Description
技术领域
本发明涉及一种利用微生物发酵的方法，具体是一种制备左旋多巴的方法，属于微生物酶法合成领域。
背景技术
左旋多巴（3,4-dihydroxyphenyl-L-ananine，简称L-DOPA）的化学名称为3,4-二羟基苯基丙氨酸，其结构式为：
作为一种重要的生物活性物质，L-DOPA是从L-酪氨酸到儿茶酚或黑色素的生化代谢途径过程中的重要中间产物。
上世纪60年代，国外许多学者开始致力于微生物酶法合成L-DOPA的研究。为了提高L-DOPA产量和底物转化率，研究者们对微生物酶法合成L-DOPA的工艺方法进行了大量研究。
酪氨酸酚裂解酶(Tyrosine phenol lyase，TPL，E.C.4.1.99.2)，又名β-酪氨酸酶，以磷酸吡哆醛（pyridoxal-phosphate，PLP）为辅酶，以钾离子和氨离子为辅助因子，TPL可以催化L-酪氨酸发生β-消去反应生成苯酚、丙酮酸和氨。由于这个反应是可逆的，将邻苯二酚代替苯酚后，可由邻苯二酚、丙酮酸和氨可在TPL催化下生成L-DOPA。左旋多巴的前体在较高浓度时对酶活都有抑制作用，其中邻苯二酚及丙酮酸除了有强抑制作用外，还会导致酶的不可逆失活，反应条件难以控制，副产物多，L-DOPA的产率低。
也有一些利用自然界中的细菌，如Escherichia、Proteus（变形菌属）、Stizolobium hassjoo和Erwinia(欧文氏菌属)等，来合成L-DOPA，如左旋多巴酶法合成综述报道，TPL大肠杆菌基因工程菌转化30h，转化生成29.6g/L的L-DOPA。又如，Jang-YoungLee等人克隆来源于Escherichia coli W(ATCC11105)的对羟基苯乙酸-3-羟基化酶（p-hydroxyphenylacetate 3-hydroxylase，PHAH），转化L-酪氨酸为L-DOPA，产物累积至10g/L，该技术申请了专利US5837504。研究者发现这些重组菌株虽然TPL的表达量高于野生菌株，但最终的L-DOPA合成能力却没有明显提高甚至低于野生菌株。这可能因为要获得较高的L-DOPA合成能力，菌株除了具备TPL高活性外，还要有相对完善的底物、产物出入细胞膜的转运机制以及对底物邻苯二酚抑制酶活的耐受力等。总体来说，反应条件难以控制，稳定性差，副产物多，L-DOPA的产率低。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是，提供一种制备左旋多巴的方法，采用一株用于发酵生产左旋多巴的具备遗传稳定性高，产量高，副产物少的重组菌株FDop。
采取的技术方案如下：一种制备左旋多巴的方法，采用重组菌大肠埃希氏菌FDop（Escherichia coli FDop）发酵产生，FDop已保存于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2016年2月19日，保藏地址：武汉大学武昌珞珈山，保藏编号为CCTCC NO：M 2016064。
重组菌FDOP是通过将来源于粗糙链孢菌（Neurospora crassa）的酪氨酸酶基因（Gene ID：M32843.1）导入左旋酪氨酸生产菌构建而成。
进一步，重组菌FDOP的获得步骤包括：设计引物克隆酪氨酸酶基因，将克隆到的酪氨酸酶基因连入表达载体中，构建表达质粒Tyrse，再将表达质粒Tyrse导入左旋酪氨酸生产菌（Tyr）中，构建得到重组菌FDop。
进一步，表达载体采用表达载体pKK223-3。
制备左旋多巴的方法，具体包括如下步骤：（1）菌种活化：挑单FDop菌落，接种于种子培养基中，加Amp至100mg/L，35-37℃，200-250rpm，培养12-16h，得到一级种子；（2）扩大培养：将所述一级种子接种到种子培养基中，加Amp至100mg/L，35-37℃，200-250rpm，培养12-16h，得到二级种子；（3）发酵培养：将所述二级种子接种到发酵培养基中，同时加入葡萄糖，转速350-450rpm，风量3-5L/min，控制pH6.0-6.5进行发酵，溶氧控制在15-30%，得到发酵液；（4）诱导：所述发酵液的OD600达到8-10，加入IPTG至终浓度为0.03-0.06mM，同时开始流加左旋酪氨酸溶液，诱导48-72小时，纯化得到左旋多巴。
进一步，步骤（4）中， 左旋酪氨酸溶液的流加流速为0.3-0.8g/L。
