CN107794273A

CN107794273A - 一种合成dl‑丙氨酸的三基因共表达载体及应用

Info

Publication number: CN107794273A
Application number: CN201711065712.1A
Authority: CN
Inventors: 鞠建松; 徐书景; 王珊珊; 孙晴晴; 蔡晓; 赵宝华
Original assignee: Hebei Normal University
Current assignee: Hebei Normal University
Priority date: 2017-11-02
Filing date: 2017-11-02
Publication date: 2018-03-13
Anticipated expiration: 2037-11-02
Also published as: CN107794273B

Abstract

本发明公开了一种合成DL‑丙氨酸的三基因共表达载体的构建及应用。根据同尾酶原理，将假坚强芽胞杆菌中编码丙氨酸脱氢酶(ald)、丙氨酸消旋酶(alr)和葡萄糖脱氢酶(gdh)基因串联插入到改造过的质粒pET‑22bNS上，构建三基因共表达载体pET‑22bNS‑G/A/A。所构建的三基因共表达载体转入大肠杆菌BL21(DE3)中，以重组菌株全细胞催化反应3h后L‑丙氨酸和D‑丙氨酸的产量最高，分别为7.0和6.5mg/mL，二者的最高合成效率分别为56.4和51.9mg/mL/d。本发明所构建的三基因共表达载体具有高效合成DL‑丙氨酸的能力，具有较好的应用价值。

Description

一种合成DL-丙氨酸的三基因共表达载体及应用

技术领域

本发明涉及一种合成DL-丙氨酸的三基因共表达载体的构建方法及应用，属于酶工程和化合物生物合成技术领域。

背景技术

DL-丙氨酸是一种非天然氨基酸，也是重要的手性中间体，广泛应用于食品、化妆品和制药等方面，国内外市场对其需求量日渐增大。现有技术中，DL-丙氨酸的制备方法主要有微生物发酵法、化学合成法和生物酶法，其中，化学合成法反应机制复杂、工艺过程长、生产成本高；发酵法生产周期长、设备投资大、分离复杂、成本高；生物酶法是利用微生物所产生的酶催化底物转化生成DL-丙氨酸，该方法具有较好的区域和立体选择性、反应条件温和、操作简便、污染少等优点，但由于所需酶蛋白的稳定性差、活性低、生产成本高。正是由于这些缺点的存在，上述三种方法均不符合工业化生产的要求，难以满足市场的需求。因此，开发高效合成DL-丙氨酸的生产方法具有非常重要的意义。

早在1997年日本京都大学Kenji Soda教授等提出利用4酶偶联合成D-氨基酸(Galkin et al.,1997)，即利用甲酸脱氢酶、L-丙氨酸脱氢酶、丙氨酸消旋酶和D-氨基酸转氨酶协同作用参与催化合成D-氨基酸，该方法转化效率较高，但高活性、高稳定性的酶蛋白的获得是此方法能否成功开发的关键。

发明内容

本发明的目的是提供一种合成DL-丙氨酸的三基因共表达载体。

本发明的目的还在于提供一种含合成DL-丙氨酸的三基因共表达载体的工程菌的培养和应用方法。

本发明基于上述方法，以葡萄糖脱氢酶替代甲酸脱氢酶，用于催化反应中还原型辅酶NADH的再生；利用同尾酶原理将葡萄糖脱氢酶(gdh)、丙氨酸脱氢酶(ald)和丙氨酸消旋酶(alr)三基因串联构建多基因共表达载体，使每个基因均带有独立的启动子(T7启动子)、核糖体结合位点(RBS)、终止子(T7终止子)等表达调控元件，各基因的表达相对独立；以含有多基因共表达载体的重组菌体全细胞进行催化，筛选获得了转化效率高的DL-丙氨酸生物合成新途径。

本发明的目的是这样实现的：一种合成DL-丙氨酸的三基因共表达载体，其核苷酸序列由SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.4和SEQ ID No.6共同构成。其中：

(1)SEQ ID No.1所示序列为改造后表达载体pET-22bNS的表达区域的核苷酸序列，其中T7启动子和终止子附近分别含有限制内切酶NheI和SpeI的识别位点；

(2)SEQ ID No.2所示序列为编码基因gdh的核苷酸序列，其中第564位的碱基T突变为C；

(3)SEQ ID No.4所示序列为编码基因ald的核苷酸序列，其中第321位的碱基A突变为C；

(4)SEQ ID No.6所示为编码基因alr的核苷酸序列。

本发明还提供三个编码基因gdh、ald和alr的氨基酸序列，如SEQ ID No.3、SEQ IDNo.5和SEQ ID No.7所示。

本发明还提供含有上述三基因的共表达载体及宿主细胞。

本发明还提供含有上述三基因共表达载体的工程菌。

本发明还提供上述三基因共表达载体的构建方法，包括以下步骤：

(1)根据商业载体pET-22b(+)中T7启动子和终止子待突变区域的核苷酸序列，设计定点突变引物，改造获得限制内切酶NheI和SpeI的识别位点；所述突变引物为：

