JP4746558B2 - 水素生産能力に関する遺伝子を改良された微生物、及びその微生物を用いた水素の製造方法 - Google Patents
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- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
- C12N9/0095—Oxidoreductases (1.) acting on iron-sulfur proteins as donor (1.18)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
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-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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- C12P3/00—Preparation of elements or inorganic compounds except carbon dioxide
-
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Description
一方、微生物による生物的水素生産方法は常温常圧の反応条件であること、そして発生するガスにはCOが含まれないためその除去も不要である。
このような観点から、微生物による生物的水素生産は燃料電池用燃料供給のより好ましい方法として、注目されている。
このうち、ピルビン酸由来の蟻酸より直接水素が発生する経路は、FHLシステムとして、多くの微生物が有している。
FHLシステムに関して、エシェリキア・コリでの報告がある。しかしながら、エシェリキア・コリにおけるFHLシステムに関して、非常に複雑な多数の酵素蛋白の複合体であることを示すモデル構造体が提示されているものの、水素の生成に関連する酵素蛋白をコードする遺伝子群の全容は明らかにされてはいない(非特許文献1)。
また、FHLシステムの機能に関して、fhlA遺伝子がFHLシステム複合体を構成する一部の酵素蛋白をコードする遺伝子への転写アクティベーター遺伝子であることが解析されている(非特許文献2)。
サウター・エム(Sauter,M.)ら、モレキュラー・ミクロバイオロジー(Molecular microbiology)、1992年、第6巻、p.1523−1532 シュレンソグ・ブイ(Schlensog,V.)ら、モレキュラー・ミクロバイオロジー(Molecular microbiology)、1990年、第4巻、p.1319−1327 ペンホールド・ディー・ダブル(Penfold, D.W.)ら、エンザイム・アンド・ミクロバイアル・テクノロジー(Enzyme and microbial technology)、2003年、第33巻、p.185−189
すなわち、本発明は蟻酸からの水素生産能を大きく向上させた微生物の創製と、この微生物を用いた水素の製造方法を提供することを課題とする。
(1) 蟻酸脱水素酵素遺伝子及びヒドロゲナーゼ遺伝子を有し、蟻酸ヒドロゲンリアーゼシステムの転写アクティベーター外来遺伝子を含有する微生物であって、蟻酸ヒドロゲンリアーゼシステムの転写アクティベーターが高発現されており、蟻酸から水素を生産させることの機能が向上していることを特徴とする微生物、
(2) さらに、蟻酸ヒドロゲンリアーゼシステムの形成を抑制する遺伝子が不活性化されていることを特徴とする前記(1)に記載の微生物、
(3) エシェリキア・コリの形質転換体であることを特徴とする前記(1)または(2)に記載の微生物、
(4) エシェリキア・コリがエシェリキア・コリW3110株(ATCC 27325)であることを特徴とする前記(3)に記載の微生物、
(5) エシェリキア・コリW3110/fhlA−pMW118株(独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター 受託番号FERM BP−10444)、
(6) エシェリキア・コリW3110 △hycA/fhlA−pMW118株(独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター 受託番号FERM BP−10443)、
(7) 前記(1)〜(6)のいずれかに記載の微生物を、好気的条件で培養後、さらに、嫌気的条件で培養し、次いで有機性基質を供給下、前記の培養した微生物を水素発生用溶液中で培養することを特徴とする水素の製造方法、
(8) 嫌気的条件下での培養時に、グルコースより代謝の遅い炭素源を用いることを特徴とする前記(7)に記載の水素の製造方法、及び
