JPS62205790A - Ｄ−アミノ酸の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は抗生物質の修飾剤をはじめ、医薬・農薬中間体
として有用なり一アミノ酸の製造方法に関する。

（従来技術） Ｄ−アミノ酸は非天然型の光学活性アミノ酸であり、合
成法でも、発酵法でも製造の困難な化合物である。この
Ｄ−アミノ酸の製造方法としては、これまでに５−置換
ヒダントインに酵素を作用させる方法（特開昭５５−１
０４８９０．特開昭５５−１１４２９２など）やＮ−ア
セチル−ＤＬ−アミノ酸なり一アミノアシラーゼでＤ一
体を選択的に脱アセチル化し、Ｄ−アミノ酸を得る方法
（特公昭５３−３６０３５　）などが知られている。

（発明が解決しようとする問題点） しかし、これらの方法は、原料基質が高価であったり、
ＤＬ一体を分割したのちに、Ｌ一体をラセミ化する別工
程が必要であったりし、更に低コストのＤ−アミノ酸の
製造法が求められている。

（問題点を解決するための手段） 本発明者らは、Ｄ−アミノ酸を低コストで製造する方法
について鋭意研究の結果、例えば、安価なアンモニア、
ギ酸などのＮＡＤＨ再生用基質、およびα−ケト酸を原
料に下記ＣＩ）式で示される共役酵素反応系を利用する
ことにより、高収率でかつ高い光学純度を有するＤ−ア
ミノ酸を生成できることを見出し、本発明をなすにいた
った。

ＨＨ ＮＨ２ＮＩ−Ｉ　２ ｏ　　　　　　　　　　　。

−ゼを示す。） 即ち、本発明はＤ−アミノ酸をアミノ基供与体ケト酸か
ら対応するＤ−アミノ酸を製造するに際し、アミノ基供
与体Ｄ−アミノ酸を再生する酵素反応系を利用すること
を特徴とするＤ−アミノ酸の製造方法である。

以下、本発明の共役酵素反応系について説明するが、本
発明は、これに限定されるものではない。

Ｌ−アミノ酸から、アミノ酸ラセマーゼ（以下ＡＡＩ’
ｌという）により生成したＤ−アミノ酸をアミノ基供与
体とし、Ｄ−アミノ酸トランスアミナーゼ（以下Ｄ　−
ＡＴＡという〕により、α−ケト酸をこれに対応するＤ
−アミノ酸に変換する。この際、アミン基供与体が脱ア
ミノ化されて得られるα−ケト酸を、アミノ酸デヒドロ
ゲナーゼ（以下ＡＡＤＨという〕によりＬ−アミノ酸に
再生する。

このアミン基供与体の再生酵素反応系で使用さ＋ れ変換されたＮＡＤ　　は、ＮＡＤＨ再生能を有する基
質および酵素の組み合わせによって、再びＮ　Ａ　Ｄ　
Ｈへと再生される。

本発明は、このようにして、目的のＤ−アミノ酸をバッ
チ法あるいは連続法により、製造することができる。

本発明の製法によって、はとんど全てのＤ−ア１−Ｉ２ 料α−ケト酸（（Ｉ）式におけるＲ　−Ｃ−ＣＯＯＩ−
１ないう）によって決定される。

例えば、α−ケトグルタル酸からＤ−グルタミン酸、α
−ケト酪酸からＤ−アミノ酪酸、α−ケト吉草酸からＤ
−フルバリン、α−ケトイソ吉草酸からＤ−バリン、オ
キザロ酢酸からＤ−アスパラギン酸、α−ケト−γ−メ
チルチオ酪酸からＤ−メチオニン、α−ケトイソカプロ
ン酸からＤ−ロイシン、イミダゾールピルビン酸からＤ
−ヒスチジン、α−ケトアルギニンからＤ−アルギニン
、フェニルピルビン酸からＤ−７エニルアラニン、と−
ヒドロキシフェニルピルビン酸からＤ−チロシン、フェ
ニルグリオキシル酸からＤ−７エニルグリシン、インド
ールピルビン酸か６　Ｄ　−トＩＪグトファン、ピルビ
ン酸からＤ−アラニン、β−ヒドロキシピルビン酸から
Ｄ−セリンなどを製Ｍすることができる。

