CN110669751A - 一种丙氨酸消旋酶的突变体酶蛋白及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种丙氨酸消旋酶的突变体酶蛋白及其制备方法。根据同源序列二级结构比对结果，通过定点突变技术将腾冲嗜热厌氧菌中丙氨酸消旋酶的173、360两个位点分别突变，构建双点突变表达载体pET‑S173Q/Q360Y，通过原核表达、纯化获得酶蛋白。所获得的突变体蛋白对底物L‑Ala的表观二级速率常数k _cat /K _m 为18.44 s^‑1·mM^‑1，平衡常数K _eq(L/D)为3.95，是野生型蛋白的68.30和3.69倍，且突变体蛋白的半衰期也有一定程度的提升。由于突变体蛋白可以提高反应产物D‑Ala的转化效率，因此，本突变体可以作为生物合成D‑Ala的元器件，有较好的应用价值。

Description

一种丙氨酸消旋酶的突变体酶蛋白及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种原核生物来源的丙氨酸消旋酶的突变体酶蛋白，属于基因工程和酶工程技术领域。

背景技术

丙氨酸消旋酶（Alanine racemase, Alr, EC 5.1.1.1）是一种以磷酸吡哆醛（Pyridoxal 5′-phosphate, PLP）为辅酶，具有催化L-丙氨酸和D-丙氨酸之间相互转化的功能，归类于异构酶家族。反应如下所示：

L-alanine ⇄ D-alanine

丙氨酸消旋酶主要来自原核生物，其催化反应产物D-丙氨酸是非天然氨基酸中的一类，D-丙氨酸不仅是细菌细胞壁肽聚糖层四肽尾的重要组成成分之一，在药物合成、食品、饲料和化妆品等行业也有着非常广泛的应用前景。

目前合成D-丙氨酸的方法主要有化学合成法、微生物发酵法和生物酶法三种，这三种方法各有其优缺点：化学合成法反应机制复杂、工艺过程长且生产成本较高；微生物法周期长、设备成本高，产物含量低，分离纯化困难；生物酶法有较好的区域和立体选择性、反应条件温和、操作简便、污染少等优点，但存在着酶蛋白稳定性差、活性低、生产成本高等不足。因此，开发一种高效的D-丙氨酸合成途径一直是广大科研工作者的关注点之一。

日本京都大学Kenji Soda教授曾提出利用甲酸脱氢酶、L-丙氨酸脱氢酶、丙氨酸消旋酶和D-氨基酸转氨酶四酶偶联合成D-氨基酸（Galkin et al., 1997）的思路，该方法实现了辅酶NADH的循环再生，降低了合成D-氨基酸的生产成本。然而，由于丙氨酸消旋酶催化反应为可逆平衡反应，其平衡常数K _eq(L/D）接近1.0，这决定了其反应产物D-丙氨酸的理论转化率不超过50%，使得反应液中D、L-丙氨酸并存（反应平衡状态下，二者比率接近1：1），增加了后续分离纯化获得D-丙氨酸的工艺复杂性。因此，开发获得具有高催化活性、稳定性好和转化效率高的丙氨酸消旋酶对于生物合成D-丙氨酸具有非常重要的意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种酶活力高、稳定性好和转化效率提高的原核生物来源的丙氨酸消旋酶的突变体酶蛋白。

本发明的目的还在于提供一种丙氨酸消旋酶的突变体酶蛋白的制备方法。

本发明的目的是这样实现的。本发明提供的一种丙氨酸消旋酶的突变体酶蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。其中：