(9) グルコースより代謝の遅い炭素源が、ガラクトース、又はアラビノースであることを特徴とする前記(8)に記載の水素の製造方法、
に関する。
なお、本明細書および特許請求の範囲において記載した△hycAは、
本発明により、微生物を用いる有機性基質からの水素生産が実用的レベルで実施できるようになる。本発明の水素の製造方法により製造される水素は、化学的水素の製造方法により製造される場合とは異なり、製造される水素ガス中にCO(一酸化炭素)を含まないので、燃料電池の電極触媒の劣化の原因となるCOを除去する手段を講じることなく、燃料電池用燃料として好適に利用できる。
また、本発明の水素の製造方法は常温で実施可能なため、高温が必要な化学的水素の製造方法と異なり、昇温や冷却に要する時間が不要であるため、必要なときに直ちに水素発生の開始と停止が可能となる。また、前記昇温や冷却に必要な外部エネルギーが不要であるので、クリーンでかつ低コストで水素を製造できる。
なお、上記「高発現」とは、目的遺伝子(例えば、fhlA遺伝子)の発現量が増加されていることを意味し、目的遺伝子を2ケ以上有する場合や、目的遺伝子が一つであってもプロモーターの改変等により発現量が増加されている場合等も含む。
fhlA遺伝子の具体例としては、エシェリキア・コリK−12 W3110株のfhlA遺伝子が好ましく挙げられる。エシェリキア・コリK−12 W3110株のfhlA遺伝子の塩基配列は、GenBankに登録されている。GenBankに登録されているエシェリキア・コリK−12 W3110株のfhlA遺伝子の塩基配列を、配列番号13に示す。
本発明に用いるhycA遺伝子の具体例として、エシェリキア・コリK−12 W3110株のhycA遺伝子が好ましく挙げられる。エシェリキア・コリK−12 W3110株のhycA遺伝子の塩基配列は、GenBankに登録されている。GenBankに登録されているエシェリキア・コリK−12 W3110株のfhlA遺伝子の塩基配列を、配列番号14に示す。
また、hycA遺伝子(DNA)としては、該hycA遺伝子(DNA)と、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつFHLシステムの形成を抑制するタンパク質をコードするDNAが含まれる。ストリンジェントな条件は、前記fhlA遺伝子(DNA)における条件と同様である。
本発明による水素の製造方法は、本発明により得られる微生物を嫌気条件下に、有機性基質を供給する事により実施することが出来るが、3段階で構成する方法にて行うことが好ましい。
1段階目は、好気条件下にて微生物を培養する段階であることが好ましい。この段階においては、水素生産能を有していない微生物が得られる。2段階目は、1段階目で得られた水素生産能を有していない微生物を、水素生産能を有する微生物へと変換する段階であることが好ましい。3段階目は、2段階目で得られた水素生産能を有する微生物を用いて、水素製造を行う段階であることが好ましい。
本発明の微生物は、遺伝子工学的な処理を行っていない微生物よりも菌体あたりの水素生産能力が大きく向上し得る。
水素生産能を有していない微生物の水素生産能を有する微生物への変換は、嫌気的条件下で培養することが好ましい。嫌気的条件下での培養は攪拌培養が好ましい。嫌気条件下での攪拌培養開始時の微生物濃度は、約0.01〜80質量%(湿潤状態菌体質量基準)が好ましい。この際、微生物が水素生産能を獲得するためには、嫌気条件下での培養中に分裂増殖することがより好ましいが、分裂増殖することは必ずしも必須ではなく、分裂増殖しない場合においても、本発明のFHLシステムにおいて水素の生成がなされればよい。
嫌気的条件下において、培養液中の酸化還元電位が約−100〜−500mV程度、好ましくは約−200〜−500mV程度であるのがよい。培地の嫌気状態を調整する方法としては、培地中の溶存酸素を除去する方法であれば、いずれも好ましく用いることができ、例えば培地の加熱処理や減圧処理あるいは培地中への窒素ガス等のバブリングにより溶存ガスを除去する方法等が挙げられる。培養液中の溶存酸素の除去を行う具体的な方法としては、約13.33×102Pa以下、好ましくは約6.67×102Pa以下、より好ましくは約4.00×102Pa以下の減圧下で約1〜60分間、好ましくは約5〜60分間程度、脱気処理することにより、嫌気条件下での培養に用いる培養液を得ることができる。また、還元剤を水溶液に添加して嫌気的条件の水溶液を調製することもできる。用いる還元剤としては、例えばチオグリコール酸、アスコルビン酸、システィン塩酸塩、メルカプト酢酸、チオール酢酸、グルタチオン又は硫化ソーダ等が挙げられる。これら還元剤は、一種、あるいは数種類を組み合わせて用いることもできる。
