CN114958792B - 一种重组表达型烟酰胺磷酸核糖转移酶突变体及其应用 - Google Patents

一种重组表达型烟酰胺磷酸核糖转移酶突变体及其应用 Download PDF

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本发明公开了一种重组表达型烟酰胺磷酸核糖转移酶突变体及其应用，本发明提出的突变体与MrNampt氨基酸序列SEQ ID NO:2相比应至少存在第366、368、369位点的多个突变。本发明属于分子生物学与生物技术领域，具体是指一种重组表达型烟酰胺磷酸核糖转移酶突变体及其应用；本发明通过应用SwissModel对MrNampt蛋白进行三维结构建模及分析，实现了快速锁定蛋白的活性中心功能结构的技术效果；通过PSI‑Blast与web‑logo配合，增加了可突变位点的选择数量的同时为突变位点的不同功能保守性组合选择方向；此外，为了解决野生型菌株Nampt酶活性低下的问题，本发明采用了多位点氨基酸组合型突变方式，实现了突变体Nampt酶活性显著高于野生型菌株的技术效果，为工业上大规模生产NMN提供了应用价值。

Description

一种重组表达型烟酰胺磷酸核糖转移酶突变体及其应用
技术领域
本发明属于分子生物学与生物技术领域，具体是指一种重组表达型烟酰胺磷酸核糖转移酶突变体及其应用。
背景技术
在现阶段的应用中，烟酰胺单核苷酸（nicotinamide mononucleotide，缩写成NMN）多采用生物酶法进行合成，已有多篇文献和专利报道生物酶法合成NMN的路线方案，早在1957年，Jack等人以PRPP和烟酰胺为底物，在人红细胞提取物的催化下生成了NMN；1994年，Jeck等人利用NAD为原料，在马铃薯NAD焦磷酸化酶的催化水解下生成NMN；2016年邦泰生物公司以烟酰胺、焦磷酸、盐和AMP为原料，在烟酰胺磷酸核糖转移酶和腺嘌呤磷酸核糖转移酶催化下获得了NMN，这种通过体外全酶催化法获得的NMN被应用于生产预防和治疗听力损失疾病的药物，经临床实验证实，通过口服和注射该药物，有效地缓解了听力障碍；2018年尚科生物公司以D-5-磷酸核糖和NAM为原料，在ATP存在下，通过固定化共表达淀粉芽孢杆菌来源的PRPP和烟酰胺磷酸核糖转移酶的全细胞催化一步实现NMN的生物合成。
烟酰胺磷酸核糖转移酶（nicotinamide phospho ribosyltransferase，缩写成Nampt）是一种由Nampt基因编码、分子量为52 kDa的多功能蛋白，Nampt可以催化NAM和PRPP合成NMN，通过体外补充NMN有望减轻辅酶I相关的生理功能衰退并改善阿尔茨海默症、II型糖尿病等相关病理的生理进程，因而如何低成本高效率的获得高产量的NMN已经成为各大食品、药品行业的研究热点，而作为催化酶的Nampt成为了关键性影响因素，然而现有技术主要存在以下问题：
A：天然的Nampt普遍酶活力较低，生产成本高且生产效率低下，产品缺乏市场竞争力；
B：现有技术可以通过人工基因突变获得Nampt突变体，然而存在可突变位点少的问题，因而无法挖掘出更多可用的突变位点；
C：突变位点选择方向不定，增加工作量和投入成本；
D：突变采取的方式单一，导致效率低下及无法获得更有价值的突变体菌株。
发明内容
针对上述情况，为克服现有技术的缺陷，本发明提出了一种重组表达型烟酰胺磷酸核糖转移酶突变体及其应用，为了解决突变位点选择方向不定、突变位点少、筛查工作量大的问题，本发明通过应用SwissModel对MrNampt蛋白进行三维结构建模及分析，实现了快速锁定蛋白的活性中心功能结构的技术效果，同时通过PSI-Blast与web-logo配合，实现了对目标蛋白活性中心功能结构的氨基酸进行保守性分析，增加了可突变位点的选择数量的同时为突变位点的不同功能保守性组合选择提供方向；此外，本发明选择的中度保守氨基酸位点进行突变的方式，破除了现有技术聚焦功能高度保守结构氨基酸的壁垒，为挖掘更多有利突变提供了参考性依据；为了解决野生型菌株Nampt酶活性低下的问题，本发明采用了多位点氨基酸组合型突变方法，实现了突变体Nampt酶活性显著高于野生型菌株的技术效果，为工业上大规模生产NMN提供了应用价值。