Nhe-F01：5′-GAGATCTCGATGCTAGCAAATTAATACGACTC-3′；

Spe-F01：5′-AGGAGGAACTAGTTCCGGATTGGC-3′；

Spe-R01：5′-GCCAATCCGGAACTAGTTCCTCCT-3′；

(2)以商业载体pET-22b(+)为模板，使用上述设计的引物进行PCR扩增，将含有限制内切酶NheI和SpeI识别位点的扩增产物替换商业载体的表达区域，构建能够容纳多个基因共同表达的载体pET-22bNS；

(3)根据NCBI数据库中公开的来自假坚强芽胞杆菌OF4的葡萄糖脱氢酶、丙氨酸脱氢酶和丙氨酸消旋酶的核苷酸序列，设计PCR扩增引物对；所述引物对为：

Gdh-F01:5′-GCATATGAAAAGACTTATAGCAGT-3′

Gdh-R01:5′-AGCGGCCGCTTCACTTCTAATCAATTC-3′

Ald-F01:5′-CACGCATATGATTATCGGTATTCCA-3′

Ald-R01:5′-AGCCTCGAGTGCTTGAACAGGTGTTTTC-3′

Alr-F01:5′-CATATGAAGACGAGCAGTTTTAGA-3′

Alr-R01:5′-CTCGAGGTTCTCTTCGTAATATCTCGGAAC-3′

(4)以假坚强芽胞杆菌OF4基因组DNA为模板，使用上述设计的引物进行PCR扩增，将扩增产物逐一连入改造后的载体pET-22bNS中，构建三基因共表达载体；

(5)将上述三基因共表达载体转化可表达目的基因的工程菌中，随工程菌的复制表达葡萄糖脱氢酶、丙氨酸脱氢酶和丙氨酸消旋酶蛋白。

制备方法的优选条件：步骤(2)中所述表达载体为pET系列中的任意一种。

步骤(5)中所述工程菌为大肠杆菌BL21系列中的任意一种。

本发明进一步提供上述三基因共表达载体的应用，具体是将三基因共表达载体用于生物法生产DL-丙氨酸。

具体地，本发明是从假坚强芽胞杆菌(Bacillus pseudofirmus)OF4中获得葡萄糖脱氢酶(GenBank:ADC51909.1)、丙氨酸脱氢酶(GenBank:ADC50010.1)和丙氨酸消旋酶(GenBank:ADC50009.1)基因，通过PCR扩增获得目的基因，并将基因片段与质粒pET-22bNS连接，构建重组表达质粒pET-22bNS-Gdh、pET-22bNS-Ald和pET-22bNS-Alr；利用NheI和SpeI互为同尾酶的原理，通过限制内切酶BglII和SpeI双酶切获取带有启动子、核糖体结合位点、终止子等表达调控元件的目的基因片段，逐一与经BglII和NheI双酶切处理的相应表达载体相连接，最终构建三基因共表达载体pET-22bNS-G/A/A；该重组质粒转化大肠杆菌感受态，构建三基因共表达的基因工程菌BL21(DE3)/pET-22bNS-G/A/A；经30℃诱导15h后收集菌体，以重组菌体全细胞参与催化反应，在37℃下180rpm振荡反应3h，经检测，反应液中L-丙氨酸和D-丙氨酸的产量分别为7.0和6.5mg/mL，二者的合成效率分别为56.4和51.9mg/mL/d。

本发明取得以下有益效果：本发明通过同尾酶的原理构建了葡萄糖脱氢酶、丙氨酸脱氢酶和丙氨酸消旋酶三基因共表达载体，每个基因均带有独立的表达调控元件；通过转化获得了含有三基因共表达载体的基因工程菌，筛选获得了转化效率高的DL-丙氨酸生物合成新方法，具有较好的推广应用价值。

附图说明

图1为pET-22bNS改造区域PCR产物电泳图谱。

图1中M：2000bp DNA marker；1：pET-22bNS改造区域PCR产物。

图2为质粒pET-22bNS-Ald双酶切电泳图谱。

图2中M：1.0kb DNA marker；1：质粒pET-22bNS-Ald的双酶切产物。

图3为质粒pET-22bNS-Alr双酶切电泳图谱。

图3中M：1.0kb DNA marker；1&2：质粒pET-22bNS-Alr的双酶切产物。

图4为质粒pET-22bNS-Gdh双酶切电泳图谱。

图4中M：1.0kb DNA marker；1：质粒pET-22bNS-Gdh的双酶切产物。

图5为三基因共表达载体中基因串联示意图。

图6为三基因共表达载体双酶切电泳图谱。

图6中M：1.0kb DNA marker；1：质粒pET-22bNS-G/A/A的双酶切产物。

图7为生物合成DL-丙氨酸含量图；

图7中A：反应液中L-丙氨酸的含量；B：反应液中D-丙氨酸的含量。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明。需要说明，下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法，所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1构建三个基因共表达载体

(1)改造载体pET-22b(+)

a,引物设计：根据商业载体pET-22b(+)中T7启动子和终止子附近待突变区域的核苷酸序列，设计PCR扩增反应引物：

Nhe-F01：5′-GAGATCTCGATGCTAGCAAATTAATACGACTC-3′；

Spe-F01：5′-AGGAGGAACTAGTTCCGGATTGGC-3′；

Spe-R01：5′-GCCAATCCGGAACTAGTTCCTCCT-3′；

b,增加SpeI识别位点：采用定点突变技术(Site-Directed Mutagenesis)，以质粒pET-22b(+)为模板，以Spe-F01和Spe-R01为引物对进行定点突变PCR，PCR反应条件为：94℃预变性4min；94℃变性35sec，55℃退火1min，72℃延伸7min，循环16次；72℃充分延伸10min。

