CN110628689B - 一株产丁二酸的大肠杆菌基因工程菌及其构建方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种产丁二酸的大肠杆菌基因工程菌，该大肠杆菌中过表达电子转换通道蛋白和细胞色素c成熟系统I蛋白，所述电子转换通道的蛋白基因序列如SEQ ID NO:1所示，所述细胞色素c成熟系统I蛋白的基因序列如SEQ ID NO:2所示。本发明在大肠杆菌中构建适配性高的跨膜电子通道，使其可以引入外源电子，调节细胞内NAD+/NADH，为微生物细胞内氧化还原调控提供了新的解决方案。通过异源表达Mtr途径的基因的构建重组大肠杆菌，使得重组大肠杆菌获得传递电子的能力，丁二酸产量提高了33.5％。

Description

一株产丁二酸的大肠杆菌基因工程菌及其构建方法与应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一株产丁二酸的大肠杆菌基因工程菌及其构建方法与应用。

背景技术

以可再生资源替代不可再生的化石资源，是转变经济增长模式、保障社会经济可持续发展的重大战略需求。可再生资源，如风能、太阳能、生物质能等，目前最有效的利用方式是转变为电能。因此，电能在未来工业制造中将扮演着重要角色。在化学品制造领域，利用化学催化剂电合成化学品已经得到广泛应用；相对于化学催化剂，生物催化剂具有可再生、高转化活性、底物多样性等优点，近年来在电合成领域的应用受到日益广泛关注。

微生物电合成是近年来在微生物燃料电池基础上发展起来的新技术。微生物燃料电池一般将产电作为目的，而微生物电合成以利用电能生产化学品为目的。目前微生物电合成技术主要用于厌氧还原性代谢产物的合成，其原理是将电极的阴极提供电子转换为胞内可利用的还原力NADH，调节胞内NAD+/NADH，从而提高还原性目标产物的合成。目前微生物电合成技术在丁醇、丁酸、丁二酸等厌氧还原性代谢产物的合成过程取得了一定的进展。

在微生物体内，电子从电子供体(低电势)传递至电子受体(高电势)，这是微生物新陈代谢的固有特征。NAD+是细胞内电子主要载体之一，NAD+/NADH作为生物氧化还原的辅因子，对生物代谢终产物的分布有着重要的影响，尤其在厌氧代谢过程中。例如在E.coli厌氧合成丁二酸的代谢过程中，1分子葡萄糖合成2分子中间产物PEP过程中产生2分子NADH，然而2分子PEP合成2分子丁二酸需要4分子NADH。因此，还原力不足是厌氧合成丁二酸的主要限制性因素。通过基因工程手段强化电子载体再生途径、增加电子载体的总量以及胞外氧化还原电位调控等方法有效地控制了细胞内电子流向，调节了细胞内NAD+/NADH，减少了副产物合成，提高了丁二酸的产量。本文旨在利用微生物电合成技术，在大肠杆菌内构建适配性高的跨膜电子通道使其可以引入外源电子，为微生物细胞内氧化还原调控提供了新的解决方案。

发明内容

发明目的：提供一株过表达电子转换通道蛋白和细胞色素c成熟系统I蛋白的大肠杆菌基因工程菌，以在大肠杆菌中构建适配性高的跨膜电子通道，使其可以引入外源电子，调节细胞内NAD+/NADH，为微生物细胞内氧化还原调控提供了新的解决方案。

本发明进一步提供上述过表达电子转换通道蛋白和细胞色素c成熟系统I蛋白的大肠杆菌基因工程菌的构建方法及其在制备丁二酸中的应用。

技术方案：为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：

一株大肠杆菌基因工程菌，该大肠杆菌中过表达电子转换通道蛋白和细胞色素c成熟系统I系统蛋白。

作为优选，所述电子转换通道的蛋白基因序列如SEQ ID NO:1所示，所述细胞色素c成熟系统I蛋白的基因序列如SEQ ID NO:2所示。

mtrCBA基因表达S.oneidensis MR-1的细胞色素c蛋白MtrC、MtrB、MtrA蛋白，其是构成S.oneidensis MR-1直接电子传递途径Mtr途径的必要蛋白，MtrC、MtrB、MtrA通常共同以MtrCAB复合物的形式行使电子转移功能。

ccmABCDEFGH是细胞色素c成熟基因簇，首先脱辅基的细胞色素c其内部血红素结合位点CXXCH中的半胱氨酸侧链巯基与辅基血红素共价连接，形成成熟的细胞色素c，这一过程需要八个完整的膜蛋白(ccmABCDEFGH)完成。

