CN114836458B - 增强鲫希瓦氏菌核黄素合成促进mo降解和电能回收方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及增强鲫希瓦氏菌核黄素合成促进MO降解和电能回收方法。对S.Carassii‑D5进行合成生物学改造。利用异源表达技术，结合基因工程等手段，构建重组质粒，将枯草芽孢杆菌中编码核黄素合成的核心基因ribA、ribD、ribE、ribH、ribC引入S.Carassii‑D5中，并对菌株的生长代谢条件进行优化，得到高产核黄素的重组菌株。重组菌株能分泌更多高导电的电子传递体，在微生物燃料电池中促进对偶氮染料甲基橙的降解和持续电能输出。重组菌株构建的MFC可以降解86％的甲基橙，为提高电活性微生物在偶氮染料降解和有机废物处理中的工业应用奠定了基础。

Description

增强鲫希瓦氏菌核黄素合成促进MO降解和电能回收方法
技术领域
本发明属于基因工程技术和生物能源技术领域，更具体的说是对高效产电菌：鲫希瓦氏菌Shewanella Carassii-D5的合成生物学改造，并用于有机污染物甲基橙的高效降解和生物发电过程耦合的运用。具体涉及增强Shewanella Carassii-D5菌核黄素合成促进MO降解和电能回收方法。
背景技术
近年来，含偶氮染料的的污水随意排放造成了严重的环境问题，它在化学上是一种具有氮-氮双键(-N-N-)的化合物，结构复杂，难以还原。然而，这些染料很容易通过获得从有机化合物氧化过程中释放出来的电子而脱色。微生物燃料电池系统(Microbial FuelCells，MFCs)就是一种很有前途的、可再生的环境友好型技术。研究表明，MFC技术的电化学反应过程中，阳极上的产电微生物(exoelectrogen)凭借强氧化还原能力氧化有机底物，所产生的电子和质子可用于偶氮染料的还原和降解。
目前研究已证实的产电微生物的胞外电子传递机制主要有两种：直接电子传递和间接电子传递。其中，直接电子传递是指产电微生物通过自身产生的导电细胞色素或电活性生物膜直接与阳极电极接触将电子传递给阳极；间接电子传递是指产电微生物通过自身分泌的电子传递体，例如黄素类，吩嗪等的扩散运动将所携带的电子传递给阳极电极的过程。作为高效产电微生物之一，鲫希瓦氏菌(Shewanella Carassii-D5)高产电性能主要是依赖在电极上形成高导电生物膜和分泌少量的核黄素(Riboflavin,又称维生素B2)电子传递体实现的。S.Carassii-D5是一种以乳酸为最优底物进行生长代谢的兼性厌氧菌，最适生长温度为30℃；菌落为圆形，浅红色，边缘光滑，有光泽，其革兰氏染色为阴性。在透射电镜及扫描电镜下观察该菌的形态为短杆状，大小为2.0～3.0μm，周围有丰富的胞外聚合物(extracellular polymeric substances，EPS)，这也有助于菌株自生生物膜的形成以抵抗复杂的环境因素。全基因组测序结果显示该菌GC含量为53.11％，适合基因操作，公开保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：D5＝CGMCC1.61311，菌株的16S rRNA序列信息如SEQ ID NO.1所示。
基因工程(genetic engineering)又称基因拼接技术和DNA重组技术，是以分子遗传学为理论基础，以分子生物学和微生物学的现代方法为手段，将不同来源的基因按预先设计的蓝图，在体外构建杂种DNA分子，然后导入活细胞，使外源基因能在受体细胞内复制、转录、翻译表达的操作，以改变生物原有的遗传特性、获得新品种、生产新产品。
为进一步提高S.Carassii-D5菌株的电活性，本发明公开了对高效产电微生物S.Carassii-D5进行基因工程改造，将枯草芽孢杆菌(Bacillus subtili,CGMCC 1.3358,在生长过程中能合成维生素B1、B2、B6、烟酸等多种B族维生素)中编码核黄素生产代谢途径的核心基因(ribA、ribD、ribE、ribH、ribC)通过Biobrick的构建策略进行整合并导入S.Carassii-D5中，同时实现对偶氮染料甲基橙(Methyl orange，MO)的高效降解和生物发电过程耦合，为开发高效的含偶氮染料废水处理和生物发电技术提供数据支持，启发未来MFC的发展。
发明内容：
本发明的目的是克服现有技术的不足，对高效产电微生物S.Carassii-D5进行基因工程改造，将枯草芽孢杆菌中编码核黄素生产代谢途径的基因(ribA、ribD、ribE、ribH、ribC)通过Biobrick的构建策略进行整合并导入S.Carassii-D5中，提高其核黄素分泌量，以实现较高的电能输出，并同步实现对偶氮染料MO的高效降解和电能回收过程。
鲫希瓦氏菌Shewanella Carassii-D5已于2022年3月25日公开保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址，北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为：D5＝CGMCC1.61311并命名Shewanella Carassii-D5，确定该菌株属于Shewanella属。
本发明的技术方案概述如下：
本发明提供了增强Shewanella Carassii-D5菌的核黄素分泌量以促进MO降解和电能回收的方法；包括如下步骤：
1)对电活性微生物S.Carassii-D5进行基因工程改造，将枯草芽孢杆菌中编码核黄素生产代谢途径的基因ribA、ribD、ribE、ribH和ribC结合可诱导型的Ptac启动子，通过Biobrick的构建策略进行整合；
2)利用SpeI与XbaI酶是同尾酶，经过处理后留下相同的粘性末端，在T4连接酶的作用下将所需要的外源基因逐个连接到基础质粒上，得到重组质粒pYYDT-ribA-ribD-ribE-ribH-ribC；
3)将步骤2)的重组质粒pYYDT-ribA-ribD-ribE-ribH-ribC导入S.carassii-D5菌中，重构菌株的代谢通路；
4)将导入重组质粒的重组菌株接种到含有不同浓度的IPTG和kana的LB液体培养基中并实时测定发酵液的OD600值，优化最适合重组菌株生长的诱导剂和抗生素浓度；
5)高产核黄素的重组菌株在步骤4)优化的最适IPTG和kana浓度的LB培养基中发酵培养，发酵液作为阳极微生物催化剂接种到MFC阳极室，实现电能输出和有机物降解。
所述的基因ribA优化后的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；基因ribD优化后的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；基因ribE优化后的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；基因ribH优化后的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；基因ribC优化后的核苷酸序列如SEQ IDNO.6所示；载体pYYDT质粒的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示。
所述的方法将经过密码子优化后的基因通过Ptac启动子和T1终止子完成表达，采用Biobrick的构建策略，利用SpeI与XbaI酶是同尾酶，经过处理后留下相同的粘性末端，在T4连接酶的作用下将所需要的外源基因逐个连接到基础质粒上，得到重组质粒pYYDT-ribA-ribD-ribE-ribH-ribC。
所述的步骤5)所述高产核黄素的重组菌株在含有0.2mM IPTG、20mg/L kana的LB液体培养基发酵培养，得到的发酵液作为阳极微生物催化剂，按OD600＝1.0接种到MFC阳极室，阴极室接种传统的K3[Fe(CN)6]溶液作为阴极电子受体，实现高电能输出。
所述的步骤5)所述高产核黄素的重组菌株在含有0.2mM IPTG、20mg/L kana的LB液体培养基发酵培养，得到的发酵液作为阳极微生物催化剂，按OD600＝0.4接种到MFC阳极室，阴极室接种MO酸性溶液作为电子受体，实现MO的有效降解和高电能回收。
具体说明如下：
本发明对高效产电微生物S.Carassii-D5进行基因工程改造，提高其核黄素分泌量，并优化其表达系统，以实现较高的电能输出并同步实现对偶氮染料MO的高效降解和电能回收过程。
本发明对高效产电菌S.Carassii-D5的基因工程改造以增强其EET能力：将Bacillus subtilis中编码核黄素生产代谢途径的核心基因(ribA、ribD、ribE、ribH、ribC)通过Biobrick的构建策略进行整合导入S.Carassii-D5中并优化表达，提高S.Carassii-D5的核黄素分泌量。
所述的构建方法；将Bacillus subtilis中编码核黄素生产代谢途径的基因(ribA、ribD、ribE、ribH、ribC)连接到载体质粒pYYDT上形成重组质粒，再导入S.Carassii-D5中，得到含有重组质粒并能进行高产量核黄素代谢的重组鲫希瓦氏菌：S.Carassii-D5-pYYDT-ribA-ribD-ribE-ribH-ribC。
