JP2023520238A - 組換え微生物及び方法 - Google Patents
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Abstract
本発明は、バイオ水素を産生させるための組換え微生物に関する。更に、本発明は、そこからの水素の産生を可能にするために微生物を改変するための核酸構築物及び方法に関する。
Description
本発明は、水素を産生するための方法、水素を産生するための核酸構築物及び組換え微生物に関する。
関連出願の相互参照
本出願は、その全内容が参照によって本明細書に組み込まれる、オーストラリア特許仮出願第2020900990号の優先権を主張する。
本出願は、その全内容が参照によって本明細書に組み込まれる、オーストラリア特許仮出願第2020900990号の優先権を主張する。
石油コストの上昇、産油国との外交逼迫の増大、及び大気中の温室効果ガスのレベルの上昇により、代替燃料への関心が高まっている。水素は、無公害燃料として寄与し、それにより、化石エネルギー利用と関連する環境及び政治的懸念を緩和する大きな可能性を有する。したがって、クリーンエネルギーの供給源として化石燃料を置換するか又は補給する候補を同定する研究は、分子水素の生産に注目してきた。
水素経済への鍵は、水素を利用可能なエネルギーへと経済的に変換するという等しく重要なゴールも達成しつつ、水素の生産のために十分な、高価ではない、及び再生可能な方法を見出すことである。
商業規模での水素の生産の一手法は、真核生物による水素の光生物学的生産の開発である。例えば、緑藻類は、酸化経路の発酵代謝への転換によって嫌気性ストレスに応答する。
コナミドリムシ(Chlamydomonas reinhardtii)のような緑藻類の、水から水素を産生する能力は長いこと認識されている。この反応は、短期間の嫌気状態への曝露後に細胞において誘導される酵素である、可逆的なヒドロゲナーゼによって触媒される。したがって、藻類バイオリアクターの使用は、水素を産生する一手法である。しかしながら、細胞が照射されると、光合成的に生成されたO2による可逆的なヒドロゲナーゼの即座の不活性化のため、ヒドロゲナーゼの活性は急速に消失する。
水素の生産のための他の手法は、組換え微生物の生成、及びそれらの微生物による炭水化物供給原料の発酵を含む。一部の例では、細菌、古細菌及び藻類由来のヒドロゲナーゼは、大腸菌(E.coli)で発現されるが、大腸菌における外因性酵素の発現は、コドン最適化にもかかわらず、低い発現率及びタンパク質不安定性により複雑である。
様々なヒドロゲナーゼが、そのような発酵手法での使用の候補として提案された。例えば、光合成紅色硫黄細菌(Allochromatiiim vinosum)由来の[NiFe]-ヒドロゲナーゼは、著しく活性な電極触媒である。[NiFe]-ヒドロゲナーゼは有望であるが、これら及び他のヒドロゲナーゼ酵素の使用と関連する問題が残っている。ヒドロゲナーゼの安定性は、酵素燃料電池でのそれらの使用における主な欠点の1つである。更に、酵素は、少量のプラチナよりもCO被毒に対する弱い感受性を示すが、商業使用は、CO並びに酸素に対する感受性の両方に関してさらなる改善を必要とする。加えて、ヒドロゲナーゼを大量に入手できないことは、酵素燃料電池でのそれらの適用可能性を制限する。したがって、大量の及び所望の触媒特性を有する安定なヒドロゲナーゼの生産は、水素燃料のためのこの興味深いバイオ電極触媒の適応を大きく増強するであろう。
藻類バイオリアクターは、多くの光捕捉及び水素捕捉の技術的障害により、スケールアップが高価である。水素は、低容積及び濃度で閉じ込め回収することが難しいため、水素生産の速度も重大な懸念である。藻類システムは、非常に低速で水素を産生し、生産を開始するのに栄養制限を必要とする。これまで、操作した微細藻類又は炭水化物供給原料の発酵のいずれかによって産生された水素の生産速度及び収率の両方は、商業的に実行可能にするためにはそれぞれ非常に遅く、低い。
したがって、水素の生成のための方法の改善が必要である。
本明細書の任意の先行技術の参照は、この先行技術が任意の管轄における一般知識の一部を形成するか、又はこの先行技術が理解され、当業者によって先行技術の他のピースと関連する、及び/又はそれらと組み合わされているとみなされると合理的に期待されるであろうことを承認又は提言するものではない。
Esselbornら、(2013年) Nat Chem Biol 9 (10):607～609頁
Berggrenら、(2013年) Nature, 499: 66～69頁
Sondergaardら、(2016年) Scientific Reports, 6:34212
Reisch CR and Prather KL, (2015年) The no-SCAR (Scarless Cas9 Assisted Recombineering) system for genome editing in Escherichia coli, Sci Rep. 14(5):15096
Sambrookら(1989年, Molecular Cloning-a laboratory manual; Cold Spring Harbor Press)
Pouwelsら、Cloning Vectors: A Laboratory Manual (Elsevier, N.Y.: 1985年)
Current Protocols in Molecular Biology, Ausubelら編(Wiley & Sons, New York, 1988年、四半期ごとのアップデート)
Segalら、1999年, Proc Natl Acad Sci USA 96(6):2758～63頁
Heidebachら、(2012年) Critical Reviews in Food Science and Nutrition, 52: 291～311頁
Martinら、(2015年) Innovative Food Science & Emerging Technologies 27:15～25頁
本発明は、通常、水素を産生する発現ベクター、微生物、方法及びリアクターシステム、並びにエネルギー及び発電適用のための活性ヒドロゲナーゼ酵素に関する。発現ベクター及び微生物は、目的の産物を産生するための培養方法において使用され得る。水素及び活性ヒドロゲナーゼ産物の両方は、例えば、水素から電気を産生するための燃料電池システムのようなシステムに組み込まれ得る。
第1の態様では、本発明は水素ガスを産生するための組換え微生物であって、
微生物が水素を産生できるようにする1つ又はそれ以上のタンパク質をコードする外因性核酸配列であって、
- 1つ又はそれ以上のタンパク質が、Fe-Fe依存性ヒドロゲナーゼ及び場合によりヒドロゲナーゼの成熟及び活性化を可能にする少なくとも1つのアセンブリタンパク質を含み、
- 核酸配列が、微生物における核酸配列の発現を可能にする1つ又はそれ以上のプロモーターに作動可能に連結し、
- 外因性核酸配列が、コドン最適化され、微生物においてヒドロゲナーゼの最適化された発現を提供する、
外因性核酸配列を含む組換え微生物を提供する。
微生物が水素を産生できるようにする1つ又はそれ以上のタンパク質をコードする外因性核酸配列であって、
- 1つ又はそれ以上のタンパク質が、Fe-Fe依存性ヒドロゲナーゼ及び場合によりヒドロゲナーゼの成熟及び活性化を可能にする少なくとも1つのアセンブリタンパク質を含み、
- 核酸配列が、微生物における核酸配列の発現を可能にする1つ又はそれ以上のプロモーターに作動可能に連結し、
- 外因性核酸配列が、コドン最適化され、微生物においてヒドロゲナーゼの最適化された発現を提供する、
外因性核酸配列を含む組換え微生物を提供する。
好ましくは、Fe-Feヒドロゲナーゼは、A1クラスのFe-Feヒドロゲナーゼのメンバーである。
好ましくは、Fe-Fe依存性ヒドロゲナーゼは、HydA(Hyd1)又はその機能的に等価な相同体若しくは誘導体である。
好ましい実施形態では、Fe-Fe依存性ヒドロゲナーゼは:コナミドリムシ、ボルボックス・カルテリ (Volvox carteri)、ランブル鞭毛虫(Giardia lamblia)、エントアメーバ・ヌタリ(Entamoeba nuttalli)、イリオバクター・ポリトロパス(Ilyobacter polytrophus)、膣トリコモナス(Trichomonas vaginalis)、メガスファエラ・ミクロヌシフォルミス(Megasphaera micronuciformis)、ベイロネラ・パルブラ(Veillonella parvula)、ベイロネラ・アティピカ(Veillonella atypica)、ペプトクロストリジウム・ビファーメンタンス(Peptoclostridium bifermentans)、クロストリジウム・アルブスティ(Clostridium arbusti)、シュードフラボニフラクター・カピローサス(Pseudoflavonifractor capillosus)、ラクノクロストリジウム・シトロニエ(Lachnoclostridium citroniae)、ラクノクロストリジウム・クロストリジオフォルメ(Lachnoclostridium clostridioforme)、ペロシナス・フェルメンタン(Pelosinus fermentans)、サーモデスルホビブリオ・アイランディカス(Thermodesulfovibrio islandicus)、ステレラ・ワズワーテンシス(Sutterella wadsworthensis)、クロストリジウム・ベウジェリンキ(Clostridium beijerinckii)、フソバクテリウム・ウルセランス(Fusobacterium ulcerans)、クロストリジウム・チロブリチカム(Clostridium tyrobutyricum)、クロストリジウム・パーフリンジェンス(Clostridium perfringens)、セトバクテリウム・ソメラエ(Cetobacterium somerae)、クロストリジウム・ベイジェリンキ(Clostridium beijerinckii)、クロストリジウム・コリカニス(Clostridium colicanis)、クロストリジウム・インテスティナーレ(Clostridium intestinale)、クロストリジウム・ショウベイ(Clostridium chauvoei)、セルロモナス・フィミ(Cellulomonas fimi)、ルミニクロストリジウム・サーモセラム(Ruminiclostridium thermocellum)、ネグレリア・グルベリ(Naegleria gruberi)、クロレラ・バリアビリス(Chlorella variabilis)、フェルビバクテリウム・ノドサム(Fervidobacterium nodosum)、サーモトガ・ペトロフィラ(Thermotoga petrophila)、サーモトガ・レティンガエ(Thermotoga lettingae)、チオミクロスピラ・ペロフィラ(Thiomicrospira pelophila)、Caldatribacterium californiense、フソバクテリウム・ネクロフォーラム(Fusobacterium necrophorum)、Omnitrophus fodinae、シトロフォサームス・リポカリダス(Syntrophothermus lipocalidus)、アモニフェックス・デゲンシイ(Ammonifex degensii)、デスルホトマキュラム・ハイドロサルマレ(Desulfotomaculum hydrothermale)、フソバクテリウム・モルティフェラム(Fusobacterium mortiferum)、デスルホトマクルム・クズネツォビイ(Desulfotomaculum kuznetsovii)、及びラクノクロストリジウム・フィトフェルメンタンス(Lachnoclostridium phytofermentans)又はその機能的に等価な相同体若しくは誘導体からなる群から選択されるHydAタンパク質のアミノ酸配列を含む。好ましくは、HydAタンパク質は:コナミドリムシ、ボルボックス・カルテリ、ランブル鞭毛虫、エントアメーバ・ヌタリ、イリオバクター・ポリトロパス(Ilyobacter polytrophus)、膣トリコモナス、メガスファエラ・ミクロヌシフォルミス、ベイロネラ・パルブラ、ベイロネラ・アティピカ、及びペプトクロストリジウム・ビファーメンタンス、及びこれらの機能的に等価な相同体からなる群から選択される。より好ましくは、HydAタンパク質は、コナミドリムシ又はその機能的に等価な相同体若しくは誘導体由来である。
ある特定の実施形態では、微生物の培養中に、ヒドロゲナーゼの成熟及び活性化を可能にする1つ又はそれ以上の因子を有する微生物が提供され得る。好ましくは、1つ又はそれ以上の因子は、小分子の形態である。ヒドロゲナーゼの成熟及び活性化を可能にする因子の例は、アザジチオレート架橋を含有する[2Fe]-サブサイト模倣体である。そのような因子は、例えば、その内容が参照によって本明細書に組み込まれる、Esselbornら、(2013年) Nat Chem Biol 9 (10):607～609頁、及びBerggrenら、(2013年) Nature, 499: 66～69頁に記載される。
好ましくは、外因性核酸配列は、ヒドロゲナーゼの成熟及び活性化を可能にする少なくとも1つのアセンブリタンパク質をコードし、少なくとも1つのタンパク質は:HydEF及び/又はHydGからなる群から選択される。より好ましくは、外因性核酸配列は、アセンブリタンパク質HydEF及びHydGの両方をコードする配列を含む。特に好ましい実施形態では、HydEF及びHydGタンパク質は、コナミドリムシ又はその機能的に等価な相同体若しくは誘導体由来のHydEF及びHydGタンパク質のアミノ酸配列を含む。
したがって、好ましい実施形態では、本発明は、水素ガスを産生するための組換え微生物であって、
微生物が水素を産生するのを可能にする1つ又はそれ以上のタンパク質をコードする外因性核酸配列であって、
- 1つ又はそれ以上のタンパク質が、Fe-Fe依存性ヒドロゲナーゼHydA、又はその機能的に等価な相同体若しくは誘導体、並びにコナミドリムシ由来のアセンブリタンパク質HydEF及びHydG、又はその機能的に等価な相同体若しくは誘導体を含み;
- 核酸配列が、微生物における核酸配列の発現を可能にする1つ又はそれ以上のプロモーターに作動可能に連結し、
- 外因性核酸配列が、コドン最適化され、微生物においてヒドロゲナーゼの最適化された発現を提供する、
外因性核酸配列を含む組換え微生物を提供する。
微生物が水素を産生するのを可能にする1つ又はそれ以上のタンパク質をコードする外因性核酸配列であって、
- 1つ又はそれ以上のタンパク質が、Fe-Fe依存性ヒドロゲナーゼHydA、又はその機能的に等価な相同体若しくは誘導体、並びにコナミドリムシ由来のアセンブリタンパク質HydEF及びHydG、又はその機能的に等価な相同体若しくは誘導体を含み;
- 核酸配列が、微生物における核酸配列の発現を可能にする1つ又はそれ以上のプロモーターに作動可能に連結し、
- 外因性核酸配列が、コドン最適化され、微生物においてヒドロゲナーゼの最適化された発現を提供する、
外因性核酸配列を含む組換え微生物を提供する。
任意の実施形態では、微生物は、タンパク質フェレドキシンNADP還元酵素(FNR)及びフェレドキシン(petFによってコードされる)、又はそれらの機能的に等価な相同体若しくは誘導体をコードする核酸配列を更に含む。
好ましくは、NFRの供給源は、フェレドキシンを還元する還元剤としてNADPHを利用するフェレドキシン還元酵素を含有するフラビンである。より好ましくは、フェレドキシンタンパク質は、コナミドリムシ由来であり、FNRは、コナミドリムシ由来のフェレドキシン(Ferrodoxin)を還元することができる任意のFNRである。特に好ましい実施形態では、FNR及びフェレドキシン(Ferrodoxin)タンパク質は、コナミドリムシ又はその機能的に等価な相同体若しくは誘導体由来のアミノ酸配列を含む。
組換え微生物は、組換えタンパク質の発現の使用に好適な任意の微生物であり得る。ある特定の実施形態では、組換え微生物は:大腸菌(Escherichia coli)、枯草菌(Bacillus subtilis)、ラクトバチルス属(Lactobacillus sp.)、又はストレプトコッカス属(Streptococcus sp.)からなる群から選択される。好ましい実施形態では、微生物は、大腸菌(E.coli)の株である。
ある特定の実施形態では、組換え微生物は、部分的に又は完全に不活性及び/又は生育不能である。
任意の実施形態では、外因性核酸配列は、1つ又はそれ以上のポリヌクレオチド構築物で提供される。好ましい実施形態では、HydEF、HydG、HydA並びに場合によりフェレドキシン及びFNRをコードする外因性核酸配列は、単一のポリヌクレオチド構築物で提供される。代替の実施形態では、タンパク質をコードする核酸配列が、別々のポリヌクレオチド構築物で提供される。
好ましい実施形態では、本発明は、細胞が水素を産生できるようにするタンパク質のクラスターをコードする組換え構築物を含む大腸菌細胞を提供し、タンパク質のクラスターは、コナミドリムシ由来のポリペプチドHydEF、HydG、HydA、フェレドキシン及びFNRを含む、からなる、又はから基本的になる。好ましい実施形態では、組換え構築物は、配列番号10に記載の配列を含む、からなる、又はから基本的になる。
さらなる実施形態では、微生物は、ペントースリン酸経路へと炭素利用を方向づけ直すための1つ又はそれ以上の遺伝子改変を含む。改変は、炭素を解糖系へと向かわせ、それにより炭素利用をペントースリン酸経路へと方向づけ直す、タンパク質の活性の減少又は阻害を生じ得る。
