CN107964525A - 一种酪氨酸酚裂解酶工程菌及其构建方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种酪氨酸酚裂解工程菌及其构建方法与应用，以大大提高酪氨酸酚裂解酶稳定性，鉴定为大肠埃希氏菌，命名为大肠埃希氏菌dYTPL（Escherichia coli dYTPL），保存于中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国武汉，武汉大学，保藏日期为2017年4月21日，保藏编号为CCTCC NO:M 2017201。将两个酪氨酸酚裂解酶基因通过一段核苷酸连接在一起构建表达质粒，得到大肠埃希氏菌dYTPL。该菌发酵表达的酪氨酸酚裂解酶酶活高，稳定性好。

Description

一种酪氨酸酚裂解酶工程菌及其构建方法与应用
技术领域
本发明涉及一种工程菌及其构建方法，具体是一种提高酪氨酸酚裂解酶稳定性的工程菌及其构建方法与应用，属于基因工程领域。
背景技术
左旋多巴（3,4-dihydroxyphenyl-L-ananine，简称L-DOPA）的化学名称为3,4-二羟基苯基丙氨酸，其结构式为：
作为一种重要的生物活性物质，L-DOPA是从L-酪氨酸到儿茶酚或黑色素的生化代谢途径过程中的重要中间产物。
上世纪60年代，国外许多学者开始致力于微生物酶法合成L-DOPA的研究。为了提高L-DOPA产量和底物转化率，研究者们对微生物酶法合成L-DOPA的工艺方法进行了大量研究。
酪氨酸酚裂解酶(Tyrosine phenol lyase，TPL，E.C.4.1.99.2)，又名β-酪氨酸酶，该酶分子量约200kDa，是一个四聚体酶。TPL酶以磷酸吡哆醛（pyridoxal-phosphate，PLP）为辅酶，以钾离子和氨离子为辅助因子，TPL可以催化L-酪氨酸发生β-消去反应生成苯酚、丙酮酸和氨。由于这个反应是可逆的，将邻苯二酚代替苯酚后，可由邻苯二酚、丙酮酸和氨可在TPL催化下生成L-DOPA。左旋多巴的前体在较高浓度时对酶活都有抑制作用，其中邻苯二酚及丙酮酸除了有强抑制作用外，还会导致酶的不可逆失活，反应条件难以控制，副产物多，L-DOPA的产率低。
印度R. KrishnaveniVandanaRathod等人利用真菌Acremoniumrutilum转化L-酪氨酸至L-多巴，酪氨酸酶比活达1095U/mg。但目前产能较低，只有0.89g/L。
巴基斯坦Ikram-Ul-Haq等人对产酪氨酸酶的Aspergillusoryzae进行紫外诱变，诱变株最大产量达1.28g/L。
埃及Doaa A. R. Mahmoud • Magda A. El Bendary利用Egyptian halophilicblack yeast的酪氨酸酶转化生成L-DOPA，产量为66μg/ml。
韩国研究人员使用酪氨酸酶进行转化时，利用电取代还原试剂，将多巴醌（DOPAquinone）还原为L-多巴，使转化率达95.9，生产强度47.27mg/L*h。
也有一些利用自然界中的细菌，如Escherichia、Proteus（变形菌属）、Stizolobiumhassjoo和Erwinia(欧文氏菌属)等，来合成L-DOPA，如左旋多巴酶法合成综述报道，TPL大肠杆菌基因工程菌转化30h，转化生成29.6g/L的L-DOPA。又如，Jang-Young Lee等人克隆来源于Escherichia coli W(ATCC11105)的对羟基苯乙酸-3-羟基化酶（p-hydroxyphenylacetate 3-hydroxylase，PHAH），转化L-酪氨酸为L-DOPA，产物累积至10g/L。研究者发现这些重组菌株虽然TPL的表达量高于野生菌株，但最终的L-DOPA合成能力却没有明显提高甚至低于野生菌株。这可能因为要获得较高的L-DOPA合成能力，菌株除了具备TPL高活性外，还要有相对完善的底物、产物出入细胞膜的转运机制以及对底物邻苯二酚抑制酶活的耐受力等。总体来说，反应条件难以控制，稳定性差，副产物多，L-DOPA的产率低。
本发明的目的之一是提供一种酪氨酸酚裂解酶工程菌，可以大大提高酪氨酸酚裂解酶稳定性，鉴定为大肠埃希氏菌，命名为大肠埃希氏菌dYTPL（Escherichia colidYTPL），保存于中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国武汉，武汉大学，保藏日期为2017年4月21日，保藏编号为CCTCC NO:M 2017201。
本发明的目的是提供所述工程菌的构建方法，将两个酪氨酸酚裂解酶基因通过一段核苷酸连接在一起构建表达质粒，即融合表达重复的酪氨酸酚裂解酶的表达质粒，得到大肠埃希氏菌dYTPL。该菌发酵表达的酪氨酸酚裂解酶酶活高，稳定性好。
所述的一段核苷酸，其序列为：
5’-ATGTGGAGCCACCCGCAGTTCGAAAAAATCGAAGGGCGC-3’