次に、本発明に使用される酵素について述べる。

Ｄ　−ＡＴＡは植物や微生物中に見い出され、特にＢａ
ｃｉｌｌｕｓ属に高生産株が存在する。その中でもＢａ
ｃｉｌｌｕｓ属の中等度好熱菌が生産するＤ　−ＡＴＡ
（特願昭６０−２６’７３５）は耐熱性が高く安定であ
ることより特に好適である。

さらに、このＢａｃｉｌｌｕｓ　ｆ５５ヤ度好熱菌由来
のは、極めて高活性であると共に、通常のＬ−ブロスで
培養後、細胞壁を破砕し、熱処理（例えば６０℃、３０
分）するだけで、Ｄ−ＡＴＡ活性を低下させることなく
、他の雑多な夾雑酵素活性を取り除くことができ、本発
明の方法において使用するにあたって、極めて有用であ
る。

また、ここで用いるＤ−アミノ酸トランスアミナーゼは
広い基質特異性を有しており、はとんどすべてのＤ−ア
ミノ酸な高収率、高い立体特異性をもって合成すること
ができる。

Ａ　’ＡＲおよびＡＡＤＨは、バチルス属をはじめ様々
な微生物や植物、動物に存在することが知られている。

ＡＡＲおよびＡＡＤＨは、アミノ基供与体となるアミノ
酸との基質特異性を勘案して選択される。

その−例として、アラニンラセマーゼ（以下Ａ１ａＲと
いう）およびアラニンデヒドロゲナーゼ（以下ＡｌａＤ
Ｈという）が掲げられるが、これらは多くの微生物に分
布している。その中で特にバチルス−ステアロサーモフ
ィルスＩＦＯ１２５５０（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｔｅａ
ｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ　）が産生ずるものは高
活性でかつ高い安定性を有することより好適である。さ
らに、このバチルス、・ステアロサーモフィルス■Ｆ○
１２５５０由来のＡｕ　ａＲおよびＡｌａＤＨの溝ｃｏ
ｌｉｃ　　６００−ｐＭＤ１１２　）などは、どちらも
元の株に比べて活性が数十倍高く、また熱処理（例えば
７０℃、１時間）により他の夾雑酵素を取り除くことが
でき、本発明の目的には極めて有用である。

Ｎ　Ａ　Ｄ　Ｈ再生系は公知の基質および酵素の組み合
わせによって実施することができる。例えば、米国特許
第４，２２１，８６９号に記載されているギ酸およびギ
酸デヒドロゲナーゼ（以下Ｆ　Ｄ　Ｈという）アルコー
ルおヨヒアルコールデヒドロゲナーゼ（以下ＡＤＨとい
う）、グルコースおよびグルコースデヒドロゲ＋ ナーゼなどの組み合わせによって、ＮＡＤ　　からＮＡ
ＤＨを再生することができる。　Ｆ’ＤＩ（はＣａｎｄ
ｉｄａ　属の酵母やＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　属の細菌
由来のものが市販されている。また、Ｃａｎｄｉｄａ、
Ｐｉｃｈｉａ　、　Ｈａｎｓｅｎｕｌａ　属等のメタノ
ール資化性酵母を培養することにより容易に調製できる
。ＡＤＨもウマ肝臓や酵母由来のものが市販されている
。

→崎−門また酵素は生物から抽出したものをそのまま、
あるいは従来知られている方法により固定化したものや
膜反応器等、いずれも使用することができる。

本発明の反応の最適条件は、使用する酵素により異なる
が、通常ｐＨ７〜１０、温度２５〜５５℃、好ましくは
ｐＨ８〜９、温度３ヤ〜５０℃の範囲で実施される。ｐ
Ｈは、反応中のｐＨ変動を酸、アルカリを添加しながら
コントロールしてもよいし、トオン交換樹脂等によって
、有機酸などから容易に分離されうる。