作为优选，所述大肠杆菌为K12系列大肠杆菌、BL21系列大肠杆菌、Rosetta系列大肠杆菌、Origami系列大肠杆菌或Tuner系列大肠杆菌。

进一步地，所述大肠杆菌为E.coli K12，优选E.coli K12(△ldh,△pfl,△ptsG)。

一株产丁二酸的大肠杆菌基因工程菌，该大肠杆菌保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2018743，分类命名为：Escherichia coli ccm-MtrCBA保藏地址：中国.武汉.武汉大学，邮编：430072，保藏日期为2018年11月01日。

上述产丁二酸的大肠杆菌基因工程菌的构建方法，包括如下步骤：

(1)将电子转换通道蛋白和细胞色素c成熟系统I蛋白的核苷酸序列克隆至表达载体上，得到重组质粒；

(2)将重组质粒转化宿主菌，得到大肠杆菌基因工程菌。

其中，所述表达载体为ptrc99a质粒、pBBR1MCS系列质粒、pCWJ质粒、pETDuet系列质粒、pACYC系列质粒、pRSFDuet系列质粒、pCDFDuet系列质粒、pET系列质粒、pGEX系列质粒、pMAL系列质粒或pTYB系列质粒。

上述产丁二酸的大肠杆菌基因工程菌在制备丁二酸中的应用在本发明的保护范围之内。

作为优选，所述产丁二酸的大肠杆菌基因工程菌利用微生物电化学系统还原富马酸制备丁二酸。

作为优选，所述产丁二酸的大肠杆菌基因工程菌利用微生物电化学装置制备丁二酸，具体步骤如下：

(1)活化大肠杆菌基因工程菌；

(2)将步骤(1)活化的大肠杆菌基因工程菌接种到2×YT液体培养基中30～37℃培养；

(3)将步骤(2)得到的菌体接种于微生物电化学装置的阴极室中，持续向阴极室通入CO₂使其保持无氧状态；在外加电压作用下，重组大肠杆菌以阴极室中的富马酸为底物，催化富马酸发生还原反应生成丁二酸；

步骤(3)中，所述外加电压的范围为-0.4～-1.0Vvs.参比电极，反应温度为30～37℃，反应时间为20～48h；

所述微生物电化学装置包括由质子交换膜隔开的阳极室和阴极室，位于阳极室的阳极、阳极液通过电源和位于阴极室的阴极、阴极液形成闭合回路；所述阴极室还设有进气口和出气口；所述阴极室还设有参比电极，所述参比电极为Ag/AgCl电极或甘汞电极。

有益效果：

本发明通过异源表达Mtr途径的基因的构建重组大肠杆菌，使得重组大肠杆菌获得传递电子的能力，丁二酸收率提高了13.4％。进一步从经过反应后的微生物电解池阴极上筛选得到对电耐受较好的重组菌株，菌体存活率提高了14.88％，丁二酸产量较对照菌株E.coli-ccm提高了33.5％，并且可以提高胞内NADH水平。筛选的重组菌株在外源添加中性红介体时可以进一步提高丁二酸产量及胞内NADH水平。

附图说明

图1重组质粒图。

图2微生物电解池，A:阳极室；B:阳极；C:阴极室；D:阴极；E:参比电极；F:进气口；G:出气口；H取样口；I质子交换膜；J：电源。

图3 E.coli BA102和E.coli–ccm丁二酸产量及生长情况图。

图4 E.coli-ccm和E.coli–ccm-MtrCBA丁二酸产量

具体实施方式

实施例1：重组大肠杆菌的构建及培养。

根据希瓦氏菌MR-1的合成途径的MtrCAB基因序列(SEQ ID No:1)，设计如下引物：

Mtr-1(SEQ ID NO.3):ccgcgaattcatgaacgcacaaaaatcaaaaatcgc；

Mtr-2(SEQ ID NO.4):cgcggatccttagagtttgtaactcatgctc。

PCR得到的MtrCBA基因簇克隆至质粒pBBR1MCS-5质粒上，构建得到质粒pBBR1MCS-MtrCBA。

同时为确保MtrC、MtrB、MtrA膜蛋白镶嵌血红素正确折叠定位，根据大肠杆菌ccmABCDEFGH基因序列(SEQ ID No:2)，设计如下引物：

Ccm-1(SEQ ID NO.5):catgccatggtgggtatgcttgaagcc；

Ccm-2(SEQ ID NO.6):cccaagcttttatttactctcctgcggcg。

PCR得到的ccmABCDEFGH基因簇克隆至质粒pCWJ质粒上，构建得到质粒pCWJ-ccm。

将验证后的质粒pCWJ-ccm用常规方法导入大肠杆菌菌株E.coli K12(△ldh,△pfl,△ptsG)，菌株命名为E.coli-ccm作为对照菌株，将验证后的质粒pCWJ-ccm和pBBR1MCS-MtrCBA用常规方法同时导入大肠杆菌株E.coli K12(△ldh,△pfl,△ptsG)，菌株命名为E.coli-Mtr，并将E.coli-ccm和E.coli-Mtr以甘油菌或冻干菌种形式保存。