所述的构建方法；将经过密码子优化后的基因通过Ptac启动子(gagctgttgacaattaatcatcggctcgtataatgtgtggaattgtgagcggataacaatt)和T1(caaataaaacgaaaggctcagtcgaaagactgggcctttcgttttatctgttgtttgtcggtgaacgctctc)终止子完成表达，采用Biobrick的构建策略，利用SpeI与XbaI酶是同尾酶，经过处理后留下相同的粘性末端，在T4连接酶的作用下将所需要的外源基因逐个连接到基础质粒上。
利用Biobrick方法，构建重组质粒，具体构建方法说明如下：
得到优化后的序列，分别在目的基因片段的5’端添加XbaI酶(公知)切位点，3’端依次添加SpeI，SbfI酶(公知)切位点；用SpeI和SbfI酶对自带该酶切位点的pYYDT质粒(质粒图谱如图3所示，核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，参考文献Enhancing BidirectionalElectron Transfer of Shewanella oneidensis by a Synthetic Flavin Pathway)进行酶切；由于XbaI和SpeI酶是同尾酶，酶切后会产生相同的粘性末端，再通过T4连接酶进行连接，构建以pYYDT为载体并含有目的基因的重组质粒：pYYDT-ribA-ribD-ribE-ribH-ribC。重组质粒图谱如图4所示，重组质粒序列是在pYYDT质粒序列的基础上，各优化后的5个目的基因序列的叠加。
首先利用XbaI和SbfI酶(公知)对基因ribA进行酶切(核苷酸序列为SEQ IDNO.2)，利用SpeI和SbfI酶(公知)对自带该酶切位点的pYYDT质粒进行酶切。由于XbaI和SpeI酶是同尾酶，酶切后会产生相同的粘性末端，再通过T4连接酶进行连接，构建含有基因ribA的重组质粒：pYYDT-ribA；
利用XbaI和SbfI酶对基因ribD进行酶切(核苷酸序列为SEQ ID NO.3)，利用SpeI和SbfI酶对刚构建的含有基因ribA的重组质粒进行酶切，经过T4连接酶后，最终获得含有ribA，ribD两个目的基因的重组质粒：pYYDT-ribA-ribD,；
利用XbaI和SbfI酶对基因ribE进行酶切(核苷酸序列为SEQ ID NO.4)，利用SpeI和SbfI酶对刚构建的含有基因ribA，ribD的重组质粒进行酶切，经过T4连接酶后，最终获得含有ribA，ribD，ribE三个目的基因的重组质粒：pYYDT-ribA-ribD-ribE；
利用XbaI和SbfI酶对基因ribH进行酶切(核苷酸序列为SEQ ID NO.5)，利用SpeI和SbfI酶对刚构建的含有基因ribA，ribD，ribE的重组质粒进行酶切，经过T4连接酶后，最终获得含有ribA，ribD，ribE，ribH四个目的基因的重组质粒：pYYDT-ribA-ribD-ribE-ribH；
利用XbaI和SbfI酶对基因ribC进行酶切(核苷酸序列为SEQ ID NO.6)，利用SpeI和SbfI酶对刚构建的含有基因ribA，ribD，ribE，ribH的重组质粒进行酶切，经过T4连接酶后，最终获得含有ribA，ribD，ribE，ribH，ribC五个目的基因的重组质粒：pYYDT-ribA-ribD-ribE-ribH-ribC。
按照上述步骤完成对重组质粒的构建，构建质粒的生物砖设计原理图如1所示，得到的重组质粒结构如图2所示，重组质粒图谱如图4所示，重组质粒序列是在pYYDT质粒序列的基础上，各优化后的5个目的基因序列的叠加。
所述的高产核黄素的重组菌株的构建；将上述得到的重组质粒通过物理转化法(公知)导入E.coli WM3064中，再通过接合转移的实验操作(公知)，将上述得到的阳性克隆菌中的重组质粒转移到S.Carassii-D5中，得到能够高产核黄素的重组菌株。
所构建的高产核黄素的重组菌株的优化表达；众所周知，IPTG(isopropylβ-d-1-thiogalactopyranoside)诱导剂和kana(kanamycin)抗生素对微生物细胞均具有一定的毒性，为了避免该重组载体质粒的过表达对菌株的生理代谢产生影响，我们进一步优化了重组菌株的诱导表达系统。对重组菌株的生长进行优化：配置含有不同浓度IPTG(0.01mM，0.05mM，0.10mM，0.15mM，0.20mM)和kana(20mg/L，25mg/L，30mg/L，40mg/L)的LB液体培养基，对重组菌株过夜培养并定期取样测量其OD600，其中OD600的大小反映了菌株在该相应诱导剂和抗生素浓度下的生长状况；同时将剩下的样液保存，利用高效液相色谱仪对发酵液中的核黄素含量进行测定。
所构建的高产核黄素的重组菌株的电生理表征；启动双室微生物燃料电池：用新鲜阴、阳极液(成分分别见表1、2)对在最优表达条件下得到重组菌株发酵液调节OD600＝1.0，得到稀释液，取140mL稀释液加入到微生物燃料电池的阳极室中；电池结构为双极室H型，其阴阳极均采用经过预处理的碳布作为电极(1cm×1cm)；阳极室和阴极室用杜邦Nafion 117质子交换膜分开，外电路用铜导线和2KΩ电阻连接构成闭合回路，放入30℃培养箱中静置；将上述启动的电池连接上数据采集器，记录电压；当电压达到峰值并保持恒定时，用线性扫描伏安法测电池的电化学性能，得到电池的伏安循环曲线和极化曲线，扫描电池的LSV时，扫描的初始电位设置为-0.87到-0.1，设置扫描速率的大小为0.1mV/s。
所构建的高产核黄素的重组菌株实现对有机污染物甲基橙的降解；构建以甲基橙(MO)溶液为阴极电子受体，重组菌株为阳极接种源的MFC，电池结构如前所述；启动双室微生物燃料电池：用新鲜阳极液对得到的重组菌株发酵液调节OD600＝0.4得到稀释液，取140mL稀释液加入到微生物燃料电池的阳极室中，电池的阴极室加入140mL，50mg/L，PH＝3的甲基橙溶液(将6.8g KH2PO4溶解在900mLdH2O中，用磷酸调节至pH＝3)。
所构建的高产核黄素的重组菌株实现持续电能输出；将上述启动的电池连接上数据采集器，记录电压；电池工作过程中，每隔12h采集阴极室的甲基橙溶液，稀释后用紫外可见分光光度计以定量表征检测MO的浓度核降解率；当电压达到峰值并保持恒定时，用线性扫描伏安法测电池的电化学性能，得到电池的伏安循环曲线和极化曲线，扫描电池的LSV时，扫描的初始电位设置为-0.87到-0.1，设置扫描速率的大小为0.1mV/s。
本发明的有益效果是：
电活性微生物是活性污泥中重要的微生物种群之一，在废水资源化与能源化应用中发挥着核心作用。目前发现的产电微生物功率输出低，产电能力弱限制了微生物燃料电池在工业上的应用，因此对野生型产电菌株进行合理的定向改造，增强其EET能力是目前重要的任务之一。本发明考虑到S.Carassii-D5菌株主要依赖形成较厚的生物膜和分泌少量的核黄素电子传递体实现胞外电子传递过程，为近一步提高菌株的电活性，我们对S.Carassii-D5进行合成生物学改造。利用异源表达技术，结合基因工程等手段，构建重组质粒，将枯草芽孢杆菌中编码核黄素合成的核心基因(ribA、ribD、ribE、ribH、ribC)引入S.Carassii-D5中，并对菌株的生长代谢条件进行优化，得到高产核黄素的重组菌株。研究表明，重组菌株可以产生更多高电导的电子传递体，在微生物燃料电池结构中，促进对偶氮染料甲基橙的降解和持续的电能输出。
数据显示，重组菌株在0.2mM IPTG和20mg/L kana的LB液体培养基中，可以实现正常生长，并能够分泌～9.0mg/g DCW的核黄素电子传递体，生成量是未改造菌株S.Carassii-D5的4.7倍。我们以未改造的菌株作为对照，进一步对重组菌株的电生理活性进行分析，结果表明该菌株有较好的产电性能：在实验室条件下，接种到MFC阳极室中可实现的623.3mV的电压输出；功率密度高达1286.3mW/m2；电流密度为3021.0mA/m2；分别是对照组S.Carassii-D5的1.6倍、2.1倍和1.9倍(384.4mV；609.1mW/m2；1547.5mA/m2)！
考虑到重组菌株优异的电化学性能，我们将重组菌株运用于以50mg/L，PH＝3的甲基橙(Methyl orange，MO)为阴极电子受体的微生物燃料电池中，可以实现持续的电能输出和偶氮染料的降解。数据显示，含重组菌株的MFC在～3.5h后工作电压提高到168.6mV，表明启动成功，比含未改造的菌株的MFC(103.1mV)更快(～7.5h)；接种重组菌株的MFC可以实现最大功率密度为192.3mW/m2，电流密度为594.7mA/m2的电能输出，分别是未改造菌株的1.6倍和1.5倍(118.6mW/m2和390.5mA/m2)；重组菌株构建的MFC可以降解86％的甲基橙，而对照组只能实现66％的降解率。