（1）SEQ ID No.1所示的丙氨酸消旋酶的氨基酸序列中第173位的丝氨酸（S）突变为谷氨酰胺（Q）；

（2）SEQ ID No.1所示的丙氨酸消旋酶的氨基酸序列中第360位的谷氨酰胺（Q）突变为酪氨酸（Y）。

本发明还提供编码上述突变体酶蛋白的基因，其核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

本发明还提供含有上述基因的表达载体及宿主细胞。

本发明还提供含有上述基因的工程菌。

本发明还提供上述突变体酶蛋白的制备方法，包括以下步骤：

（1）根据NCBI数据库中公开的来自腾冲嗜热厌氧菌的丙氨酸消旋酶的氨基酸序列，通过与同源蛋白的序列比对确定突变位点，设计定点突变的突变引物对；

所述的173位突变引物为：

S173Q-F01： 5′-TGCTGCCGCACAGGAAGATGAT-3′；

S173Q-R01： 5′- ATCATCTTCCTGTGCGGCAGCA-3′；

所述的360位突变引物为：

Q360Y-F01： 5′-AACTATTCCTTATGAAGTTTTTTCT-3′；

Q360Y-R01： 5′-AGAAAAAACTTCATAAGGAATAGTT-3′；

（2）以携带丙氨酸消旋酶基因的载体为模板，使用上述设计的引物依次进行PCR扩增，PCR扩增产物经限制内切酶DpnI酶切处理后转入大肠杆菌E. coli中，筛选获得突变质粒；

（3）将上述突变质粒转化可表达目的基因的工程菌中，随工程菌的复制表达获得突变体酶蛋白。

所述制备方法的优选条件：步骤（2）中所述表达载体为pET系列中的任意一种；步骤（3）中所述工程菌为BL21(DE3)。

本发明进一步提供上述突变体酶蛋白的应用，具体是将突变体酶蛋白用于转化产生D-丙氨酸。

具体地，本发明是从腾冲嗜热厌氧菌（Thermoanaerobacter tengcongensis）中获得丙氨酸消旋酶基因（alr _Tt ，GenBank ID. AAM24437.1），在与同源蛋白序列比对的基础上确定突变位点，基于定点突变技术（Site-directed Mutagenesis）依此取代原有氨基酸位点，构建突变质粒pET-S173Q/Q360Y；该质粒转化大肠杆菌感受态细胞，构建用于突变体酶蛋白表达的基因工程菌BL21(DE3)/ pET-S173Q/Q360Y，在37℃、180 rpm和1 mM IPTG条件下获得了较好的表达。以表观二级速率常数k _cat /K _m 和反应平衡常数K _eq(L/D)表示，突变体蛋白S173Q/Q360Y的催化效率和反应平衡常数分别是野生型蛋白TtAlr的68.30倍和3.69倍。

突变体的表观二级速率常数和反应平衡常数提高的倍数：

腾冲嗜热厌氧菌丙氨酸消旋酶的突变体核苷酸序列为：SEQ ID NO: 2，氨基酸序列为：SEQ ID NO: 1。

本发明取得的有益效果如下：本发明基于氨基酸序列同源比对结果确定突变位点，通过定点突变技术（Site-directed Mutagenesis）构建获得丙氨酸消旋酶突变体蛋白S173Q/Q360Y，以表观二级速率常数k _cat /K _m 和反应平衡常数K _eq(L/D)表示，突变体蛋白的活性和转化率都有明显提高。

附图说明

图1为PCR扩增产物的电泳图谱。

图1中M：DNA marker；1：基因alr _Tt 的PCR产物。

图2为质粒pMD-TtAlr及pET-22b(+)双酶切电泳检测图。

图2中1&2：经双酶切处理的质粒pMD-TtAlr；M：DNA marker；3：经双酶切处理的质粒pET-28a。

图3为定点突变PCR产物及pET-TtAlr双酶切电泳检测图。

图3A中M：DNA marker；1：173位点突变PCR产物；2：173/360双点突变PCR产物。

图3B中M：DNA marker；3：经双酶切处理的质粒pET-S173Q；4：经双酶切处理的质粒pET-S173Q/Q360Y。

图4为纯化蛋白的SDS-PAGE图。

图4中M：Protein marker；1：野生型蛋白TtAlr；2：突变蛋白S173Q/Q360Y。

图5为突变体蛋白S173Q/Q360Y与TtAlr的热稳定性比较图。

图5中□—□：野生型蛋白TtAlr；△—△：突变体蛋白S173Q/Q360Y。

图6为突变蛋白S173Q/Q360Y与TtAlr的转化效率比较图。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1 克隆丙氨酸消旋酶基因alr _Tt 及构建表达载体