挑取单菌落E.coli-ccm 5ml含34ug/ml氯霉素的LB液体培养基，挑取单菌落E.coli-Mtr于5ml含50ug/ml庆大霉素和34ug/ml氯霉素的LB液体培养基中，37℃、200rpm过夜活化菌种。活化的菌种按1％接种量转接到50ml含相应抗生素的2×YT液体发酵培养基中，30℃、200rpm培养。

LB：每1L溶液中含有：10g蛋白胨，5g酵母粉，5g NaCl。

2×YT:每1L溶液中含有：16g蛋白胨，8g酵母粉，8g NaCl。

实施例2：微生物电合成装置的构建。

本发明的方法和装置构成属于典型的微生物电解池(图2)，例如主要包括阳极室、阴极室、阳离子交换膜等。微生物电解池的阳极电极及阴极点极为石墨毡；以Ag/AgCl为参比电极；

阴极液：每1L溶液中含有：5.6g/L酵母粉，35.29g5.6g/L Na₂HPO₄·12H₂O，9.52g5.6g/L NaH₂PO₄·2H₂O，11.2g5.6g/L NaHCO₃,121℃灭菌20min；

阳极液：每1L溶液中含有：2.506g5.6g/L Na₂HPO₄·12H₂O，2.808g5.6g/LNaH₂PO₄·2H₂O，1.45g5.6g/L NaCl，0.02％DTT(用0.2μm的滤膜过滤除菌，现配现用)，pH7.2，121℃灭菌20min。

实施例3：产丁二酸的工艺。

将培养后的微生物4000g离心10min后的菌体为接种物，阴极液CO₂曝气脱氧并将pH调至7.2后接种菌体到微生物电解池阴极室中(OD₆₀₀＝0.5-1)，并以20mL/min的流量不断充CO₂，以使阴极室保持无氧状态；阳极液加入用0.2μm的滤膜过滤除菌的0.02％的DTT后接入阳极室，将上述搭建好的微生物电解池置于30-37℃的培养箱中，在微生物电解池两个电极之间由恒电位仪施加一个-0.4～-1.0V vs.Ag/AgCl的直流电压，观察微生物电解池产生的电流信号随时间的变化，定时取样测定有机酸含量。

有机酸含量的测定方法：采用高效液相色谱法(High performance liquidchromatography,HPLC)测定：液相色谱分析柱：

HPX-87H型离子排斥色谱柱(300mm×7.8mmid，5μm)；检测器：紫外检测器，波长215nm；流动相：8mM H₂SO₄溶液；进样体积：20μl；流动相流速：0.6mL/min；柱温：55℃。

实施例4：电子传递功能鉴定。

为确定ccm基因簇对菌株的影响，向阴极液中加入终浓度10g/L左右的葡萄糖，分别接入OD₆₀₀约0.5的菌体E.coli K12(△ldh,△pfl,△ptsG)和E.coli–ccm，添加阴极电势-0.8V(vs.Ag/AgCl)情况下，过程中不断通入CO₂，微生物电解池运行时间呢，E.coliK12(△ldh,△pfl,△ptsG)和E.coli–ccm的丁二酸产量及菌体生长OD情况相似(见图3)，说明ccm基因簇对菌体生长及丁二酸生成无明显影响，后期选用E.coli–ccm作为对照菌株。

由于电子传递链Mtr途径位于细胞膜，需要菌体与阴极电极的充分接触才能起到更佳的效果，为进一步确定电子传递链Mtr途径在E.coli的电子传递功能，进行了3轮72h/轮的挂膜实验，每次接入含OD₆₀₀约0.5～1的菌体的含10g/L左右富马酸钠阴极液，添加阴极电势-0.8V(vs.Ag/AgCl)情况下，过程中不断通入CO₂，挂膜成功后，接入不含菌体的含10g/L富马酸的新鲜阴极液，E.coli-ccm及E.coli-Mtr菌株32h时阴极液游离菌体OD₆₆₀均在0.2以下，丁二酸的产量分别为2.73g/L和2.27g/L，E.coli-Mtr较E.coli-ccm并未提高，但产率从28.87％提高到42.27％。32h运行结束后检测了阴极电极上菌体的OD及活菌数，发现E.coli-Mtr阴极菌体数大幅度小于E.coli-ccm，主要原因是每次接入反应器后E.coli-Mtr会出现较大幅度的菌体死亡现象，存活率仅为36.78％，可能过多电子进入胞内从而胞内氧化还原水平失衡导致菌体损伤。说明电合成过程中，直接电子传递途径可以引入电子并对碳流分布起到影响，对丁二酸的生产起到促进作用。为尽量减少菌体损失，挑选经过挂膜实验的阴极上E.coli-Mtr单菌落，得到一株较多膜蛋白情况下菌体生长较好的同时在电合成系统中菌体损伤较小的一株命名为E.coli-ccm-MtrCBA进行后续实验。将该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心”(简称CCTCC)，保藏地址：中国.武汉.武汉大学，邮编：430072，保藏号为：CCTCC NO：M2018743，保藏日期为2018年11月01日。