综上所述，利用合成生物学方法，对S.Carassii-D5菌株进行合理定向的基因工程改造，使其具有良好的甲基橙降解和生物发电能力，为提高电活性微生物在偶氮染料降解和环境有机废物处理中的工业应用奠定了基础。
附图说明
图1构建质粒的生物砖设计原理图
图2含目的基因ribA、ribD、ribE、ribH、ribC重组质粒结构示意图
图3目的基因表达载体pYYDT图谱
图4含目的基因ribA、ribD、ribE、ribH、ribC的重组质粒图谱
图5优化重组菌株生长代谢的最优IPTG和kana抗生素浓度示意图
图6重组菌株在含0.2mMIPTG和20mg/L kana LB液体培养基中的生长情况
图7重组菌株在含0.2mMIPTG和20mg/L kana LB液体培养基中的黄素表达量
图8阳极室接种重组菌株MFC的电能输出图
图9阳极室接种重组菌株MFC的LSV和极化曲线示意图
图10阳极室接种重组菌株，阴极室接种50mg/L MO MFC电能输出图
图11阳极室接种重组菌株，阴极室接种50mg/L MO MFC LSV和极化曲线示意图
图12阳极室接种S.Carassii-D5 MFC的MO相对含量全波长扫描示意图
图13阳极室接种重组菌株MFC的MO相对含量全波长扫描示意图
图14MO的浓度变化示意图
图15:专利文本的技术总结与展示。
具体实施方式
提高产电微生物S.Carassii-D5菌株的核黄素分泌量，并优化其表达系统，以实现较高的电能输出，以促进MO降解和电能回收。
据文献报道，通过合成生物学方法强化产电菌株的核黄素分泌量，能有效提升其胞外电子传递能力。为了让菌株S.Carassii-D5在产电的过程中能够实现两种机制同时发挥最大功效(生物膜和细胞色素介导的直接电子传递机制与电子传递体介导的间接电子传递机制),我们利用异源表达技术，结合基因工程等手段，将枯草芽孢杆菌中编码核黄素生产代谢途径的基因(ribA、ribD、ribE、ribH、ribC)和可诱导性启动子Ptac通过Biobrick的构建策略进行整合并导入S.Carassii-D5中，使菌株S.Carassii-D5能够大量合成核黄素作为电子传递载体，并优化其表达系统，从而使它的电化学性能进一步提升，以促进MO降解和电能回收。
本发明中构建的质粒是本实验室设计，在全合成过程中，需要将发明所需要的各外源基因连接到质粒载体上并保存。下面结合实施例，进一步阐述本发明。
(1)目的基因的获取和序列优化：
首先在KEGG上查询枯草芽孢杆菌中编码核黄素生产代谢途径的基因ribA、ribD、ribE、ribH、ribC的序列信息(http://www.kegg.jp/kegg/genes.html)，并利用Jcat(http://www.jcat.de/)对coding sequence进行密码子优化以及定点突变掉序列中所存在的生物砖酶切位点，选择在Shewanella oneidensis MR-1中进行优化，并避免以后实验所需要用到的酶切位点EcoRI，XbaI，SpeI和PstI。得到优化后的序列：
基因ribA的核苷酸序列为SEQ ID NO.2；
基因ribD的核苷酸序列为SEQ ID NO.3；
基因ribE的核苷酸序列为SEQ ID NO.4；
基因ribH的核苷酸序列为SEQ ID NO.5；
基因ribC的核苷酸序列为SEQ ID NO.6。
(2)利用Biobrick方法，构建重组质粒：
在优化后的各目的基因片段的5’端添加XbaI酶切位点，3’端依次添加SpeI，SbfI酶切位点，并合成。利用Biobrick方法，将上述基因通过酶切连接的方式，构建重组质粒：pYYDT-ribA-ribD-ribE-ribH-ribC：
首先利用XbaI和SbfI酶(公知)对基因ribA进行酶切(核苷酸序列为SEQ IDNO.2)，利用SpeI和SbfI酶(公知)对自带该酶切位点的pYYDT质粒(质粒图谱如图3所示，核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，参考文献Enhancing Bidirectional Electron Transferof Shewanella oneidensis by a Synthetic Flavin Pathway)进行酶切。由于XbaI和SpeI酶是同尾酶，酶切后会产生相同的粘性末端，再通过T4连接酶进行连接，构建含有基因ribA的重组质粒：pYYDT-ribA；
利用XbaI和SbfI酶对基因ribD进行酶切(核苷酸序列为SEQ ID NO.3)，利用SpeI和SbfI酶对刚构建的含有基因ribA的重组质粒进行酶切，经过T4连接酶后，最终获得含有ribA，ribD两个目的基因的重组质粒：pYYDT-ribA-ribD；
利用XbaI和SbfI酶对基因ribE进行酶切(核苷酸序列为SEQ ID NO.4)，利用SpeI和SbfI酶对刚构建的含有基因ribA，ribD的重组质粒进行酶切，经过T4连接酶后，最终获得含有ribA，ribD，ribE三个目的基因的重组质粒：pYYDT-ribA-ribD-ribE；
利用XbaI和SbfI酶对基因ribH进行酶切(核苷酸序列为SEQ ID NO.5)，利用SpeI和SbfI酶对刚构建的含有基因ribA，ribD，ribE的重组质粒进行酶切，经过T4连接酶后，最终获得含有ribA，ribD，ribE，ribH四个目的基因的重组质粒：pYYDT-ribA-ribD-ribE-ribH；
利用XbaI和SbfI酶对基因ribC进行酶切(核苷酸序列为SEQ ID NO.6)，利用SpeI和SbfI酶对刚构建的含有基因ribA，ribD，ribE，ribH的重组质粒进行酶切，经过T4连接酶后，最终获得含有ribA，ribD，ribE，ribH，ribC五个目的基因的重组质粒：pYYDT-ribA-ribD-ribE-ribH-ribC。
按照上述步骤依次完成重组质粒的构建，构建质粒的生物砖设计原理图如1所示，得到的重组质粒结构如图2所示，重组质粒图谱如图4所示，重组质粒序列是在pYYDT质粒序列的基础上，各优化后的5个目的基因序列的叠加。由于pYYDT作为基础质粒载体含有卡那霉素抗性基因序列，可用于后期重组菌株的定向筛选。
(3)高产核黄素的重组菌株的构建
①转化：将上述得到的重组质粒通过物理转化法导入E.coli WM3064中，用于后续高产核黄素的重组菌株的构建。
从-80℃冰箱取出E.coli WM3064感受态细胞50μL，置于冰盒内自然解冻后加入重组质粒pYYDT-ribA-ribD-ribE-ribH-ribC 3μL，冰上静置30min，42℃热击90s，再冰上静置2-3min，向EP管中加入1mL LB+DAP液体培养基，置于37℃、220rpm的摇床中复苏1h。离心后涂布至LB+DAP+kana固体平板上，最后倒置放到37℃的恒温培养箱过夜培养，挑取阳性克隆，并保藏菌种，取过夜培养的阳性克隆菌500μL，50％的甘油500μL，加入到保菌管中，置于-80℃保存。
②接合转移：将上述得到的阳性克隆菌中的重组质粒通过接合转移到S.Carassii-D5中，得到能够高产核黄素的重组菌株。
将转化后的大肠杆菌接种到3mL LB+DPA+kana液体培养基中培养，37℃，200rpm生长10-12h；将菌株S.Carassii-D5接种到3mL LB液体培养基中培养，30℃，200rpm生长10-12h。将得到的大肠杆菌种子液和S.Carassii-D5种子液各取500μL混合到一个1.5mL无菌EP管中，混合均匀，5000rpm下离心10min，倒掉上清液。用1mL LB+DAP液体培养基重悬，在30℃下静置2h。静置完成后混合均匀并取50μL菌液接种于LB+kana的固体平板上，置于30℃培养箱中培养12小时以上，得到希瓦氏工程菌。
菌落PCR进行验证：接合转移涂板的菌长出明显单菌落(直径大约0.5-1mm)后，准备菌P验证质粒是否结转成功。需要准备LB+kana平板，并画好格子做好标记。配制PCR体系，分装入96孔板，可以比实际需要的多配2-5个体系，防止因枪头沾有溶液造成损失。准备足量的灭菌牙签。在超净台，一根牙签挑取一个单菌落，放入一个体系的孔中；挑完后，每根牙签在新平板对应的格中划线接种，丢弃牙签。全部划完后，96孔板用封板垫严密封口，放入PCR仪，设定参数，开始运行。平板放入30℃恒温培养箱(生长不少于10h，具体看菌落长势，长到一定程度可以用保鲜膜包好放4℃)。单个PCR反应体系配置(trans fast Taq)：ddH2011.55μL；上、下游引物各0.3μL；10x buffer1.5μL；dNTPS，1.2μL；Taq酶0.15μL；一个反应体系共15μL。PCR反应条件为：94℃预变性5min，94℃变性30s，53℃退火30s，72℃延伸Xs(1kb/30s，只能时间富裕不能不足)，30cycles，最后72℃再延伸7min，4℃保温。
琼脂糖凝胶电泳：先制胶，1XTAE缓冲液100mL，琼脂糖1.0g，加热溶解，待适当冷却后加核酸染料5μL，摇匀倒入放好透明垫和梳子的胶槽中，等待凝固。
跑胶：PCR结束后，加DNA Loading buffer，点样，每孔各10μL，电泳8-12min。观察有无目的条带并记录对应编号。