为了达到上述目的，本发明采取的技术方案如下：本发明提出了一种重组表达型烟酰胺磷酸核糖转移酶突变体及其应用，以Meiothermus ruber DSM 1279的烟酰胺磷酸核糖转移酶（缩写成MrNampt）为亲本，所述MrNampt的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述MrNampt的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
进一步地，本发明提出的突变体与MrNampt氨基酸序列SEQ ID NO:2相比应至少存在第366、368、369位点的多个突变。
优选地，所述突变体具有至少一个下述突变：Met366Ile、Met366Val、Met366Cys、Met366Thr、Gly368Ser、Gly368A、Gly368Cys、Gly368Thr、Ala369Phe、Ala369Tyr、Ala369Gln、Ala369Ser和Ala369Thr。
作为本发明进一步优选地，所述突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO:3和SEQ IDNO:4所示。
进一步地，本发明还提出了一种重组表达型烟酰胺磷酸核糖转移酶突变体的制备方法，具体包括以下步骤：
（1）以Meiothermus ruber DSM 1279的烟酰胺磷酸核糖转移酶（MrNampt）为亲本，以人源烟酰胺磷酸核糖转移酶的晶体结构（PDB：6TAC）为模板，利用SwissModel在线建模所述MrNampt的三维结构，找出所述MrNampt中组成活性口袋的氨基酸，优选地，所述MrNampt以二聚体形式发挥催化功能，所述MrNampt的组成活性口袋位于二聚体中间；
（2）以所述MrNampt为模板，通过PSI-Blast找出所述MrNampt的500条同源序列，对所述MrNampt中组成活性口袋的氨基酸残基进行多重序列比对，并通过web-logo对所述MrNampt中组成活性口袋的氨基酸进行保守性分析，并确定进行突变的氨基酸位点，优选地，所述氨基酸位点为保守程度中等的氨基酸；
（3）以重组质粒pET-28a-Nampt为模板，对所述MrNampt中M366、G368和A369进行组合型定点突变，所述突变体包括MrNampt1突变体和MrNampt2突变体，与SEQ ID NO:2所示的MrNampt相比，所述MrNampt1突变体的氨基酸序列在第366位点、368位点、369位点分别由Met、Gly、Ala突变为Ile、Ser、Phe，所述MrNampt2突变体的氨基酸序列在第366位点、368位点、369位点分别由Met、Gly、Ala突变为Thr、Cys、Ser，所述MrNampt1突变体的PCR扩增引物为5’-GGAATTCCATATGGTGAAAACCCTCAACCCCCACAACCTC-3’、5’-GTGCTGCAAGAGACTACAGCCAGTGCCGAAGG-3’和5’-GGCCTTCGGCACTGGCTGTTCTCTCTTGCAG-3’、5’-CGGGATCCTTAAGCGTTGTTGCGCACCTCTTCC-3’；所述MrNampt1突变体的融合PCR引物为5’-GGAATTCCATATGGTGAAAACCCTCAACCCCC-3’、5’-CGGGATCCTTAAGCGTTGTTGCGCACC-3’；所述MrNampt2突变体的PCR引物为5’-GGAATTCCATATGGTGAAAACCCTCAACCCCCACAACCTC-3’、5’-GTGCTGCAAGAGACTACAGCCAGTGCCGAAGG-3’和5’-GGCCTTCGGCACTGGCTGTTCTCTCTTGCAG-3’、5’-CGGGATCCTTAAGCGTTGTTGCGCACCTCTTCC-3’；所述MrNampt2突变体的融合PCR引物为5’-GGAATTCCATATGGTGAAAACCCTCAACCCCCACAACCTC-3’、5’-CGGGATCCTTAAGCGTTGTTGCGCACCTCTTCC-3’；