PCR反应产物经限制内切酶DpnI消化后，转化至大肠杆菌E.coli DH5α，挑取单一菌落培养后提取质粒并送样测序验证，获得含有SpeI识别位点的突变质粒pET-22bS。

c,增加NheI识别位点：以质粒pET-22bS为模板，以Nhe-F01和Spe-R01为引物对进行PCR，PCR反应条件为：94℃预变性4min；94℃变性35sec，55℃退火1min，72℃延伸1min，循环22次；72℃延伸10min。PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳检测、分离(见图1，约390bp的DNA片段)，将通过胶回收获得的目的DNA与T载体pMD18-T连接构建载体pMD-22bNS，转入大肠杆菌E.coli DH5α，挑取菌落培养后送样测序验证；

将测序正确的质粒pMD-22bNS经BglII和SpeI双酶切，酶切产物经胶回收后，与经同样双酶切处理的线性质粒pET-22bS混匀，以T4连接酶16℃过夜连接，连接产物转化至大肠杆菌E.coli DH5α，筛选获得含有限制内切酶NheI和SpeI识别位点的质粒pET-22bNS。

(2)获得目的基因

依据假坚强芽胞杆菌OF4已知的葡萄糖脱氢酶(Gdh，GenBank:ADC51909.1)、丙氨酸脱氢酶(Ald，GenBank:ADC50010.1)和丙氨酸消旋酶(Alr，GenBank:ADC50009.1)基因序列设计PCR引物，以B.pseudofirmus OF4基因组DNA为模板，进行PCR扩增，获得对应的特异DNA片段。各基因扩增引物及PCR条件分别为：

Gdh-F01:5′-GCATATGAAAAGACTTATAGCAGT-3′(下划线为NdeI的识别位点)

Gdh-R01:5′-AGCGGCCGCTTCACTTCTAATCAATTC-3′(下划线为NotI的识别位点)

Ald-F01:5′-CACGCATATGATTATCGGTATTCCA-3′(下划线为NdeI的识别位点)

Ald-R01:5′-AGCCTCGAGTGCTTGAACAGGTGTTTTC-3′(下划线为XhoI的识别位点)

Alr-F01:5′-CATATGAAGACGAGCAGTTTTAGA-3′(下划线为NdeI的识别位点)

Alr-R01:5′-CTCGAGGTTCTCTTCGTAATATCTCGGAAC-3′(下划线为XhoI的识别位点)

95℃预变性5min；95℃变性45sec，53℃退火1min，72℃延伸90sec，循环25次；72℃延伸10min。扩增得到的DNA片段经琼脂糖凝胶电泳回收后，分别与载体pMD18-T连接，并将连接产物转化至大肠杆菌E.coli DH5α，挑取菌落进行菌落PCR检测，挑选具有目的DNA条带的阳性克隆培养、提取质粒并送样测序。序列比对发现测序基因与Genbank公布的序列完全一致。

(3)构建三基因共表达载体

a,构建单基因表达载体：质粒pMB18-Gdh、pMB18-Ald和pMB18-Alr经NdeI、XhoI或NotI双酶切，获得大小均约为1.1kbp的DNA片段。酶切产物经胶回收后，与经同样双酶切处理的线性质粒pET-22bNS混合，用T4连接酶16℃过夜连接，连接产物转化至大肠杆菌E.coliDH5α，通过菌落PCR筛选阳性克隆，获得表达载体pET-22bNS-Gdh0、pET-22bNS-Ald0和pET-22bNS-Alr。

b，构建同义突变体：由于葡萄糖脱氢酶和丙氨酸脱氢酶的核苷酸序列中分别存在一个限制内切酶BglII(AGATCT)或SpeI(ACTAGT)的识别位点，为了消除这些影响构建多基因共表达载体的酶切位点，在不改变酶蛋白的氨基酸序列的前提下，根据葡萄糖脱氢酶和丙氨酸脱氢酶基因中待突变区域的核苷酸序列设计定点突变引物，通过定点突变技术构建同义突变体，从而消除基因中限制内切酶BglII及SpeI的识别位点；所述突变引物为：

Gdh188D-F01:5′-CTCTGCCCCAGACCTAGCACAGGAC-3′

Gdh188D-R01:5′-GTCCTGTGCTAGGTCTGGGGCAGAG-3′

Ald107L-F01:5′-GCAAAAGCACTCGTAGACAGCG-3′

Ald107L-R01:5′-CGCTGTCTACGAGTGCTTTTGC-3′

采用定点突变技术，分别以质粒pET-22bNS-Gdh0和pET-22bNS-Ald0为模板，以引物对Gdh188D-F01和Gdh188D-R01或Ald107L-F01和Ald107L-R01进行定点突变PCR，PCR反应条件为：94℃预变性4min；94℃变性35sec，55℃退火1min，72℃延伸7min，循环16次；72℃充分延伸10min。