进一步，步骤（3）中，采用氨水控制pH6.0-6.5。
进一步，所述种子培养基包括胰蛋白胨10g/L、酵母提取物0.5g/L、氯化钠10g/L。
进一步，发酵培养基包括十二水磷酸氢二钠15.14g/L、磷酸二氢钾3g/L、氯化铵1g/L、氯化钠0.5g/L、七水硫酸镁0.246g/L。
进一步，获得重组菌FDOP的具体步骤包括：
1.将L-酪氨酸生产菌（Tyr）制备成感受态细胞
使用TAKARA 感受态细胞制备试剂盒，按说明书操作，制备获得Tyr菌感受态。
2.全基因合成酪氨酸酶基因片段
根据NCBI数据库中Gene ID：M32843.1提供的序列，合成粗糙链孢菌（Neurosporacrassa）来源的酪氨酸酶全基因片段。
3.构建酪氨酸酶表达质粒Tyrse
将酪氨酸酶全基因片段亚克隆至pKK223-3质粒，酶切位点EcoRI、HindIII。
4.表达质粒Tyrse导入感受态细胞
1)感受态从-70度取出后立刻插入冰水浴中3min；
2)超净台中取1微升的质粒Tyrse加入感受态，轻弹混匀，立刻插入冰水浴25min，静置；
3)将感受态轻轻转移至42度水浴热激1.5min，立刻轻轻转移至冰水浴5min；
4)加700微升左右的LB培养基，150rpm，37度，60min复苏；
5)3500rpm*3min，弃上清600-700微升，剩余菌液吹吸混匀，涂布加氨苄青霉素（100mg/L）LB平板，37℃培养16h。
通过实施上述技术方案，本发明具有如下有益效果：本发明制备左旋多巴的工艺易于控制，稳定性好，副产物少，左旋多巴的产率高。
具体实施方式
下面结合具体实施例，对本发明作进一步详细说明。
实施例1：
一、制备重组菌FDop
1、将L-酪氨酸产生菌（大肠杆菌工程菌）制备成感受态细胞
使用TAKARA 感受态细胞制备试剂盒，按说明书操作，制备获得Tyr菌感受态。
2、全基因合成酪氨酸酶基因片段
根据Gene ID：M32843.1提供的序列，合成粗糙链孢菌（Neurospora crassa）来源的酪氨酸酶全基因片段。
3、构建酪氨酸酶表达质粒Tyrse
将酪氨酸酶全基因片段与强启动子片段亚克隆至表达载体pKK223-3质粒，酶切位点选用EcoRI、HindIII。
4、表达质粒Tyrse导入感受态细胞
（1）感受态从-70度取出后立刻插入冰水浴中3min；
（2）超净台中取1微升的质粒Tyrse加入感受态，轻弹混匀，立刻插入冰水浴25min，静置；
（3）将感受态轻轻转移至42度水浴热激1.5min，立刻轻轻转移至冰水浴5min；
（4）加700微升左右的LB，150rpm，37度，60min复苏；
3500rpm*3min，弃上清600-700微升，剩余菌液吹吸混匀，涂布加氨苄青霉素（100mg/L）LB平板，37℃培养16h；
二、利用重组菌FDop发酵产生左旋多巴
1)挑重组菌FDop单菌落接种于含4ml 种子培养基的试管，加Amp至100mg/L，37℃，220rpm，培养12h，得到一级种子；采用的种子培养基：胰蛋白胨10g/L、酵母提取物0.5 g/L、氯化钠10g/L、纯水；
2)一级种子接种于100ml种子培养基的三角瓶内，加Amp至100mg/L，37℃，220rpm，培养4h，得到二级种子；
3)二级种子接种8L发酵培养基中，同时加入基础葡萄糖4 g/L，转速400rpm，风量4L/min，氨水控制pH6.0发酵，溶氧控制20%；发酵培养基：十二水磷酸氢二钠15.14g/L、磷酸二氢钾3g/L、氯化铵1g/L、氯化钠0.5g/L、七水硫酸镁0.246 g/L、纯水；
4)基糖耗完，补加葡萄糖6g/L，控制加入速度0.6-1.2g/L，得到发酵液；
5)待发酵液的OD600达到8-10时，开始加IPTG至终浓度0.05mM，同时开始流加L-酪氨酸溶液（质量含量为30%），控制L-酪氨酸溶液流速0.5g/L。
6)发酵至左旋多巴不再增加，约48-50小时，停止发酵，左旋多巴含量达50g/L。
实施例2：
一、制备重组菌FDop
同实施例1。
二、利用重组菌FDop发酵产生左旋多巴
1)挑重组菌FDop单菌落接种于含4ml 种子培养基的试管，加Amp至100mg/L，35℃，250rpm，培养16h，得到一级种子；采用的种子培养基：胰蛋白胨10g/L、酵母提取物0.5 g/L、氯化钠10g/L、纯水；
2)一级种子接种于100ml种子培养基的三角瓶内，加Amp至100mg/L，37℃，200rpm，培养6h，得到二级种子；