（4）所述突变体的筛选：将所述步骤三中进行PCR扩增后的产物用pET-28a载体连接后得到质粒pET-28a-Nampt1和质粒pET-28a-Nampt2，再将所述质粒pET-28a-Nampt1和质粒pET-28a-Nampt2转化入感受态细菌细胞Ecoli BL21中，在含50 mg/L卡那霉素的Luriabroth平板上筛选出具有烟酰胺磷酸核糖转移酶活性的克隆菌落，从所述克隆菌落中提取质粒pET-28a-Nampt1和pET-28a-Nampt2的DNA，经DNA测序后确定所述DNA引入的点突变如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示。
进一步地，所述突变体的基因表达体系包括表达载体和表达宿主，所述表达载体包括原核生物系统的表达载体、酵母细胞系统的表达载体、昆虫细胞系统的表达载体和哺乳动物细胞系统的表达载体，所述表达宿主细胞包括大肠杆菌细胞、枯草杆菌细胞、酵母细胞、昆虫细胞和哺乳动物细胞。
优选地，所述突变体的表达形式为细胞内表达和分泌形式表达。
进一步地，本发明还提出了一种重组表达型烟酰胺磷酸核糖转移酶突变体的应用，具体为：所述突变体应用于烟酰胺单核苷酸的制备。
采用上述方案本发明取得的有益效果如下：
（1）为了解决现有技术突变位点选择方向不定、突变位点少、筛查工作量大的问题，本发明通过应用SwissModel对MrNampt蛋白进行三维结构建模及分析，实现了快速锁定蛋白的活性中心功能结构的技术效果；
（2）同时，通过PSI-Blast与web-logo配合，实现了目标蛋白活性中心功能结构的氨基酸保守性分析，增加了可突变位点的选择数量的同时为突变位点的不同功能保守性组合选择方向；
（3）为了进一步验证突变位点的可行性，本发明选择的中度保守氨基酸位点进行突变的方式，破除了现有技术聚焦功能高度保守结构氨基酸的壁垒，为挖掘更多有利突变提供了参考性依据；
（4）为了解决野生型菌株Nampt酶活性低下的问题，本发明采用了多位点氨基酸组合型突变方案，实现了突变体Nampt酶活性显著高于野生型菌株的技术效果，为工业上大规模生产NMN提供了应用价值。
附图说明
图1为野生型MrNampt cDNA扩增及验证结果；
图2为MrNampt1突变体cDNA分段扩增及鉴定结果；
图3为MrNampt1突变体cDNA全序列融合PCR扩增及鉴定结果；
图4为MrNampt2突变体cDNA分段扩增及鉴定结果；
图5为MrNampt2突变体cDNA全序列融合PCR扩增及鉴定结果；
图6为重组pET-28a(+)-His6-MrNampt的可溶性分析SDS-PAGE结果图；
图7为重组pET-28a(+)-His6-MrNampt1突变体的可溶性分析SDS-PAGE结果图；
图8为重组pET-28a(+)-His6-MrNampt2突变体的可溶性分析SDS-PAGE结果图；
图9为NMN浓度标准曲线及回归方程。
附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例；基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明提出了一种重组表达型烟酰胺磷酸核糖转移酶突变体及其应用，利用分子克隆技术、基因工程技术获得烟酰胺磷酸核糖转移酶的重组大肠杆菌（或其他微生物菌）表达菌株，然后将重组大肠杆菌发酵，制备得到含有烟酰胺磷酸核糖转移酶的重组细胞，应用于烟酰胺单核苷酸的制备。
在上述制备过程，操作人员可采用任何适用的载体，例如：pET-28a载体、pET-32a载体，标签连接到C端或N端，载体的宿主细胞可以是包括大肠杆菌在内的原核细胞，本发明优先选用pET-28a为载体，将标签设置在MrNampt的N端，宿主为大肠杆菌。
本发明实施例中所使用的酶，除了如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示的烟酰胺磷酸核糖转移酶突变体是通过人工诱导表达产生之外，其余的酶均是从市场上直接购入的酶冻干粉。
实施例1：
烟酰胺磷酸核糖转移酶基因可突变位点的挖掘与选择