PCR反应产物经限制内切酶DpnI消化后，转化至大肠杆菌E.coli DH5α，挑取单一菌落培养后提取质粒并送样测序验证，获得分别消除BglII和SpeI识别位点的突变质粒pET-22bNS-Gdh和pET-22bNS-Ald，其中葡萄糖脱氢酶中第188位的天门冬氨酸(D)残基密码子由GAT突变为GAC，丙氨酸脱氢酶中第107位的赖氨酸(L)残基密码子由CTA突变为CTC，二者的氨基酸序列均未发生改变，即为同义突变体。

c，构建三基因共表达载体：将表达载体pET-22bNS-Ald经限制内切酶BglII和SpeI双酶切处理，酶切产物经胶回收获得约1.4kb的DNA片段(见图2)，将该DNA与经限制内切酶BglII和NheI双酶切处理的质粒pET-22bNS-Alr(见图3)相连接，随后连接产物转化至大肠杆菌E.coli DH5α，并通过菌落PCR筛选阳性克隆，获得双基因共表达载体pET-22bNS-A/A；

将表达载体pET-22bNS-Gdh经限制内切酶BglII和SpeI双酶切处理，酶切产物经胶回收获得约1.4kb的DNA片段(见图4)，将该DNA与经限制内切酶BglII和NheI双酶切处理的双基因共表达载体pET-22bNS-A/A相连接，随后连接产物转化至大肠杆菌E.coli DH5α，通过菌落PCR筛选阳性克隆，获得三基因串联共表达载体pET-22bNS-G/A/A，其中每个基因都带有独立的启动子、核糖体结合位点和终止子等表达调控元件(见图5)；经限制内切酶BglII和SpeI双酶切处理得到一个大小约为4.2kb的DNA片段(见图6)，说明三基因共表达载体构建成功。

实施例2生物合成四氢嘧啶

(1)三基因共同表达

将三基因共表达载体pET-22bNS-G/A/A转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，挑选转化子于37℃含100μg/mL氨苄青霉素的LB培养液中过夜培养；次日将培养液以1:100比例接种于100mL含100μg/mL氨苄青霉素的LB培养液，于37℃180rpm下振荡培养至OD₆₀₀为0.5～0.6时，于30℃诱导15h，8000rpm离心收集菌体，用0.8％的NaCl溶液洗菌体；

(2)全细胞催化合成四氢嘧啶

称取1g菌体重悬于20mL反应液(20mM Na₂CO₃-NaHCO₃缓冲液，pH 10；200mM丙酮酸钠，200mM氯化铵，200mM葡萄糖)中，于37℃180rpm振荡培养3h后离心去除菌体，采用HPLC检测上清中L-丙氨酸和D-丙氨酸的含量。结果显示，该反应所合成L-丙氨酸和D-丙氨酸的含量分别为7.0和6.5mg/mL(见图7)，二者的最高合成效率分别为56.4和51.9mg/mL/d，具有较高的合成水平。

虽然，以上已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对其作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 河北师范大学