进行第一轮的实验后对菌体存活情况阴极膜上菌体数进行分析，E.coli-ccm-MtrCBA较E.coli-Mtr菌体存活率提高了14.88％，阴极活菌数提高了41.5％，明显的改善了菌体在电化学系统中的难存活现象，之后对质粒进行测序验证，ccmABCDEFGH及MtrCAB序列均未突变，说明Mtr途径三个蛋白的表达正常。

将E.coli-ccm和E.coli-ccm-MtrCBA分别进行了挂膜实验(72h/轮)，每次接入OD₆₀₀约0.5-1的菌体，添加阴极电势-0.8V(vs.Ag/AgCl)情况下，过程中不断通入CO₂。在第一轮实验中，E.coli-ccm-MtrCBA丁二酸产量从45h后显示出提高，而后72h进入第二轮实验，第二轮实验进行23h后丁二酸产量即显示开始提高，之后进入第三轮不接入菌体实验，E.coli-ccm-MtrCBA丁二酸产量较E.coli-ccm显示出明显提高，53h时，E.coli-ccm和E.coli-ccm-MtrCBA丁二酸产量分别为3.07g/L和4.10g/L。证明Mtr途径的引入对胞外电子传递进细胞内有一定的促进作用，电子利用的效率得到提高。

实施例5：电子传递通道与外源电子传递体结合应用。

由电子传递通道功能验证实验可知，电子传递链Mtr途径位于细胞膜，需要菌体与阴极电极的充分接触才能充分起到作用，而挂膜实验周期长。考察外源添加电子传递体中性红是否可以进一步促进电子传递通道的电子传递效率。

考察了以10g/L左右的富马酸钠为碳源，添加阴极电势-0.8V(vs.Ag/AgCl)，电子传递体中性红在电化学反应器中对E.coli-ccm丁二酸的影响。在32h时，0.5OD₆₆₀(初始是接入菌体OD₆₆₀＝0.5左右，之后进行数据处理时丁二酸产量*0.5/OD660表示0.5OD₆₆₀的丁二酸产量)的E.coli-ccm在添加0.1mM中性红生成丁二酸的量为3.42g/L。相较于未添加中性红E.coli-ccm，32h时丁二酸产量3.21g/L，提高了6.5％。说明单表达ccmA_H基因簇对丁二酸生成的影响较低。

最后考察了以10g/L左右的富马酸为碳源，添加阴极电势-0.8V(vs.Ag/AgCl)，电子传递体中性红在电化学反应器中对E.coli-ccm-MtrCBA产丁二酸的影响。在32h时，0.5OD₆₆₀的重组菌株E.coli-ccm-MtrCBA在添加0.1mM中性红生成丁二酸的量为4.54g/L。相较于未添加中性红重组菌株E.coli–ccm-MtrCBA，32h时丁二酸产量3.80g/L，提高了19.5％。而相较于添加0.1mM中性红的E.coli-ccm丁二酸的产量提高了32.65％。从结果可知，电子传递通道跨膜在大肠杆菌中与电子传递体可能存在协同作用，极大地提高了胞外电子传递及电子用于丁二酸生成的效率。

实施例6：电子传递对胞内NADH影响。

为了研究电子传递对胞内代谢影响，分别选点测定了对照菌株E.coli-ccm和重组菌株E.coli-ccm-MtrCBA在电化学反应器中，施加-0.8V外部电压，添加与未添加中性红情况下胞内NADH情况。首先E.coli-ccm未添加中性、E.coli-ccm添加中性红、E.coli-ccm-MtrCBA未添加中性红、E.coli–ccm-MtrCBA添加中性红胞内NADH浓度分别为14.3pM/OD₆₆₀、27.3pM/OD₆₆₀、20.0pM/OD₆₆₀和52.6pM/OD₆₆₀。无论是在中性红作用还是在电子传递通道作用下，电子传递进胞内会使得NADH水平会增多，而叠加作用引起NADH水平的大量增多。