例えば、微生物は、更に改変され:ホスホフルクトキナーゼ、ピルビン酸キナーゼ、グリセリン酸ムターゼ、グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ、6-ホスホグルコン酸デヒドラターゼ、及び2-ケト-3-デオキシ-6-ホスホグルコン酸アルドラーゼからなる群から選択される1つ又はそれ以上の内因性タンパク質の活性又はレベルを減少又は阻害し得る。これらのタンパク質は、それぞれ遺伝子、pfkA、pps、gpmA/gpmM、gapA、edd及びedaによってコードされる。
好ましくは、微生物は遺伝的に改変され、それぞれホスホフルクトキナーゼ、ピルビン酸キナーゼ、グリセリン酸ムターゼ、グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ、6-ホスホグルコン酸デヒドラターゼ、及び2-ケト-3-デオキシ-6-ホスホグルコン酸アルドラーゼをコードする遺伝子pfkA、pps、gpmA/gpmM、gapA、edd及びedaの1つ又はそれ以上の発現を欠失又は減少する。改変は、遺伝子の発現を部分的又は完全に減少させる任意の改変であり得る。発現の部分的な減少がある場合、発現は、同じ株の野生型微生物における発現と比較して、少なくとも5%、少なくとも10%、少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%又はそれ以上減少してもよい。
遺伝子改変を、CRISPR-Cas9システム又は他のゲノム改変システム(ラムダレッドリコンビナーゼ等)を使用して行って、1つ又はそれ以上の遺伝子の発現を部分的又は完全に阻害し得る。遺伝子改変は、遺伝子の完全又は部分的な機能喪失変異、好ましくは完全な機能喪失変異をもたらし得る。改変は、遺伝子配列の完全又は部分的な削除であり得る。
ある特定の実施形態では、pfkA、pps、gpmA/gpmM、gapA、edd及びeda遺伝子の1つのみが欠失又はノックダウンされる。好ましくは、pfkA又はgpmAが欠失又はノックダウンされる。さらなる実施形態では、微生物は遺伝的に改変され、遺伝子pfkA、pps、gpmA/gpmM、gapA、edd及びedaの2つ、3つ、4つ、5つ又は全ての発現を欠失又は減少する。ある特定の実施形態では、遺伝子改変は、pfkA及びgpmA;又はedd及びeda;又はgpmM、edd及びeda;又はgpmA、edd及びeda;又はgpmM、edd、eda及びpfkA;又はgpmA、edd、eda及びpfkA又はpfkA、pps、gpmA/gpmM、edd及びedaの全ての発現の欠失又は減少をもたらす。
よりさらなる実施形態では、微生物を遺伝的に改変し、ペントースリン酸経路の1つ又はそれ以上のタンパク質のレベル又は活性を増加させる。
好ましくは、1つ又はそれ以上のタンパク質は、ホスホグルコムターゼ、グルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼ、6-ホスホグルコノラクトナーゼ、6-ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ、トランスケトラーゼ及びトランスアルドラーゼからなる群から選択される。これらのタンパク質は、それぞれ遺伝子pgm、zwf、pgl、gnd、tktB又はtktA、及びtalA又はtalBによってコードされる。特に好ましい実施形態では、タンパク質は、グルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼである。
さらなる実施形態では、内因性NADキナーゼ(yfjBによってコードされるNADK)及び/又は可溶性ピリジンヌクレオチドトランスヒドロゲナーゼ(sthAによってコードされるUdhA)のレベル又は活性が増加する。
好ましくは、微生物のタンパク質のレベル又は活性の増加は、ペントースリン酸経路の1つ又はそれ以上のタンパク質をコードする核酸配列の発現を増加させることによって達成され、微生物によって産生されるタンパク質のレベルが同じ株の野生型微生物と比較して増加する。代替の実施形態では、タンパク質のレベル又は活性の増加は、タンパク質の活性の増加をもたらす1つ又はそれ以上の点変異の導入によって達成される。
好ましい実施形態では、グルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子、zwfが過剰発現される。さらなる実施形態では、6-ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子、gndが過剰発現される。他の実施形態では、6-ホスホグルコノラクトナーゼをコードする遺伝子、pglが過剰発現される。
ホスホグルコムターゼ、グルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼ、6-ホスホグルコノラクトナーゼ、6-グルコホスホネートデヒドロゲナーゼ、トランスケトラーゼ及びトランスアルドラーゼの過剰発現及びレベル又は活性の増加は、場合によりpgm、zwf、pgl、gnd、tktB又はtktA、及びtalA又はtalBの1つ又はそれ以上のプロモーター配列の改変によって達成され得る。ある特定の実施形態では、pgm、zwf、pgl、gnd、tktB又はtktA、及びtalA又はtalBの1つ又はそれ以上のための内因性プロモーターは、遺伝子の発現を増加させるための外因性プロモーターによって置換される。ある特定の実施形態では、pgm、zwf、pgl、gnd、tktB又はtktA、及びtalA又はtalBの1つ又はそれ以上のための内因性プロモーターは、微生物において異なる遺伝子の発現を制御する内因性プロモーターによって置換される。代替の実施形態では、pgm、zwf、pgl、gnd、tktB又はtktA、及びtalA又はtalBの1つ又はそれ以上のための内因性プロモーターは、外因性プロモーターによって置換される。外因性プロモーターは、ノンコグネート微生物における相同遺伝子の発現を制御し得るか、又はノンコグネート微生物における非相同タンパク質の発現を制御し得る。
特に好ましい実施形態では、pgm、zwf、pgl、gnd、tktB又はtktA、及びtalA又はtalBの1つ又はそれ以上のための内在性プロモーターは、osmYプロモーター、gapAプロモーター、nirBプロモーター及びnarプロモーターからなる群から選択されるプロモーターによって置換される。
更に、例えば、ペントースリン酸経路の関連酵素のレベル又は活性を増加させる目的のため、宿主細胞は、別の微生物種由来の異種タンパク質をコードする組換え構築物によって形質転換され得る。
組換え構築物は、内在性遺伝子の発現と同時に外因性遺伝子の発現を可能にし得る。或いは、組換え構築物は、微生物ゲノムに安定に導入され、内因性遺伝子配列が外因性遺伝子配列によって置換される。
ホスホグルコムターゼ、グルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼ、6-ホスホグルコノラクトナーゼ、6-グルコホスホネートデヒドロゲナーゼ、トランスケトラーゼ及びトランスアルドラーゼの過剰発現及びレベル又は活性の増加は、相同タンパク質をコードする外因性遺伝子による、前記タンパク質をコードする内因性遺伝子の補給又は置換によって達成され得る。ある特定の例では、内因性zwf遺伝子は、ザイモモナス・モビリス(Zymomonas mobilis)由来のzwf遺伝子によって置換される。好ましくは、微生物は大腸菌であり、大腸菌zwf遺伝子はザイモモナス・モビリス由来のzwf遺伝子によって置換される。よりさらなる例では、gnd遺伝子は、コリネバクテリウム・グルタミクム(Corynebacterium glutamicum)由来のgnd遺伝子によって置換される。好ましくは、微生物は大腸菌であり、トランスケトラーゼ及びトランスアルドラーゼをコードする遺伝子は、サッカロマイセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)由来の相同遺伝子によって補給又は置換される。好ましくは、微生物は大腸菌であり、大腸菌gnd遺伝子は、コリネバクテリウム・グルタミクム由来のgnd遺伝子によって置換される。更に、内因性gapA遺伝子(グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼをコードする)は、クロストリジウム・アセトブチリカム(Clostridium aceteobutylicum)由来のgapC遺伝子によって置換される。好ましくは、微生物は大腸菌であり、大腸菌gapA遺伝子は、クロストリジウム・アセトブチリカム(Clostridium aceteobutylicum)由来のgapC遺伝子によって置換される。
好ましくは、ホスホグルコムターゼ、グルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼ、6-ホスホグルコノラクトナーゼ、及び6-グルコホスホネートデヒドロゲナーゼをコードする1つ又はそれ以上の遺伝子の発現は、少なくとも約1.5倍、少なくとも約2倍、少なくとも約3倍、少なくとも約5倍又はそれ以上増加する。
よりさらなる実施形態では、組換え微生物は、エネルギー消費のためにスクロースを代謝するように改変される。微生物が大腸菌である実施形態では、微生物は、好ましくは遺伝的に改変され、スクロースを代謝する大腸菌の株由来のそれぞれスクロースヒドロラーゼ、及びスクロースパーミアーゼをコードする、cscA及びcscB遺伝子を発現する。更に、大腸菌微生物を遺伝的に改変し、内因性大腸菌ホスホグルコムターゼ(pgm)又はキシロースイソメラーゼ(xylA)のレベル又は活性を増加させてもよい。遺伝子改変は、内因性遺伝子の発現を増加させるためであり得る(例えば、プロモーター領域の改変によるか、又は遺伝子をコードする外因性核酸の導入及び発現による)。
さらなる実施形態では、微生物は改変され、ロイコノストック・メセントロイデス(Leuconostoc mesenteroides)由来のスクロースホスホリラーゼを発現する。
外因性遺伝子の発現を必要とする本明細書に記載される任意の実施形態では、遺伝子は、微生物での発現のためにコドン最適化され得る。
微生物が組換え大腸菌微生物である場合、微生物は、外因性核酸配列を発現することができる大腸菌の任意の株であり得る。ある特定の好ましい実施形態では、大腸菌株は、K12由来株又はW由来株のいずれかから選択される。ある特定の実施形態では、大腸菌株は、DH5α(DH5アルファ)からなる群から選択される。
さらなる態様では、本発明は水素ガスを産生するための方法であって、
- Fe-Fe依存性ヒドロゲナーゼをコードする核酸配列を含む1つ又はそれ以上の組換えポリヌクレオチドを含む宿主細胞を提供する工程であって、核酸配列が微生物において核酸配列の発現を可能にする1つ又はそれ以上のプロモーターに作動可能に連結される、工程、
- ヒドロゲナーゼの成熟及び活性化を可能にする外因性因子と宿主細胞を接触させる工程;
- そこから水素の産生を可能にするための好適な条件下で宿主細胞を培養する工程
を含む方法を提供する。
- Fe-Fe依存性ヒドロゲナーゼをコードする核酸配列を含む1つ又はそれ以上の組換えポリヌクレオチドを含む宿主細胞を提供する工程であって、核酸配列が微生物において核酸配列の発現を可能にする1つ又はそれ以上のプロモーターに作動可能に連結される、工程、
- ヒドロゲナーゼの成熟及び活性化を可能にする外因性因子と宿主細胞を接触させる工程;
- そこから水素の産生を可能にするための好適な条件下で宿主細胞を培養する工程
を含む方法を提供する。
好ましくは、1つ又はそれ以上の因子は、小分子の形態である。ヒドロゲナーゼの成熟及び活性化を可能にする因子の例は、アザジチオレート架橋を含有する[2Fe]-サブサイト模倣体である。そのような因子は、例えば、その内容が参照によって本明細書に組み込まれる、Esselbornら、(2013年) Nat Chem Biol 9 (10):607～609頁、及びBerggrenら、(2013年) Nature, 499: 66～69頁に記載される。
更に、本発明は水素ガスを産生するための方法であって、
- Fe-Fe依存性ヒドロゲナーゼ及びヒドロゲナーゼの成熟及び活性化を可能にする少なくとも1つのアセンブリタンパク質をコードする核酸配列を含む1つ又はそれ以上の組換えポリヌクレオチドを含む宿主細胞を提供する工程であって;
核酸配列が微生物において核酸配列の発現を可能にする1つ又はそれ以上のプロモーターに作動可能に連結される、及び
外因性核酸配列が、コドン最適化され、微生物においてヒドロゲナーゼの最適化された発現を提供する
工程を含む方法を提供する。
- Fe-Fe依存性ヒドロゲナーゼ及びヒドロゲナーゼの成熟及び活性化を可能にする少なくとも1つのアセンブリタンパク質をコードする核酸配列を含む1つ又はそれ以上の組換えポリヌクレオチドを含む宿主細胞を提供する工程であって;
核酸配列が微生物において核酸配列の発現を可能にする1つ又はそれ以上のプロモーターに作動可能に連結される、及び
外因性核酸配列が、コドン最適化され、微生物においてヒドロゲナーゼの最適化された発現を提供する
工程を含む方法を提供する。
別の態様では、本発明は水素ガスを産生するための方法であって、
- Fe-Fe依存性ヒドロゲナーゼ及び場合によりヒドロゲナーゼの成熟及び活性化を可能にする少なくとも1つのアセンブリタンパク質をコードする核酸配列を含む1つ又はそれ以上のポリヌクレオチドを提供する工程であって、核酸配列が核酸配列の発現を可能にするプロモーターに作動可能に連結され、核酸配列が異種宿主細胞における発現のためにコドン最適化される、工程;
- 異種宿主細胞を提供する工程;
- ポリヌクレオチドによって宿主細胞を形質転換するか又はトランスフェクトする工程;
- 細胞培養培地を提供する工程;及び
- ポリヌクレオチドの発現のために十分な条件下で細胞培養培地中で形質転換又はトランスフェクトした宿主細胞を培養する工程
を含む方法を提供する。
- Fe-Fe依存性ヒドロゲナーゼ及び場合によりヒドロゲナーゼの成熟及び活性化を可能にする少なくとも1つのアセンブリタンパク質をコードする核酸配列を含む1つ又はそれ以上のポリヌクレオチドを提供する工程であって、核酸配列が核酸配列の発現を可能にするプロモーターに作動可能に連結され、核酸配列が異種宿主細胞における発現のためにコドン最適化される、工程;
- 異種宿主細胞を提供する工程;
- ポリヌクレオチドによって宿主細胞を形質転換するか又はトランスフェクトする工程;
- 細胞培養培地を提供する工程;及び
- ポリヌクレオチドの発現のために十分な条件下で細胞培養培地中で形質転換又はトランスフェクトした宿主細胞を培養する工程
を含む方法を提供する。
よりさらなる態様では、本発明は、水素生成Fe-Feヒドロゲナーゼ、好ましくはA1 Fe-Feヒドロゲナーゼの発現を最大にするための方法であって、
- Fe-Fe依存性ヒドロゲナーゼ及びヒドロゲナーゼの成熟及び活性化を可能にする少なくとも1つのアセンブリタンパク質をコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドを提供する工程であって、核酸配列がプロモーターに作動可能に連結され、異種宿主細胞における核酸配列の発現を可能にするためにコドン最適化される、工程;
- 異種宿主細胞を提供する工程;
- ポリヌクレオチドによって宿主細胞を形質転換するか又はトランスフェクトする工程;
- 細胞培養培地を提供する工程;及び
- ポリヌクレオチドの発現のために十分な条件下で細胞培養培地中で形質転換又はトランスフェクトした宿主細胞を培養する工程
を含む方法を提供する。
- Fe-Fe依存性ヒドロゲナーゼ及びヒドロゲナーゼの成熟及び活性化を可能にする少なくとも1つのアセンブリタンパク質をコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドを提供する工程であって、核酸配列がプロモーターに作動可能に連結され、異種宿主細胞における核酸配列の発現を可能にするためにコドン最適化される、工程;
- 異種宿主細胞を提供する工程;
- ポリヌクレオチドによって宿主細胞を形質転換するか又はトランスフェクトする工程;
- 細胞培養培地を提供する工程;及び
- ポリヌクレオチドの発現のために十分な条件下で細胞培養培地中で形質転換又はトランスフェクトした宿主細胞を培養する工程
を含む方法を提供する。
好ましくは、Fe-Fe依存性ヒドロゲナーゼは、クラスA1 Fe-Feヒドロゲナーゼである。
好ましくは、Fe-Fe依存性ヒドロゲナーゼは、HydA(Hyd1)又はその機能的に等価な相同体若しくは誘導体である。
好ましい実施形態では、Fe-Fe依存性ヒドロゲナーゼは、コナミドリムシ、ボルボックス・カルテリ、ランブル鞭毛虫、エントアメーバ・ヌタリ、イリオバクター・ポリトロパス(Ilyobacter polytrophus)、膣トリコモナス、メガスファエラ・ミクロヌシフォルミス、ベイロネラ・パルブラ、ベイロネラ・アティピカ、ペプトクロストリジウム・ビファーメンタンス、クロストリジウム・アルブスティ、シュードフラボニフラクター・カピローサス、ラクノクロストリジウム・シトロニエ、ラクノクロストリジウム・クロストリジオフォルメ、ペロシナス・フェルメンタン、サーモデスルホビブリオ・アイランディカス、ステレラ・ワズワーテンシス、クロストリジウム・ベウジェリンキ、フソバクテリウム・ウルセランス、クロストリジウム・チロブリチカム、クロストリジウム・パーフリンジェンス、セトバクテリウム・ソメラエ、クロストリジウム・ベイジェリンキ、クロストリジウム・コリカニス、クロストリジウム・インテスティナーレ、クロストリジウム・ショウベイ、セルロモナス・フィミ、ルミニクロストリジウム・サーモセラム、ネグレリア・グルベリ、クロレラ・バリアビリス、フェルビバクテリウム・ノドサム、サーモトガ・ペトロフィラ、サーモトガ・レティンガエ、チオミクロスピラ・ペロフィラ、Caldatribacterium californiense、フソバクテリウム・ネクロフォーラム、Omnitrophus fodinae、シトロフォサームス・リポカリダス、アモニフェックス・デゲンシイ、デスルホトマキュラム・ハイドロサルマレ、フソバクテリウム・モルティフェラム、デスルホトマクルム・クズネツォビイ、及びラクノクロストリジウム・フィトフェルメンタンス、又はその機能的に等価な相同体若しくは誘導体からなる群から選択されるHydAタンパク質のアミノ酸配列を含む。好ましくは、HydAタンパク質は:コナミドリムシ、ボルボックス・カルテリ、ランブル鞭毛虫、エントアメーバ・ヌタリ、イリオバクター・ポリトロパス(Ilyobacter polytrophus)、膣トリコモナス、メガスファエラ・ミクロヌシフォルミス、ベイロネラ・パルブラ、ベイロネラ・アティピカ、及びペプトクロストリジウム・ビファーメンタンス、並びにこれらの機能的に等価な相同体からなる群から選択