<120> 一种合成DL-丙氨酸的三基因共表达载体及应用

<130> 2017

<160> 7

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 390

<212> DNA

<213> 质粒pET-22bNS表达区域

<400> 1

agatctcgat gctagcaaat taatacgact cactataggg gaattgtgag cggttaacaa 60

ttcccctcta gaactaattt tgtttaactt taagaaggag atatacatat gaaatacctg 120

ctgccgaccg ctgctgctgg tctgctgctc ctcgctgccc agccggcgat ggccatggat 180

atcggaatta attcggatcc gaattcgagc tccgtcgaca agcttgcggc cgcactcgag 240

caccaccacc accaccactg agatccggct gctaacaaag cccgaaagga agctgagttg 300

gctgctgcca ccgctgagca ataactagca taaccccttg gggcctctaa acgggtcttg 360

aggggttttt tgctgaaagg aggaactagt 390

<210> 2

<211> 1116

<212> DNA

<213> 假坚强芽胞杆菌（Bacillus pseudofirmus OF4）

<400> 2

atgaaaagac ttatagcagt atgtatattc ctgctgatac tagggtgttc tagtgtaggg 60

tgttctagta atgaacaaga agactctaca gcggagcagc ctgacataaa tgaagcttcg 120

aatcagccag aggaggagca tgcagctggg atagaagtca tagcagaaaa cctcgagatt 180

ccatggtcaa ttgaaaaagc agacgatact ttttacttaa cagaaagacc gggctctatt 240

ataaaagtag aaaatggaga aatgaaacgg caaggtgtac agctagaaaa aaatattgca 300

acggcagcag aggcgggact tttgggatta gtgctggcac cagatttttc tgattcgaat 360

ctagcatttg cttactacac ctatgaagac agttccggac aattcaatcg aattgtcact 420

ctgcgattgg aggacgacag ttggagggaa gagagcttgc ttttagatca gatcccaagc 480

ggtacctatc atcacggggg acggttgaaa atcggaccag atgaaacgct ttacgcaaca 540

gcaggtgatg cctctgcccc agacctagca caggacctta actcattagg aggaagcata 600

ttaaggatga atctagatgg atcgatccca gaagataatc cactgcctga ctcctacatc 660

tacagctacg gacaccgcaa tcctcaaggg ctgacttggt catctgcagg tacgctttac 720

tccagtgaac atggcagcag tgccaatgat gaaataaatg aaattgaagg cggacaaaat 780

tatggctggc caagcataca aggaacagag gaagaagaag gaatgatcac acctttattc 840

acttcaggag cagcggacac gtgggcacca tcaggtatgg cttatgcgaa tggcaagctg 900

tatgtagcag ctttaagggg agaagccgtg atcgaatttg atcttgaaac gggagaacaa 960

cgaaaagtca ttaccgatta tggcaggata cgagatgtgc tgattgagga tgatacatta 1020

tatttcatca gcaataacac agacggacgc ggcaatccaa aagagaatga tgataaactg 1080

tataaagtct ctttaacaga attgattaga agtgaa 1116

<210> 3

<211> 372

<212> PRT

<213> 假坚强芽胞杆菌（Bacillus pseudofirmus OF4）

<400> 3

Met Lys Arg Leu Ile Ala Val Cys Ile Phe Leu Leu Ile Leu Gly Cys

1 5 10 15

Ser Ser Val Gly Cys Ser Ser Asn Glu Gln Glu Asp Ser Thr Ala Glu

20 25 30

Gln Pro Asp Ile Asn Glu Ala Ser Asn Gln Pro Glu Glu Glu His Ala

35 40 45

Ala Gly Ile Glu Val Ile Ala Glu Asn Leu Glu Ile Pro Trp Ser Ile

50 55 60

Glu Lys Ala Asp Asp Thr Phe Tyr Leu Thr Glu Arg Pro Gly Ser Ile

65 70 75 80

Ile Lys Val Glu Asn Gly Glu Met Lys Arg Gln Gly Val Gln Leu Glu

85 90 95

Lys Asn Ile Ala Thr Ala Ala Glu Ala Gly Leu Leu Gly Leu Val Leu

100 105 110

Ala Pro Asp Phe Ser Asp Ser Asn Leu Ala Phe Ala Tyr Tyr Thr Tyr

115 120 125

Glu Asp Ser Ser Gly Gln Phe Asn Arg Ile Val Thr Leu Arg Leu Glu

130 135 140

Asp Asp Ser Trp Arg Glu Glu Ser Leu Leu Leu Asp Gln Ile Pro Ser

145 150 155 160

Gly Thr Tyr His His Gly Gly Arg Leu Lys Ile Gly Pro Asp Glu Thr

165 170 175

Leu Tyr Ala Thr Ala Gly Asp Ala Ser Ala Pro Asp Leu Ala Gln Asp

180 185 190

Leu Asn Ser Leu Gly Gly Ser Ile Leu Arg Met Asn Leu Asp Gly Ser

195 200 205

Ile Pro Glu Asp Asn Pro Leu Pro Asp Ser Tyr Ile Tyr Ser Tyr Gly

210 215 220

His Arg Asn Pro Gln Gly Leu Thr Trp Ser Ser Ala Gly Thr Leu Tyr

225 230 235 240

Ser Ser Glu His Gly Ser Ser Ala Asn Asp Glu Ile Asn Glu Ile Glu

245 250 255

Gly Gly Gln Asn Tyr Gly Trp Pro Ser Ile Gln Gly Thr Glu Glu Glu

260 265 270

Glu Gly Met Ile Thr Pro Leu Phe Thr Ser Gly Ala Ala Asp Thr Trp

275 280 285

Ala Pro Ser Gly Met Ala Tyr Ala Asn Gly Lys Leu Tyr Val Ala Ala