本発明に使用される原料α−ケト酸は５０〜５００　ｍ
　ｍｏｌ／　ｌの範囲が好ましく、アミン基供与士 体アミノ酸は０．５〜２０　ｍ　ｍｏｔ／　ｔ、　ＮＡ
Ｄ　　は０．１〜１０ｍｍ０Ｚ／　ｔ％ギ酸、アルコー
ル、グルコース等のＮ　Ａ　Ｄ　Ｉ−１再生系基質は１
００〜１０００ｍ　ｍｏｂ／１．、アンモニアは５０ｍ
〜１ｍｏｔ／ｌが好ましい。また、Ｄ−ＡＴ　Ａは２〜
２０　Ｕｎｉ　ｔ　／ｍＡ　、　ＡＡ　Ｒは１〜１０　
Ｕｎｉｔ　／ｍｌ。

Ａ　ＡＤ　Ｉ−１は４〜１００　Ｕｎｉｔ　／ｍ／Ｌ　
、　ＮＡＤＨ再生系酵素は１〜１０　ｔＪｎｉｔ　／ｍ
Ａの範囲で使用されることが好ましい。

わ ただし、これらの酵素量は、基質との組みＮや４種の酵
素の組み合わせ等の条件によって、適宜選択される。本
発明においてアミノ基供与体として添加するアミノ酸（
（Ｉ）式におけるす Ｒ’−Ｃ−Ｃｏｏｌ−１ヲイウ）　ハ、目的とするＤ−
アミノ糺。

酸と異った種類のアミノ酸であることが必要であり、ま
た、対応するＡＡＲおよびＡ　Ａ　Ｄ　Ｈを有し、かつ
、目的とするＤ−アミノ酸の生成サイクルを崩さないア
ミノ酸の中から適宜選択される。また、このアミノ酸は
、Ｌ一体であってもＤＬ一体であっても差しつかえない
。

本発明の反応には、　Ｄ　−ＡＴＡ　、　ＡＡＲの補酵
素としてピリドキサールリン酸を加えることが好ましい
。

（発明の効果） 本発明の方法により、 （１）安価な原料を利用できる。

（２）煩雑な工程を必要としない。

（３）高収率で （４）高い光学純度を有するＤ−アミノ酸を製造するこ
とができる。

（実施例） 実施例１ ＮＨ４Ｃｔ／ＮＨ４０Ｈ緩衝液（ｐＩ−１８，１）　１
００μｍｏ４ギ酸ナトリウム２５０μｍｏ　Ｌ、α−ケ
トグルタル酸＋ ２５　μｍｏｌＳＤＬ−アラニン５　μｍｏｂ、　ＮＡ
Ｄ　Ｏ，５ｐｍｏｌ、　ピリドキサールリン酸２５　ｎ
　ｍｏｔＳＦＤＨＩＵｎｉｔ、Ｄ　−ＡＴＡ　３　Ｕｎ
ｉｔ、　Ａｌａ−Ｒ３ＵｎｉｔおよびＡｌａＤＨ５Ｕｎ
ｉｔを含む反応液５００μｔを５０℃で４時間反応させ
た。反応はＤＬ−アラニンの添加により開始し、１２％
トリクロル酢酸を添加することによって終了させた。反
応液を中和し、遠心分離した上清を希釈し、アミノ酸自
動分析機により生成したグルタミン酸を定量した。また
、得られたグルタミン酸は分析の結果はぼ１００％Ｄ一
体であった。

収率は、基質α−ケトグルタル酸に対して１００％であ
った。

ただし、Ｆ　Ｄ　Ｈは リン酸緩衝液（ｐｌ−１８，０）　　５０μｍｏｌ、ギ
酸ナトリウ液１ｍＡ、５０℃）、３４０　ｎｍにおける
吸収の増加を経時的に測定し、１分間にＮＡＤＩ−Ｉ　
１μｍｏｔの生成を触媒する酵素量を１Ｕｎｉｔとした
。