される。より好ましくは、HydAタンパク質は、コナミドリムシ又はその機能的に等価な相同体若しくは誘導体由来である。
される。より好ましくは、HydAタンパク質は、コナミドリムシ又はその機能的に等価な相同体若しくは誘導体由来である。
好ましくは、少なくとも1つのアセンブリタンパク質は、HydEF及び/又はHydGからなる群からのタンパク質を含む。より好ましくは、外因性核酸配列は、アセンブリタンパク質HydEF及びHydGの両方をコードする配列を含む。特に好ましい実施形態では、HydEF及びHydGタンパク質は、コナミドリムシ、又はその機能的に等価な相同体若しくは誘導体由来のHydEF及びHydGタンパク質のアミノ酸配列を含む。
したがって、好ましい実施形態では、本発明は水素ガスを産生するための方法であって、
- コナミドリムシポリペプチドHydEF、HydG及びHydAをコードする核酸配列を含む1つ又はそれ以上の組換えポリヌクレオチドを含む宿主細胞を提供する工程であって、
核酸配列が、核酸配列の発現を可能にするプロモーターに作動可能に連結され、
核酸配列が、異種宿主における発現のためにコドン最適化される
工程、及び
- ポリヌクレオチドの発現をもたらす条件下で好適な培養培地中で前記宿主細胞を培養する工程
を含む方法を提供する。
- コナミドリムシポリペプチドHydEF、HydG及びHydAをコードする核酸配列を含む1つ又はそれ以上の組換えポリヌクレオチドを含む宿主細胞を提供する工程であって、
核酸配列が、核酸配列の発現を可能にするプロモーターに作動可能に連結され、
核酸配列が、異種宿主における発現のためにコドン最適化される
工程、及び
- ポリヌクレオチドの発現をもたらす条件下で好適な培養培地中で前記宿主細胞を培養する工程
を含む方法を提供する。
別の態様では、本発明は水素ガスを産生するための方法であって、
- コナミドリムシポリペプチドHydEF、HydG及びHydAをコードする核酸配列を含む1つ又はそれ以上のポリヌクレオチドを提供する工程であって、核酸配列が核酸配列の発現を可能にするプロモーターに作動可能に連結され、核酸配列が異種宿主細胞における発現のためにコドン最適化される工程;
- 宿主細胞を提供する工程;
- ポリヌクレオチドによって宿主細胞を形質転換するか又はトランスフェクトする工程;
- 細胞培養培地を提供する工程;及び
- ポリヌクレオチドの発現のために十分な条件下で細胞培養培地中で形質転換又はトランスフェクトした宿主細胞を培養する工程
を含む方法を提供する。
- コナミドリムシポリペプチドHydEF、HydG及びHydAをコードする核酸配列を含む1つ又はそれ以上のポリヌクレオチドを提供する工程であって、核酸配列が核酸配列の発現を可能にするプロモーターに作動可能に連結され、核酸配列が異種宿主細胞における発現のためにコドン最適化される工程;
- 宿主細胞を提供する工程;
- ポリヌクレオチドによって宿主細胞を形質転換するか又はトランスフェクトする工程;
- 細胞培養培地を提供する工程;及び
- ポリヌクレオチドの発現のために十分な条件下で細胞培養培地中で形質転換又はトランスフェクトした宿主細胞を培養する工程
を含む方法を提供する。
よりさらなる態様では、本発明は異種宿主細胞においてコナミドリムシ由来の水素生成Fe-Feヒドロゲナーゼの発現を最大にするための方法であって、
- コナミドリムシポリペプチドHydEF、HydG及びHydAをコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドを提供する工程であって、核酸配列がプロモーターに作動可能に連結され、異種宿主細胞において核酸配列の発現を可能にするためにコドン最適化される工程;
- 異種宿主細胞を提供する工程;
- ポリヌクレオチドによって宿主細胞を形質転換するか又はトランスフェクトする工程;
- 細胞培養培地を提供する工程;及び
- ポリヌクレオチドの発現のために十分な条件下で細胞培養培地中で形質転換又はトランスフェクトした宿主細胞を培養する工程
を含む方法を提供する。
- コナミドリムシポリペプチドHydEF、HydG及びHydAをコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドを提供する工程であって、核酸配列がプロモーターに作動可能に連結され、異種宿主細胞において核酸配列の発現を可能にするためにコドン最適化される工程;
- 異種宿主細胞を提供する工程;
- ポリヌクレオチドによって宿主細胞を形質転換するか又はトランスフェクトする工程;
- 細胞培養培地を提供する工程;及び
- ポリヌクレオチドの発現のために十分な条件下で細胞培養培地中で形質転換又はトランスフェクトした宿主細胞を培養する工程
を含む方法を提供する。
好ましくは、異種宿主細胞は大腸菌細胞であり、核酸配列は大腸菌における発現のためにコドン最適化される。好ましくは、ポリヌクレオチドのプロモーターは、大腸菌におけるポリヌクレオチドの発現のためである。
任意の上記の態様の好ましい実施形態では、組換えポリヌクレオチドは、フェレドキシンNADP還元酵素及びフェレドキシン、又はそれらの機能的に等価な相同体若しくは誘導体をコードする核酸配列を含む。
好ましくは、FNRの供給源は、フェレドキシンを還元する還元剤としてNADPHを利用するフェレドキシン還元酵素を含有するフラビンである。より好ましくは、フェレドキシンタンパク質は、コナミドリムシ由来であり、FNRは、コナミドリムシ由来のフェレドキシン(Ferrodoxin)を還元することができる任意のFNRである。特に好ましい実施形態では、FNR及びフェレドキシン(Ferrodoxin)タンパク質は、コナミドリムシ又はその機能的に等価な相同体若しくは誘導体由来のアミノ酸配列を含む。
宿主細胞は、組換えタンパク質の発現の使用に好適な任意の微生物であり得る。ある特定の実施形態では、宿主細胞は:大腸菌、枯草菌、ラクトバチルス属、又はストレプトコッカス属からなる群から選択される。好ましい実施形態では、微生物は、大腸菌(E.coli)の株である。
ある特定の実施形態では、宿主細胞は、部分的に又は完全に不活性化される及び/又は生育不能である。
本明細書で使用される場合、HydEF、HydG、HydA、フェレドキシンNADP還元酵素及びフェレドキシンをコードする核酸配列の組合せは、水素産生遺伝子クラスター(HPGC)と呼ばれてもよい。
任意の実施形態では、上記の方法は、遺伝的に改変した宿主細胞を利用する工程、又は微生物若しくは宿主細胞を改変する工程、又は微生物若しくは宿主細胞を薬剤と接触させ、ホスホフルクトキナーゼ、ピルビン酸キナーゼ、グリセリン酸ムターゼ、6-ホスホグルコン酸デヒドラターゼ、及び2-ケト-3-デオキシ-6-ホスホグルコン酸アルドラーゼからなる群から選択される1つ又はそれ以上の内因性宿主細胞タンパク質の活性又はレベルを減少又は阻害する工程を更に含み得る。
ホスホフルクトキナーゼ、ピルビン酸キナーゼ、グリセリン酸ムターゼ、6-ホスホグルコン酸デヒドラターゼ、及び2-ケト-3-デオキシ-6-ホスホグルコン酸アルドラーゼの1つ又はそれ以上の活性又はレベルを減少又は阻害する薬剤は: 1つ又はそれ以上のタンパク質の活性又はレベルを減少することができる小分子、ペプチド、抗体、干渉RNA、例えばアンチセンスRNA、microRNA、shRNA、siRNAから選択され得る。
好ましい実施形態では、方法は、微生物又は宿主細胞を遺伝的に改変する薬剤と微生物又は宿主細胞を接触させる工程又は関係させる工程を含み、それにより1つ又はそれ以上のpfkA、pps、gpmA/gpmM、gapA、edd及びeda(それぞれホスホフルクトキナーゼ、ピルビン酸キナーゼ、グリセリン酸ムターゼ、グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ、6-ホスホグルコン酸デヒドラターゼ、及び2-ケト-3-デオキシ-6-ホスホグルコン酸アルドラーゼをコードする)のレベル又は活性が部分的又は完全に減少する。例えば、薬剤は、遺伝子の一部又は全てを欠失するためのCRISPR-Cas9又は他のゲノム編集システム(例えばラムダレッドリコンビナーゼ)と組み合わせた使用のためのgRNA分子を含み得る。
よりさらなる実施形態では、方法は、微生物又は宿主細胞を遺伝的に改変するか又は改変しておき、ペントースリン酸経路の1つ又はそれ以上のタンパク質のレベル又は活性を増加させる工程を更に含む。好ましくは、1つ又はそれ以上のタンパク質は:ホスホグルコムターゼ、グルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼ、6-ホスホグルコノラクトナーゼ、6-ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ、トランスケトラーゼ及びトランスアルドラーゼからなる群から選択される。これらの遺伝子は、それぞれ遺伝子pgm、zwf、pgl、gnd、tktB又はtktA、及びtalA又はtalBによってコードされる。特に好ましい実施形態では、タンパク質は、グルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼである。
さらなる実施形態では、内因性NADキナーゼ(NADK、yfjBによってコードされる)及び/又は可溶性ピリジンヌクレオチドトランスヒドロゲナーゼ(UdhA、sthAによってコードされる)のレベル又は活性が増加する。
好ましくは、方法は、微生物又は宿主細胞を改変し、ペントースリン酸経路の1つ又はそれ以上のタンパク質をコードする遺伝子を過剰発現するための核酸配列を含ませる工程を含み、それにより、微生物によって産生されるタンパク質のレベルが同じ株の野生型微生物と比較して増加する。代替の実施形態では、タンパク質のレベル又は活性の増加は、タンパク質の活性の増加をもたらす1つ又はそれ以上の点変異の導入によって達成される。
好ましい実施形態では、グルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子、zwfが過剰発現される。さらなる実施形態では、6-ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子、gndが過剰発現される。他の実施形態では、6-ホスホグルコノラクトナーゼをコードする遺伝子、pglが過剰発現される。他の実施形態では、グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子、gapAが過剰発現される。過剰発現は、場合により、pgm、zwf、pgl、gnd、tktB又はtktA、及びtalA又はtalBの1つ又はそれ以上のプロモーター配列の改変によって達成され得る。
ある特定の実施形態では、pgm、zwf、pgl、gnd、tktB又はtktA、及びtalA又はtalBの1つ又はそれ以上のための内因性プロモーターは、遺伝子の発現を増加させるための外因性プロモーターによって置換される。ある特定の実施形態では、pgm、zwf、pgl、gnd、tktB又はtktA、及びtalA又はtalBの1つ又はそれ以上のための内因性プロモーターは、微生物において異なる遺伝子の発現を制御する内因性プロモーターによって置換される。代替の実施形態では、pgm、zwf、pgl、gnd、tktB又はtktA、及びtalA又はtalBの1つ又はそれ以上のための内因性プロモーターは、外因性プロモーターによって置換される。外因性プロモーターは、ノンコグネート微生物における相同遺伝子の発現を制御し得るか、又はノンコグネート微生物における非相同タンパク質の発現を制御し得る。
特に好ましい実施形態では、pgm、zwf、pgl、gnd、tktB又はtktA、及びtalA又はtalBの1つ又はそれ以上のための内在性プロモーターは、osmYプロモーター、gapAプロモーター、nirBプロモーター及びnarプロモーターからなる群から選択されるプロモーターによって置換される。
ホスホグルコムターゼ、グルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼ、6-ホスホグルコノラクトナーゼ、6-グルコホスホネートデヒドロゲナーゼ、トランスケトラーゼ及びトランスアルドラーゼの過剰発現及びレベル又は活性の増加は、相同タンパク質をコードする外因性遺伝子による、前記タンパク質をコードする内因性遺伝子の置換によって達成され得る。
好ましくは、ホスホグルコムターゼ、グルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼ、6-ホスホグルコノラクトナーゼ、及び6-グルコホスホネートデヒドロゲナーゼをコードする1つ又はそれ以上の遺伝子の発現は、少なくとも約1.5倍、少なくとも約2倍、少なくとも約3倍、少なくとも約5倍又はそれ以上増加する。
よりさらなる実施形態では、組換え微生物又は宿主細胞は、エネルギー消費のためにスクロースを代謝するように改変される。微生物が大腸菌である実施形態では、微生物は、好ましくは遺伝的に改変され、スクロースを代謝する大腸菌の株由来のそれぞれスクロースヒドロラーゼ、及びスクロースパーミアーゼをコードする、cscA及びcscB遺伝子を発現する。更に、大腸菌微生物を遺伝的に改変し、内因性大腸菌ホスホグルコムターゼ(pgm)又はキシロースイソメラーゼ(xylA)のレベル又は活性を増加させてもよい。遺伝子改変は、内因性遺伝子の発現を増加させるためであり得る(例えば、プロモーター領域の改変によるか、又は遺伝子をコードする外因性核酸の導入及び発現による)。
さらなる実施形態では、微生物は改変され、ロイコノストック・メセントロイデス由来のスクロースホスホリラーゼを発現する。
宿主細胞が組換え大腸菌である実施形態では、大腸菌微生物は、外因性核酸配列を発現することができる大腸菌の任意の株であり得る。ある特定の好ましい実施形態では、大腸菌株は、K12由来株又はW由来株のいずれかから選択される。ある特定の実施形態では、大腸菌株は、DH5α(DH5アルファ)からなる群から選択される。
さらなる実施形態では、本明細書に記載される方法は、本明細書に記載される水素産生遺伝子クラスター(HPGC)の発現を可能にするために最適化される条件下で微生物又は宿主細胞を培養する工程、及びそれにより微生物による水素の産生を増加させる工程を更に含む。一例では、方法は、嫌気性条件下で宿主細胞を培養する工程を含む。当業者は、還元剤として中性ガスの添加を含む、嫌気性条件下で細胞を培養する方法に精通しているであろう。
更に、培養条件は、第二鉄(鉄III)又は第一鉄(鉄II)の培養培地への添加を含み得る。好ましい実施形態では、二価鉄(FeII)は、少なくとも約20μM又はそれ以上の濃度で、好ましくは約50μM以下の濃度で培養培地に添加される。
培養条件は、好ましくは37℃以下、より好ましくは約35℃未満、約32℃未満、最も好ましくは約30℃未満で実施される。
本発明は、分子水素を生成するシステムでの使用のための様々な核酸構築物又はポリヌクレオチドも提供する。
一実施形態では、本発明は、ポリペプチドHydEF、HydG及びHydAをコードするヌクレオチド配列を含む核酸構築物又はポリヌクレオチドを提供し、核酸配列は、核酸配列の発現を可能にするプロモーターに作動可能に連結され、核酸配列は、異種宿主における発現のためにコドン最適化される。好ましくは、核酸配列は、大腸菌での発現のためにコドン最適化される。好ましくは、HydEF及びHydGポリペプチドは、コナミドリムシ由来である。
好ましい実施形態では、本発明の核酸構築物においてHydAタンパク質をコードする核酸は:コナミドリムシ、ボルボックス・カルテリ、ランブル鞭毛虫、エントアメーバ・ヌタリ、イリオバクター・ポリトロパス(Ilyobacter polytrophus)、膣トリコモナス、メガスファエラ・ミクロヌシフォルミス、ベイロネラ・パルブラ、ベイロネラ・アティピカ、ペプトクロストリジウム・ビファーメンタンス、クロストリジウム・アルブスティ、シュードフラボニフラクター・カピローサス、ラクノクロストリジウム・シトロニエ、ラクノクロストリジウム・クロストリジオフォルメ、ペロシナス・フェルメンタン、サーモデスルホビブリオ・アイランディカス、ステレラ・ワズワーテンシス、クロストリジウム・ベウジェリンキ、フソバクテリウム・ウルセランス、クロストリジウム・チロブリチカム、クロストリジウム・パーフリンジェンス、セトバクテリウム・ソメラエ、クロストリジウム・ベイジェリンキ、クロストリジウム・コリカニス、クロストリジウム・インテスティナーレ、クロストリジウム・ショウベイ、セルロモナス・フィミ、ルミニクロストリジウム・サーモセラム、ネグレリア・グルベリ、クロレラ・バリアビリス、フェルビバクテリウム・ノドサム、サーモトガ・ペトロフィラ、サーモトガ・レティンガエ、チオミクロスピラ・ペロフィラ、Caldatribacterium californiense、フソバクテリウム・ネクロフォーラム、Omnitrophus fodinae、シトロフォサームス・リポカリダス、アモニフェックス・デゲンシイ、デスルホトマキュラム・ハイドロサルマレ、フソバクテリウム・モルティフェラム、デスルホトマクルム・クズネツォビイ、及びラクノクロストリジウム・フィトフェルメンタンス又はその機能的に等価な相同体又は誘導体からなる群から選択される生物由来のHydAタンパク質のアミノ酸配列をコードする。好ましくは、HydAタンパク質は:コナミドリムシ、ボルボックス・カルテリ、ランブル鞭毛虫、エントアメーバ・ヌタリ、イリオバクター・ポリトロパス(Ilyobacter polytrophus)、膣トリコモナス、メガスファエラ・ミクロヌシフォルミス、ベイロネラ・パルブラ、ベイロネラ・アティピカ、及びペプトクロストリジウム・ビファーメンタンス、並びにこれら