290 295 300

Leu Arg Gly Glu Ala Val Ile Glu Phe Asp Leu Glu Thr Gly Glu Gln

305 310 315 320

Arg Lys Val Ile Thr Asp Tyr Gly Arg Ile Arg Asp Val Leu Ile Glu

325 330 335

Asp Asp Thr Leu Tyr Phe Ile Ser Asn Asn Thr Asp Gly Arg Gly Asn

340 345 350

Pro Lys Glu Asn Asp Asp Lys Leu Tyr Lys Val Ser Leu Thr Glu Leu

355 360 365

Ile Arg Ser Glu

370

<210> 4

<211> 1131

<212> DNA

<213> 假坚强芽胞杆菌（Bacillus pseudofirmus OF4）

<400> 4

atgattatcg gtattccaaa ggaaattaaa aataatgaaa accgcgtagc aattacacca 60

gcaggagttg ttgctttaac aaaagcaggc caccaaattc taatcgaaca aggcgctgga 120

attggcagcg gatttgaaga tgtagattac acagctgctg gagcaacaat tattccagaa 180

gcgaaagatg tatgggctaa agctgaaatg gtgatgaaag ttaaagaacc attaagctct 240

gagtacggct acttccgcaa aggattaatc ctattcacat accttcacct agctgctgag 300

cctgaacttg caaaagcact cgtagacagc ggcgttattg cgatcgctta tgaaacagtt 360

gaagtaaacc gcactcttcc tcttttaact cctatgagtg aagtggctgg acgcatggca 420

tcacaaattg gtgctcaatt cctagagaag tctaaaggcg gaaaaggaat tctattatca 480

ggtgttcctg gagttaaacg tggtaaagta acaatcatcg gcggcggtgt tgttggtaca 540

aacgcagcta aaattgctgt tggccttggt gctgatgtaa cacttatcga cttaagtgca 600

gatcgtcttc gccagcttga tgatcaattt ggaaacgata ttcaaacact tatgtctaac 660

ccgcttaaca ttgctgaggc agtaaaagaa tctgacttag taatcggtgc tgtattaatt 720

cctggtgcaa aagctcctaa gcttgtaaca gaggaaatga tcaaatctat gactcctgga 780

tcggttgttg ttgacgtagc gattgaccaa ggcggtatca ttgaaacagt tgatcaaatt 840

acaacacatg ataacccaac gtatacaaaa cacggtgttg ttcactatgc agttgctaac 900

atgcctggag ctgttccgcg cacatcaaca atcggcttaa caaacgtaac aattccttac 960

gctatgcaga ttgctaacaa aggcgtagaa aaagctgttg ctgagaaccc tgcacttgct 1020

cttggtgtaa acgttgcaaa cggtgatgta acatacaacg ctgtagcacg tgatcttgga 1080

tatgagttag tatctgtaga agatgcatta aagaaaacac ctgttcaagc a 1131

<210> 5

<211> 377

<212> PRT

<213> 假坚强芽胞杆菌（Bacillus pseudofirmus OF4）

<400> 5

Met Ile Ile Gly Ile Pro Lys Glu Ile Lys Asn Asn Glu Asn Arg Val

1 5 10 15

Ala Ile Thr Pro Ala Gly Val Val Ala Leu Thr Lys Ala Gly His Gln

20 25 30

Ile Leu Ile Glu Gln Gly Ala Gly Ile Gly Ser Gly Phe Glu Asp Val

35 40 45

Asp Tyr Thr Ala Ala Gly Ala Thr Ile Ile Pro Glu Ala Lys Asp Val

50 55 60

Trp Ala Lys Ala Glu Met Val Met Lys Val Lys Glu Pro Leu Ser Ser

65 70 75 80

Glu Tyr Gly Tyr Phe Arg Lys Gly Leu Ile Leu Phe Thr Tyr Leu His

85 90 95

Leu Ala Ala Glu Pro Glu Leu Ala Lys Ala Leu Val Asp Ser Gly Val

100 105 110

Ile Ala Ile Ala Tyr Glu Thr Val Glu Val Asn Arg Thr Leu Pro Leu

115 120 125

Leu Thr Pro Met Ser Glu Val Ala Gly Arg Met Ala Ser Gln Ile Gly

130 135 140

Ala Gln Phe Leu Glu Lys Ser Lys Gly Gly Lys Gly Ile Leu Leu Ser

145 150 155 160

Gly Val Pro Gly Val Lys Arg Gly Lys Val Thr Ile Ile Gly Gly Gly

165 170 175

Val Val Gly Thr Asn Ala Ala Lys Ile Ala Val Gly Leu Gly Ala Asp

180 185 190

Val Thr Leu Ile Asp Leu Ser Ala Asp Arg Leu Arg Gln Leu Asp Asp

195 200 205

Gln Phe Gly Asn Asp Ile Gln Thr Leu Met Ser Asn Pro Leu Asn Ile

210 215 220

Ala Glu Ala Val Lys Glu Ser Asp Leu Val Ile Gly Ala Val Leu Ile

225 230 235 240

Pro Gly Ala Lys Ala Pro Lys Leu Val Thr Glu Glu Met Ile Lys Ser

245 250 255

Met Thr Pro Gly Ser Val Val Val Asp Val Ala Ile Asp Gln Gly Gly

260 265 270

Ile Ile Glu Thr Val Asp Gln Ile Thr Thr His Asp Asn Pro Thr Tyr

275 280 285

Thr Lys His Gly Val Val His Tyr Ala Val Ala Asn Met Pro Gly Ala

290 295 300

Val Pro Arg Thr Ser Thr Ile Gly Leu Thr Asn Val Thr Ile Pro Tyr

305 310 315 320

Ala Met Gln Ile Ala Asn Lys Gly Val Glu Lys Ala Val Ala Glu Asn

325 330 335

Pro Ala Leu Ala Leu Gly Val Asn Val Ala Asn Gly Asp Val Thr Tyr