（1）alr基因获得

根据腾冲嗜热厌氧菌（Thermoanaerobacter tengcongensis）中丙氨酸消旋酶基因（alr _Tt ，GenBank ID. AAM24437.1）设计引物，以T. tengcongensis基因组DNA为模板，PCR扩增获得1个特异的DNA条带（图1）。基因alr _Tt 扩增引物为：

TtAlr-F01：5′-GCTAGCGTGAAATTTGACGGGGTAAGA-3′（下划线为NheI酶切位点）；

TtAlr-R01：5′-CTCGAGCTTTAAGTAATTTACTTCTCCA-3′（下划线为XhoI酶切位点）；

PCR扩增反应条件为：95℃预热4 min；95℃变性45sec，55℃退火1min，72℃延伸2min，重复25个循环；72℃延伸10min。

扩增得到的DNA片段，经琼脂糖凝胶回收后，与载体pMD-19T连接，连接产物转化至大肠杆菌E. coli DH5α，经菌落PCR验证后，挑取阳性菌落培养、提取质粒pMD-TtAlr，送测序公司测序验证。序列比对发现所克隆基因序列与GenBank（AAM24437.1）中的丙氨酸消旋酶alr _Tt 基因序列完全一致（100%）。

（2）表达载体构建

质粒pMD-TtAlr与质粒pET-28a分别经NheI和XhoI双酶酶切（图2），目的DNA片段经胶回收后，以T4 DNA连接酶于16℃过夜连接，随后将连接产物转入大肠杆菌E. coli DH5α中，筛选阳性克隆，获得表达载体pET-TtAlr。

实施例2 突变体S173Q/Q360Y表达载体构建

（1）设计突变引物

按照丙氨酸消旋酶TtAlr待突变位点S173和Q360周边核苷酸序列，设计以下2对定点突变引物：

173位点突变引物为：

S173Q-F01： 5′-TGCTGCCGCACAGGAAGATGAT-3′；

S173Q-R01： 5′- ATCATCTTCCTGTGCGGCAGCA-3′；

360位点突变引物为：

Q360Y-F01： 5′-AACTATTCCTTATGAAGTTTTTTCT-3′；

Q360Y-R01： 5′-AGAAAAAACTTCATAAGGAATAGTT-3′；

（2）突变体S173Q表达载体构建

采用定点突变技术（Site-directed mutagenesis）,以表达质粒pET-TtAlr为模板，以173位突变引物为PCR扩增引物，PCR扩增反应条件为：94℃预变性4 min；94℃变性45 sec，55℃退火30sec，72℃延伸7min，循环16次；72℃充分延伸10min，取5 μL PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测（图3A，lane 1）。

PCR产物经限制性内切酶DpnI 37℃酶切处理3 h，随后置于80℃金属浴热激5 min使酶失活，冷却后将酶切产物转化至大肠杆菌DH5α中，涂布于含Kan抗性的LB平板上过夜培养；挑取单一菌落培养后提取质粒，通过双酶切及测序验证所获得的突变载体pET-S173Q（图3B，lane 3）。

（3）双点突变体S173Q/Q360Y表达载体构建

以质粒pET-S173Q为PCR模板，以360位点突变引物为PCR扩增引物，按照173位点突变反应条件进行PCR反应，构建双点突变体表达载体pET-S173Q/Q360Y（图3A，lane 2），通过双酶切和测序验证所获得的双点突变表达载体（图3B，lane 4）。