の機能的に等価な相同体からなる群から選択される。より好ましくは、HydAタンパク質は、コナミドリムシ又はその機能的に等価な相同体若しくは誘導体由来である。
の機能的に等価な相同体からなる群から選択される。より好ましくは、HydAタンパク質は、コナミドリムシ又はその機能的に等価な相同体若しくは誘導体由来である。
本発明は、水素産生遺伝子クラスター(HPGC)をコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドも提供し、HPGCは、HydEF、HydG、HydA、フェレドキシンNADP還元酵素及びフェレドキシンをコードする遺伝子を含む。好ましくは、核酸は、フェレドキシンを還元する還元剤としてNADPHを利用するフェレドキシン還元酵素を含有するフラビンであるFNRをコードする。より好ましくは、核酸は、コナミドリムシ由来のフェレドキシンタンパク質をコードし、コナミドリムシ由来のフェレドキシン(Ferrodoxin)を還元することができる任意のFNRであるFNRをコードする。特に好ましい実施形態では、ポリヌクレオチドは、コナミドリムシ又はその機能的に等価な相同体若しくは誘導体由来のFNR及びフェレドキシン(Ferrodoxin)タンパク質をコードする核酸を含む。
特に好ましい実施形態では、HPGCを含むポリヌクレオチドの配列は、配列番号10又は30～40に記載されるヌクレオチド配列を含む、からなる、又はから基本的になる。
本発明は、水素を産生するシステムで使用される場合、又はその使用のための、本明細書に記載される微生物も提供する。したがって、本発明は、水素を産生するシステムであって、
- 本明細書に記載される組換え微生物の培養又は集団;
- 微生物による水素の産生を可能にする1つ又はそれ以上のタンパク質の発現を誘導する組換え微生物による使用のための供給原料
を含むシステムを提供する。
- 本明細書に記載される組換え微生物の培養又は集団;
- 微生物による水素の産生を可能にする1つ又はそれ以上のタンパク質の発現を誘導する組換え微生物による使用のための供給原料
を含むシステムを提供する。
場合により、システムは、組換え微生物によって産生される水素を保存又は移行する手段も含む。
好ましくは、供給原料は、炭水化物ベースの供給原料、例えばグルコース又はスクロース又は任意の炭水化物供給源である。
本発明は、水素を産生するためのバイオリアクターであって、本明細書に記載される水素産生システムであって、本発明の水素生成微生物の懸濁液を含むシステム、組換え微生物による使用のための炭素の供給源を提供するための供給原料、及び前記懸濁液からの水素ガスを分離又は抽出する手段を含む容器を含むバイオリアクターも提供する。
本発明は、電気を産生するシステムで使用される場合、又はその使用のための、本明細書に記載される微生物も提供する。したがって、本発明は、水素から電気を産生するためのシステム又は装置であって、
- 本明細書に記載される組換え微生物の培養又は集団;
- 微生物による水素の産生を可能にする1つ又はそれ以上のタンパク質の発現を誘導する組換え微生物による使用のための供給原料
- 水素燃料電池
- 組換え微生物によって産生された水素を水素燃料電池に移行するための手段
を含むシステム又は装置を提供する。
- 本明細書に記載される組換え微生物の培養又は集団;
- 微生物による水素の産生を可能にする1つ又はそれ以上のタンパク質の発現を誘導する組換え微生物による使用のための供給原料
- 水素燃料電池
- 組換え微生物によって産生された水素を水素燃料電池に移行するための手段
を含むシステム又は装置を提供する。
本発明は、電気を産生するための方法であって、本明細書に記載される組換え微生物を含むシステム又は装置を操作する工程、又は本明細書に記載される方法に従って産生した水素を利用する工程を含む方法も提供する。
本発明は、水素から電気を産生するためのシステム又は装置における本明細書に記載される組換え微生物の使用も提供する。
本明細書で使用される場合、文脈が他に必要とする場合を除き、用語「含む(comprising)」及び、「含む(comprising)」、「含む(comprises)」、及び「含む(comprised)」のような用語のバリエーションは、さらなる添加物、成分、整数又は工程を除外することを意図しない。
本発明のさらなる態様及び前述の段落で記載される態様のさらなる実施形態は、実施例により、及び添付の図面を参照して与えられる、以下の説明から明らかになるであろう。
本明細書に開示及び規定した本発明は、文章又は図面から述べられ又は証明された個々の特徴の2つ又はそれ以上の全ての代替の組合せに及ぶことが理解されるであろう。これらの異なる組合せの全ては、本発明の様々な代替の態様を構成する。
ここで、本発明のある特定の実施形態を詳細に参照する。本発明は実施形態と組み合わせて記載されるが、本発明をそれらの実施形態に制限しないことを意図することが理解されるであろう。反対に、本発明は、全ての代替物、改変、及び均等物をカバーすることが意図され、それらは請求項によって規定されるように本発明の範囲内に含まれ得る。
当業者は、本明細書に記載されるものと類似の又は等価な多くの方法及び材料を認識するであろう。本発明は、記載される方法及び材料に決して制限されない。本明細書に開示及び規定した本発明は、文章又は図面から述べられ又は証明された個々の特徴の2つ又はそれ以上の全ての代替の組合せに及ぶことが理解されるであろう。これらの異なる組合せの全ては、本発明の様々な代替の態様を構成する。
本明細書で参照する全ての特許及び論文は、その全体が参照によって組み込まれる。
本明細書を解釈する目的のため、単数形で使用される用語は複数も含み、逆もまたそうである。
微生物は、通常、ヒドロゲナーゼとして公知のクラスの酵素を使用して分子水素を合成することができる。これらの酵素の水素を生成する能力を使用するため、研究者らは、異種発現系における様々な微生物及び藻類からヒドロゲナーゼを発現する努力をしてきた。典型的には、このアプローチは、藻類及び「好極限性微生物」由来の様々なヒドロゲナーゼをスクリーニングする工程を含む。しかしながら、この型の手法を使用して十分な量の水素を生成するための努力は、これらのヒドロゲナーゼ及びそれらのコグネート変異タンパク質の不安定性、並びに異種生物において発現された場合、Fe-Feヒドロゲナーゼ酵素複合体を生じることによって妨げられた。
そのような制限に対処するため、当技術分野の他の研究者らは、異種生物においてヒドロゲナーゼを発現する場合、ノンコグネート生物由来の成熟タンパク質を共発現する努力をしてきた。しかしながら、この手法は、通常、商業システムでの使用のための十分なレベルの水素を得ることの困難を克服できなかった。
他の研究者らは、発現されるヒドロゲナーゼの型に注目して考え、例えば、Fe-FeヒドロゲナーゼよりもNi-Feヒドロゲナーゼを発現しようとした。そのようなシステムは、in vitroで機能的であり、NADPH依存性Ni-Feヒドロゲナーゼ及びペントースリン酸経路からの市販の酵素の混合物のみを利用する水素の産生に十分であることが実証された。しかしながら、そのようなシステムは、さらなる酵素を提供するコストにより商業的に実行可能ではないことが分かっている。更に、水素産生の速度が、商業生産のためには遅すぎる。
本発明者らは、異種宿主細胞において発現された藻類遺伝子からの分子水素の産生を最大にする新しい手法を同定した。本発明者らによって採用されたアプローチは、様々な微生物からのFe-Feヒドロゲナーゼ複合体の安定な産生を可能にする。更に、本発明者らは、それらの手法が経時的な水素産生の速度の増加及び収率の増加を提供すると考える(インプット当たりの産生)。本発明者らの手法は、生物学的水素の生成のための先の最適化されていない手法を超える大きな進展を示す。
水素産生遺伝子クラスター
本発明は、本明細書に記載されるように、その微生物において水素を産生するために必要な分子装置の成分をコードする様々な核酸配列を有する微生物を提供する工程を含む。更に、本発明は、それらの核酸配列を含む遺伝的に改変した微生物を提供する。
本発明は、本明細書に記載されるように、その微生物において水素を産生するために必要な分子装置の成分をコードする様々な核酸配列を有する微生物を提供する工程を含む。更に、本発明は、それらの核酸配列を含む遺伝的に改変した微生物を提供する。
特に、本発明は、HydEF、HydG及びHydAタンパク質をコードする核酸配列(組換えポリヌクレオチドを含む)を有する宿主細胞の提供を含む。好ましい実施形態では、フェレドキシンNADP還元酵素(FNP)及びフェレドキシン(petF)をコードする核酸を有する宿主細胞もまた提供される。水素が、本明細書に記載されるように、微生物によって産生され、微生物が改変され、HydAをコードする核酸配列を発現し、微生物が内因性フェロドキシン(ferrodoxin)を含むことが理解されるであろう。
更に、ヒドロゲナーゼの成熟は、アザジチオレート架橋を含有する[2Fe]-サブサイト模倣体のような小分子を使用して達成され得る。そのような因子は、例えば、その内容が参照によって本明細書に組み込まれる、Esselbornら、(2013年) Nat Chem Biol 9 (10):607～609頁、及びBerggrenら、(2013年) Nature, 499: 66～69頁に記載される。
しかしながら、好ましい実施形態では、微生物は好ましく改変され、本明細書に記載されるHPGCの成分を発現する。
本明細書で使用される場合、水素産生遺伝子クラスター(HPGC)は、好ましくは、HydA、HydE、HydG、フェレドキシンNADP還元酵素及びフェレドキシンをコードする核酸配列を含み、HydAはFe-Feヒドロゲナーゼ(好ましくはA1サブクラス)を指し、HydEF及びHydGは、活性なFeFe-ヒドロゲナーゼの形成に必要とされるタンパク質の成熟及びアセンブリ複合体を指す。
本明細書で使用される場合、HydAは、任意のFe-Feヒドロゲナーゼタンパク質HydAを指し、鉄ヒドロゲナーゼ、又は鉄ヒドロゲナーゼHydA1若しくはHyd1とも呼ばれる。このタンパク質は、遺伝子hyd1によってコードされる。
当業者は、異なるヒドロゲナーゼの分類のための方法に通じており、Fe-FeヒドロゲナーゼのNi-Feヒドロゲナーゼと異なる場合、所与のヒドロゲナーゼがFe-Feヒドロゲナーゼ(A1クラスを含む)であるかどうか決定するための方法を含む。そのような方法は、例えば、Sondergaardら、(2016年) Scientific Reports, 6:34212に記載される。
HydAタンパク質は:コナミドリムシ、ボルボックス・カルテリ、ランブル鞭毛虫、エントアメーバ・ヌタリ、イリオバクター・ポリトロパス(Ilyobacter polytrophus)、膣トリコモナス、メガスファエラ・ミクロヌシフォルミス、ベイロネラ・パルブラ、ベイロネラ・アティピカ、ペプトクロストリジウム・ビファーメンタンス、クロストリジウム・アルブスティ、シュードフラボニフラクター・カピローサス、ラクノクロストリジウム・シトロニエ、ラクノクロストリジウム・クロストリジオフォルメ、ペロシナス・フェルメンタン、サーモデスルホビブリオ・アイランディカス、ステレラ・ワズワーテンシス、クロストリジウム・ベウジェリンキ、フソバクテリウム・ウルセランス、クロストリジウム・チロブリチカム、クロストリジウム・パーフリンジェンス、セトバクテリウム・ソメラエ、クロストリジウム・ベイジェリンキ、クロストリジウム・コリカニス、クロストリジウム・インテスティナーレ、クロストリジウム・ショウベイ、セルロモナス・フィミ、ルミニクロストリジウム・サーモセラム、ネグレリア・グルベリ、クロレラ・バリアビリス、フェルビバクテリウム・ノドサム、サーモトガ・ペトロフィラ、サーモトガ・レティンガエ、チオミクロスピラ・ペロフィラ、Caldatribacterium californiense、フソバクテリウム・ネクロフォーラム、Omnitrophus fodinae、シトロフォサームス・リポカリダス、アモニフェックス・デゲンシイ、デスルホトマキュラム・ハイドロサルマレ、フソバクテリウム・モルティフェラム、デスルホトマクルム・クズネツォビイ、及びラクノクロストリジウム・フィトフェルメンタンス又はその機能的に等価な相同体又は誘導体からなる群から選択される微生物由来のHydAタンパク質であり得る。
好ましくは、HydAタンパク質は:コナミドリムシ、ボルボックス・カルテリ、ランブル鞭毛虫、エントアメーバ・ヌタリ、イリオバクター・ポリトロパス(Ilyobacter polytrophus)、膣トリコモナス、メガスファエラ・ミクロヌシフォルミス、ベイロネラ・パルブラ、ベイロネラ・アティピカ、及びペプトクロストリジウム・ビファーメンタンス、及びこれらの機能的に等価な相同体からなる群から選択される。より好ましくは、HydAタンパク質は、コナミドリムシ又はその機能的に等価な相同体又は誘導体由来である。
HydAのコナミドリムシタンパク質配列の例示的な配列は、UniProt受託番号Q9FYU1で提供され、前記タンパク質をコードする例示的な核酸配列は、受託番号AJ308413、CAC83731.1 (EBI)及びXP_001693376.1で見出すことができる。
HydAをコードする例示的な核酸配列は、配列番号6で提供される。hydAの発現を可能にする例示的なプロモーターは、配列番号5で提供される。
ボルボックス・カルテリ、ランブル鞭毛虫、エントアメーバ・ヌタリ、イリオバクター・ポリトロパス(Ilyobacter polytrophus)、膣トリコモナス、メガスファエラ・ミクロヌシフォルミス、ベイロネラ・パルブラ、ベイロネラ・アティピカ、及びペプトクロストリジウム・ビファーメンタンス由来のHydAの配列情報を提供する例示的な受託番号は、それぞれ、XP002956049、XP001709915、XP008860420、WP013388849 (及びXP002948483)、XP001330775、WP006942403、WP004697562、WP005375825及びWP021432477を含む。
ボルボックス・カルテリ、ランブル鞭毛虫、エントアメーバ・ヌタリ、イリオバクター・ポリトロパス(Ilyobacter polytrophus)、膣トリコモナス、メガスファエラ・ミクロヌシフォルミス、ベイロネラ・パルブラ、ベイロネラ・アティピカ、ペプトクロストリジウム・ビファーメンタンス由来のHydAをコードする例示的なコドン最適化した核酸配列(制限部位を含む)は、配列番号18～27で提供される。
本明細書で使用される場合、HydEFは、好ましくは、コナミドリムシFe-ヒドロゲナーゼアセンブリタンパク質HydEFを指し、鉄ヒドロゲナーゼアセンブリタンパク質HydEFとも呼ばれる。このタンパク質は、遺伝子hydEFによってコードされる。HydEFのコナミドリムシタンパク質配列の例示的な配列は、UniProt受託番号Q6PSL5で提供され、前記タンパク質をコードする例示的な核酸配列は、受託番号DS496119、EDP05198.1 (EBI)及びXP_001691465.1に見出すことができる。
HydEFをコードする例示的な核酸配列は、配列番号2で提供される。hydEFの発現を可能にする例示的なプロモーターは、配列番号1で提供される。
本明細書で使用される場合、HydGは、コナミドリムシFe-ヒドロゲナーゼアセンブリタンパク質HydGを指し、鉄ヒドロゲナーゼアセンブリタンパク質HydGとも呼ばれる。このタンパク質は、HydGによってコードされる。HydGのコナミドリムシタンパク質配列の例示的な配列は、UniProt受託番号Q6PSL4で提供され、前記タンパク質をコードする例示的な核酸配列は、受託番号DS496119、EDP05052.1 (EBI)及びXP_001691319.1に見出すことができる。
HydGをコードする例示的な核酸配列は、配列番号4で提供される。hydGの発現を可能にする例示的なプロモーターは、配列番号3で提供される。
本明細書で使用される場合、フェロドキシンは、petF遺伝子によってコードされたコナミドリムシフェレドキシンタンパク質を指す。フェレドキシンのコナミドリムシタンパク質配列の例示的な配列は、UniProt受託番号A8IV40で提供され、前記タンパク質をコードする例示的な核酸配列は、受託番号DS496124、EDP03827.1(EBI)及びXP_001692808.1に見出すことができる。
フェレドキシンをコードする例示的な核酸配列は、配列番号8で提供される。petFの発現を可能にする例示的なプロモーターは、配列番号7で提供される。
本明細書で使用される場合、コナミドリムシフェレドキシンNADP還元酵素(FNR)は、EC:1.18.1.2を指す。タンパク質は、遺伝子petH又はfnr1によってコードされる。FNRのコナミドリムシタンパク質の例示的な配列は、UniProt受託番号A8J6Y8及びP53991で提供され、前記タンパク質をコードする例示的な核酸配列は、受託番号DS496140、EDP00292.1(EBI)及びXP_001697352.1に見出すことができる。
FNRをコードする例示的な核酸配列は、配列番号9で提供される。
好ましい実施形態では、HydEF、HydG、HydA、フェレドキシン及びFNRタンパク質をコードする核酸配列は、単一のポリヌクレオチド構築物で提供される。一例では、ポリヌクレオチドは、配列番号10に記載される核酸配列を有する。
ペントースリン酸経路へのグルコースの酸化の方向づけ直し