340 345 350

Asn Ala Val Ala Arg Asp Leu Gly Tyr Glu Leu Val Ser Val Glu Asp

355 360 365

Ala Leu Lys Lys Thr Pro Val Gln Ala

370 375

<210> 6

<211> 1107

<212> DNA

<213> 假坚强芽胞杆菌（Bacillus pseudofirmus OF4）

<400> 6

atgaagacga gcagttttag aaacacctat gcacaaatct cattacaagc cctaaaagaa 60

aatgcagctt cttttaaagc ttccctacaa tctcctgcat gcagattaat ggcggttgta 120

aaaggagacg ggtacggaca cggggccgtt gctgcagcta gttcagcctt aaacggcgga 180

gcagactatt tgggagtagc cattcttgat gaagcgattg agcttcgtga tgcaggagtt 240

gaagcaccta ttttagtgtt aggctatacc tctccgcatg cgttacgaga agcgatttct 300

cgcaatatta cgctcactgt gttttctact gatgttcggg atgcattgct tgaggtggct 360

tctgaggccg aatcgccaat aaaggttcat attaaaactg aaacaggcat gggacgagta 420

ggtgtgcaga ccaaagaaga gctgctcgac gtcatgactc ctctctatca ccataataat 480

attgaagtag aaggcatttt cacccatttt gctgaagctg ataacctgca gtctacctac 540

acagatgaac aatttgcacg atttctatca tttattgagg caatagaaaa agacgatatg 600

cacgtaccga ttaaacattg ctgcaatagt gcaggaactc tcttccataa ggataaacat 660

cttgatatgg tacgtgtcgg catcagcctg tacgggttaa gaccggacgt ttccttagaa 720

ttcccaattg agcttactca ggcaatgcgg ttattttcta gtattgtatc gcttagaaaa 780

ctgcctgaag gttcatcaat tagttacgga agaacacata aactctcatc tgaaaaagtt 840

gtggctacga tgccgatcgg atatgccgac ggtctttccc gggccttatc taataaaggg 900

ttcgtcactt tacacggcca aaaagcgccg atcttgggtc gcgtgtgcat ggaccagacg 960

atgatcgatg taacagatat cccagatgct gcgcttggcg atcatgtgga atttccaatc 1020

gatgagatgg ctgaattaac agggacgatt aattatgaga ttgtttgcgc ggtgagtaag 1080

cgtgttccga gatattacga agagaac 1107

<210> 7

<211> 369

<212> PRT

<213> 假坚强芽胞杆菌（Bacillus pseudofirmus OF4）

<400> 7

Met Lys Thr Ser Ser Phe Arg Asn Thr Tyr Ala Gln Ile Ser Leu Gln

1 5 10 15

Ala Leu Lys Glu Asn Ala Ala Ser Phe Lys Ala Ser Leu Gln Ser Pro

20 25 30

Ala Cys Arg Leu Met Ala Val Val Lys Gly Asp Gly Tyr Gly His Gly

35 40 45

Ala Val Ala Ala Ala Ser Ser Ala Leu Asn Gly Gly Ala Asp Tyr Leu

50 55 60

Gly Val Ala Ile Leu Asp Glu Ala Ile Glu Leu Arg Asp Ala Gly Val

65 70 75 80

Glu Ala Pro Ile Leu Val Leu Gly Tyr Thr Ser Pro His Ala Leu Arg

85 90 95

Glu Ala Ile Ser Arg Asn Ile Thr Leu Thr Val Phe Ser Thr Asp Val

100 105 110

Arg Asp Ala Leu Leu Glu Val Ala Ser Glu Ala Glu Ser Pro Ile Lys

115 120 125

Val His Ile Lys Thr Glu Thr Gly Met Gly Arg Val Gly Val Gln Thr

130 135 140

Lys Glu Glu Leu Leu Asp Val Met Thr Pro Leu Tyr His His Asn Asn

145 150 155 160

Ile Glu Val Glu Gly Ile Phe Thr His Phe Ala Glu Ala Asp Asn Leu

165 170 175

Gln Ser Thr Tyr Thr Asp Glu Gln Phe Ala Arg Phe Leu Ser Phe Ile

180 185 190

Glu Ala Ile Glu Lys Asp Asp Met His Val Pro Ile Lys His Cys Cys

195 200 205

Asn Ser Ala Gly Thr Leu Phe His Lys Asp Lys His Leu Asp Met Val

210 215 220

Arg Val Gly Ile Ser Leu Tyr Gly Leu Arg Pro Asp Val Ser Leu Glu

225 230 235 240

Phe Pro Ile Glu Leu Thr Gln Ala Met Arg Leu Phe Ser Ser Ile Val

245 250 255

Ser Leu Arg Lys Leu Pro Glu Gly Ser Ser Ile Ser Tyr Gly Arg Thr

260 265 270

His Lys Leu Ser Ser Glu Lys Val Val Ala Thr Met Pro Ile Gly Tyr

275 280 285

Ala Asp Gly Leu Ser Arg Ala Leu Ser Asn Lys Gly Phe Val Thr Leu

290 295 300

His Gly Gln Lys Ala Pro Ile Leu Gly Arg Val Cys Met Asp Gln Thr

305 310 315 320

Met Ile Asp Val Thr Asp Ile Pro Asp Ala Ala Leu Gly Asp His Val

325 330 335

Glu Phe Pro Ile Asp Glu Met Ala Glu Leu Thr Gly Thr Ile Asn Tyr

340 345 350

Glu Ile Val Cys Ala Val Ser Lys Arg Val Pro Arg Tyr Tyr Glu Glu

355 360 365

Asn

Claims

1.一种合成DL-丙氨酸的三基因共表达载体，其特征在于其核苷酸序列由SEQ IDNo.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.4和SEQ ID No.6共同构成，其中：