保菌：将验证成功的重组鲫希瓦氏菌保菌备用。取过夜培养的重组菌液500μL，50％的甘油500μL，加入到保菌管中，置于-80℃长期保存。
(4)高产核黄素的重组菌株的代谢优化
众所周知，IPTG诱导剂和kana抗生素对细胞均具有一定的毒性，为了避免该重组载体质粒的过表达对菌株的生理代谢产生影响，我们进一步优化了重组菌株的诱导表达系统。对重组菌株的生长进行优化：配置含有不同浓度的IPTG(0.01mM，0.05mM，0.10mM，0.15mM，0.20mM)和kana(20mg/L，25mg/L，30mg/L，40mg/L)的LB液体培养基，并分装到10mL摇菌管中；取200μL过夜培养的重组菌株菌液加入上述摇菌管中；将摇菌管放入200rpm，30℃的摇床中培养一段时间，隔2h取样1mL；将取得的样液各取200μL于96孔细胞培养板中，并放到酶标仪中测量其OD600，其中OD600的大小反映了菌株在该相应诱导剂和抗生素浓度下的生长状况；同时将剩下的样液保存，利用高效液相色谱仪详细地测量了发酵液中的核黄素量：将得到的发酵液在6000rpm下离心90s，取上清液并通过0.2μm的滤膜进行过滤，然后将待测液注入HPLC(high-performance liquid chromatography，LC-20AT岛津)系统中，采用270nm波长的紫外检测器监测黄素浓度。测量时，柱温箱设置35℃，流动相为纯甲醇-超纯水(50:50,v:v)，流速0.6min，C18 column，5um，4.6×250，Shim-pack GIST。离心的细胞沉淀则用PBS缓冲液清洗两遍后烘干至恒重得细胞干重。如图5所示，优化后得到的IPTG和卡那霉素的最佳浓度分别为0.2mM和20mg/L。此外，我们评估了在此条件下重组菌株和未改造菌株在LB液体培养基中的细胞生长情况，将过夜培养的重组菌株和未改造菌株菌液的OD600调至同一生长状态，按1：100的比例分别接种到含有0.2mM IPTG、20mg/L kana的LB液体培养基和无诱导剂、无抗性的LB液体培养基中，定期取样测定其OD600和核黄素生成量。如图6所示，重组菌株在约28小时后达到最大细胞密度，且生长情况优于对照组。核黄素合成测定的最终结果表明(如图7所示)，重组菌株能产生～9.0mg/g DCW的核黄素，是未改造菌株S.Carassii-D5(1.9mg/g DCW)的4.7倍，得到高产核黄素的重组菌株。
(5)高产核黄素的重组菌株的电能输出
至此，我们得到高产核黄素的重组菌株。为验证重组菌株增强的EET能力，对菌株的电生理特性进行表征：
①从-80℃冰箱取出重组菌株的甘油菌，在LB+kana平板上划线活化，把活化后的菌接种到含有3mL LB+kana液体培养基的10mL摇菌管中，放入转速为200r/min，温度为30℃的摇床中过夜培养，得到一级种子液。
②将一级种子液转接到含有0.2mM IPTG、20mg/L kana的100mL LB液体培养基的锥形瓶中(1:100)，放入转速为200r/min，温度为30℃的摇床中过夜培养，得到二级发酵液。
③启动双室微生物燃料电池：用新鲜阳极液(成分见表2)对得到的发酵液调节OD600＝1.0得到稀释液，取140mL稀释液加入到微生物燃料电池的阳极室中，用新鲜阴极液(成分见表1)140mL接种到MFC的阴极室中；电池结构为双极室H型，其阴阳极均采用经过预处理的碳布作为电极(1cm×1cm)；阳极室和阴极室用杜邦Nafion 117质子交换膜分开，外电路用铜导线和2KΩ电阻连接构成闭合回路，放入30℃培养箱中静置。该过程中以未改造的S.Carassii-D5菌株做阳性对照。
④将上述启动的电池连接上数据采集器，记录电压(如图8所示)。数据显示，重组菌株的最大电压输出为623.3mV，比对照组S.Carassii-D5(384.4±10.0mV)高1.6倍。这表明重组菌株具有较强的电压输出或电子传递能力。
⑤电池结构的LSV(Linear sweep voltammetry)测定：当电压达到峰值并保持恒定时，用线性扫描伏安法测电池的电化学性能，得到电池的伏安循环曲线和极化曲线(如图9所示)。扫描电池的LSV时，扫描的初始电位设置为-0.87到-0.1，设置扫描速率的大小为0.1mV/s。数据进一步表明，重组菌株有较好的产电性能：重组菌株接种的MFC功率密度高达1286.3mW/m2，电流密度为3021.0mA/m2，分别是对照组未改造菌株S.Carassii-D5的2.1倍和1.9倍(609.1mW/m2；1547.5mA/m2)；与此同时，较低的极化曲线斜率证明接种重组菌株的MFC具有较低的电池内阻！所以核黄素合成模块的整合提高了菌株S.Carassii-D5的核黄素分泌量，可以加速菌株的EET过程，同时降低界面电荷转移电阻。
(6)高产核黄素的重组菌株促进MO降解和电能回收过程
研究表明，MFC技术的电化学反应过程中，阳极上的电活性微生物氧化有机底物所产生的电子和质子可用于偶氮染料的还原和降解。考虑到重组菌株优异的电化学性能，于是，我们将合成生物学改造得到的高电活性重组菌株运用于实际偶氮染料甲基橙(MO)的降解过程，从而同时实现了对MO的高效去除和生物发电过程的同步进行。
构建以MO溶液为阴极电子受体，重组菌株为阳极接种源的MFC：用新鲜阳极液(成分见表2)对得到的重组菌株发酵液调节OD600＝0.4得到稀释液，取140mL稀释液加入到微生物燃料电池的阳极室中；电池的阴极室加入140mL，50mg/L，PH＝3的甲基橙溶液：将6.8gKH2PO4溶解在900mL dH2O中，用磷酸调节至pH＝3；该过程中以未改造的S.Carassii-D5菌株做阳性对照；电池结构如前所述。
将上述启动的电池连接上数据采集器，记录电压MFC如图10所示，数据显示，在实验室条件下，重组菌株的最大电压输出为168.6mV，比未改造菌株S.Carassii-D5(103.1mV±10.0mV)高1.6倍。这表明重组菌株具有较强的电压输出或电子传递能力。当电压达到峰值并保持恒定时，用线性扫描伏安法测电池的电化学性能，得到电池的伏安循环曲线和极化曲线，如图11所示，数据进一步表明，重组菌株有较好的产电性能：重组菌株的极化曲线下降斜率较小，即内阻较小；与S.carassii-D5(118.5mW/m2，390.5mA/m2)相比，重组菌株在MFCs中表现出更好的EET能力，能量输出分别增加了约162％和152％(192.2mW/m2和594.7mA/m2)！
电池工作过程中，每隔12h采集电池阴极室的甲基橙溶液用以定量表征和检测MO的降解率。从MFC阴极室中取2mLMO溶液，稀释后用紫外可见分光光度计(TU-1810,BeijingPurkinje General Instrument Co.Ltd.,China)进行全波长扫描，波长值设置为300-600nm，测定MO的相对含量(分别如图12、13所示)，在465nm处的吸光度逐渐下降，表明偶氮键的断裂，MO的浓度逐渐降低，从而实现了对甲基橙溶液的降解还原。然后用公式计算MO的脱色速率R＝(A0-At)/A0*100％，其中，A0代表溶液在465nm处的初始吸光值，At代表该时间点对应的吸光值。结果表明，在72h内，未改造菌株降解了66％的MO，而重组菌株则降解了86％的MO，如图14所示。
如图15所示，我们依据S.carassii-D5菌株的EET机制，合理的对其进行基因工程改造，提高产电微生物S.Carassii-D5菌株的核黄素分泌量，并优化其表达系统，以实现较高的电能输出。将重组菌株运用于实际的有机污染物降解过程，最终得到较高MO的还原效率和电池结构的功率输出，该研究结果将为开发高效的MFC技术，同时实现偶氮染料降解和生物发电过程提供数据支持，为未来MFC的发展提供动力。
表1：阴极液组成(1L)：余量为无菌水
组成 K3[Fe(CN)6] KH2PO4 K2HPO4
含量(g) 16.4 6.8 11.4
表2：阳极液的组成(1L)：余量为无菌水
补充说明：
1.本实验所需的试剂如下：
①Luria-Bertani(LB)液体培养基：NaCl(10 g/L)、酵母提取物(5 g/L)和蛋白胨(10 g/L)。
②Luria-Bertani(LB)固体培养基：NaCl(10 g/L)、酵母提取物(5 g/L)、蛋白胨(10 g/L)和琼脂粉(15g/L)。
③5×M9母液：称取2.5 g NaCl,5 g NH4Cl,15 g KH2PO4和30 g Na2HPO4溶于适量ddH2O中，后定容至1L，灭菌后降至室温，储存于4℃冰箱。
④PBS缓冲溶液：把8 g NaCl、1.44 g Na2HPO4、0.24 g KH2PO4和0.2 g KCl用dH2O溶解并用容量瓶定容至1L，用HCl调节溶液的pH到7.4之后灭菌备用。
⑤IPTG母液(1 M)：1.9064 g IPTG、ddH2O定容至8 mL，用0.22μm滤膜除菌，分装为1 mL/管，-20℃保存。
⑥卡那霉素母液(kana，50 mg/mL)：0.5 g kana粉末，ddH2O定容至10 mL，用0.22μm滤膜除菌，分装为1 mL/管，-20℃保存。