本発明者らは、解糖系からのペントースリン酸経路の隔離が、炭水化物から水素への最適な変換を可能にすることを見出した。したがって、好ましい実施形態では、本発明の微生物は更に改変され、ホスホフルクトキナーゼ、ピルビン酸キナーゼ、グリセリン酸ムターゼ、6-ホスホグルコン酸デヒドラターゼ及び2-ケト-3-デオキシ-6-ホスホグルコン酸アルドラーゼをコードする1つ又はそれ以上の内因性遺伝子の発現を減少又は欠失する。これらのタンパク質は、それぞれ遺伝子、pfkA、pps、gpmA、gpmM、gapA、edd及びedaによってコードされる。
本発明者らは、解糖系からのペントースリン酸経路の隔離が、炭水化物から水素への最適な変換を可能にすることを見出した。したがって、好ましい実施形態では、本発明の微生物は更に改変され、ホスホフルクトキナーゼ、ピルビン酸キナーゼ、グリセリン酸ムターゼ、6-ホスホグルコン酸デヒドラターゼ及び2-ケト-3-デオキシ-6-ホスホグルコン酸アルドラーゼをコードする1つ又はそれ以上の内因性遺伝子の発現を減少又は欠失する。これらのタンパク質は、それぞれ遺伝子、pfkA、pps、gpmA、gpmM、gapA、edd及びedaによってコードされる。
更に、本発明の方法は、タンパク質ホスホフルクトキナーゼ、ピルビン酸キナーゼ、グリセリン酸ムターゼ、6-ホスホグルコン酸デヒドラターゼ及び2-ケト-3-デオキシ-6-ホスホグルコン酸アルドラーゼの1つ又はそれ以上の活性又はレベルを阻害する1つ又はそれ以上の薬剤と微生物を接触させる工程を含む。
本明細書で使用される場合、PFKとしても公知のホスホフルクトキナーゼ、(E.C.2.7.1, 11及びE.C.2.7.1.105)は、解糖のフルクトース6-リン酸をリン酸化するキナーゼ酵素である。ホスホフルクトキナーゼは、解糖系の重要な制御工程である、フルクトース-6-リン酸からフルクトース-1,6-二リン酸へのリン酸化を触媒する。
本明細書で使用される場合、pps遺伝子によってコードされるピルビン酸キナーゼ(E.C.2.7.1.40)は、ホスホエノールピルビン酸(PEP)からアデノシン二リン酸(ADP)へのリン酸基の移行を触媒し、ピルビン酸の1分子及びATPの1分子を生じる酵素である。
本明細書で使用される場合、グリセリン酸ムターゼは、2,3-ビスホスホグリセリン酸依存性(dPGM、GpmA)又は補因子依存性(iPGM、GpmM)のいずれかのホスホグリセリン酸ムターゼを指し得る。2,3-ビスホスホグリセリン酸依存性ホスホグリセリン酸ムターゼは、gpmA遺伝子によってコードされ、反応2-ホスホ-D-グリセリン酸←→3-ホスホ-D-グリセリン酸を触媒する。2,3-ビスホスホグリセリン酸依存性ホスホグリセリン酸ムターゼ(gpmC; gpml; gpml又はyibOとしても公知)は、gpmM遺伝子によってコードされ、同じ反応を触媒する。iPGM酵素は、著しく低い特異的活性を有する。したがって、好ましくは、pgmAは、本発明の方法による欠失又は阻害のために標的化される。
本明細書で使用される場合、6-ホスホグルコン酸デヒドラターゼ(E.C.4.2.1.12)は、反応6-ホスホ-D-グルコン酸←→2-デヒドロ-3-デオキシ-6-ホスホ-D-グルコン酸+H2Oを触媒する酵素である。常用の他の名前は、6-ホスホグルコン酸デヒドラターゼ、6-ホスホグルコン酸デヒドラーゼ、グルコン酸-6-リン酸デヒドラターゼ、グルコン酸6-リン酸デヒドラターゼ、6-ホスホグルコン酸デヒドラーゼ、及び6-ホスホ-D-グルコン酸ヒドロリアーゼを含む。
本明細書で使用される場合、KDPGアルドラーゼとして一般に公知の2-ケト-3-デオキシ-6-ホスホグルコン酸アルドラーゼ(E.C.4.1.2.14)は、反応2-デヒドロ-3-デオキシ-D-グルコン酸6-リン酸←→ピルビン酸+D-グリセルアルデヒド3-リン酸を触媒する酵素である。
ホスホフルクトキナーゼ、ピルビン酸キナーゼ、グリセリン酸ムターゼ、6-ホスホグルコン酸デヒドラターゼ、及び2-ケト-3-デオキシ-6-ホスホグルコン酸アルドラーゼの任意の1つ又はそれ以上は、本発明の微生物又は宿主細胞を、タンパク質のレベル若しくは活性を減少又は阻害する任意の薬剤と接触させることによって阻害され得る。阻害は、直接又は間接であり得る。阻害は、部分的又は完全であり得る。
阻害剤は、好ましくは:小分子、ペプチド、抗体、干渉RNA、例えばアンチセンスRNA、microRNA、shRNA、siRNAから選択され、1つ又はそれ以上のタンパク質の活性又はレベルを減少させることができる。
好ましい実施形態では、微生物又は宿主細胞は遺伝子pfkA、pps、gpmA、gpmM、gapA、edd及びedaの1つ又はそれ以上の発現を完全に欠失するか又は部分的に減少させるように、遺伝的に改変される。
当業者は、遺伝子発現を部分的に又は完全に減少させるように、遺伝子配列を欠失又は改変するための様々な技術に精通しているであろう。ある特定の実施形態では、遺伝子改変は、CRISPR-Cas9システムの使用による。用いることができる他のゲノム編集技術は、ラムダレッドリコンビナーゼシステム、ランダム突然変異導入及び選択並びにMultiplex Automated Genome Engineering (MAGE)を含む。一例では、CRIPSR-Cas9とラムダレッドリコンビナーゼの組合せが使用されてもよく、例えば、Reisch CR and Prather KL, (2015年) The no-SCAR (Scarless Cas9 Assisted Recombineering) system for genome editing in Escherichia coli, Sci Rep. 14(5):15096に概説される。
pfkA、pps、gpmA、gpmM、gapA、edd及びeda遺伝子の任意の1つ又はそれ以上の発現の減少は、少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%又は少なくとも100%の発現の減少であり得る。
発現が欠失されるか又は減少した遺伝子は、好ましくはpfk又はgpmAである。他の実施形態では、pfkとgpmAの両方、又はpfk及びgpmMが欠失される。より更には、eddとedaの両方が欠失され得る。代替の実施形態では、edd及びedaと組み合わせてgpmM及び/又はgpmAが欠失される。よりさらなる実施形態では、pfk、edd-eda及びgpmA又はgpmMが欠失される。
グルコースの酸化をペントースリン酸経路に更に方向づけるため、及び水素の産生の速度及び収率を最大にするため、本発明は様々な内因性遺伝子の発現又は活性の増加(又はそれらがコードするタンパク質の阻害)も検討する。
したがって、好ましい実施形態では、本発明の微生物は更に改変され、ホスホグルコムターゼ、グルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼ、6-ホスホグルコノラクトナーゼ、6-グルコホスホネートデヒドロゲナーゼNADキナーゼ及び可溶性ピリジンヌクレオチドトランスヒドロゲナーゼをコードする1つ又はそれ以上の遺伝子のレベル又は活性を増加させる。これらのタンパク質は、それぞれ遺伝子pgm、zwf、pgl、gnd、yfjB及びsthAによってコードされる。更に、本発明の方法は、タンパク質ホスホグルコムターゼ、グルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼ、6-ホスホグルコノラクトナーゼ、及び6-ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼの1つ又はそれ以上の発現を増加させる工程を含む。
本明細書で使用される場合、グルコース-リン酸イソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ/ホスホグルコイソメラーゼ(PGI)又はホスホヘキソースイソメラーゼ(PHI)としても公知のホスホグルコムターゼ、(PGM)(E.C.5.3.1.9)は、グルコース-6-リン酸(G6P)及びフルクトース-6-リン酸(F6P)を相互変換する解糖酵素(グルコース-6-リン酸イソメラーゼ)として機能する酵素である。反応は可逆的であるため、その方向はG6P及びF6P濃度によって決定される。
ある特定の実施形態では、PGMのレベル又は活性は、例えば遺伝子の発現の増加を可能にするプロモーターを導入することにより、内因性pgm遺伝子の発現を増加させることによって増加する。
好ましい実施形態では、大腸菌におけるpgm遺伝子のプロモーターは、大腸菌由来のgapAプロモーターによって置換される。例示的なgapAプロモーター(gapAp)5'-3'は、配列番号13に記載される。
本明細書で使用される場合、G6PDとしても公知のグルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼ(E.C.1.1.1.49)は、化学反応D-グルコース6-リン酸+NADP+←→6-ホスホ-D-グルコノ-1,5-ラクトン+NADPH+H+を触媒する酵素である。G6PDは、G6Pを6-ホスホグルコノ-δ-ラクトンヘと変換し、ペントースリン酸経路の律速酵素である。したがって、G6PDの制御は、ペントースリン酸経路の残りの活性のための下流の結果を有する。グルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼは、その基質G6Pによって刺激される。大腸菌では、zwf遺伝子は、グルコース-6-リン酸1-デヒドロゲナーゼをコードする。大腸菌のG6PDタンパク質の例示的なアミノ酸配列は、UniProt受託番号POAC53に見出すことができ、例示的な核酸配列は受託番号M55005、NP_416366.1、及びNC_000913.3である。ザイモモナス・モビリス由来のコグネートタンパク質は、zwfによってコードされ、その例示的な核酸配列は、本明細書において配列番号16で提供される。
ある特定の実施形態では、G6PDのレベル又は活性は、例えば、遺伝子の発現の増加を可能にするプロモーターを導入することにより、内因性zwf遺伝子の発現を増加させることによって増加する。ある特定の実施形態では、大腸菌のzwfプロモーターは、osmYプロモーター(osmYp)によって置換される。例示的なosmYプロモーター(osmYp)配列は、配列番号12に記載される。代替の実施形態では、大腸菌のzwfプロモーターは、配列番号13に記載される大腸菌のgapAプロモーターによって置換される。
好ましい実施形態では、G6PDのレベル又は活性は、大腸菌のzwf遺伝子をザイモモナス・モビリス由来のzwf遺伝子によって置換するか又は補足することによって増加する。さらなる実施形態では、大腸菌のzwf遺伝子は任意のグラム陰性通性細菌由来のzwf遺伝子によって置換されるか又は補足される。
本明細書で使用される場合、6PGL又はPGLSとしても公知の、6-ホスホグルコノラクトナーゼ、(E.C.3.1.1.31)は、ペントースリン酸経路の酸化相における6-ホスホグルコノラクトンの6-ホスホグルコン酸(又は6-ホスホ-D-グルコン酸+H+)への加水分解を触媒する酵素である。6-ホスホグルコノラクトナーゼは、6-ホスホグルコノラクトンの6-ホスホグルコン酸への変換を触媒し、両方ともグルコースがリブロース5-リン酸へと変換されるペントースリン酸経路の酸化相を仲介する。ペントースリン酸経路の酸化相は、CO2を放出し、NADP+からNADPHの2つの等価物の生成をもたらす。最終産物、リブロース5リン酸は、ペントースリン酸経路の非酸化相中で生物によって更に処理され、ヌクレオチド、ATP、及びコエンザイムAを含む生体分子を合成する。ペントースリン酸経路の6PGLに先行する酵素、グルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼは、もっぱら6-ホスホグルコノラクトンのδ-アイソマーを形成する。例示的な大腸菌の6PGL配列は、Uniprot受託番号P52697に見出すことができ、例示的な核酸配列は、受託番号U27192、NP_415288.1及びNC_000913.3に見出すことができる。
ある特定の実施形態では、PGLのレベル又は活性は、例えば、遺伝子の発現を増加させることができるプロモーターを導入することにより、内因性pgl遺伝子の発現を増加させることによって増加する。
好ましい実施形態では、大腸菌のpgl遺伝子のプロモーターは、大腸菌由来のgapAプロモーターによって置換される。例示的なgapAプロモーター(gapAp)5'-3'は配列番号13に記載される。
本明細書で使用される場合、GAPDHとして、及びごく稀にG3PDHとしても公知のグリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ(E.C.1.2.1.12)は、大腸菌のgapA遺伝子によってコードされる。タンパク質は、補因子NADを使用して、グリセルアルデヒド3-リン酸(G3P)の1,3-ビスホスホグリセリン酸(BPG)への酸化的リン酸化を触媒する。第一の反応工程は、G3Pとシステイン残基の間のヘミアセタール中間体の形成を含み、このヘミアセタール中間体は次いで、NADのNADHへの還元を伴いチオエステルへと酸化される。還元されたNADHは次いで、第2のNADと交換され、チオエステルは求核無機リン酸塩によって攻撃され、BPGを産生する。大腸菌のGapAタンパク質の例示的なアミノ酸配列は、Uniprot受諾番号POA9B2に見出すことができ、例示的な核酸配列は受託番号X02662、NP_416293.1及びNC_000913.3である。クロストリジウム・アセトブチリカム(Clostridium acetobutylicum)由来のコグネートタンパク質は、gapCによってコードされ、その例示的な核酸配列は、本明細書において配列番号15で提供される。
ある特定の実施形態では、GAPDHのレベル又は活性は、遺伝子を欠損させる工程又はプロモーターを変更して遺伝子の発現を減少する工程により、内因性gapA遺伝子の発現を低下させるか又は除くことによって低下される。
好ましい実施形態では、大腸菌のgapA遺伝子は、クロストリジウム・アセトブチリカム由来のgapC遺伝子によって置換される。
本明細書で使用される場合、6-ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ、脱カルボキシ(E.C.1.1.1.44)とも呼ばれる、6-グルコホスホネートデヒドロゲナーゼは、NADPからNADPHへの還元を伴う、6-ホスホグルコン酸のリブロース5-リン酸及びCO2への酸化的脱カルボキシル化を触媒する酵素である。大腸菌において、6-グルコホスホネートデヒドロゲナーゼは、gnd遺伝子によってコードされる。大腸菌の6-グルコホスホネートデヒドロゲナーゼの例示的なアミノ酸配列は、Uniprot受諾番号PP00350に見出すことができ、核酸配列は受託番号K02072、NP_416533.1及びNC_000913.3に見出すことができる。コリネバクテリウム・グルタミクム由来のコグネートタンパク質は、gndによってコードされ、その例示的な核酸配列は、本明細書において配列番号14で提供される。
ある特定の実施形態では、6-グルコホスホネートデヒドロゲナーゼのレベル又は活性は、例えば、遺伝子の発現の増加を可能にするプロモーターを導入することにより、内因性gnd遺伝子の発現を増加させることによって増加する。ある特定の実施形態では、微生物は大腸菌であり、大腸菌におけるgnd遺伝子のプロモーターは、大腸菌由来のgapAプロモーターによって置換される。例示的なgapAプロモーター(gapAp)5'-3'は、配列番号13に記載される。代替の実施形態では、大腸菌のgndプロモーターは、osmYプロモーター(osmYp)によって置換される。例示的なosmYプロモーター(osmYp)配列は、配列番号12に記載される。
特に好ましい実施形態では、pgm、zwf、pgl、gnd、tktB又はtktA、及びtalA又はtalBの1つ又はそれ以上の内因性プロモーターは、osmYプロモーター、gapAプロモーター、nirBプロモーター及びnarプロモーターからなる群から選択されるプロモーターによって置換される。
好ましい実施形態では、微生物(例えば大腸菌)由来のgnd遺伝子は、コリネバクテリウム・グルタミクム由来のgnd遺伝子によって置換される。
特に好ましい実施形態では、pgm、zwf、pgl、gnd、tktB又はtktA、及びtalA又はtalBの1つ又はそれ以上の内因性プロモーターは、osmYプロモーター、gapAプロモーター、nirBプロモーター及びnarプロモーターからなる群から選択されるプロモーターによって置換される。好ましくは、osmY、gapA、nirB及び/又はnarプロモーターは、生物の内因性プロモーターである。より好ましくは、微生物が大腸菌である場合、osmY、gapA、nirB及び/又はnarプロモーターは大腸菌由来である。
スクロース代謝遺伝子
ほとんどの大腸菌株が、炭素の供給源としてスクロースを利用することができないため、本発明の微生物及び方法は、宿主微生物の改変も含み、スクロースの代謝を可能にする。ある特定の実施形態では、これは、微生物を改変し、スクロースを代謝することができる大腸菌のこれらの株で同定された、遺伝子クラスター、cscRAKBを発現させることによって達成され得る。
ほとんどの大腸菌株が、炭素の供給源としてスクロースを利用することができないため、本発明の微生物及び方法は、宿主微生物の改変も含み、スクロースの代謝を可能にする。ある特定の実施形態では、これは、微生物を改変し、スクロースを代謝することができる大腸菌のこれらの株で同定された、遺伝子クラスター、cscRAKBを発現させることによって達成され得る。
したがって、好ましい実施形態では、本発明の方法は、スクロースヒドロラーゼ(cscA遺伝子によってコードされる)及びスクロースパーミアーゼ(cscB遺伝子によってコードされる)をコードする核酸配列の発現を可能にする組換えポリヌクレオチドを有する宿主微生物を提供する工程を更に含む。さらなる実施形態では、方法は、制御タンパク質CscR及びCscK(それぞれ遺伝子cscR及びcscKによってコードされる)をコードする組換えポリヌクレオチドを有する微生物を提供する工程も含む。