(2)SEQ ID No.2所示序列为葡萄糖脱氢酶基因的核苷酸序列，其中第564位的碱基T突变为C；

(3)SEQ ID No.4所示序列为丙氨酸脱氢酶基因的核苷酸序列，其中第321位的碱基A突变为C；

(4)SEQ ID No.6所示序列为丙氨酸消旋酶基因的核苷酸序列。

2.一种编码如权利要求1所述三个酶蛋白Gdh、Ald和Alr，其特征在于其氨基酸序列如SEQ ID NO.3、SEQ ID No.5和SEQ ID No.7所示，其中SEQ ID No.3中第188位的天门冬氨酸(D)为同义突变(GAT→GAC)，SEQ ID No.5中第107位的赖氨酸(L)为同义突变(CTA→CTC)。

3.一种含权利要求1所述三基因共表达载体的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)根据质粒pET-22b(+)中T7启动子和终止子待突变区域核苷酸序列信息，设计突变引物，通过PCR突变技术引入限制内切酶NheI和SpeI的识别位点；

所述引物为：

Nhe-F01:5′-GAGATCTCGATGCTAGCAAATTAATACGACTC-3′；

Spe-F01:5′-AGGAGGAACTAGTTCCGGATTGGC-3′；

Spe-R01:5′-GCCAATCCGGAACTAGTTCCTCCT-3′；

以质粒pET-22b(+)为PCR模板，使用上述设计的引物，利用PCR突变技术将T7启动子和终止子待突变区域分别突变获得限制内切酶NheI和SpeI的识别位点，改造获得质粒pET-22bNS；

(2)根据NCBI数据库中公开的来自假坚强芽胞杆菌OF4的葡萄糖脱氢酶、丙氨酸脱氢酶和丙氨酸消旋酶的核苷酸序列，设计PCR扩增引物对，通过PCR扩增获得目的DNA；

所述各基因扩增引物为：

Gdh-F01:5′-GCATATGAAAAGACTTATAGCAGT-3′

Gdh-R01:5′-AGCGGCCGCTTCACTTCTAATCAATTC-3′

Ald-F01:5′-CACGCATATGATTATCGGTATTCCA-3′

Ald-R01:5′-AGCCTCGAGTGCTTGAACAGGTGTTTTC-3′

Alr-F01:5′-CATATGAAGACGAGCAGTTTTAGA-3′

Alr-R01:5′-CTCGAGGTTCTCTTCGTAATATCTCGGAAC-3′

以来自假坚强芽胞杆菌(Bacillus pseudofirmus)OF4的基因组DNA为模板，使用上述设计的引物，利用PCR技术扩增获得目的DNA片段，通过限制内切酶将目的DNA与经相同酶切处理的质粒pET-22bNS连接，构建表达载体pET-22bNS-Gdh0、pET-22bNS-Ald0和pET-22bNS-Alr；

(3)在不改变氨基酸序列的前提下，根据待突变区域的核苷酸序列设计定点突变引物，通过定点突变技术构建同义突变以消除相关限制内切酶的识别位点；

所述突变引物为：

Gdh188D-F01:5′-CTCTGCCCCAGACCTAGCACAGGAC-3′

Gdh188D-R01:5′-GTCCTGTGCTAGGTCTGGGGCAGAG-3′

Ald107L-F01:5′-GCAAAAGCACTCGTAGACAGCG-3′

Ald107L-R01:5′-CGCTGTCTACGAGTGCTTTTGC-3′

以质粒pET-22bNS-Gdh0和pET-22bNS-Ald0为模板，使用上述设计的引物，利用定点突变技术分别消除葡萄糖脱氢酶和丙氨酸脱氢酶基因中的BglII或SpeI识别位点，改造获得质粒pET-22bNS-Gdh和pET-22bNS-Ald；

(4)利用NheI和SpeI互为同尾酶的原理，通过限制内切酶BglII和NheI或SpeI逐一双酶切处理表达载体pET-22bNS-Gdh，pET-22bNS-Ald和pET-22bNS-Alr，最终构建三基因共表达载体pET-22bNS-G/A/A。

4.含有权利要求1所述三基因共表达载体的工程菌的培养和应用方法，其特征在于：

(1)将共表达载体pET-22bNS-G/A/A通过化学转化法转入大肠杆菌BL21(DE3)中，37℃于含100μg/mL氨苄青霉素的LB固体培养基过夜培养，即得工程菌；

(2)挑取单菌落，37℃于含100μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中培养至OD₆₀₀达0.5-0.6时，于30℃诱导15h，离心收集菌体作为转化反应的酶源；

(3)称取1g湿菌体，重悬于20mL含200mM丙酮酸钠，200mM氯化铵，200mM D-葡萄糖，20mMNa₂CO₃-NaHCO₃缓冲液(pH 10)中，在37℃下180rpm振荡反应3h，离心去除菌体，经检测反应液中L-丙氨酸和D-丙氨酸的含量分别为7.0和6.5mg/mL，合成效率分别为56.4和51.9mg/mL/d。

5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：步骤(1)中表达载体为pET系列中的任意一种。

6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：步骤(1)所述的工程菌为大肠杆菌BL21系列中的任意一种。

7.一种如权利要求1所述三基因共表达载体的应用，其特征在于用于生物合成L-丙氨酸和D-丙氨酸。