Ｄ　−Ａ’ｌｌは Ｔｒｉｓ　−１（Ｃ４緩衝液（ｐｉ−１８，１）　２５
μｍｏｔ、ピリドα−ケトグルタル酸ナトリウムを添加
することにより反応を開始しく反応液５００μｔＳｉＭ
度５０℃）、したピルビン酸をサリチルアルデヒド法に
よす定量し、１分間にピルビン酸１μｍｏｔの生成を触
媒する酵素量を１Ｕｎｉｔとした。

Ａｌ　ａ−Ｒは リン酸緩衝液（ｐＨ８，０）　２５μｍｏｌ、　　ビリ
　ドキサルリン酸２５　ｎｍｏｔ、　　α−ケトグルタ
ル酸ナトリウり反応を開始しく反応液５００μｔ、５０
’Ｃ）、１５分間インキュベートした後、６０％ＫＯＨ
を５００μを添加することにより反応を停止させ、生成
したピルビン酸をサリチルアルデヒド法で測定し、１分
間にピルビン酸１μｍｏ７の生成を触媒する酵素量を１
Ｕｎｉｔとした０ ＡＩａＤＩ−１は アンモニア緩唾液（ｐＨ８，６）　７５０μｍｏＡ、ピ
ルを開始しく反応液１　ｍｌ、　５０℃）、３４０　ｎ
ｍにおける吸収の減少を経時的に測定し１分間にＮＡＤ
Ｔ−Ｉ　１μｍｏＪ−の減少を触媒する酵素量を１Ｕｎ
ｉｔとした。

実施例２〜１８ α−ケト酸を実施例１と変えて、各種アミノ酸を製造し
た。結果を表−１に示す。Ｄ−ＡＴＡｆｉおよび反応時
間以外の条件は、実施例１と同様にして行なった。

実施例１９〜２８ Ｔｒｉｓ−ＨＣｔ緩衝液（ｐＨ９、Ｏ）　１００μｍｏ
Ａ、　−％−ｍ−＋α−ケト酸１００μｍｏｔギ酸アン
モニウム１００１０Ｏ４、Ｌ−、”／、ｆｉｉｙ酸２０
．ａｍｏｊ、ＮＡＤ＋１μｍ６ｔ、　ピリドキサールリ
ン酸５Ｑｎｍｏｔ、グルタミン酸ラセマーゼ０．５Ｕｎ
ｉｔ、ＦＤＩ４１　Ｕｎｉｔ、Ｄ−ＡＴＡを含む反応液
１　ｍｌを３７℃で反応させた。反応はＬ−グルタミン
酸の添加により開始し、１２％トリクロル酢酸を添加す
ることによって終了させた。

反応液を中和し、遠心分離した上清を希釈し、アミノ酸
自動分析機により、生成したアミノ酸を定量した。得ら
れたアミノ酸は分析の結果り一体であった。収率は、基
質α−ケト酸に対する生成したＤ−アミノ酸の比とした
。綿果友ａ−２＋こ示す。

ただしＦ　Ｄ　Ｉ−１は リン酸緩衝液（ｐＨ４８，０）　５０μｍｏＡ、ギ酸ナ
ト液１ｍＡ、３７℃〕、３４０　ｎｍにおける吸収の増
加を経時的に測定し、１分間にＮＡＤＨ１μｍｏｔの生
成を触媒する酵素量を１Ｕｎｉｔとした。

Ｄ　−ＡＴＡは Ｔｒｉｓ−ＨＣ２緩衝液（ｐＨ８，１）２５μ＋ｎｏ７
．ビリ　ドキーケトグルタル酸ナトリウムを添加するこ
とにより反応を開始しく反応液５００μｔ、温度３７℃
）、１５分間インキ−ベートした後、６０％ＫＯＨを５
００μを添加することによって反応を停止させ、生成し
たピルビン酸をサリチルアルデヒド法により定量し１分
間にピルビン酸１μｍｏｔの生成を触媒する酵素量を１
Ｕｎｉｔとした。