本明細書で使用される場合、スクロースヒドロラーゼは、cscA遺伝子によってコードされるスクロース又はインベルターゼ(E.C.3.2.1.26)とも呼ばれる、酵素スクロース-6-リン酸ヒドロラーゼを指す。スクロースヒドロラーゼの例示的なアミノ酸配列は、UniProt受託番号P40714で提供され、例示的なヌクレオチド配列は受託番号X81461で提供される。
本明細書で使用される場合、スクロースパーミアーゼは、cscB遺伝子によってコードされるタンパク質を指す。スクロースパーミアーゼは、スクロース輸送タンパク質としても公知であり、例示的なアミノ酸配列はUniprot受託番号P3000に見出すことができる。スクロースパーミアーゼをコードする例示的なヌクレオチド配列は、受託番号X63740又はX81461に見出すことができる。
更に、大腸菌微生物を遺伝的に改変し、内因性大腸菌ホスホグルコムターゼ(pgm)又はキシロースイソメラーゼ(xylA)のレベル又は活性を増加させてもよい。遺伝子改変は、内因性遺伝子の発現を増加させるためであり得る(例えば、プロモーター領域の改変によるか、又は遺伝子をコードする外因性核酸の導入及び発現による)。
さらなる実施形態では、微生物は改変され、ロイコノストック・メセントロイデス由来のスクロースホスホリラーゼを発現する。
核酸
「単離された」核酸分子は、通常、核酸をコードするポリペプチドの天然源と関連する少なくとも1つの夾雑核酸分子から同定及び分離される核酸分子である。単離された核酸分子は、天然で見出される形態又は設定以外である。単離された核酸分子は、したがって、天然細胞に存在する核酸分子とは区別される。しかしながら、単離された核酸分子は、通常核酸を発現する細胞に含有される核酸分子を含み、例えば核酸分子は天然細胞とは異なる染色体位置にある。
「単離された」核酸分子は、通常、核酸をコードするポリペプチドの天然源と関連する少なくとも1つの夾雑核酸分子から同定及び分離される核酸分子である。単離された核酸分子は、天然で見出される形態又は設定以外である。単離された核酸分子は、したがって、天然細胞に存在する核酸分子とは区別される。しかしながら、単離された核酸分子は、通常核酸を発現する細胞に含有される核酸分子を含み、例えば核酸分子は天然細胞とは異なる染色体位置にある。
用語「核酸分子」又は「ポリヌクレオチド」は、本明細書で交換可能に使用され、デオキシリボヌクレオチド若しくはリボヌクレオチドのいずれかの、任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態、又はその類似体を指す。ポリヌクレオチドの非限定的な例としては、遺伝子、遺伝子断片、メッセンジャーRNA(mRNA)、cDNA、組換えポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離されたDNA、任意の配列の単離されたRNA、核酸プローブ、及びプライマーが挙げられる。選択されたポリペプチドを「コードする」核酸配列は、適切な制御配列の調節下に置かれた場合、in vivoで転写され(DNAの場合)、ポリペプチドへと翻訳される。コード配列の境界は、5'(アミノ)末端の開始コドン及び3'(カルボキシ)末端の翻訳終止コドンによって決定される。転写終結配列は、コード配列の3'に位置し得る。
本発明のポリヌクレオチドは、例により、Sambrookら(1989年, Molecular Cloning-a laboratory manual; Cold Spring Harbor Press)に記載されるように、当技術分野で周知の方法に従って合成され得る。
本明細書で使用される場合、「コドン最適化された」は、宿主微生物における遺伝子のコドン利用に似せるDNA配列の最適化を指す。好ましい実施形態では、配列のコドン利用は、高発現された大腸菌遺伝子のものと似るように最適化される。
本発明のポリヌクレオチド分子は、挿入配列に作動可能に連結され、したがって、ポリペプチドの発現を可能にする調節配列を含む発現カセットの形態で提供され得る。これらの発現カセットは、今度は、典型的にはベクター内で提供される(例えば、プラスミド又は組換えベクター)。好適なベクターは、十分な量の遺伝情報を運ぶことができ、本発明のポリペプチドの発現を可能にする任意のベクターであり得る。
本発明は、したがって、そのようなポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターを含む。発現ベクターは、分子生物学の分野で日常的に構築され、所望のポリペプチドの発現を可能にするために必要であり、正しい方向で位置される、例えばプラスミドDNA及び適切なイニシエーター、プロモーター、エンハンサー及び他の要素の使用を含み得る。他の好適なベクターは、当業者には明らかであろう。これに関して、さらなる例により、本発明者らはSambrookらを参照する。
したがって、本発明のポリペプチドは、そのようなベクターを細胞へと送達し、ベクターからの転写を生じさせることによって提供され得る。当業者は、形質転換技術等を含む、そのような発現ベクターの細胞への送達の標準的な技術に精通しているであろう。
ベクターは、プラスミドであり得る。ある特定の実施形態では、プラスミドは高コピー数プラスミド又は低コピー数プラスミドである。ベクターは当技術分野で周知であり、クローニングベクター、発現ベクター等を含み得る。クローニングベクターは、自律的に複製することができるか又は宿主細胞のゲノムにインテグレートされる組換え核酸構築物であり、ベクターが確定できる様式で切断され、新しい組換えベクターが宿主細胞において複製するその能力を保持するように所望のDNA配列がライゲートされ得る1つ又はそれ以上のエンドヌクレアーゼ制限部位によって更に特徴付けられる。プラスミドの場合、プラスミドの宿主細菌内でのコピー数が増加すると所望の配列の複製が何回も、又は有糸分裂によって宿主が再生する前に宿主当たり単回生じ得る。ファージの場合、複製は、溶菌相中に活発に又は溶原相中に不活発に生じ得る。発現ベクターは、所望のDNA配列が制限処理及びライゲーションによって挿入され、制御配列に作動可能に接合され、RNA転写として発現され得る、組換え核酸構築物である。ベクターは、ベクターによって形質転換又はトランスフェクトされたか又はされていない細胞の同定での使用に好適な1つ又はそれ以上のマーカー配列を更に含有し得る。マーカーは、例えば、抗生物質又は他の化合物への耐性又は感受性のいずれかを増加又は減少させるタンパク質をコードする遺伝子、その活性が当技術分野で公知の標準的なアッセイによって検出可能であるポリペプチド又は酵素(例えば、β-ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ又はアルカリホスファターゼ)をコードする遺伝子、及び形質転換又はトランスフェクとした細胞、宿主、コロニー又はプラークの表現型に明らかに影響する遺伝子(例えば緑色蛍光タンパク質等の蛍光タンパク質)を含む。好ましいベクターは、それらが作動可能に接合されるDNAセグメントに存在する構造遺伝子産物の自律的複製及び発現ができるものである。
本明細書で使用される場合、コード配列及び制御配列は、制御配列の影響及び調節下でコード配列の発現又は転写が起こるように共有結合される場合、「作動可能に」接合又は連結されると言われる。コード配列が機能性タンパク質へと翻訳されることが所望される場合、2つのDNA配列は、5'制御配列におけるプロモーターの誘導がコード配列の転写をもたらす場合、及び2つのDNA配列間の結合の性質が(1)フレームシフト突然変異の導入を生じない、(2)コード配列の転写を指示するプロモーター領域の能力と干渉しない、又は(3)相当するRNA転写物がタンパク質へと翻訳される能力と干渉しない場合、作動可能に接合又は連結されると言われる。したがって、プロモーター領域は、プロモーター領域がそのDNA配列の転写に影響することができ、生じた転写物が所望のタンパク質又はポリペプチドへと翻訳され得る場合、コード配列に作動可能に接合又は連結されるであろう。
遺伝子発現に必要とされる制御配列の正確な性質は、種又は細胞型間で変わり得るが、通常、必要であれば、TATAボックス、キャッピング配列、CAAT配列等のような、それぞれ転写及び翻訳の開始に関与する5'非転写及び5'非翻訳配列を含む。特に、そのような5'非転写制御配列は、作動可能に接合された遺伝子の転写制御のためのプロモーター配列を含むプロモーター領域を含むであろう。
制御配列は、要望どおりエンハンサー配列又は上流アクチベーター配列も含み得る。本発明のベクターは、場合により、5'リーダー又はシグナル配列を含み得る。適切なベクターの選択及び設計は、当業者の能力又は裁量内である。
「プロモーター」は、ポリペプチドコードポリヌクレオチドの転写を開始及び制御するヌクレオチド配列である。プロモーターは、誘導性プロモーター(プロモーターに作動可能に連結したポリヌクレオチド配列の発現が、分析物、補因子、制御タンパク質等によって誘導される)、抑制性プロモーター(プロモーターに作動可能に連結したポリヌクレオチド配列の発現が、分析物、補因子、制御タンパク質等によって抑制される)、及び構成的プロモーターを含み得る。用語「プロモーター」又は「調節エレメント」は、全長プロモーター領域及びこれらの領域の機能性(例えば転写又は翻訳を調節する)セグメントを含むことが意図される。
本発明の核酸は、好ましくは、プロモーターに作動可能に連結され、本明細書に記載されるように水素の産生を可能にするために好適な条件下で培養される場合、対象酵素は細胞で発現される。プロモーターは、個々の細菌細胞種に特異的であり得る。プロモーターは、細胞で観察される典型的な発現レベルを超えて遺伝子の発現を増加させる異種プロモーターであり得る。プロモーターは、誘導性プロモーターであり得る。
本発明に記載のポリヌクレオチド、発現カセット又はベクターは、シグナルペプチド配列を更に含み得る。シグナルペプチド配列は、通常、プロモーターとの作動可能な結合に挿入され、シグナルペプチドが発現され、プロモーターとの作動可能な結合においてコード配列によってコードされるポリペプチドの分泌を促進する。任意の実施形態では、本明細書に記載される任意の例示的な発現カセット、ベクター又は配列は更に改変され、シグナルペプチド配列を含まないことが更に理解されるであろう。
任意の適切な発現ベクター(例えばPouwelsら、Cloning Vectors: A Laboratory Manual (Elsevier, N.Y.: 1985年)に記載される)及び対応する好適な宿主は、組換えポリペプチドの産生のために用いることができる。発現宿主は、限定はされないが、大腸菌属、バチルス属、シュードモナス属、サルモネラ属宿主細胞系等内の細菌種を含む。当業者は、発現宿主の選択が産生されたポリペプチドの型の分岐を有することを認識している。
一部の実施形態では、目的の分子の産生を生じる、又は変更された産生、場合により増加した産生を有するように、細胞が(例えば、本明細書に記載されるように)操作又は選択される。一部の実施形態では、細胞は、1つ又はそれ以上の遺伝子の欠失又は突然変異を含む(例えば、本明細書に記載される1つ又はそれ以上の制御性又は競合代謝遺伝子)。他の例では、欠失又は変異される1つ又はそれ以上の遺伝子は、競合経路のものである。突然変異は、単一又は複数の点変異、付加、部分内部欠失、N末端若しくはC末端欠失(トランケーション)、又は完全欠失であってもよく、その全てが遺伝子にコードされるアミノ酸配列に影響し得る。
欠失又は突然変異は、当技術分野の標準的な方法を使用して作製され得る。突然変異は、非ランダム、部分的なランダム若しくはランダム、又はこれらの突然変異の組合せであり得る。例えば、部分的なランダム突然変異について、突然変異は、突然変異が作製されるポリペプチドをコードする核酸分子のある特定の部分に限られ得る。
微生物の培養及び改変
特に好ましい実施形態では、本明細書に記載されるように、微生物又は宿主細胞の培養は、最初は好気性条件下で実施してバイオマスを産生し、次いで嫌気性条件に移され、HPGCの発現中に嫌気状態を導入する。当業者は、天然ガス(例えばN2)又は還元剤の添加を含む、嫌気状態を生じる技術に精通している。しかしながら、嫌気状態は、酸化可能な炭素源の存在下で密閉容器中で微生物を培養することにより簡単に達成され得ることも理解されるであろう。
特に好ましい実施形態では、本明細書に記載されるように、微生物又は宿主細胞の培養は、最初は好気性条件下で実施してバイオマスを産生し、次いで嫌気性条件に移され、HPGCの発現中に嫌気状態を導入する。当業者は、天然ガス(例えばN2)又は還元剤の添加を含む、嫌気状態を生じる技術に精通している。しかしながら、嫌気状態は、酸化可能な炭素源の存在下で密閉容器中で微生物を培養することにより簡単に達成され得ることも理解されるであろう。
更に、微生物又は宿主細胞の培養は、好ましくは、第二鉄(鉄III)又は第一鉄(鉄II)塩を培養培地に含めることによって実施される。好ましくは、第二鉄(鉄III)又は第一鉄(鉄II)塩は、少なくとも約5μM、少なくとも約10μM、少なくとも約20μM、又は少なくとも約30μM又はそれ以上の培地中最終濃度で提供される。好ましくは、培養培地中で提供される第二鉄(鉄III)又は第一鉄(鉄II)塩の最終濃度は、約20μMに等しいか又はそれより高い。
当業者は、組換えタンパク質の産生のための組換え宿主細胞の培養が、生物におけるタンパク質の増殖及び発現に最適の温度で実行されることを理解するであろう。例えば、大腸菌及び関連細菌の増殖のための最適温度は約37℃であり、組換えタンパク質を産生する酵母の増殖のための温度は約30～32℃である。しかしながら、本発明者らは、機能性ヒドロゲナーゼの発現が、大腸菌のような細菌発現システムを使用する場合、培養温度を下げると、更に増強され得ることを見出した。したがって、好ましい実施形態では、微生物又は宿主細胞が大腸菌である場合、培養温度は約30℃以下である。温度は約10℃～約30℃の間、好ましくは少なくとも約15℃であり得る。ある特定の実施形態では、温度は約20℃～約30℃である。特に好ましい実施形態では、温度は約20℃である(例えば、18℃、19℃、20℃、21℃、22℃)。
「遺伝的に操作された」又は「遺伝的に改変された」は、任意の組換えDNA又はRNA技術によって改変された任意の細胞を指す。言い換えると、細胞は、組換えポリヌクレオチド分子によってトランスフェクト、形質転換、又は形質導入され、それにより細胞の所望のタンパク質の発現を変更させるように変更されている。宿主細胞を遺伝子操作するための方法及びベクターは当技術分野で周知であり;例えば、様々な技術がCurrent Protocols in Molecular Biology, Ausubelら編(Wiley & Sons, New York, 1988年、四半期ごとのアップデート)に示される。遺伝子操作技術は、限定はされないが、発現ベクター、標的化相同組み換え、及び遺伝子活性化(例えば、米国特許第5,272,071号を参照)、及び操作した転写因子によるトランス活性化(例えば、Segalら、1999年, Proc Natl Acad Sci USA 96(6):2758～63頁)を含む。
ある特定の実施形態では、本明細書に記載される遺伝子改変は、遺伝子発現又は機能の増加をもたらし、遺伝子の増幅、過剰生産、過剰発現、活性化、増強、付加、又は上方制御と呼ばれ得る。より詳細には、本明細書で議論する酵素又は他のタンパク質の作用(又は活性)の増加ヘの言及は、通常、酵素又はタンパク質の発現及び/又は機能性(生物活性)の増加をもたらし、酵素のより高い活性(例えば特異的活性又はin vivo酵素活性)、酵素の阻害又は分解の減少、及び酵素の過剰発現を含む、問題の微生物における任意の遺伝子改変を指す。例えば、天然のプロモーターよりもより高い発現レベルをもたらすプロモーターの使用により、遺伝子コピー数を増加させることができ、発現レベルを増加させることができ、又は酵素の生物活性を増加させる遺伝子操作若しくは古典的な変異導入によって遺伝子を変更することができる。これらの改変の一部の組合せも可能である。
本明細書で使用される場合、用語「外因性ポリヌクレオチド」は、所与の生物において天然に存在するポリヌクレオチドに由来しないポリヌクレオチドを意味することが意図される。外因性ポリヌクレオチドは、異なる生物に存在するポリヌクレオチド由来であってもよい。本発明にしたがって、大腸菌細胞は、細胞に水素を産生させることができる1つ又はそれ以上の酵素をコードする1つ又はそれ以上の外因性ポリヌクレオチドを含有する核酸構築物によって遺伝的に改変されてもよい。
外因性ポリヌクレオチドは、異種又は相同であってもよい。用語「異種」は、参照した種以外の供給源由来の分子又は活性を指すが、「相同」は、宿主微生物由来の分子又は活性を指す。したがって、本発明の核酸分子の外因性発現は、異種又は相同核酸分子のいずれか又は両方の使用により得る。
外因性ポリヌクレオチドは、1つ又はそれ以上の発現構築物(プラスミドベクター)で提供されてもよい。
微生物を形質転換する方法は、当技術分野で周知であり、エレクトロポレーション、塩化カルシウム、又は酢酸リチウムベース法のような非限定的な例を含み得る。
当業者は、関連構築物の形質転換の成功を確認するための方法、並びに形質転換体がコードされたタンパク質によって提供される関連酵素活性を保持するかどうか決定するための方法に精通しているであろう。例えば、ホスホフルクトキナーゼ活性(したがってコードされたタンパク質のタンパク質フォールディングの修正を推測する)は、市販の酵素アッセイキットを使用して推測することができる。
同様に、当業者は、関連タンパク質の活性のレベル又は関連遺伝子の発現のレベルの阻害又は欠失を確認するための標準的な技術に精通している。遺伝子改変、欠失又は置換の成功は、標準的なシークエンシング技術を使用して確認され得る。細胞の阻害剤との接触後のタンパク質活性の阻害の成功は、例えば市販の酵素アッセイキットを使用して、関連タンパク質の活性を評価することによって評価され得る。