所述工程菌是全基因合成酪氨酸酚裂解酶基因，连入表达载体，构建质粒YTPL，YTPL质粒NdeI单切，回收载体。扩增酪氨酸酚裂解酶基因序列，回收DNA片段。前后两次的回收产物重组即得质粒dYTPL。
具体步骤包括：
（1）根据Gene ID：X66978.1提供的序列，并在5’端增加序列：ATGTGGAGCCACCCGCAGTTCGAAAAAATCGAAGGGCGC，合成酪氨酸酚裂解酶全基因片段；
（2）将酪氨酸酶全基因片段亚克隆至表达载体质粒，酶切位点为NdeI、XhoI，得到质粒YTPL；
（3）将质粒YTPL采用NdeI单酶切，回收载体；
（4）如下引物扩增序列，回收DNA片段：
F：5’-ACTTTAAGAAGGAGATATACATATGAACTATCCGGCA GA ACCGTTTCGCATC-3’；
R ：5’-GAACTGCGGGTGGCTCCACATATGGATGAAATCGAA GCGCGCGGTAAAGAAGCGCAGC-3’；
（5）将步骤（3）回收的载体与步骤（4）回收的DNA片段重组即得质粒dYTPL，转化受体菌，即得大肠埃希氏菌dYTPL。
以上操作构建的菌提高了单位菌体的酶活，和酶的稳定，后续转化合成左旋多巴时，投菌量少，酶活持续稳定，后续转化合成左旋多巴稳定而高效。
作为优选，所述酪氨酸酚裂解酶基因来源于弗氏柠檬酸杆菌，连入表达载体上融合性好，后续表达稳定，表达产物更高效地、更专一的合成左旋多巴，副产物少，给后续的分离纯化带来了很大的方便，并简化了分离步骤，有效的降低了生产成本。
作为优选，所述表达载体采用pET24a，与目的基因片段融合性更好，后续表达更稳定。
作为优选，所述受体菌大肠杆菌采用BL21（DE3），酶表达效率高，而且表达稳定，产率高，遗传稳定性高。
上述方案通过优选表达载体和受体菌，将两个酪氨酸酚裂解酶基因通过一段核苷酸连接在一起构建表达质粒，即融合表达重复的酪氨酸酚裂解酶的表达质粒，可以有效提高目的基因片段的表达效率，表达稳定性，提高工程菌表达产生酪氨酸酚裂解酶活性以及稳定性。
上述所得到的工程菌大肠埃希氏菌dYTPL，用于在底物溶液存在条件下，转化产生L-多巴。
具体操作步骤包括：
（1）挑单菌落接种到含 LB培养基的试管中，加卡那霉素（25-50mg/L）30-37℃，220rpm，培养12-16h，得到一级种子；
（2）将所述一级种子接种到含发酵培养基的摇瓶中，30-37℃，200-250rpm，培养2-5h，加IPTG至终浓度0.1-1mM，23-27℃，180-220rpm，培养10-12h；所述发酵培养基组分如下：胰蛋白胨12g/L、酵母提取物24g/L、甘油5g/L，磷酸二氢钾2.31 g/L、三水磷酸氢二钾16.43g/L；
（3）离心收菌，得到菌体；
（4）菌体60g，加入底物溶液，搅匀，25℃，密封震荡反应；所述底物溶液包括14-16g/L的丙酮酸钠、10-12g/L的邻苯二酚、40-45g/L的氯化铵、2-5g/L的亚硫酸钠、1-3g/L的EDTA，调pH7.5-8.5；
本发明的有益效果如下：本发明将两个酪氨酸酚裂解酶基因通过一段核苷酸连接在一起构建表达质粒，可以有效提高目的基因片段的表达效率，提高工程菌表达产生酪氨酸酚裂解酶活性以及稳定性，可以在提供相关底物下，转化合成左旋多巴，工艺简单，成本低廉，产率高，具有工业化生产的应用价值。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明进一步加以说明。
实施例1：
一、制备大肠埃希氏菌dYTPL
1.将BL21（DE3）制备成感受态细胞
使用TAKARA 感受态细胞制备试剂盒，按说明书操作，制备获得BL21（DE3）感受态。
2.全基因合成酪氨酸酚裂解酶基因片段
根据Gene ID：X66978.1提供的序列，并在5’端增加序列ATGTGGAGCCACCCGCAGTTCGAAAAAATCGAAGGGCGC，合成酪氨酸酚裂解酶全基因片段。
3.构建酪氨酸酶表达质粒YTPL
将酪氨酸酶全基因片段亚克隆至pET24a质粒，得质粒YTPL，酶切位点NdeI、XhoI，质粒YTPL转化入受体菌即得YTPL菌。
4.质粒YTPL采用NdeI单切，回收载体；
5.如下引物扩增序列，回收DNA片段，
引物：F ：5’-ACTTTAAGAAGGAGATATACATATGAACTATCCGGCA GA ACCGTTTCGCATC-3’
R ：5’-GAACTGCGGGTGGCTCCACATATGGATGAAATCGAA GCGCGCGGTAAAGAAGCGCAGC-3’
6.步骤4与5的回收产物重组即得质粒dYTPL；
7.质粒dYTPL导入感受态细胞
1)感受态从-70度取出后立刻插入冰水浴中3min；
2)超净台中取1微升的质粒dYTPL加入感受态，轻弹混匀，立刻插入冰水浴25min，静置；