グルタミン酸デヒドロゲナーゼは、（株）ベーリンガー
マンハイム山之内製（グルタミン酸脱水素酵素）を用い
た。（１ｍ？あたり１２０Ｕｎｉｔ）グルタミン酸ラセ
マーゼ　ｒ−５’４は、Ｔｒｉｓ−ＨＣＡ緩衝液（ｐＩ
−１８，０）　２００μｍｏｔ、グルタミ７することに
より反応を開始し、（反応液１　ｍｔ、３７℃）３４０
　ｎｍにおける吸収の増加を経時的に測定し、１分間に
ＮＡＤＩ−１１μｍｏｌの生成を触媒する酵素量を１Ｕ
ｎｉｔとした。

手　　続　　補　　正　　出　（自発）昭和６１年４り
十日 ２、発明の名称 Ｄ−アミノ酸の製造方法 ３、補正をする者 事件との関係　　　特許出願人 住　　所　大阪府堺市鉄砲町１番地 名　　称　（２９０）ダイセル化学工業株式会社代表者
　久保田美文 ４、代理人 東京都千代田区霞が関三丁目８−１ 虎の門三井ビル ダイセル化学工業株式会社　特許部内 明細書の特許請求の範囲の欄および発明の詳細な説明の
欄、／−、、ｌ−１ ６、補正の内容 １）　明細書の特許請求の範囲の欄を別紙の通り補正す
る。

２）　明細１第６頁３行「脱アミン化」を）“脱アミノ
」と補正づ゛る。

３）　明細書第６頁６〜７行「使用され変換された」を
「生成された」と補正する。

／ｌ）　　明細書第１３頁１９行「２５ｍｍｏｌＪをｒ
２５ｎｍｏｌＪど補正する。

５）　明ａｍ第１８頁５行ｒ　２５ｍｒｎｏ　ｌ　Ｊを
ｆ２５ｎｍｏｌＪと補正する。

６□ｌ＋−ゝ、 特許請求の範囲 （１）Ｄ−アミノ酸をアミノ基供与体とし、Ｄ−アミノ
酸トランスアミナーゼにより、α−ケト酸から対応する
Ｄ−アミノ酸を製造するに際し、１　アミノ基供与体り
−アミノ酸を再生する酵素反応系を利用することを与体
Ｄ−アミノ酸の再生に必要なＮ　Ａ　Ｄ　Ｈを再生する
酵素反応系を含む特許請求の範囲第１項記載の方法。

（３）　　アミノ基供与体り−アミノ酸を再生する酵素
反応系が、そのアミノゼを作用させることにより行なわ
れる系である特許請求の範囲第１項記載の方法。

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. （１）Ｄ−アミノ酸をアミノ基供与体とし、Ｄ−アミノ
   酸トランスアミナーゼによりα−ケト酸から対応するＤ
   −アミノ酸を製造するに際し、アミノ基供与体Ｄ−アミ
   ノ酸を再生する酵素反応系を利用することを特徴とする
   Ｄ−アミノ酸の製造方法。
2. （２）アミノ基供与体Ｄ−アミノ酸を再生する酵素反応
   系が、アミノ基供与体Ｄ−アミノ酸の再生に必要なＮＡ
   ＤＨを再生する酵素反応系を含む特許請求の範囲第１項
   記載の方法。
3. （３）アミノ基供与体Ｄ−アミノ酸を再生する酵素反応
   系が、そのアミノ基供与体Ｄ−アミノ酸が脱アミノ化さ
   れて得られるα−ケト酸に、アミノ酸デヒドロゲナーゼ
   、アンモニア、 ＮＡＤＨ、及びアミノ酸ラセマーゼを作用させることに
   より行なわれる系である特許請求の範囲第１項記載の方
   法。