序列表

<110> 南京工业大学

<120> 一株产丁二酸的大肠杆菌基因工程菌及其构建方法与应用

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 5192

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atgatgaacg cacaaaaatc aaaaatcgca ctgctgctcg cagcaagtgc cgtcacaatg 60

gccttaaccg gctgtggtgg aagcgatggt aataacggca atgatggtag tgatggtggt 120

gagccagcag gtagcatcca gacgttaaac ctagatatca ctaaagtaag ctatgaaaat 180

ggtgcaccta tggtcactgt tttcgccact aacgaagccg acatgccagt gattggtctc 240

gcaaatttag aaatcaaaaa agcactgcaa ttaataccgg aaggggcgac aggcccaggt 300

aatagcgcta actggcaagg cttaggctca tcaaagagct atgtcgataa taaaaacggt 360

agctatacct ttaaattcga cgccttcgat agtaataagg tctttaatgc tcaattaacg 420

caacgcttta acgttgtttc tgctgcgggt aaattagcag acggaacgac cgttcccgtt 480

gccgaaatgg ttgaagattt cgacggccaa ggtaatgcgc cgcaatatac aaaaaatatc 540

gttagccacg aagtatgtgc ttcttgccac gtagaaggtg aaaagattta tcaccaagct 600

actgaagtcg aaacttgtat ttcttgccac actcaagagt ttgcggatgg tcgcggcaaa 660

ccccatgtcg cctttagtca cttaattcac aatgtgcata atgccaacaa agcttggggc 720

aaagacaata aaatccctac agttgcacaa aatattgtcc aagataattg ccaagtttgt 780

cacgttgaat ccgacatgct caccgaggca aaaaactggt cacgtattcc aacaatggaa 840

gtctgttcta gctgtcacgt agacatcgat tttgctgcgg gtaaaggcca ctctcaacaa 900

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cacaaaaaac acgttgaaga tgcctacggc ctcattggtg gcaattgtgc ctcttgtcac 1740

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ccttaagtgc cgacaagcaa aacagcgtat gtatgagctg tcaccaagac gataagcgta 2520

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cgaatgccaa tactgaaaaa gtgaaattat ccgcatggag ctgtaaaggc tgcgtcgttg 3240

aaacgggcac atcaggcact gtgggtgtcg gtgtcggtta taacagcgaa gaggatattc 3300

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gcggtcgctt agatgtcaat gcgggcaaac aaggccagta caacgtcaat gtgaactatc 3480

gccaaattgc tacctacgac agcaatagcg ccctatcgcc ctacgcgggt attggtggca 3540

ataacctcac gttaccggat aactggataa cagcaggttc aagcaaccaa atgccactct 3600

tgatggacag cctcaatgcc ctcgaactct cacttaaacg tgagcgcacg gggttgggat 3660

ttgaatatca aggtgaatcc ctgtggagca cctatgttaa ctacatgcgt gaagagaaaa 3720

ccggcttaaa acaagcctct ggtagcttct tcaaccaatc gatgatgtta gcagagccgg 3780

tggattacac cactgacacc attgaagcgg gtgtcaaact caagggtgat cgttggttta 3840

ccgcactcag ttacaatggg tcaatattca aaaacgaata caaccaattg gactttgaaa 3900

atgcttttaa ccccaccttt ggtgctcaaa cccaaggtac gatggcactc gatccggata 3960

accagtcaca caccgtgtcg ctgatgggac agtacaacga tggcagcaac gcactgtcgg 4020

gtcgtattct gaccggacaa atgagccaag atcaggcgtt agtgacggat aactaccgtt 4080

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gtaaggtggc ttataacacc ccttacgata atcgtacgca acgctttaaa gttgccgcag 4320

attatcgcat tacccgcgat atcaaactcg atggtggtta tgacttcaaa cgtgaccaac 4380

gtgattatca agaccgtgaa accacggatg aaaataccgt ttgggcccgt ttacgtgtaa 4440

acagcttcga tacttgggac atgtgggtaa aaggcagtta cggtaaccgt gacggctcac 4500

aataccaagc gtctgaatgg acctcttctg aaaccaacag cctgttacgt aagtacaatc 4560

tggctgaccg tgacagaact caagtcgaag cacggatcac ccattcgcca ttagaaagcc 4620

tgactatcga tgttggtgcc cgttacgcgt tagatgatta taccgatact gtgattggat 4680

taactgagtc aaaagacacc agttatgatg ccaacatcag ttatatgatc accgctgact 4740

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attacagcac cccaacgtgg acaggcttta tagaagatca ggtagatgtg gtcggtgcag 4860

gtatcagcta caacaatctg ctggagaaca agttacgcct aggactggac tacacctatt 4920

ccaactccga cagtaacact caagtcagac aaggtatcac tggcgactat ggtgattatt 4980

ttgccaaagt gcataacatt aacttatacg ctcaatatca agccaccgag aaactcgcgc 5040

tgcgcttcga ttacaaaatt gagaactata aggacaatga cgccgcaaat gatatcgccg 5100

ttgatggcat ttggaacgtc gtaggttttg gtagtaacag ccatgactac accgcacaaa 5160

tgctgatgct gagcatgagt tacaaactct aa 5192

<210> 2

<211> 6287

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gtgggtatgc ttgaagccag agagttactt tgtgagcggg atgaacgaac cttatttagt 60