当業者は、組換え微生物におけるポリヌクレオチドの発現を誘導するために必要な通常の培養技術にも精通しており、必要な場合、それによりHPGCのタンパク質の産生を誘導し、水素を産生する。一部の例では、組換え微生物の液体培養は、グルコースを供給した嫌気性条件下で増殖される。
形質転換の成功は、細胞を形質転換するベクターのプラスミドに選択マーカー遺伝子を含めることによっても決定され得る。本明細書で使用される場合、用語「選択マーカー遺伝子」は、選択培養培地中で増殖した宿主細胞の生存及び/又は増殖に必要なタンパク質をコードする遺伝子物質を指す。大腸菌を含む微生物での使用のための典型的な選択マーカー遺伝子は、当業者に周知である。
水素産生の測定は、実施例に概説したものを含む任意の好適な方法により得る。1つの簡単な例では、水素産生は、培養中の気泡の産生を観察することによって簡単に計測することができる。他の実施例では、産生及び水素産生の定量は、気泡をサンプリングすること及び熱伝導度の検出によるガスクロマトグラフィー又はマススペクトロメトリーによりガス組成を解析することによる。他の例では、当業者に公知のクラーク型電極、又は水素産生を検出する任意の他の好適な方法が使用されてもよい。
本発明の任意の実施形態では、微生物、好ましくは大腸菌微生物は、水素の産生を誘導する前に一定期間保存されてもよい。例えば、ある特定の実施形態では、本発明の微生物又は本明細書に記載される方法は、水素を生成することができる組換え微生物を生成するために必要とされるポリヌクレオチドによる微生物の形質転換を含んでもよい。微生物は、次いで回収され、水素産生に必要とされるまで、微生物の保存に好適な条件下で保存されてもよい(例えば、好適な緩衝液中で4℃、-20℃又は-80℃)。微生物が、さらなる使用に必要とされるまで凍結されてもよいことも理解されるであろう。更に、微生物は、HPGCの発現を可能にする条件下で増殖することができ、次いで回収され、必要な場合保存され、次いでグルコースを補足した適切な溶液中に再懸濁し、細菌の水素産生を開始させることが理解されるであろう。
一部の例では、産生され、及びHPGCを発現する培養細菌が回収され、等張条件下でグルコースを供給し、水素を産生させた。
ある特定の実施形態では、細菌は、例えば標準的な技術を使用してアルギン酸カルシウムビーズにカプセル化し、等張培地にグルコースを供給し、水素を産生させる。当業者は、Inotech Encapsulator IE-50R (EncapBioSystems Inc社)、又はEncapsulator B-390/B-395 pro (Buchi社)、又は関連システムのような装置を使用することを含め、バイオカプセル化の標準的な手順並びにメカニズム技術及び装置に精通している。他の方法は、その全内容が、参照によって本明細書に組み込まれる、例えば: Heidebachら、(2012年) Critical Reviews in Food Science and Nutrition, 52: 291～311頁; Martinら、(2015年) Innovative Food Science & Emerging Technologies 27:15～25頁に記載される。
他の実施例では、組換え微生物は、本発明に従って水素を産生可能であるために、生存可能である(すなわち、複製する、「増殖する」又は細胞数を増加させることができる)必要はない。例えば、任意の実施形態では、方法は、本明細書に記載されるように組換え微生物を提供するか又は生成する工程、水素を産生するために必要なタンパク質(例えば、HPGCによってコードされるタンパク質)の発現を誘導する条件下及び十分な時間、微生物を培養する工程、次いで微生物を不活性化する工程を含む。好ましくは、不活性化した微生物は無傷のままであるが、必須要件ではないことが理解されるであろう。
本発明の不活性化した組換え微生物は、次いで、例えば実施例において本明細書に記載されるように、水素を生成するために使用され得る。
当業者は、細胞は無傷のままであるが、依然として水素の産生に利用され得るように微生物を不活性化する方法に精通しているであろう(すなわち、HPGC及び細胞によって発現された他のタンパク質から)。不活性化は、ガンマ線照射によるか又は抗生物質(マイトマイシン又は類似物等)による処置により得る。
任意の実施形態では、微生物の少なくとも10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%又は100%が不活性化される。
システム及び装置
本発明は、本発明の微生物、又は水素を産生するための本明細書に記載される方法を含むリアクターシステムを含むシステム及び装置も提供する。
本発明は、本発明の微生物、又は水素を産生するための本明細書に記載される方法を含むリアクターシステムを含むシステム及び装置も提供する。
好ましい実施形態では、本発明は、微生物によって産生される水素ガスを回収するための水素ガス回収システムを更に含む。水素ガス回収システムは、生成された水素ガスが回収され、場合により使用のために保存されるような、リアクターシステムに含まれ得る。或いは、生成された水素ガスは使用場所、例えば、水素燃料駆動装置に向けられ得る。
一部の実施形態では、水素ガス回収ユニットは、リアクターシステムで産生された水素ガスの流れを保存容器又は直接使用場所に向ける1つ又はそれ以上の水素ガス導管を含む。他の実施形態では、水素ガス導管は、場合によりスイープガスの供給源に接続され、水素ガスはスイープガスを使用して回収される。例示的なスイープガスは窒素である。例えば、水素ガスが最初に産生されると、スイープガスが水素ガス導管に導入され、保存容器又は水素ガス使用場所の方向に流すことができる。さらなる実施形態では、水素回収システムは、リアクターシステムからの水素の回収のための容器を含み得る。更に他の実施形態では、回収システムは、水素の通路のための導管を更に含み得る。導管及び/又は容器は、反応チャンバからの水素ガスの流出のために提供されたチャネルを有するガス流伝導にあり得る。
燃料電池は、燃料のエネルギーを直接電気化学及び熱エネルギーに変換する電気化学装置である。典型的には、燃料電池はアノード及びカソードからなり、それらは電解質を介して電気的に接続される。例えば、水素のような燃料は、アノードに供給され、そこで電極触媒の助けを借りて酸化される。カソードでは、酸素(又は空気)のような酸化剤の還元が起こる。電極で起こる電気化学反応は電流、及びそれにより電気エネルギーを産生する。一般に、熱エネルギーも産生され、それを使用してさらなる電気を提供するか又は他の目的のためであり得る。現在、燃料電池での使用のための最も一般的な電気化学反応は、水素と酸素の間のものであり、水を産生する。分子水素自体は、アノードに供給され、そこで酸化され、産生された電子は、酸化剤が還元されるカソードへと外部回路を通過する。中間電解質を通るイオン流は、電荷を中性に維持する。
本主題の燃料電池は、燃料として水素を利用し、水素の供給源は本主題の組換え微生物由来である。
典型的には、水素は、容積で少なくとも約2%、容積で好ましくは少なくとも約5%及びより好ましくは少なくとも約10%、例えば容積で約25%、50%、75%又は90%の量で燃料源に存在する。不活性ガスが使用され、燃料ガスの一部を形成する場合、不活性ガスは、典型的には容積で少なくとも約10%、例えば少なくとも約25%、50%又は75%、最も好ましくは容積で少なくとも約80%の量で存在する。
通常、燃料源は、場合により気体又は液体形態の燃料源の加圧容器から供給される。燃料源は、注入口を介して電極に供給され、場合によりバルブを含み得る。使用済み又は廃棄燃料源を燃料電池から取り除くことができる排出口も提供される。
典型的には、酸化剤は酸素を含むが、任意の他の好適な酸化剤が使用され得る。酸化剤源は、典型的には、酸化剤を含むガスの形態でカソードに酸化剤を提供する。一部の実施形態では、酸化剤は、液体形態で提供されてもよい。一般に、酸化剤源は、不活性ガスも含むが、その純粋形態の酸化剤が使用されてもよい。例えば、窒素、ヘリウム、ネオン又はアルゴンのような1つ又はそれ以上のガスとの酸素の混合物が使用されてもよい。酸化剤源は、場合により、さらなる成分、例えば代替の酸化剤又は他の添加剤を含み得る。好適な酸化剤源の例は空気である。
典型的には、酸素は、容積で少なくとも約2%、好ましくは容積で少なくとも約5%、及びより好ましくは少なくとも約10%で酸化剤源に存在する。
通常、酸化剤源は、場合により気体又は液体形態の酸化剤源の加圧容器から供給される。酸化剤源は、注入口を介して電極に供給され、場合によりバルブを含み得る。使用済み又は廃棄酸化剤源を燃料電池から取り除くことができる排出口も提供される。
アノードは、導体材料、例えばステンレス鋼、真鍮又は炭素から作製されてもよく、グラファイトであってもよい。アノードの表面は、少なくとも一部は、触媒の吸着を促進する異なる材料によってコートされ得る。触媒が吸着される表面は、ヒドロゲナーゼを変性させない材料のものである。好適な表面材料は、グラファイト、例えば、炭素布又は炭素スポンジのような高表面積を有する研磨したグラファイト表面又は材料等を含む。荒い表面を有する及び/又は高表面積を有する材料が、通常好ましい。
カソードは、その表面で酸化剤を還元することができるであろう任意の好適な伝導材料から構成され得る。例えば、従来の燃料電池のカソードを形成するために使用される材料が使用され得る。電極触媒は、所望であれば、カソードに存在し得る。この電極触媒は、例えば、カソード自体にコート又は吸着され得るか、又はカソードの周囲の溶液に存在し得る。好適な電極触媒は、プラチナのような従来の燃料電池で使用されるものを含む。生物触媒は、この目的のため、特に、本明細書に記載される酵素及びアクセサリタンパク質の組合せにも使用されてもよい。
本主題の燃料電池は、典型的には、少なくとも約25℃、より好ましくは少なくとも約30℃の温度で操作される。燃料電池が、約35℃～約65℃、例えば約40℃～約50℃の温度で操作されることが好ましい。より高い温度は、反応速度の増加をもたらし、より高い酸化電流をもたらす。
上記のように、燃料電池は、上記の条件下で操作され、電気回路において電流を産生することができる。燃料電池は、アノードに水素を供給し、カソードに酸化剤を供給することによって操作される。本発明の燃料電池は、陽電極の表面積のcm2あたり少なくとも約0.5mA、典型的には少なくとも約0.8mA、1mA又は1.5mAの電流密度を産生することができる。例えば、本発明の燃料電池は、陽電極の表面積のcm2あたり少なくとも約2mA、例えば少なくとも約3mAの電流を産生することができる。
(実施例1)
材料及び方法
細菌株及びプラスミド
野生型(DH5α)大腸菌NEB5-アルファ(CP017100.1, (Anton and Raleigh, 2016))、DH5αの即時型fhuA2誘導体及びK-12の誘導体は、New England Biolabs社から購入し、Luria-Bertani (LB)培地及び1.5%アガーを含有するプレートで維持した。抗生物質クロラムフェニコール(Cam) 30mg/L及び硫酸カナマイシン(Kan)50mg/Lは、必要であれば含まれる。DH5αの変異株は、CRISPR/Cas9法(Reisch and Prather, 2015)を使用して構築された。プラスミドpHPGC(CamR)は、標準的なBiobrickアセンブリ法、制限酵素消化及びライゲーションを使用して構築された。生じるプラスミドは、標準的な手順によってWT及び変異株を形質転換した。水素産生のために使用される株及びプラスミドは、Table2(表2)に列挙する。HPGC及び異種プロモーターの様々な成分の配列並びに遺伝子配列はTable1(表1)に示す。水素産生のために使用される野生型及び変異株のゲノム配列は、Nanopore Sequencing技術を使用して確認された。
材料及び方法
細菌株及びプラスミド
野生型(DH5α)大腸菌NEB5-アルファ(CP017100.1, (Anton and Raleigh, 2016))、DH5αの即時型fhuA2誘導体及びK-12の誘導体は、New England Biolabs社から購入し、Luria-Bertani (LB)培地及び1.5%アガーを含有するプレートで維持した。抗生物質クロラムフェニコール(Cam) 30mg/L及び硫酸カナマイシン(Kan)50mg/Lは、必要であれば含まれる。DH5αの変異株は、CRISPR/Cas9法(Reisch and Prather, 2015)を使用して構築された。プラスミドpHPGC(CamR)は、標準的なBiobrickアセンブリ法、制限酵素消化及びライゲーションを使用して構築された。生じるプラスミドは、標準的な手順によってWT及び変異株を形質転換した。水素産生のために使用される株及びプラスミドは、Table2(表2)に列挙する。HPGC及び異種プロモーターの様々な成分の配列並びに遺伝子配列はTable1(表1)に示す。水素産生のために使用される野生型及び変異株のゲノム配列は、Nanopore Sequencing技術を使用して確認された。
発酵
Camを含有する、100mLのカタボライト抑制を伴うSuper Optimal broth (SOC)培地中の前培養に、大腸菌DH5α、DH5α-HPGC、ΔpfkA-HPGC又はΔgpmA-HPGCの単一コロニーを接種した(配列番号10及び30～40に特定したHPGC構築物を使用する)。前培養は、およそOD6002(1.6×109個の細胞)まで37℃で終夜インキュベートし、滅菌濾過(0.2μm)した20mM D-グルコース、1mM硫酸鉄及びCam(30mg/L)の添加によって2LのSOC培地(pH7)に接種した。
Camを含有する、100mLのカタボライト抑制を伴うSuper Optimal broth (SOC)培地中の前培養に、大腸菌DH5α、DH5α-HPGC、ΔpfkA-HPGC又はΔgpmA-HPGCの単一コロニーを接種した(配列番号10及び30～40に特定したHPGC構築物を使用する)。前培養は、およそOD6002(1.6×109個の細胞)まで37℃で終夜インキュベートし、滅菌濾過(0.2μm)した20mM D-グルコース、1mM硫酸鉄及びCam(30mg/L)の添加によって2LのSOC培地(pH7)に接種した。
細胞は、発酵槽(Eppendorf社、BioFlow 120及びBioFlo(登録商標)/CelliGen(登録商標) 115 Fermenter/Bioreactor)の助けを借りて37℃に調節された温度及び1M水酸化ナトリウムで滴定することによって7に維持したpHで、100rpmの撹拌速度で、OD6000.6(4.8×108個の細胞)まで嫌気的に増殖させた。細胞増殖がOD6000.6(4.8×108個の細胞)に達すると、誘導の前に培養温度を18℃に下げた。細胞は、滅菌濾過したイソプロピル-b-D-チオガラクトピラノシド(IPTG、1mM)及び1mM硫酸鉄によって誘導した。誘導中の発酵パラメーターは、上記と同じであり、細胞はおよそOD6002(1.6×109個の細胞)まで終夜増殖させた。次いで、細胞は、18℃で15分間、4650rcfの遠心分離によって回収した。細胞ペレットは、pH7.4の1×リン酸緩衝生理食塩水(PBS)(10mM)又は1mM亜ジチオン酸ナトリウムを含有するpH8.0の1×PBS(およそ50mM)で3回洗浄し、4℃に保存した。
バイオ水素リアクター
発酵を通して得られたDH5α、DH5α-HGPC、ΔpfkA-HGPC又はΔgpmA-HGPCの細胞ペレットは、場合により1mMの亜ジチオン酸塩を有する、20 OD600でpH7.4の1×PBS(10mM)又はpH8.0の1×PBS(およそ50mM)中に再懸濁し、水素産生を試験及び測定するために100mLのサイドアームコニカルフラスコに入れた。フラスコは、懸濁した細胞に突き出ているpHプローブを有するゴム栓によって密封した。フラスコのサイドアームは、ガス容積を測定するために設計された特別注文の装置に接続された。コニカルフラスコの中にテフロン（登録商標）コートした磁気バーを入れ、フラスコを磁気撹拌プレートに置いた。コニカルフラスコのヘッドスペースに、D-グルコース(最終濃度20mM)の添加前に3倍容積の100%窒素ガスをパージし、細菌の水素形成を開始させた。実験は、およそ22℃の室温で実施した。
発酵を通して得られたDH5α、DH5α-HGPC、ΔpfkA-HGPC又はΔgpmA-HGPCの細胞ペレットは、場合により1mMの亜ジチオン酸塩を有する、20 OD600でpH7.4の1×PBS(10mM)又はpH8.0の1×PBS(およそ50mM)中に再懸濁し、水素産生を試験及び測定するために100mLのサイドアームコニカルフラスコに入れた。フラスコは、懸濁した細胞に突き出ているpHプローブを有するゴム栓によって密封した。フラスコのサイドアームは、ガス容積を測定するために設計された特別注文の装置に接続された。コニカルフラスコの中にテフロン（登録商標）コートした磁気バーを入れ、フラスコを磁気撹拌プレートに置いた。コニカルフラスコのヘッドスペースに、D-グルコース(最終濃度20mM)の添加前に3倍容積の100%窒素ガスをパージし、細菌の水素形成を開始させた。実験は、およそ22℃の室温で実施した。
水素、二酸化炭素及びpH測定
開始時(D-グルコース添加後すぐ)のバイオ水素リアクター及びガス産生がほとんど止まるまでおよそ15～20分ごとに、それぞれ、ヘッドスペースガス試料(5μL)及びpH測定を行い、記録した。ガス試料は、Shimadzu Nexis、カラムを有するGC-2030 (Restek社, ShinCarbon ST Micropacked GC Column, Cat. # 19808)及びGC法: SPL1温度100℃、カラム流速6mL/分、DTCD温度180℃、オーブン温度40℃を3分維持し、次いで15℃/分で170℃まで、170℃で2分間維持を使用して、解析した。キャリアガスはアルゴンであった。カラム指定、ShinCarbon ST、100/120 mesh、2m、1/16in. OD, 1.0mm)。