上述の2段階目の水素生産機能を付与するための培養終了後、培地中にある水素生産能を有する微生物をそのまま使用することもできるし、一度微生物を分離したのちに、還元状態にある水素発生溶液に分離した微生物を加えて使用することもできる。いずれの場合であっても、培地又は水素発生溶液に有機性基質を供給することにより、微生物に水素を製造させることができる。
水素を製造させる方法としては、連続的にあるいは間欠的に例えば蟻酸類等の有機性基質を供給する方法(直接的供給方法)、あるいは微生物内代謝経路において蟻酸類に変換される糖類の化合物を供給する方法(間接的供給方法)等が挙げられる。上記直接的供給方法と間接的供給方法は、併用することも可能である。上記培地又は水素発生溶液に供給される有機性基質としては、蟻酸類等が好ましく挙げられる。
水素発生溶液としては、還元状態下の水素発生用溶液を用いる必要がある。この溶液の嫌気的条件として、水素発生用溶液の酸化還元電位が約−100〜−500mVであることが好ましく、約−200〜−500mVであることがさらに好ましい。
水素発生用溶液の微生物濃度は、約0.1〜80質量%(湿潤状態菌体質量基準)、好ましくは約0.1〜70質量%(湿潤状態菌体質量基準)、さらに好ましくは、微生物濃度は約10〜70質量%(湿潤状態菌体質量基準)が好ましい。
水素発生用溶液には、気体の発生が激しいため、消泡剤を加えることが好ましい。消泡剤は、公知のものを用いることができ、具体的には、例えばシリコーン系〔例えば、SI(Silicone)等〕又はポリエーテル系〔例えばPE−H(Polyether−High),PE−M(Polyether−Medium),PE−L(Polyether−Low)等〕などが好ましい。
本発明の水素の製造方法においては、主に水素と二酸化炭素からなるガスが生成され、基本的には一酸化炭素は生成されない。一般的に、現在の固体高分子型燃料電池の燃料を用いる場合には、一酸化炭素を除去するシステム(CO変成器、CO除去器等)を用いて、COの濃度は約10ppm以下に維持する必要がある。しかし本発明の水素の製造方法を燃料電池の燃料として用いたシステムでは、COが生成されないのでCOを除去するシステムが不要であり、装置を簡易化することができる。
また、本発明の水素の製造方法においては、水素製造時の反応容器の温度制御が容易である。例えば、従来の天然ガスから水素を製造する場合では約600℃以上の温度条件が必要となり、メタノールを用いた場合でも数百℃の温度条件が必要となる。一方、本発明の水素の製造方法では、反応容器の温度条件は常温であることが好ましい。従って、本発明による水素製造に於いては、昇温や冷却に要する時間が不要となり、必要なときに直ちに水素の発生と停止を行なうことが出来る。
エシェリキア・コリ株(FHLシステムの転写アクティベーター fhlAの高発現株)の作成
1) ゲノムDNAの抽出
エシェリキア・コリW3110株(ATCC27325)を、表1記載のLB培地(Luria-Bertani培地)10mLで37℃にて、一晩振盪培養を行い、GenomicPrep Cells and Tissue DNA Isolation Kit(Amersham Bioscience社製)にてゲノムDNAの抽出を行った。
上記1)にて取得したゲノムDNAから、下記のプライマー:
GGGGTACCTAAAATTCTAAATCTCCTATATGTTAG(配列番号1)
CGGGATCCTGCGTCATCTCATCGATGACAA(配列番号2)
を用い、サーマルサイクラー GeneAmp PCR System 9700(ABI社製)を使用してfhlA及びその上流のプロモータ領域を増幅した。増幅したDNA及びプラスミドpMW118(ニッポンジーン社製)をKpnI、BamHIにて制限酵素処理後、DNA ligation Kit ver 2.1(宝酒造(株)製)によりライゲーションを行い、ベクター fhlA−pMW118を得た。このベクターの構造図を図3に示す。
上記2)で得られたベクター fhlA−pMW118をエシェリキア・コリW3110株にエレクトロポレーション法により導入し、表2記載の培養培地(アンピシリン含有LB寒天培地)で培養して目的とするfhlA高発現株のコロニーを取得した。
上記の方法により得られたエシェリキア・コリW3110株のfhlAの高発現株の評価はリアルタイムRT−PCR法により行った。リアルタイムRT−PCR法は以下に記す方法に従った。まず、fhlAの高発現株及び野生株を、表1記載のLB培地にグルコース20mM(さらにfhlA高発現株についてはアンピシリン50mg/L)を添加した培地で、10時間嫌気培養した菌体から、RNeasy Mini Kit(QIAGEN社製)にてトータルRNAを抽出した。トータルRNA、下記fhlAのプライマー:
Fwd : AGATCGTTTCTGTCGTCACCG(配列番号3)
Rev : CCGGCATAACAACTCATAGTCG(配列番号4)
及びQuantiTect SYBR Green RT-PCR(QIAGEN社製)を用い、下表3記載の混合液を作成し、ABI Prism 7000 sequence detection system(ABI社製)によって、50℃にて、30分で逆転写、95℃にて、15分で熱変性を行った後、95℃、15秒→57℃、20秒→60℃、1分の条件で40サイクルの熱サイクルでDNAを合成した。PCRによるDNA増幅を経時的にモニタリングし、各サイクルでの蛍光強度を検出することにより、DNAの増幅曲線から算出されるCT値の差よりfhlAの発現差を調べた。その結果、fhlA高発現株は野生株に比べfhlAについて2倍以上の発現量があることが確かめられた。
実施例1により得られたエシェリキア・コリW3110株(fhlA遺伝子の高発現株)による微生物を用いた水素生産方法。
実施例1により得られたエシェリキア・コリW3110株(fhlA遺伝子の高発現株)を表1で示される組成の培養液10mL(実施例2)、200mL(実施例3)、2000mL(実施例4)にアンピシリン50mg/Lを各々添加し、好気的条件下、37℃で一晩振盪培養を行った。
次に好気的条件下、一晩振盪培養を行った培養液を遠心分離機にかけ(5000回転、15分)、上澄み液を除去した後の微生物を用いて、水素生産機能を有する微生物を得るために下表4で示される組成の培養液200mLにて37℃で、24時間(実施例2)、12時間(実施例3、4)の培養を行った。この時、微生物濃度を湿潤状態微生物質量基準で0.04質量%(実施例2)、1質量%(実施例3)、10質量%(実施例4)に設定して、嫌気条件下での培養を開始した。なお、pHは6.0を保つように適時5N水酸化ナトリウムの添加を行った。
上記2)の条件で培養した微生物を遠心分離により分離後、下表5記載の組成で示される水素発生用反応溶液50mLに懸濁した(微生物濃度約0.2質量% 湿潤状態菌体質量基準;以下、微生物懸濁水素発生溶液という。)。
微生物の水素生産能力の測定方法としては、蟻酸ナトリウムを滴下した直後に、発生するガスを水上置換法により集める方法により測定を行った。今回、蟻酸ナトリウムの添加から30秒間に発生するガス量より、水素生成初速度を求めた。なお、発生ガスをガスクロマトグラフィー(島津製作所製)により分析したところ、発生ガス中には50容積%の水素と残余のガス(炭酸ガス)を含んでいた。
結果を図1に示した。
エシェリキア・コリW3110株のfhlA遺伝子高発現かつhycA遺伝子破壊株の作成
エシェリキア・コリW3110株(ATCC 27325)を、表1記載のLB培地10mLで37℃にて一晩振盪培養を行い、GenomicPrep Cells and Tissue DNA Isolation Kit(Amersham Bioscience社製)にてゲノムDNAの抽出を行った。
上記1)にて取得したゲノムDNAから、下記プライマー:
CTCTGGATCCATTTCATCTTCGGGCGTGC(配列番号5)
CTCTGAGCTCAAAGGTCACATTTGACGGCG(配列番号6)
を用い、サーマルサイクラー GeneAmp PCR System 9700(ABI社製)を使用してhycA領域を増幅した。増幅したDNA及びプラスミドpHSG398(宝酒造(株)製)をBamHI、SacIで制限酵素処理後、DNA ligation Kit ver 2.1(宝酒造(株)製)によりライゲーションを行い、ベクター hycA−pHSG398を得た。さらに、得られたベクターをAvaII、XmnIで制限酵素処理後、DNA Blunting Kit(宝酒造(株)製)により平滑末端処理を行い、その後、8bpのEcoRIリンカーGGAATTCCと共にライゲーションし、△hycA−pHSG398を得た。
またpMV5 (Vertes,A.A. et al. Isolation and characterization of IS31831,a transposable element from Corynebacterium glutamicum. Mol. Microbiol. 11,739-746(1994))からPCRにて、下記プライマー:
CTCTGCATGCAACCCATCACATATACCTGC(配列番号7)
CTCTGCATGCATCGATCCTCTAGAGTATCG(配列番号8)