3)二级种子接种8L发酵培养基中，培养转速350rpm，风量3L/min，氨水控制pH6.5发酵，溶氧控制30%，得到发酵液；发酵培养基：十二水磷酸氢二钠15.14g/L、磷酸二氢钾3g/L、氯化铵1g/L、氯化钠0.5g/L、七水硫酸镁0.246 g/L、葡萄糖10g/L、纯水；
4)待发酵液的OD600达到8时，开始加IPTG至终浓度0.06mM，同时开始流加L-酪氨酸溶液（质量含量为30%），控制L-酪氨酸溶液流速0.5g/L；
5)发酵至左旋多巴不再增加，约60-65小时，停止发酵，左旋多巴含量达58g/L。
实施例3：
一、制备重组菌FDop
同实施例1。
二、利用重组菌FDop发酵产生左旋多巴
（1）挑重组菌FDop单菌落接种于含4ml 种子培养基的试管，加Amp至100mg/L，36℃，200rpm，培养15h，得到一级种子；采用的种子培养基：胰蛋白胨10g/L、酵母提取物0.5 g/L、氯化钠10g/L、纯水；
（2）一级种子接种于100ml种子培养基的三角瓶内，加Amp至100mg/L，36℃，200rpm，培养5h，得到二级种子；
（3）二级种子接种8L发酵培养基中，同时加入基础葡萄糖4 g/L，转速450rpm，风量5L/min，氨水控制pH6.5发酵，溶氧控制30%；发酵培养基：十二水磷酸氢二钠15.14g/L、磷酸二氢钾3g/L、氯化铵1g/L、氯化钠0.5g/L、七水硫酸镁0.246 g/L、纯水；
（4）基糖耗完，补加葡萄糖6g/L，控制加入速度1.0-1.2g/L，得到发酵液；
（5）待发酵液的OD600达到9时，开始加IPTG至终浓度0.03mM，同时开始流加L-酪氨酸溶液（质量含量为30%），控制L-酪氨酸溶液流速0.5g/L。
（6）发酵至左旋多巴不再增加，约72小时，停止发酵，左旋多巴含量达55g/L。
Claims (8)
1.一种制备左旋多巴的方法，其特征在于，采用重组菌大肠埃希氏菌FDop（Escherichia coli FDop）发酵产生，FDOP已保存于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2016年2月19日，保藏编号为CCTCC NO：M 2016064。
2.根据权利要求1所述一种制备左旋多巴的方法，其特征在于，重组菌FDop是通过将酪氨酸酶基因导入左旋酪氨酸生产菌构建而成。
3.根据权利要求2所述一种制备左旋多巴的方法，其特征在于，所述酪氨酸酶基因来源于粗糙链孢菌（Neurospora crassa）。
4.根据权利要求1所述一种制备左旋多巴的方法，其特征在于，包括如下步骤：（1）菌种活化：挑单FDop单菌落，接种于种子培养基中，加Amp至100mg/L，35-37℃，200-250rpm，培养12-16h，得到一级种子；（2）扩大培养：将所述一级种子接种到种子培养基中，加Amp至100mg/L，35-37℃，200-250rpm，培养4-6h，得到二级种子；（3）发酵培养：将所述二级种子接种到发酵培养基中，同时加入葡萄糖，转速350-450rpm，风量3-5L/min，控制pH6.0-6.5进行发酵，溶氧控制在15-30%，得到发酵液；（4）诱导：所述发酵液的OD600达到8-10，加入IPTG至终浓度为0.03-0.06mM，同时开始流加左旋酪氨酸溶液，诱导48-72小时，纯化得到左旋多巴。
5.根据权利要求4所述一种制备左旋多巴的方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤（4）中， 左旋酪氨酸溶液的流加流速为0.3-0.8g/L。
6.根据权利要求4所述一种制备左旋多巴的方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤（3）中，采用氨水控制pH6.0-6.5。
7.根据权利要求2或3所述一种制备左旋多巴的方法，其特征在于，重组菌FDop的获得步骤包括：设计引物克隆酪氨酸酶基因，将克隆到的酪氨酸酶基因连入表达载体中，构建表达质粒Tyrse，再将表达质粒Tyrse导入左旋酪氨酸生产菌（Tyr）中，构建得到重组菌FDop。
8.根据权利要求7所述一种制备左旋多巴的方法，其特征在于，所述表达载体采用表达载体pKK223-3。
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