開始時(D-グルコース添加後すぐ)のバイオ水素リアクター及びガス産生がほとんど止まるまでおよそ15～20分ごとに、それぞれ、ヘッドスペースガス試料(5μL)及びpH測定を行い、記録した。ガス試料は、Shimadzu Nexis、カラムを有するGC-2030 (Restek社, ShinCarbon ST Micropacked GC Column, Cat. # 19808)及びGC法: SPL1温度100℃、カラム流速6mL/分、DTCD温度180℃、オーブン温度40℃を3分維持し、次いで15℃/分で170℃まで、170℃で2分間維持を使用して、解析した。キャリアガスはアルゴンであった。カラム指定、ShinCarbon ST、100/120 mesh、2m、1/16in. OD, 1.0mm)。
ガス標準(20%水素、20%窒素、20%一酸化炭素及び20%二酸化炭素[製造番号: PGS402470D];アルゴンバランスガスを含む10%水素、10%窒素、10%一酸化炭素及び10%二酸化炭素[製造番号: PGS402469D];及びアルゴンバランスガスを含む50%酸素[製造番号: PGS402471D2])を使用して、水素及び二酸化炭素の%濃度を決定した。酸素及び窒素ガスも測定し、実験中にコニカルサイドアームフラスコに漏れ出る空気をモニターした。ガス標準は、BOCオーストラリアによって供給された。
NMR解析
各試料につき、700μLの細胞培養を、2分間20,018rcfでの遠心分離によってペレットにした。上澄み液(600μL)を15mLのファルコンチューブに回収し、次いで-80℃で凍結した。試料は、次いで凍結乾燥し、酸化重水素(800μL)中に再懸濁した。再懸濁液をNMRチューブ(Norell Sample Vault Series, standard wall, closed cap, parameter 700MHz frequency, diam. x L 5mm×178mm, mfr no. Norell, SVCP-5-178-96PK)に入れた。全てのNMRスペクトルは5mm BBFO SmartProbeを備えたBruker AVIIIHD 400MHz NMR Spectrometerにおいて298Kで記録した。Topspin3.5を使用してスペクトルを処理及び解析した。1Hスペクトルを、64Kデータポイントにわたり8013Hz(20.0ppm)のスペクトル幅によって記録した。
各試料につき、700μLの細胞培養を、2分間20,018rcfでの遠心分離によってペレットにした。上澄み液(600μL)を15mLのファルコンチューブに回収し、次いで-80℃で凍結した。試料は、次いで凍結乾燥し、酸化重水素(800μL)中に再懸濁した。再懸濁液をNMRチューブ(Norell Sample Vault Series, standard wall, closed cap, parameter 700MHz frequency, diam. x L 5mm×178mm, mfr no. Norell, SVCP-5-178-96PK)に入れた。全てのNMRスペクトルは5mm BBFO SmartProbeを備えたBruker AVIIIHD 400MHz NMR Spectrometerにおいて298Kで記録した。Topspin3.5を使用してスペクトルを処理及び解析した。1Hスペクトルを、64Kデータポイントにわたり8013Hz(20.0ppm)のスペクトル幅によって記録した。
結果
大腸菌のDH5α-HPGC、ΔpfkA-HPGC、ΔgpmA-HPGC又はDH5α-H1-HEGF(petF及びFNRを欠損するHPGCである)株は、グルコースの添加後2時間以内に顕著な量のガスを産生する。水素産生の停止は、グルコースの完全な消費と相関した。ΔgpmA-HGPC(例えば、配列番号10)は、1モルのグルコース当たり0.95モルの水素を産生し;ΔpfkA-HPGCは、1モルのグルコース当たり0.85モルの水素を産生し; DH5α-HPGCは、1モルのグルコース当たり0.45モルの水素を産生し、DH5α-H1-HEFGは、1モルのグルコース当たり0.45モルの水素を産生した。
大腸菌のDH5α-HPGC、ΔpfkA-HPGC、ΔgpmA-HPGC又はDH5α-H1-HEGF(petF及びFNRを欠損するHPGCである)株は、グルコースの添加後2時間以内に顕著な量のガスを産生する。水素産生の停止は、グルコースの完全な消費と相関した。ΔgpmA-HGPC(例えば、配列番号10)は、1モルのグルコース当たり0.95モルの水素を産生し;ΔpfkA-HPGCは、1モルのグルコース当たり0.85モルの水素を産生し; DH5α-HPGCは、1モルのグルコース当たり0.45モルの水素を産生し、DH5α-H1-HEFGは、1モルのグルコース当たり0.45モルの水素を産生した。
水素ガス産生の最大速度は、22℃でのHPGC含有株と類似しており;1時間当たりの200 OD600で、細胞(L)当たり3.6+/-0.66Lの水素ガスである。速度は、HPGCを欠損するそれらの株では低く; DH5αのこれらの条件下では水素は検出されず、DH5α-H1-HEFGは、1時間当たり200 OD600で、細胞(L)当たり～1.2Lの水素ガスを生じ、それはpetF-FNRを欠損した。
十分に緩衝されない場合、pHが5以下まで落ちると水素産生が停止する。pHの低下は、有機酸、乳酸、コハク酸、ピルビン酸及び酢酸の産生により、ΔpfkA及びΔgpmA変異体は有機酸の産生が減少した(図2)。
(実施例2)
解糖系の下流を標的化することによる水素産生の速度
解糖系の下流を通るグルコースからの炭素の流れを減少させることの証拠は、図4に示す。遺伝子gpmM又はgpmAの欠損は、水素産生の速度を改善した。
解糖系の下流を標的化することによる水素産生の速度
解糖系の下流を通るグルコースからの炭素の流れを減少させることの証拠は、図4に示す。遺伝子gpmM又はgpmAの欠損は、水素産生の速度を改善した。
gnd及びzwfの発現の増加は、図4に示すように水素産生の速度も予期せず改善した。
図5は、ペントースリン酸経路(PPP)を通るグルコースからの炭素の流れを増加させることが、H2のCO2に対する比を増加させる証拠も提供する。グルコース中の全ての炭素がペントースリン酸経路を介してCO2に代謝され、産生された還元剤を使用してH2を生成する場合、嫌気性条件下での理論最大比は、2:1である。グルコースが解糖系を通過する場合、比は嫌気性条件下で1:1である。PPPを通る流れを増加させることは、グルコースから生成されるH2の全体的な収率を改善するであろう。
PPPを通る代謝の増加は、zwf及び/又はgndの活性及び/又は発現を増加させることによって達成され得る。或いは、これはpfkの活性を減少すること(Δpfkと記す)によって、6個の炭素を有する中間体による解糖系の部分から3個の炭素を有する中間体による解糖系の部分への流れを減少することによっても達成され得る。図5に示すデータは、zwfの発現の増加又はpfk活性の減少が、水素のCO2に対する比、したがってペントースリン酸経路を通る流れを増加させることを示す。gndが、zwfによってコードされる酵素と比較して、代謝経路の下流にある酵素をコードするため、この変異体のgndの活性の増加は、wtDH5αと比較してH2のCO2に対する比に著しく影響しない。
本明細書に開示及び定義される発明は、記載したか又は文脈若しくは図面から明らかな個々の特徴の2つ又はそれ以上の全ての代替の組合せにも及ぶことが理解されるであろう。これらの異なる組合せの全てが、本発明の様々な代替の態様を構成する。
Claims (34)
- 水素ガスを産生するための組換え微生物であって、
- 微生物が水素を産生できるようにする1つ又はそれ以上のタンパク質をコードする外因性核酸配列であって、
- 1つ又はそれ以上のタンパク質が、Fe-Fe依存性ヒドロゲナーゼ、好ましくはHydAを含み、
- 核酸配列が、微生物における核酸配列の発現を可能にする1つ又はそれ以上のプロモーターに作動可能に連結され、
- 微生物又は細胞が、ペントースリン酸経路を介して炭素の利用を促進する遺伝子改変を含む、
外因性核酸配列を含む組換え微生物。 - 核酸配列が、タンパク質フェレドキシンNADP還元酵素(FNR)及びフェレドキシンをコードする、請求項1に記載の組換え微生物。
- 核酸配列が、ヒドロゲナーゼの成熟及び活性化を可能にする少なくとも1つのアセンブリタンパク質をコードする、請求項1又は2に記載の組換え微生物。
- ペントースリン酸経路を介する炭素の利用を促進する遺伝子改変が、ホスホフルクトキナーゼ、ピルビン酸キナーゼ、グリセリン酸ムターゼ、6-ホスホグルコン酸デヒドラターゼ、及び2-ケト-3-デオキシ-6-ホスホグルコン酸アルドラーゼから選択される、微生物の1つ又はそれ以上の内因性タンパク質の活性又はレベルを減少又は阻害する、請求項1から3のいずれか一項に記載の組換え微生物。
- ペントースリン酸経路を介する炭素の利用を促進する遺伝子改変は、ペントースリン酸経路の1つ又はそれ以上のタンパク質及びNADPH制御タンパク質のレベル又は活性を増加させ、遺伝子改変が、a)1つ又はそれ以上のタンパク質をコードする遺伝子のプロモーター領域の改変又はb)異種遺伝子配列による、1つ又はそれ以上のタンパク質をコードする内因性遺伝子の置換である、請求項1から4のいずれか一項に記載の組換え微生物。
- FNR及びフェレドキシンタンパク質がコナミドリムシ由来であるか、又はコナミドリムシ由来のFNR及びフェレドキシン(Ferrodoxin)タンパク質の機能的に等価な相同体又は誘導体である、請求項2から5のいずれか一項に記載の組換え微生物。
- 少なくとも1つのアセンブリタンパク質が、HydEF及びHydG又はその機能的に等価な相同体又は誘導体から選択される、請求項3から6のいずれか一項に記載の組換え微生物。
- 核酸配列が、コナミドリムシ由来のHydEF及びHydG又はコナミドリムシ由来のHydEF、HydGタンパク質の機能的に等価な相同体若しくは誘導体をコードする、請求項7に記載の組換え微生物。
- Fe-Fe依存性ヒドロゲナーゼが、コナミドリムシ、ボルボックス・カルテリ、ランブル鞭毛虫、エントアメーバ・ヌタリ、イリオバクター・ポリトロパス(Ilyobacter polytrophus)、膣トリコモナス、メガスファエラ・ミクロヌシフォルミス、ベイロネラ・パルブラ、ベイロネラ・アティピカ、及びペプトクロストリジウム・ビファーメンタンからなる群から選択される微生物由来のHydAタンパク質又はその機能的に等価な相同体若しくは誘導体である、請求項1から8のいずれか一項に記載の組換え微生物。
- HydAタンパク質、又はその機能的に等価な相同体若しくは誘導体が、コナミドリムシ由来である、請求項9に記載の組換え微生物。
- 大腸菌(E.coli)の株である、請求項1から10のいずれか一項に記載の組換え微生物。
- 外因性核酸配列が、単一のポリヌクレオチド構築物で提供される、請求項1から11のいずれか一項に記載の組換え微生物。
- 外因性核酸配列が、コドン最適化され、微生物において最適化された発現を提供する、請求項1から12のいずれか一項に記載の組換え微生物。
- 細胞が水素を産生できるようにするタンパク質をコードする外因性核酸を含む大腸菌細胞であって、タンパク質がポリペプチドHydEF、HydG、HydA、フェレドキシン及びFNRを含む、からなる、又はから基本的になり、
HydEF、HydG、フェレドキシン及びFNRがコナミドリムシ由来であるか、又はコナミドリムシ由来のHydEF、HydG、フェレドキシン及びFNRの機能的に等価な相同体又は誘導体であり、及び
a)細胞が、ホスホフルクトキナーゼ、ピルビン酸キナーゼ、グリセリン酸ムターゼ、6-ホスホグルコン酸デヒドラターゼ、及び2-ケト-3-デオキシ-6-ホスホグルコン酸アルドラーゼからなる群から選択される1つ又はそれ以上の内因性タンパク質の活性又はレベルを減少又は阻害する遺伝子改変を含み;及び/又はb)細胞が、ペントースリン酸経路及びNADPH制御タンパク質の1つ又はそれ以上のタンパク質のレベル又は活性を増加させる遺伝子改変を含む、
大腸菌細胞。 - HydAタンパク質が、コナミドリムシ、ボルボックス・カルテリ、ランブル鞭毛虫、エントアメーバ・ヌタリ、イリオバクター・ポリトロパス(Ilyobacter polytrophus)、膣トリコモナス、メガスファエラ・ミクロヌシフォルミス、ベイロネラ・パルブラ、ベイロネラ・アティピカ、及びペプトクロストリジウム・ビファーメンタンからなる群から選択される微生物由来のHydAタンパク質又はその機能的に等価な相同体若しくは誘導体である、請求項14に記載の細胞。
- 微生物又は細胞微生物が、それぞれホスホフルクトキナーゼ、ピルビン酸キナーゼ、グリセリン酸ムターゼ、6-ホスホグルコン酸デヒドラターゼ、及び2-ケト-3-デオキシ-6-ホスホグルコン酸アルドラーゼをコードする、遺伝子pfkA、pps、gpmA/gpmM、edd及びedaの1つ又はそれ以上に相当する核酸配列を部分的又は完全に切り出す遺伝子改変を含む、請求項1から15のいずれか一項に規定の組換え微生物又は細胞。
- 遺伝子改変が、遺伝子において部分的な機能喪失変異を生じる、請求項16に記載の組換え微生物又は細胞。
- 遺伝子改変が、ホスホフルクトキナーゼ及び/又はグリセリン酸ムターゼの活性を減少又は阻害する、請求項16又は17に記載の組換え微生物又は細胞。
- ペントースリン酸経路の1つ又はそれ以上のタンパク質及びNADPH制御タンパク質が、ホスホグルコムターゼ、グルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼ、6-ホスホグルコノラクトナーゼ、グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ、6-ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ、トランスケトラーゼ、トランスアルドラーゼ(transldolase)、NADキナーゼ及び可溶性ピリジンヌクレオチドトランスヒドロゲナーゼからなる群から選択される、請求項5又は14に記載の組換え微生物又は細胞。
- 1つ又はそれ以上のタンパク質をコードする遺伝子のプロモーター領域が、gapA又はosmYpプロモーターによって置換されている、請求項5に記載の組換え微生物又は細胞。
- グルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼをコードするzwf遺伝子のプロモーターが、gapA又はosmYプロモーター又は嫌気的に誘導されたnar又はnirBプロモーターによって置換されている、請求項20に記載の組換え微生物又は細胞。
- 6-ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼをコードするgnd遺伝子のプロモーターが、gapA又はosmYプロモーターによって置換されている、請求項20又は21に記載の組換え微生物又は細胞。
- ホスホグルコムターゼをコードするpgi遺伝子のプロモーターが、gapA又はosmYプロモーターによって置換されている、請求項20から22のいずれか一項に記載の組換え微生物又は細胞。
- 6-ホスホグルコノラクトナーゼをコードするgpl遺伝子のプロモーターが、gapA又はosmYプロモーターによって置換されている、請求項20から23のいずれか一項に記載の組換え微生物又は細胞。
- グルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子(zwf)が、ザイモモナス・モビリス(Zygomonas mobilis)由来のzwf遺伝子によって置換されている、請求項19に記載の組換え微生物又は細胞。
- 6-ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子(gnd)が、コナミドリムシ由来のgnd遺伝子によって置換されている、請求項19に記載の組換え微生物又は細胞。
- グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子(gapA)が、クロストリジウム・アセトブチリカム由来のgapC遺伝子によって置換されている、請求項19に記載の組換え微生物又は細胞。
- 組換え微生物が、微生物又は細胞をエネルギー消費のためにスクロースを代謝できるようにするように1つ又はそれ以上のタンパク質をコードする核酸構築物を含み、好ましくは核酸構築物が、それぞれスクロースヒドロラーゼ、スクロースパーミアーゼ、及びスクロースホスホリラーゼをコードするcscA、cscB、及びsp遺伝子を含む、請求項1から27のいずれか一項に記載の組換え微生物又は細胞。
- 水素ガスを産生するための方法であって、
請求項1～28のいずれか一項に記載の細胞を提供する工程、
好適な培養培地中、及び細胞が水素ガスを産生できる好適な条件下で細胞を培養する工程
を含む方法。 - 細胞を培養する工程が、嫌気性条件下である、請求項29に記載の方法。
- 培養する工程が、ヒドロゲナーゼの成熟を可能にする1つ又はそれ以上の因子と細胞を接触させる工程を含む、請求項29又は30に記載の方法。
- 培養する工程が、好ましくは約20μMと等しいか又はそれより高い濃度で、第二鉄(鉄III)又は第一鉄(鉄II)の培養培地への供給を含む、請求項29から31のいずれか一項に記載の方法。
- 培養する工程が、約37℃以下、より好ましくは約35℃未満、約32℃未満、約30℃未満、約25℃未満、約20℃未満、好ましくは約10℃以上で実施される、請求項29から32のいずれか一項に記載の方法。
- 請求項1から28のいずれか一項に記載の微生物又は細胞を含む、水素ガスから電気を産生するための装置。
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