を用いて、sacB領域を増幅したもの及びプラスミドpTH18ks1(Hashimoto-Gotoh,T. et al. A set of temperature sensitive-replication /-segregation and temperature resistant plasmid vectors with different copy numbers and in an isogenic background (chloramphenicol,kanamycin,lacZ,repA,par,polA). Gene 241,185-191(2000))をBamHI、SphIで制限酵素処理したものを、ライゲーションにより連結し、ベクターsacB−pTH18ks1を得た。
得られたベクターsacB−pTH18ks1のBamHI、SacIサイトに△hycA−pHSG398の△hycA領域を挿入し、ベクター△hycA−sacB−pTH18ks1を得た。
このベクターの構造図を図4に示す。
上記の方法により得られたベクター△hycA−sacB−pTH18ks1をエシェリキア・コリW3110株にエレクトロポレーション法により導入した。下表6記載の培地にて43℃にて培養することで、相同組み換えが起こり、ベクターがエシェリキア・コリW3110株の染色体上に挿入された組み換え株を得た。
上記の方法により得られたエシェリキア・コリW3110株のhycA遺伝子の破壊株はシーケンサー Prism 3100 genetic analyzer(ABI社製)により、hycA領域の削除された株であることを確認した。
上記1)にて取得したゲノムDNAから、下記プライマー:
GGGGTACCTAAAATTCTAAATCTCCTATATGTTAG(配列番号9)
CGGGATCCTGCGTCATCTCATCGATGACAA(配列番号10)
を用い、サーマルサイクラー GeneAmp PCR System 9700(ABI社製)を使用してfhlAをコードするDNA及びその上流のプロモータ領域を増幅した。増幅したDNA及びプラスミドpMW118(ニッポンジーン社製)をKpnI、BamHIにて制限酵素処理後、DNA ligation Kit ver 2.1(宝酒造(株)製)によりライゲーションを行い、ベクター fhlA−pMW118を得た。
上記2)で得られたベクター fhlA−pMW118をhycA遺伝子破壊株にエレクトロポレーション法により導入し、表2の培地にて目的とするhycA遺伝子破壊かつfhlA遺伝子高発現株のコロニーを取得した。
上記の方法により得られたhycA遺伝子破壊かつfhlA遺伝子高発現株のfhlA遺伝子の高発現の評価はリアルタイムRT−PCR法により行った。リアルタイムRT−PCR法は以下に記す方法に従った。まず、fhlA遺伝子の高発現株及び野生株を、表1記載のLB培地にグルコース20mM(さらにfhlA遺伝子高発現株についてはアンピシリン50mg/L)を添加した培地で、10時間嫌気培養した菌体から、RNeasy Mini Kit(QIAGEN社製)にてトータルRNAを抽出した。トータルRNA、下記fhlAのプライマー:
Fwd : AGATCGTTTCTGTCGTCACCG(配列番号11)
Rev : CCGGCATAACAACTCATAGTCG(配列番号12)
及びQuantiTect SYBR Green RT-PCR(QIAGEN社製)を用い、表4の混合液を作成し、ABI Prism 7000 sequence detection system(ABI社製)によって、50℃にて30分で逆転写、95℃にて15分で熱変性を行った後、95℃、15秒→57℃、20秒→60℃、1分の条件で40サイクルの熱サイクルでDNAを合成し、各サイクルでの蛍光強度を検出することにより、DNAの増幅曲線から算出されるCT値の差よりfhlAの発現差を調べた。その結果、hycA破壊かつfhlA高発現の株は、野生株に比べfhlAについて5倍以上の発現量があることが確かめられた。
上記の如くして、本実施例により形質転換されたエシェリキア・コリW3110株はエシェリキア・コリW3110 △hycA/fhlA−pMW118と命名され、独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに寄託されている(受託番号:FERM BP−10443)。
実施例5により得られたエシェリキア・コリW3110株(fhlA遺伝子高発現かつhycA遺伝子破壊株)を用いた水素生産方法。
実施例5により得られたエシェリキア・コリW3110株(fhlA遺伝子高発現かつhycA遺伝子破壊株)を表1で示される組成の培養液10mL(実施例6)、200mL(実施例7)、2000mL(実施例8)にアンピシリンを各々50mg/L添加し、好気的条件下、37℃で一晩振盪培養を行った。