ggcttgtcat ttacgctgaa cgcaggagag tgggtacaaa tcaccggtag caacggcgcg 120

gggaagacaa cgcttctccg tttgctgacg gggttgtctc gccctgacgc aggcgaggtt 180

ctctggcaag ggcagccctt gcatcaggta cgcgacagct accatcaaaa cctgttatgg 240

ataggccatc agccggggat caaaacccgg ctgacggcgt tagaaaatct gcacttttat 300

catcgcgatg gcgataccgc acaatgtctg gaagccctgg cgcaggccgg gcttgccgga 360

ttcgaagata ttcctgtaaa tcagctctcg gccgggcaac aacgccgcgt cgctttagcg 420

cgtctgtggc tgacccgtgc cacgttatgg atcctcgacg agccttttac cgcgattgac 480

gttaacggtg tcgatcgtct gacccagcgt atggcgcagc atacggagca gggggggatt 540

gtgattctga ctacccacca gccgctcaac gttgctgaaa gtaaaattcg ccgcatttca 600

ctgacgcaaa cgagggccgc atgatgttct ggcgcatttt ccgtcttgag ctgcgtgtag 660

cgtttcgcca tagcgccgaa atcgccaacc cgctgtggtt cttcctgatt gtaattaccc 720

tttttccgct cagtatcggt ccggagccgc aactgctggc gcgtattgca ccgggcatta 780

tctgggttgc tgcgctgctt tcatccttgc tggcgctgga acgactgttc cgtgacgatt 840

tgcaggacgg cagtcttgaa caattgatgt tgttgccgtt acccttgccc gccgttgtgc 900

tggcgaaggt gatggcgcac tggatggtaa ccggtctgcc gttactcatc ctttcgccac 960

tggtagcaat gctactggga atggatgttt atggctggca agtgatggcg ctgacgctgc 1020

tgctgggaac gcctacgctt ggctttctcg gtgcaccggg cgtggcgctg acagtgggac 1080

ttaagcgcgg tggtgtgctg ctcagcatac tggtgttacc gctgactatc ccattactca 1140

tctttgccac cgccgcgatg gacgcggctt ctatgcattt gcccgttgac gggtatctgg 1200

caattttagg cgcgttgctg gcaggcaccg cgacattaag tccttttgcg acggcggcag 1260

cgttacgaat cagcattcaa taacgctgga ttactgattt ttgttcgagt ctggtatcga 1320

aactatgtgg aaaacactgc atcaactggc gatcccacca cggctgtatc aaatctgtgg 1380

ctggtttata ccgtggctgg caattgccag tgtggtcgtg cttaccgtcg gctggatctg 1440

gggattcggc tttgctccgg ctgattatca gcagggaaat agctaccgca ttatctacct 1500

gcatgtgcct gcggcgatct ggtcgatggg catttatgca tcaatggcag tggcagcgtt 1560

tattggcctt gtctggcaga tgaaaatggc caacctggcg gtggcggcga tggcccccat 1620

tggtgccgtg tttaccttta ttgccctggt taccggctct gcatggggaa aaccgatgtg 1680

gggcacctgg tgggtatggg atgcacgtct gacttctgaa ctggtgctgc tgtttttgta 1740

tgtgggtgtg attgccctgt ggcacgcctt cgacgaccgc cgtctggcgg gccgtgcggc 1800

aggtatcctg gtgctgattg gcgtggtgaa tctgccgatt attcattact ccgtggagtg 1860

gtggaacacc ctgcatcagg gatcaacgcg gatgcagcaa agtatcgatc cggcgatgcg 1920

ttcgccgctg cgctggtcga tttttggctt cctgctcctg tctgccacgc tgacgctgat 1980

gcggatgcgt aatttgattt tgctgatgga aaaacgccgt ccgtgggtga gtgaactgat 2040

actgaaaaga ggccgtaaat gacccctgca tttgcttcct ggaatgaatt tttcgcaatg 2100

ggcggttacg ccttttttgt ctggctggcg gtggtgatga ccgttattcc gctggtggtt 2160

ttggtcgtgc actcggtgat gcaacatcgc gcaattctgc gtggcgtggc gcaacagcgg 2220

gcgcgtgagg cgcgtttacg tgctgcgcaa cagcaggagg ctgcatgaat attcgccgta 2280

aaaaccgctt gtggattgcc tgtgccgtgt tggcagggct ggcgctgact atcggtctgg 2340

tgctatatgc gctgcgctcg aatatcgatc tcttttatac gccgggggaa attctctacg 2400

gcaagcgtga aactcagcaa atgccggaag tcggtcagcg tctgcgcgtt ggcgggatgg 2460