3)将感受态轻轻转移至42度水浴热激1.5min，立刻轻轻转移至冰水浴5min；
4)加700微升左右的LB，150rpm，37度，60min复苏；
5)3500rpm*3min，弃上清600-700微升，剩余菌液吹吸混匀，涂布加卡那霉素（50mg/L）LB平板，37℃培养16h，获得大肠埃希氏菌dYTPL。
二、发酵产生酪氨酸酚裂解酶
LB培养基：胰蛋白胨10g/L、酵母提取物0.5 g/L、氯化钠10g/L、纯水。
发酵培养基：胰蛋白胨12g/L、酵母提取物24g/L、甘油5g/L，磷酸二氢钾2.31 g/L、三水磷酸氢二钾16.43 g/L、纯水。
1)挑单菌落接种4ml LB培养基试管中，加卡那霉素（50mg/L），37℃，220rpm，培养12h，得到一级种子；
2)一级种子接种到100ml的发酵培养基的摇瓶中，37℃，220rpm，培养4h，加IPTG至终浓度1mM，25℃，220rpm，培养12h；
3)步骤（2）中菌液离心收菌体，放置-20℃冰箱。
三、单位酶活与酶的稳定性
1.测酶活：
1)取酶4g（湿菌体在-80℃冰箱冷冻破胞），加5ml的水，加1ml的PLP溶液，至终浓度50mg/L，搅拌吹吸混匀。
2)配置底物溶液：称1.4g丙酮酸钠、1.2g的邻苯二酚、3g氯化铵、0.1g的EDTA、0.1g的亚硫酸钠，加水80ml，搅拌溶解，调pH8.0，定容90ml；
3)菌液混合底物溶液，20℃水浴搅拌反应20min，取样检测；
4)酶活计算公式：
1U=（C*V*1000000）/（Mr*t*m）
C：产物含量或底物消耗量，单位g/L；
V：转化体系，单位L；
Mr：产物或底物分子量，单位g/mol；
t：反应时间，单位min；
m：投入菌体质量，单位g；
定义：催化1min产生1微摩尔的产物所需的酶量。
2.摇瓶发酵收集菌体，冷冻破胞后测酶活。YTPL菌单位酶活86U/g湿菌体，dYTPL菌单位酶活160U/g湿菌体；
3.YTPL和dYTPL两种湿菌体在60度烘箱处理1h，再立刻冷却处理，然后测酶活，YTPL保留60%的活性，dYTPL保留95%的活性。
四、酪氨酸酚裂解酶转化产生L-多巴
1)1L底物溶液：14g/L的丙酮酸钠、10g/L的邻苯二酚、40g/L的氯化铵、2g/L的亚硫酸钠、1g/L的EDTA，调pH8.0；
2)菌体40g，加入1L底物溶液，搅匀，25℃，密封震荡反应；
3)每半小时添加一次底物（等量的丙酮酸钠和领苯二酚），控制两种底物底物浓度不高于10g/L；
4)当邻苯二酚残留浓度至0.3g/L以下，停止反应， L-多巴浓度累积至125g/L以上。

Claims (8)

1.一种酪氨酸酚裂解酶工程菌，名称为大肠埃希氏菌dYTPL（Escherichia colidYTPL），保存于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2017年4月21日，保藏编号为CCTCCNO:M 2017201。
2.如权利要求1所述工程菌的构建方法，其特征在于，将两个酪氨酸酚裂解酶基因通过一段核苷酸连接在一起构建表达质粒，转入大肠杆菌受体菌，得到大肠埃希氏菌dYTPL。
3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，所述酪氨酸酚裂解酶基因来源于弗氏柠檬酸杆菌。
4.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，包括步骤：A、将全基因合成得到的酪氨酸酚裂解酶全基因片段整合进表达载体上，并将整合后的重整质粒转化进入大肠杆菌受体菌，获得YTPL菌；B、重复融合表达YTPL后构建大肠埃希氏菌dYTPL。
5.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于，具体步骤包括：（1）根据Gene ID：X66978.1提供的序列，并在5’端增加序列，合成酪氨酸酚裂解酶全基因片段；
（2）将酪氨酸酶全基因片段亚克隆至表达载体质粒，酶切位点为NdeI、XhoI，得到质粒YTPL；
（3）将质粒YTPL采用NdeI单酶切，回收载体；
（4）如下引物扩增序列，回收DNA片段：
（5）将步骤（3）回收的载体与步骤（4）回收的DNA片段重组即得质粒dYTPL，转化受体菌，即得大肠埃希氏菌dYTPL。
6.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，大肠杆菌受体菌为BL21（DE3）。
7.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，所述表达载体为pET24a。
8.如权利要求1所述一种酪氨酸酚裂解酶工程菌的应用，其特征在于，用于在底物溶液存在条件下，发酵、转化产生L-多巴。
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