⑦LB+DAP液体培养基：5 g/L酵母提取物、10 g/L胰蛋白胨、10 g/L NaCl、0.059g/L 2,6-二氨基庚二酸。
⑧LB+DAP+kana固体平板：5 g/L酵母提取物、10 g/L胰蛋白胨、10 g/L NaCl、0.059 g/L DAP、50 mg/mL kana(1:1000)、15 g/L琼脂粉。
⑨LB+DPA+kana液体培养基：5 g/L酵母提取物、10 g/L胰蛋白胨、10 g/L NaCl、0.059 g/L DAP、50 mg/mL kana(1:1000)。
⑩LB+kana固体培养基：5g/L酵母提取物、10g/L胰蛋白胨、10g/L NaCl、15g/L琼脂粉、50mg/mLkana(1:1000)。
B+kana液体培养基：5g/L酵母提取物、10g/L胰蛋白胨、10g/L NaCl、50 mg/mLkana(1:1000)。
M MgSO4溶液：把12.05 g无水MgSO4用100 mL dH2O溶解即可，然后用灭菌锅灭菌，冷却后常温备用。
M乳酸钠溶液：将18.68 g乳酸钠溶液(60％)溶解到100 mL dH2O中，然后高温灭菌备用。
1M CaCl溶液：将1.1g无水CaCl溶解在100mL dH2O里，灭菌备用。
M NaoH溶液：将16g NaoH粉末溶解在100mL dH2O里，灭菌备用。
2.所选重组质粒扩增的工程菌为营养缺陷型菌株E.coil WM3064(市售可得，ColiGenetic Stock Center http://cgsc.biology.yale.edu/)；Bacillus subtili,CGMCC1.3358；鲫希瓦氏菌S.carassii-D5已经公开保存至中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址，北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为：D5＝CGMCC1.61311。
3.由于菌种信息录入系统中无法录入带下标的名称，因此菌种保藏编号写为“D5”，学术论文发表中的菌株命名为Shewanella Carassii-D5，简称S.Carassii-D5。
4.以上所用限制性内切酶、DNA连接酶和分子生物学试剂从thermo公司购买(http://www.thermoscientificbio.com/fermentas)；所用其他生化试剂从生工生物工程(上海)股份有限公司购买(http://www.sangon.com/)。
本发明公开和提出的技术方案，本领域技术人员可通过借鉴本文内容，适当改变条件路线等环节实现，尽管本发明的方法和制备技术已通过较佳实施例子进行了描述，相关技术人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和技术路线进行改动或重新组合，来实现最终的制备技术。特别需要指出的是，所有相类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，他们都被视为包括在本发明精神、范围和内容中。本发明未尽事宜属于公知技术。
序列表
<110> 天津大学
<120> 增强鲫希瓦氏菌核黄素合成促进MO降解和电能回收方法
<160> 7
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1409
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tgcaagtcga gcggtaacat ttcaaaagct tgcttttgaa gatgacgagc ggcggacggg 60
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tctgcaactc gactccatga agtcggaatc gctagtaatc gtggatcaga atgccacggt 1320
gaatacgttc ccgggccttg tacacaccgc ccgtcacacc atgggagtgg gctgcaccag 1380
aagtagatag cttaaccttc gggagggcg 1409
<210> 2
<211> 1197
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
atgttccacc caatcgaaga agctttagat gctttaaaaa aaggtgaagt tatcatcgtt 60
gttgatgatg aagatcgtga aaacgaaggt gatttcgttg ctttagctga acacgctact 120
ccagaagtta tcaacttcat ggctactcac ggtcgtggtt taatctgtac tccattatct 180
gaagaaatcg ctgatcgttt agatttacac ccaatggttg aacacaacac tgattctcac 240
cacactgctt tcactgtttc tatcgatcac cgtgaaacta aaactggtat ctctgctcaa 300
gaacgttctt tcactgttca agctttatta gattctaaat ctgttccatc tgatttccaa 360
cgtccaggtc acatcttccc attaatcgct aaaaaaggtg gtgttttaaa acgtgctggt 420
cacactgaag ctgctgttga tttagctgaa gcttgtggtt ctccaggtgc tggtgttatc 480
tgtgaaatca tgaacgaaga tggtactatg gctcgtgttc cagaattaat cgaaatcgct 540
aaaaaacacc aattaaaaat gatcactatc aaagatttaa tccaataccg ttacaactta 600
actactttag ttgaacgtga agttgatatc actttaccaa ctgatttcgg tactttcaaa 660
gtttacggtt acactaacga agttgatggt aaagaacacg ttgctttcgt tatgggtgat 720
gttccattcg gtgaagaacc agttttagtt cgtgttcact ctgaatgttt aactggtgat 780
gttttcggtt ctcaccgttg tgattgtggt ccacaattac acgctgcttt aaaccaaatc 840
gctgctgaag gtcgtggtgt tttattatac ttacgtcaag aaggtcgtgg tatcggttta 900
atcaacaaat taaaagctta caaattacaa gaacaaggtt acgatactgt tgaagctaac 960
gaagctttag gtttcttacc agatttacgt aactacggta tcggtgctca aatcttacgt 1020
gatttaggtg ttcgtaacat gaaattatta actaacaacc cacgtaaaat cgctggttta 1080
gaaggttacg gtttatctat ctctgaacgt gttccattac aaatggaagc taaagaacac 1140
aacaaaaaat acttacaaac taaaatgaac aaattaggtc acttattaca cttctaa 1197
<210> 3
<211> 1086
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
atggaagaat actacatgaa attagcttta gatttagcta aacaaggtga aggtcaaact 60
gaatctaacc cattagttgg tgctgttgtt gttaaagatg gtcaaatcgt tggtatgggt 120
gctcacttaa aatacggtga agctcacgct gaagttcacg ctatccacat ggctggtgct 180
cacgctgaag gtgctgatat ctacgttact ttagaaccat gttctcacta cggtaaaact 240
ccaccatgtg ctgaattaat catcaactct ggtatcaaac gtgttttcgt tgctatgcgt 300
gatccaaacc cattagttgc tggtcgtggt atctctatga tgaaagaagc tggtatcgaa 360
gttcgtgaag gtatcttagc tgatcaagct gaacgtttaa acgaaaaatt cttacacttc 420
atgcgtactg gtttaccata cgttacttta aaagctgctg cttctttaga tggtaaaatc 480