tgatgccggg tagtgtgcag cgcgatccca attcgctgaa agtgaccttc accatttacg 2520

atgctgaagg ctcagtggat gtctcttacg aaggcatttt gccggatctg ttccgtgaag 2580

ggcagggcgt tgtggtgcag ggcgaactgg aaaaaggcaa tcatatcctc gcgaaagaag 2640

tgctggcgaa acacgatgaa aactatacgc cgccagaagt tgagaaagcg atggaagcta 2700

accaccgtcg cccggcgagt gtttataagg acccagcatc atgatgccag aaattggtaa 2760

cggactgctg tgcctggcgc tgggaattgc gctgctgctg tccgtgtatc cgctatgggg 2820

cgtggcgcgc ggagatgcgc gcatgatggc gtcttcccgc ttgtttgcct ggctgctgtt 2880

tatgtctgtg gctggcgcat ttctggtgct ggtcaatgct ttcgtggtca acgacttcac 2940

cgtcacctat gttgccagca actccaatac ccagcttccg gtgtggtatc gcgtggcggc 3000

tacctggggc gcgcatgaag gctcgctact gctgtgggtg ctgctgatga gcggctggac 3060

ctttgcggtg gcgattttta gtcagcgtat tccgctggat attgtggccc gtgtactggc 3120

gataatgggg atggtcagtg tcggcttttt gctgttcatt ctctttacct ctaacccgtt 3180

ctctcgcacg ttgccgaact tcccgattga aggtcgcgat cttaacccgc tattgcagga 3240

tccggggctg atcttccatc cgcctctgct ttatatgggg tacgtgggtt tctcggtggc 3300

gtttgctttt gccattgctt ctttgctgag cgggcgtctg gacagcactt atgcgcgttt 3360

tactcgtccg tggacgctgg cagcgtggat cttcctgacg ctcggcatcg tgctcggttc 3420

cgcatgggcc tattacgaac tcggctgggg tggctggtgg ttctgggatc cggtagaaaa 3480

cgcctcgttt atgccgtggc tggtggggac tgcgctgatg cactcactgg cggtcactga 3540

acaacgcgcc agcttcaaag cgtggacatt actgctggca atcagtgcct tctcgttgtg 3600

tctgttgggg actttcctcg tgcgttccgg cgtgctggta tcggtacacg cgtttgcgtc 3660

tgatccggcg cgcggtatgt ttatcctcgc ctttatggtg ctggtgattg gcggttcgct 3720

gctgctgttt gccgcgcgtg gacacaaagt tcgctcacgc gtaaacaatg cgctgtggtc 3780

gcgggaatct ttgctgttag cgaacaatgt tttgctggtc gctgcgatgc tggtggtgtt 3840

gctggggacg ctgctgccgt tggtgcataa gcaactggga ctgggcagta tttcgattgg 3900

cgaaccgttc ttcaacacca tgtttacctg gctgatggtg ccgtttgcgc tactgcttgg 3960

tgtcggtcct ctggtgcgct gggggcggga tcgcccgcgt aagatccgca atttattgat 4020

tatcgccttc atctctacgc tggtgctgtc gctgctgttg ccgtggctgt tcgaaagcaa 4080

agttgtggcg atgacggtgc tcggcctggc aatggcctgc tggattgcgg tgctggcaat 4140

tgcggaagct gcgctacgta tttcacgcgg cacgaaaacc accttcagtt attgggggat 4200

ggtggcggct caccttgggc tggcagtgac aattgttggc attgccttta gccagaacta 4260

tagcgttgag cgtgatgtgc gcatgaagtc cggcgatagc gtcgatattc atgaatatcg 4320

cttcaccttc cgtgatgtca aagaggtgac tggcccgaac tggcgtggcg gtgtggcgac 4380

tatcggcgta acgcgcgatg gcaagccgga aacggtgctg tatgcggaaa aacgttatta 4440

caacactgcc gggtcgatga tgaccgaagc ggcaattgac ggcggcatca cgcgtgacct 4500

gtacgcggcc ctcggtgaag agctggaaaa cggcgcgtgg gccgtgcgtc tttactacaa 4560

accatttgtt cgctggattt gggcgggcgg gctgatgatg gcgttgggcg gactgctgtg 4620

tctgtttgat cctcgctatc gtaagcgcgt gagtccgcaa aaaactgcgc cggaggccgt 4680

atgaagcgca aagtattgtt aattccgttg attatcttcc tggcgattgc cgcggcgctg 4740

ctgtggcagc tggcgcgtaa tgccgaaggg gatgatccga ccaatctgga atcggcgctc 4800

attggcaagc ctgtgccgaa gtttcgtctc gaatcactgg acaatccggg gcagttttat 4860