次に好気的条件下、一晩振盪培養を行った上記1)の培養液を遠心分離機にかけ(5000回転、15分)、上澄み液を除去した後の微生物を用いて、水素生産機能を有する微生物を得るために表4で示される組成の培養液200mLにて37℃で24時間(実施例6)、12時間(実施例7、8)の培養を行った。この時、微生物濃度を湿潤状態微生物質量基準で0.04質量%(実施例6)、1質量%(実施例7)、10質量%(実施例8)に設定して、嫌気条件下での培養を開始した。なお、pHは6.0を保つように適時5N水酸化ナトリウムの添加を行った。
上記2)の条件で培養した微生物を遠心分離により分離後、表5の組成で示される水素発生用反応溶液50mLに懸濁した〔微生物濃度約0.2質量%(湿潤状態菌体質量基準);以下、微生物懸濁水素発生溶液という〕。
上記で作成した微生物懸濁水素発生溶液に、溶液の蟻酸ナトリウム濃度が100mMとなるように蟻酸ナトリウムを添加し、微生物の水素生産能力を測定した。
水素生産能力の測定方法としては、蟻酸ナトリウムを滴下した直後に、発生するガスを水上置換法により集める方法により測定を行った。今回、蟻酸ナトリウムの添加から30秒間に発生するガス量より、水素生成初速度を求めた。なお、発生ガスをガスクロマトグラフィー(島津製作所製)により分析したところ、発生ガス中には50容積%の水素と残余のガス(炭酸ガス)を含んでいた。
これらの結果を図1に示す。
エシェリキア コリW3110株(ATCC 27325)を用いた水素生産方法。
野生株のエシェリキア・コリW3110(ATCC 27325)を用い、以下の実施例と対応する以下の条件、方法で好気培養、嫌気培養後の水素発生初速度を測定した。
比較例1は、実施例2及び実施例6と対応する同様の条件、方法
比較例2は、実施例3及び実施例7と対応する同様の条件、方法
比較例3は、実施例4及び実施例8と対応する同様の条件、方法
それらの結果を図1に併せ示した。
また、実施例2、実施例6、比較例1により得られたそれぞれの株での嫌気培養時における増殖曲線を図2に示した。
本発明によるfhlA遺伝子に係る高発現株(実施例2,3,4)は、野生株(比較例1,2,3)と比較して顕著に水素発生速度が向上していることが明確である。実施例6、7、8の株では、fhlA高発現とhycA破壊による相乗効果が見られ、野生株及びfhlA高発現株に比べ、一段と優れた水素発生機能の向上が認められる。
また、図2からは、本発明の組換え微生物は野生株に比べ、より効率的な、高い水素生産機能を有する微生物の取得(培養)が可能なことを示している。
実施例5により得られたエシェリキア・コリW3110株(fhlA遺伝子高発現かつhycA遺伝子破壊株)を用いて、嫌気条件下での水素生産能を付与するための培養をそれぞれ、表8で示される嫌気的培養液にて24時間の培養を行う以外は、実施例8と同様に培養を行い、水素生産能力の検討をいった。図5は、嫌気的条件下で使用した炭素源(グルコース、ガラクトース、アラビノース)の濃度変化を、高速液体クロマトグラフィーを用いて測定した結果を示したものである。図6は、それぞれの炭素源を用いた場合の水素発生初速度を示したものである。
図5から、ガラクトース、アラビノースがグルコースよりも代謝の遅い炭素源であることが確認できた。図6から、グルコースよりも代謝の遅い炭素源(ガラクトース、アラビノース)を用いることにより、より高い水素生産能を有する微生物の取得(培養)が可能となることが、明らかとなった。
Claims (6)
- 蟻酸脱水素酵素遺伝子及びヒドロゲナーゼ遺伝子を有し、fhlA外来遺伝子を含有し、蟻酸ヒドロゲンリアーゼシステムの転写アクティベーターが高発現され、hycA遺伝子が不活性化している、蟻酸から水素を生産する機能が向上していることを特徴とするエシェリキア・コリ。
- エシェリキア・コリW3110株(ATCC 27325)を用いて作製されたものであることを特徴とする請求項1に記載のエシェリキア・コリ。
- エシェリキア・コリW3110△hycA/fhlA−pMW118株(独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター 受託番号FERM BP−10443)。
- 請求項1〜3のいずれかに記載のエシェリキア・コリを、好気的条件で培養後、さらに、嫌気的条件で培養し、次いで有機性基質を供給下、前記の培養したエシェリキア・コリを水素発生用溶液中で培養することを特徴とする水素の製造方法。
- 嫌気的条件下での培養時に、グルコースより代謝の遅い炭素源を用いることを特徴とする請求項4に記載の水素の製造方法。
- グルコースより代謝の遅い炭素源が、ガラクトース、又はアラビノースであることを特徴とする請求項5に記載の水素の製造方法。
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