gctacttcta ctggtgattc taaatggatc acttctgaag ctgctcgtca agatgctcaa 540
caataccgta aaactcacca atctatctta gttggtgttg gtactgttaa agctgataac 600
ccatctttaa cttgtcgttt accaaacgtt actaaacaac cagttcgtgt tatcttagat 660
actgttttat ctatcccaga agatgctaaa gttatctgtg atcaaatcgc tccaacttgg 720
atcttcacta ctgctcgtgc tgatgaagaa aaaaaaaaac gtttatctgc tttcggtgtt 780
aacatcttca ctttagaaac tgaacgtatc caaatcccag atgttttaaa aatcttagct 840
gaagaaggta tcatgtctgt ttacgttgaa ggtggttctg ctgttcacgg ttctttcgtt 900
aaagaaggtt gtttccaaga aatcatcttc tacttcgctc caaaattaat cggtggtact 960
cacgctccat ctttaatctc tggtgaaggt ttccaatcta tgaaagatgt tccattatta 1020
caattcactg atatcactca aatcggtcgt gatatcaaat taactgctaa accaactaaa 1080
gaataa 1086
<210> 4
<211> 648
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
atgttcactg gtatcatcga agaaactggt actatcgaat ctatgaaaaa agctggtcac 60
gctatggctt taactatcaa atgttctaaa atcttagaag atgttcactt aggtgattct 120
atcgctgtta acggtatctg tttaactgtt actgatttca ctaaaaacca attcactgtt 180
gatgttatgc cagaaactgt taaagctact tctttaaacg atttaactaa aggttctaaa 240
gttaacttag aacgtgctat ggctgctaac ggtcgtttcg gtggtcactt cgtttctggt 300
cacgttgatg gtactgctga aatcactcgt atcgaagaaa aatctaacgc tgtttactac 360
gatttaaaaa tggatccatc tttaactaaa actttagttt taaaaggttc tatcactgtt 420
gatggtgttt ctttaactat cttcggttta actgaagata ctgttactat ctctttaatc 480
ccacacacta tctctgaaac tatcttctct gaaaaaacta tcggttctaa agttaacatc 540
gaatgtgata tgatcggtaa atacatgtac cgtttcttac acaaagctaa cgaaaacaaa 600
actcaacaaa ctatcactaa agctttctta tctgaaaacg gtttctaa 648
<210> 5
<211> 465
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
atgaacatca tccaaggtaa cttagttggt actggtttaa aaatcggtat cgttgttggt 60
cgtttcaacg atttcatcac ttctaaatta ttatctggtg ctgaagatgc tttattacgt 120
cacggtgttg atactaacga tatcgatgtt gcttgggttc caggtgcttt cgaaatccca 180
ttcgctgcta aaaaaatggc tgaaactaaa aaatacgatg ctatcatcac tttaggtact 240
gttatccgtg gtgctactac tcactacgat tacgtttgta acgaagctgc taaaggtatc 300
gctcaagctg ctaacactac tggtgttcca gttatcttcg gtatcgttac tactgaaaac 360
atcgaacaag ctatcgaacg tgctggtact aaagctggta acaaaggtgt tgattgtgct 420
gtttctgcta tcgaaatggc taacttaaac cgttctttcg aataa 465
<210> 6
<211> 951
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
gtgaaaacta tccacatcac tcacccacac cacttaatca aagaagaaca agctaaatct 60
gttatggctt taggttactt cgatggtgtt cacttaggtc accaaaaagt tatcggtact 120
gctaaacaaa tcgctgaaga aaaaggttta actttagctg ttatgacttt ccacccacac 180
ccatctcacg ttttaggtcg tgataaagaa ccaaaagatt taatcactcc attagaagat 240
aaaatcaacc aaatcgaaca attaggtact gaagttttat acgttgttaa attcaacgaa 300
gttttcgctt ctttatctcc aaaacaattc atcgatcaat acatcatcgg tttaaacgtt 360
caacacgctg ttgctggttt cgatttcact tacggtaaat acggtaaagg tactatgaaa 420
actatgccag atgatttaga tggtaaagct ggttgtacta tggttgaaaa attaactgaa 480
caagataaaa aaatctcttc ttcttacatc cgtactgctt tacaaaacgg tgatgttgaa 540
ttagctaacg ttttattagg tcaaccatac ttcatcaaag gtatcgttat ccacggtgat 600
aaacgtggtc gtactatcgg tttcccaact gctaacgttg gtttaaacaa ctcttacatc 660
gttccaccaa ctggtgttta cgctgttaaa gctgaagtta acggtgaagt ttacaacggt 720
gtttgtaaca tcggttacaa accaactttc tacgaaaaac gtccagaaca accatctatc 780
gaagttaact tattcgattt caaccaagaa gtttacggtg ctgctatcaa aatcgaatgg 840
tacaaacgta tccgttctga acgtaaattc aacggtatca aagaattaac tgaacaaatc 900
gaaaaagata aacaagaagc tatccgttac ttctctaact tacgtaaata a 951
<210> 7
<211> 5904
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
cacctcgcta acggattcac cgtttttatc aggctctggg aggcagaata aatgatcata 60
tcgtcaatta ttacctccac ggggagagcc tgagcaaact ggcctcaggc atttgagaag 120
cacacggtca cactgcttcc ggtagtcaat aaaccggtca gaatttcaga taaaaaaaat 180
ccttagcttt cgctaaggat gatttctgtg gtacctcgga tcccggggag ctagcacgaa 240
ttcgcggccg cttctagacc gacaccatcg aatggtgcaa aacctttcgc ggtatggcat 300
gatagcgccc ggaagagagt caattcaggg tggtgaatgt gaaaccagta acgttatacg 360
atgtcgcaga gtatgccggt gtctcttatc agaccgtttc ccgcgtggtg aaccaggcca 420