实施例3 突变体蛋白及野生型蛋白的表达与纯化

将表达载体pET-TtAlr和pET-S173Q/Q360Y分别转化至大肠杆菌感受态细胞BL21(DE3)中，挑取单一菌落接种于LB液体培养基（含35 μg/mL卡那霉素），37℃恒温振荡培养；次日，培养液以1：100接种于100mL 含卡那霉素的LB液体培养基中，37℃，200 rpm培养至OD₆₀₀值为0.5-0.6，加入诱导剂IPTG（终浓度为1.0 mM），于30℃，180 rpm诱导培养5 h。

4℃，8000 rpm离心10 min收集菌体，弃上清，加入10 mL细胞裂解液重悬菌体，通过超声破碎法裂解菌体，采用Ni-NTA亲和层析法纯化蛋白，以含有500 mM的咪唑洗脱液洗脱蛋白，获得纯化的野生型蛋白TtAlr和突变体蛋白S173Q/Q360Y。

纯化后的蛋白经SDS-PAGE（12.5%）检测，如图4所示，两泳道均有清晰且单一的蛋白条带，说明纯化效果良好；目的蛋白分子量大小均约为46.6 kDa，与理论分子量基本一致。

实施例4 丙氨酸消旋酶及突变体蛋白的活性检测

（1）相对酶活测定

将由实施例3得到的蛋白TtAlr和S173Q/Q360Y各取等量蛋白（3.12 μg），与含有碳酸氢钠-氢氧化钠缓冲液（25mM，pH 10.3）、辅酶PLP（10μM）及底物L-丙氨酸（50mM）的混合溶液迅速混合，反应体系为200μL，于65℃水浴反应10min，以2M HCl终止反应，旋即以2M NaOH中和多余的HCl；取50μL反应产物，与150 μL含有Tris-HCl（200 mM，pH 8.0），4-Aminoantipyrine，TOOS（0.1mg/mL），Peroxidase（2 units）和D-氨基酸氧化酶（0.1 unit）的溶液混合，混合液置于37℃反应20min，以酶标仪（Epoch MicroplateSpectrophotometer，BioTek，USA）测定550nm下的吸光值，每组做3个平行实验，取平均值计算相对酶活。

以BSA替代酶蛋白作为阴性对照，以蛋白TtAlr的相对活力为100%，与之相比，突变体蛋白S173Q/Q360Y的相对活力约为319.95%，约为野生型的3.2倍（表1）。

表1 酶蛋白的相对酶活及动力学常数表

(2) 酶动力学参数测定

酶活活力单位（unit）定义：1min内将L-丙氨酸或D-丙氨酸催化生成1μmol对映异构体所需要的酶量。

在含有25mM碳酸氢钠-氢氧化钠缓冲液（pH 10.3）和10 μM辅酶PLP混合液中，改变底物L-丙氨酸或D-丙氨酸的浓度（5-200 mM），加入由实施例3得到的酶蛋白（2.8 μg）后迅速混匀（反应体系为40 μL），65℃恒温水浴反应10min，以2M HCl终止反应2min，迅速加入2MNaOH中和多余的HCl，4℃下12000 rpm离心15 min。

反应液经OPA试剂衍生后，取衍生产物10 μL注入液相色谱柱Nova-Pack C18column (4 μm, 3.9×300 mm; Waters, USA)，通过荧光检测器（RF20A, Shimadzu,Kyoto, Japan）检测L-丙氨酸或D-丙氨酸衍生物。根据峰面积计算不同底物浓度下L-丙氨酸和D-丙氨酸的量，根据GraphPad软件提供的非线性拟合法计算各酶蛋白的动力学常数K _m 、V _max 、k _cat 及k _cat /K _m 值。由表1可见，以表观二级速率常数k _cat /K _m 表示，突变体S173Q/Q360Y对L-丙氨酸及D-丙氨酸的催化效率分别是野生型蛋白TtAlr的68.30倍和18.68倍；突变体蛋白S173Q/Q360Y的反应平衡常数K _eq (L/D)为3.95，是野生型蛋白的3.69倍，说明173和360两个位点突变后打破了丙氨酸消旋酶催化L-丙氨酸与D-丙氨酸之间相互转化的动态平衡，使之具备了更好地将L-丙氨酸转化为D-丙氨酸的能力。