caggcggatg tgctgactca gggcaaacca gtactgctta acgtctgggc gacctggtgt 4920

ccgacctgcc gtgcggaaca tcaatatctg aatcagcttt ctgcgcaggg catccgcgtg 4980

gtcggcatga actataaaga cgatcgccag aaggcaatca gctggctgaa agagctgggc 5040

aatccttacg cgctaagcct gtttgatggc gatggcatgt tagggctgga tctcggtgtc 5100

tatggcgcgc cagaaacgtt tcttattgac ggcaacggca tcattcgcta tcgccatgcg 5160

ggcgatctga atcctcgcgt ctgggaagaa gagatcaagc cgctgtggga gaaatacagt 5220

aaggaggccg cacaatgagg tttttattgg gcgtgctgat gctgatgatc tccggctcag 5280

cgctggcgac catcgatgtg ttgcagttta aagatgaagc acaggaacaa cagttccgtc 5340

agctcactga agaactgcgc tgcccgaaat gccagaacaa cagcattgcc gattccaact 5400

cgatgattgc caccgacctg cgtcagaaag tgtatgaact gatgcaggaa ggtaaaagta 5460

aaaaagagat tgtcgattat atggtggcgc gttacggcaa cttcgtcact tacgatccgc 5520

cgttaacgcc gctgaccgtg ctgctgtggg tgctgccagt agtggctatt ggcattggcg 5580

gttgggtcat atacgcccgc tcgcggcgtc gggtacgcgt ggtgccggaa gcgtttcctg 5640

aacaaagcgt gccggaaggt aagcgtgccg gatatgttgt ttatctgccg ggtattgtgg 5700

tggcgttaat tgtggctggc gtcagctact accagactgg caattatcag caggtgaaaa 5760

tctggcagca ggccacggca caggctccgg cgttgctgga cagggcgctg gatccgaaag 5820

ccgatccgct caacgaagaa gagatgtcgc gtcttgcgct ggggatgcgt actcaactgc 5880

aaaaaaatcc gggagatata gaaggctgga ttatgttggg ccgcgttggc atggcgctgg 5940

gtaacgccag tatcgccacc gatgcatacg ccactgcgta tcgcctcgat ccgaaaaaca 6000

gtgatgctgc actgggatac gctgaagcgt tgactcgttc atctgatccc aacgacaacc 6060

gcctcggcgg tgaactgcta cgtcagctgg tgagaacgga ccatagcaat atccgtgtgc 6120

taagcatgta tgcgtttaat gcctttgagc agcagcgatt tggcgaagcc gttgccgcgt 6180

gggagatgat gttgaaactc ttacctgcca acgatactcg ccgtgcggtg attgaacgta 6240

gtatcgcgca ggcgatgcaa catttgtcgc cgcaggagag taaataa 6287

<210> 3

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ccgcgaattc atgaacgcac aaaaatcaaa aatcgc 36

<210> 4

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

cgcggatcct tagagtttgt aactcatgct c 31

<210> 5

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

cggggtaccg tgggtatgct tgaagc 26

<210> 6

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

cccaagcttt tatttactct cctgcggcg 29

Claims (3)

1.产丁二酸的大肠杆菌基因工程菌在制备丁二酸中的应用，所述大肠杆菌基因工程菌保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC NO：M2018743，保藏地址：中国.武汉.武汉大学，保藏日期为2018年11月01日。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述产丁二酸的大肠杆菌基因工程菌利用微生物电化学系统还原富马酸制备丁二酸。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述产丁二酸的大肠杆菌基因工程菌利用微生物电化学装置制备丁二酸，具体步骤如下：

（1）活化大肠杆菌基因工程菌；

（2）将步骤（1）活化的大肠杆菌基因工程菌接种到2×YT液体培养基中20～37 ℃培养；

（3）将步骤（2）得到的菌体接种于微生物电化学装置的阴极室中，持续向阴极室通入CO₂使其保持无氧状态；在外加电压作用下，重组大肠杆菌以阴极室中的富马酸为底物，催化富马酸发生还原反应生成丁二酸；

步骤（3）中，所述外加电压的范围为-0.4～-0.8Vvs.参比电极，反应温度为30～37 ℃，反应时间为20～48h；

所述微生物电化学装置包括由质子交换膜隔开的阳极室和阴极室，位于阳极室的阳极、阳极液通过电源和位于阴极室的阴极、阴极液形成闭合回路；所述阴极室还设有进气口和出气口；所述阴极室还设有参比电极，所述参比电极为Ag/AgCl电极或甘汞电极。

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