gccacgtttc tgcgaaaacg cgggaaaaag tggaagcggc gatggcggag ctgaattaca 480
ttcccaaccg cgtggcacaa caactggcgg gcaaacagtc gttgctgatt ggcgttgcca 540
cctccagtct ggccctgcac gcgccgtcgc aaattgtcgc ggcgattaaa tctcgcgccg 600
atcaactggg tgccagcgtg gtggtgtcga tggtagaacg aagcggcgtc gaagcctgta 660
aagcggcggt gcacaatctt ctcgcgcaac gcgtcagtgg gctgatcatt aactatccgc 720
tggatgacca ggatgccatt gctgtggaag ctgcctgcac taatgttccg gcgttatttc 780
ttgatgtctc tgaccagaca cccatcaaca gtattatttt ctcccatgaa gacggtacgc 840
gactgggcgt ggagcatctg gtcgcattgg gtcaccagca aatcgcgctg ttagcgggcc 900
cattaagttc tgtctcggcg cgtctgcgtc tggctggctg gcataaatat ctcactcgca 960
atcaaattca gccgatagcg gaacgggaag gcgactggag tgccatgtcc ggttttcaac 1020
aaaccatgca aatgctgaat gagggcatcg ttcccactgc gatgctggtt gccaacgatc 1080
agatggcgct gggcgcaatg cgcgccatta ccgagtccgg gctgcgcgtt ggtgcggata 1140
tctcggtagt gggatacgac gataccgaag acagctcatg ttatatcccg ccgttaacca 1200
ccatcaaaca ggattttcgc ctgctggggc aaaccagcgt ggaccgcttg ctgcaactct 1260
ctcagggcca ggcggtgaag ggcaatcagc tgttgcccgt ctcactggtg aaaagaaaaa 1320
ccaccctggc gcccaatacg caaaccgcct ctccccgcgc gttggccgat tcattaatgc 1380
agctggcacg acaggtttcc cgactggaaa gcgggcagtg agcgcaacgc aattaatgta 1440
agttagctca ctcattaggc acaattctca tgtttgacag cttatcatcg actgcacggt 1500
gcaccaatgc ttctggcgtc aggcagccat cggaagctgt ggtatggctg tgcaggtcgt 1560
aaatcactgc ataattcgtg tcgctcaagg cgcactcccg ttctggataa tgttttttgc 1620
gccgacatca taacggttct ggcaaatatt ctgaaatgag ctgttgacaa ttaatcatcg 1680
gctcgtataa tgtgtggaat tgtgagcgga taacaatttc acacaggaaa cagccagtcc 1740
gtttaggtgt tttcacgagc acttcaccaa caaggaccat agcatatgcc actagtagcg 1800
gccgcctgca ggtggtcgac cactcgaggc caggcatcaa ataaaacgaa aggctcagtc 1860
gaaagactgg gcctttcgtt ttatctgttg tttgtcggtg aacgctctct actagagtca 1920
cactggctca ccttcgggtg ggcctttctg cgtttataac cggtaaacca gcaatagaca 1980
taagcggcta tttaacgacc ctgccctgaa ccgacgaccg ggtcgaattt gctttcgaac 2040
cccagagtcc cgctcagaag aactcgtcaa gaaggcgata gaaggcgatg cgctgcgaat 2100
cgggagcggc gataccgtaa agcacgagga agcggtcagc ccattcgccg ccaagctctt 2160
cagcaatatc acgggtagcc aacgctatgt cctgatagcg gtccgccaca cccagccggc 2220
cacagtcgat gaatccagaa aagcggccat tttccaccat gatattcggc aagcaggcat 2280
cgccatgggt cacgacgaga tcctcgccgt cgggcatgcg cgccttgagc ctggcgaaca 2340
gttcggctgg cgcgagcccc tgatgctctt cgtccagatc atcctgatcg acaagaccgg 2400
cttccatccg agtacgtgct cgctcgatgc gatgtttcgc ttggtggtcg aatgggcagg 2460
tagccggatc aagcgtatgc agccgccgca ttgcatcagc catgatggat actttctcgg 2520
caggagcaag gtgagatgac aggagatcct gccccggcac ttcgcccaat agcagccagt 2580
cccttcccgc ttcagtgaca acgtcgagca cagctgcgca aggaacgccc gtcgtggcca 2640
gccacgatag ccgcgctgcc tcgtcctgca gttcattcag ggcaccggac aggtcggtct 2700
tgacaaaaag aaccgggcgc ccctgcgctg acagccggaa cacggcggca tcagagcagc 2760
cgattgtctg ttgtgcccag tcatagccga atagcctctc cacccaagcg gccggagaac 2820
ctgcgtgcaa tccatcttgt tcaatcatgc gaaacgatcc tcatcctgtc tcttgatcag 2880
atcttgatcc cctgcgccat cagatccttg gcggcaagaa agccatccag tttactttgc 2940
agggcttccc aaccttacca gagggcgccc cagctggcaa ttccggttcg cttgctgtcc 3000
ataaaaccgc ccagtctagc tatcgccatg taagcccact gcaagctacc tgctttctct 3060
ttgcgcttgc gttttccctt gtccagatag cccagtagct gacattcatc ccaggtggca 3120
cttttcgggg aaatgtgcgc gcccgcgttc ctgctggcgc tgggcctgtt tctggcgctg 3180
gacttcccgc tgttccgtca gcagcttttc gcccacggcc ttgatgatcg cggcggcctt 3240
ggcctgcata tcccgattca acggccccag ggcgtccaga acgggcttca ggcgctcccg 3300
aaggtctcgg gccgtctctt gggcttgatc ggccttcttg cgcatctcac gcgctcctgc 3360
ggcggcctgt agggcaggct catacccctg ccgaaccgct tttgtcagcc ggtcggccac 3420
ggcttccggc gtctcaacgc gctttgagat tcccagcttt tcggccaatc cctgcggtgc 3480
ataggcgcgt ggctcgaccg cttgcgggct gatggtgacg tggcccactg gtggccgctc 3540
cagggcctcg tagaacgcct gaatgcgcgt gtgacgtgcc ttgctgccct cgatgccccg 3600
ttgcagccct agatcggcca cagcggccgc aaacgtggtc tggtcgcggg tcatctgcgc 3660
tttgttgccg atgaactcct tggccgacag cctgccgtcc tgcgtcagcg gcaccacgaa 3720