实施例5 丙氨酸消旋酶热稳定性测定

将实施例3得到的酶蛋白TtAlr和S173Q/Q360Y溶于碳酸氢钠-氢氧化钠缓冲液（25mM，pH 10.3）中，置于65℃下恒温水浴处理，随后加入底物L-丙氨酸（终浓度为50mM）开始反应，测定酶蛋白在65℃不同处理时间的残余活力，以初始酶活力为100%，确定各蛋白的热稳定情况。由图5可见，野生型蛋白TtAlr的半衰期在0.5 h-1.0 h之间，突变体蛋白S173Q/Q360Y的半衰期为3h，比TtAlr的半衰期延长超过2h，说明173和360位点突变后导致酶蛋白的稳定性增强。

实施例6 产物D-丙氨酸转化能力测定

分别移取由实施例3得到的酶蛋白TtAlr和S173Q/Q360Y（终浓度均为0.08 μg/μL），与含有25mM碳酸氢钠-氢氧化钠缓冲液（pH 10.3）、10 μM辅酶PLP和50 mM L-丙氨酸溶液混合（总体积为40 μL），于65℃反应30 min，终止反应后于4℃下12000 rpm离心15 min。

反应液经OPA试剂衍生后，采用高效液相色谱法检测衍生产物中L-ala和D-ala的含量（参见实施例4）。由图6可得，野生型蛋白TtAlr的催化反应产物中D-丙氨酸为22.22mM，转化率为44.44%；而突变体蛋白S173Q/Q360Y的催化反应产物中D-丙氨酸为26.85 mM，转化率为53.70%；与野生型蛋白相比，突变体蛋白的转化率提高了9.26%，D-丙氨酸的生成量提高了20.84%。这些数据说明了突变体蛋白S173Q/Q360Y所参与的催化反应更偏向于将L-丙氨酸转化生成D-丙氨酸，这将有益于利用该蛋白参与D-丙氨酸的生物合成。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (6)

1.一种丙氨酸消旋酶的突变体酶蛋白，其特征在于其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，其中：

SEQ ID No.1所示的丙氨酸消旋酶的氨基酸序列中第173位的丝氨酸（S）突变为谷氨酰胺（Q）；

（B）SEQ ID No.1所示的丙氨酸消旋酶的氨基酸序列中第360位的谷氨酰胺（Q）突变为酪氨酸（Y）。

2.一种编码如权利要求1所述突变体酶蛋白的基因，其特征在于其核苷酸序列如SEQID No.2所示。

3.一种制备如权利要求1所述突变体酶蛋白的方法，其特征在于包括以下步骤：

（1）根据NCBI数据库中公开的来自腾冲嗜热厌氧菌中的丙氨酸消旋酶的氨基酸序列，在与同源蛋白的氨基酸序列比对的基础上确定突变位点；设计定点突变所需的引物；

所述的173位的突变引物为：

S173Q-F01： 5′-TGCTGCCGCACAGGAAGATGAT-3′；

S173Q-R01： 5′- ATCATCTTCCTGTGCGGCAGCA-3′；

所述的360位的突变引物为：

Q360Y-F01： 5′-AACTATTCCTTATGAAGTTTTTTCT-3′；

Q360Y-R01： 5′-AGAAAAAACTTCATAAGGAATAGTT-3′；

以携带腾冲嗜热厌氧菌中丙氨酸消旋酶基因的载体为模板，使用上述设计的引物，利用定点突变技术，构建173和360两个位点突变的突变质粒；

（3）将上述突变质粒转化可表达目的基因的工程菌中，随工程菌的复制表达该突变体酶蛋白。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：步骤（2）中表达载体为pET-28a。

5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：步骤（3）中工程菌为BL21(DE3)。

6.一种如权利要求1所述突变体酶蛋白的应用，其特征在于用于L-丙氨酸和D-丙氨酸之间的消旋反应，以及生物合成D-丙氨酸。

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