cgcggtcatg tgcgggctgg tttcgtcacg gtggatgctg gccgtcacga tgcgatccgc 3780
cccgtacttg tccgccagcc acttgtgcgc cttctcgaag aacgccgcct gctgttcttg 3840
gctggccgac ttccaccatt ccgggctggc cgtcatgacg tactcgaccg ccaacacagc 3900
gtccttgcgc cgcttctctg gcagcaactc gcgcagtcgg cccatcgctt catcggtgct 3960
gctggccgcc cagtgctcgt tctctggcgt cctgctggcg tcagcgttgg gcgtctcgcg 4020
ctcgcggtag gcgtgcttga gactggccgc cacgttgccc attttcgcca gcttcttgca 4080
tcgcatgatc gcgtatgccg ccatgcctgc ccctcccttt tggtgtccaa ccggctcgac 4140
gggggcagcg caaggcggtg cctccggcgg gccactcaat gcttgagtat actcactaga 4200
ctttgcttcg caaagtcgtg accgcctacg gcggctgcgg cgccctacgg gcttgctctc 4260
cgggcttcgc cctgcgcggt cgctgcgctc ccttgccagc ccgtggatat gtggacgatg 4320
gccgcgagcg gccaccggct ggctcgcttc gctcggcccg tggacaaccc tgctggacaa 4380
gctgatggac aggctgcgcc tgcccacgag cttgaccaca gggattgccc accggctacc 4440
cagccttcga ccacataccc accggctcca actgcgcggc ctgcggcctt gccccatcaa 4500
tttttttaat tttctctggg gaaaagcctc cggcctgcgg cctgcgcgct tcgcttgccg 4560
gttggacacc aagtggaagg cgggtcaagg ctcgcgcagc gaccgcgcag cggcttggcc 4620
ttgacgcgcc tggaacgacc caagcctatg cgagtggggg cagtcgaagg cgaagcccgc 4680
ccgcctgccc cccgagcctc acggcggcga gtgcgggggt tccaaggggg cagcgccacc 4740
ttgggcaagg ccgaaggccg cgcagtcgat caacaagccc cggaggggcc actttttgcc 4800
ggagggggag ccgcgccgaa ggcgtggggg aaccccgcag gggtgccctt ctttgggcac 4860
caaagaacta gatatagggc gaaatgcgaa agacttaaaa atcaacaact taaaaaaggg 4920
gggtacgcaa cagctcattg cggcaccccc cgcaatagct cattgcgtag gttaaagaaa 4980
atctgtaatt gactgccact tttacgcaac gcataattgt tgtcgcgctg ccgaaaagtt 5040
gcagctgatt gcgcatggtg ccgcaaccgt gcggcaccct accgcatgga gataagcatg 5100
gccacgcagt ccagagaaat cggcattcaa gccaagaaca agcccggtca ctgggtgcaa 5160
acggaacgca aagcgcatga ggcgtgggcc gggcttattg cgaggaaacc cacggcggca 5220
atgctgctgc atcacctcgt ggcgcagatg ggccaccaga acgccgtggt ggtcagccag 5280
aagacacttt ccaagctcat cggacgttct ttgcggacgg tccaatacgc agtcaaggac 5340
ttggtggccg agcgctggat ctccgtcgtg aagctcaacg gccccggcac cgtgtcggcc 5400
tacgtggtca atgaccgcgt ggcgtggggc cagccccgcg accagttgcg cctgtcggtg 5460
ttcagtgccg ccgtggtggt tgatcacgac gaccaggacg aatcgctgtt ggggcatggc 5520
gacctgcgcc gcatcccgac cctgtatccg ggcgagcagc aactaccgac cggccccggc 5580
gaggagccgc ccagccagcc cggcattccg ggcatggaac cagacctgcc agccttgacc 5640
gaaacggagg aatgggaacg gcgcgggcag cagcgcctgc cgatgcccga tgagccgtgt 5700
tttctggacg atggcgagcc gttggagccg ccgacacggg tcacgctgcc gcgccggtag 5760
cacttgggtt gcgcagcaac ccgtaagtgc gctgttccag actatcggct gtagccgcct 5820
cgccgcccta taccttgtct gcctccccgc gttgcgtcgc ggtgcatgga gccgggccac 5880
ctcgacctga atggaagccg gcgg 5904

Claims (3)

1.增强鲫希瓦氏菌核黄素合成促进MO降解和电能回收方法；其特征是：包括如下步骤：
（1）对电活性微生物S. Carassii-D5进行基因工程改造，将枯草芽孢杆菌中编码核黄素生产代谢途径的基因ribA、ribD、ribE、ribH和ribC结合可诱导型的Ptac启动子，通过Biobrick的构建策略进行整合；S. Carassii-D5公开保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：D5 = CGMCC1.61311；
（2）利用SpeI与XbaI酶是同尾酶，经过处理后留下相同的粘性末端，在T4连接酶的作用下将所需要的外源基因逐个连接到基础质粒上，得到重组质粒pYYDT-ribA-ribD-ribE- ribH-ribC；
（3）（将步骤2）的重组质粒pYYDT-ribA-ribD-ribE-ribH-ribC导入S. carassii-D5菌中，重构菌株的代谢通路；
（4）将导入重组质粒的重组菌株接种到含有不同浓度的IPTG和kana的LB液体培养基中并实时测定发酵液的OD600值，优化最适合重组菌株生长的诱导剂和抗生素浓度；
（5）高产核黄素的重组菌株在步骤4）优化的最适IPTG和kana浓度的LB培养基中发酵培养，发酵液作为阳极微生物催化剂接种到MFC阳极室，实现电能输出和有机物降解；
基因ribA优化后的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；基因ribD优化后的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；基因ribE优化后的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；基因ribH优化后的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；基因ribC优化后的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；载体pYYDT质粒的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示。
2.如权利要求1所述的方法；其特征是：步骤5）所述高产核黄素的重组菌株在含有0.2mM IPTG、20mg/L kana的LB液体培养基发酵培养，得到的发酵液作为阳极微生物催化剂，按OD600=1.0接种到MFC阳极室，阴极室接种传统的K3[Fe(CN)6]溶液作为阴极电子受体，实现高电能输出。
3.如权利要求1所述的方法；其特征是：步骤5）所述高产核黄素的重组菌株在含有0.2mM IPTG、20mg/L kana的LB液体培养基发酵培养，得到的发酵液作为阳极微生物催化剂，按OD600=0.4接种到MFC阳极室，阴极室接种MO酸性溶液作为电子受体，实现MO的有效降解和高电能回收。
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