本发明以Meiothermus ruber DSM 1279的烟酰胺磷酸核糖转移酶（MrNampt）为亲本，MrNampt的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述MrNampt的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，以Nampt为目标，以人源Nampt的晶体结构（PDB：6TAC）为模板，利用SwissModel在线建模MrNampt的三维结构，找出其活性口袋的氨基酸组成，MrNampt以二聚体形式发挥催化功能，其组成活性口袋位于二聚体中间，然后以MrNampt为模板，通过PSI-Blast找到了其500条同源序列，对组成活性口袋的氨基酸残基进行多重序列比对，并通过web-logo对上述氨基酸残基进行了保守性分析，选择保守程度中等的氨基酸进行突变，本发明提出的突变体与MrNampt氨基酸序列SEQ ID NO:2相比应至少存在第366、368、369位点的多个突变，所述突变体具有下述至少一个突变：Met366Ile、Met366Val、Met366Cys、Met366Thr、Gly368Ser、Gly368A、Gly368Cys、Gly368Thr、Ala369Phe、Ala369Tyr、Ala369Gln、Ala369Ser和Ala369Thr。
实施例2：
含有亲本烟酰胺磷酸核糖转移酶基因(MrNampt)的载体质粒构建
如图1所示，对基因库公布的来自Meiothermus ruber DSM 1279的亲本烟酰胺磷酸核糖转移酶的基因序列（GenBank登录号：CP001743.1）进行全序列人工合成（由商业合成公司完成），合成的产物经限制性内切酶Ndel和BamH1酶切后进行琼脂糖凝胶电泳检测，胶回收后的产物与经同样限制性内切酶Ndel和BamH1酶切的载体pET-28a连接，得质粒pET-28a-Nampt，通过DNA测序，确定该被克隆的亲本烟酰胺磷酸核糖转移酶的核苷酸序列如SEQID NO:1所示，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
实施例3：
烟酰胺磷酸核糖转移酶突变体的制备
PCR的扩增体系为：dNTP Mixture（each 2.5 mM）1.0 μL、10 × PCR Buffer（Mg2+plus）2.0 μL、Primer F（10 µM）1.0 μL、Primer R（10 µM）1.0 μL、Template 1.0 μL、TaKaRa Taq（5 U/µL）0.2 μL、Nuclease-free water 13.8 μL；
PCR的扩增条件为：94℃ 5分钟，35圈循环：94℃ 30秒、62℃ 30秒和72℃ 50秒，最后72℃ 5分钟；
1、MrNampt1突变体（M366I\G368S\A369F）制备
分别以5’-GGAATTCCATATGGTGAAAACCCTCAACCCCC-3’、5’-TGCAAGAGAAAAGAGCCAATGCCGAAGGC-3’和5’-GCCTTCGGCATTGGCTCTTTTCTCTTGCAGC-3’、5’-CGGGATCCTTAAGCGTTGTTGCGCACC-3’为引物，以实施例2中构建的pET-28a-Nampt为模板，利用上述PCR扩增反应体系和PCR扩增反应条件进行PCR扩增突变体上游片段（结果如图2A所示）和下游片段（结果如图2B所示），经1.5％琼脂糖胶电泳分离后使用商业试剂盒回收扩增产物，再以5’-GGAATTCCATATGGTGAAAACCCTCAACCCCC-3’、5’-CGGGATCCTTAAGCGTTGTTGCGCACC-3’为引物进行全长PCR（结果如图3所示），再将扩增产物用载体pET-28a连接（具体参考实施例2），得到质粒pET-28a-Nampt1突变体再转化感受态细菌细胞Ecoli BL21（DE3），在Luriabroth（LB）平板（含50mg/L卡那霉素）上筛选出具有烟酰胺磷酸核糖转移酶活性的克隆菌落，从克隆菌落中提取质粒pET-28a-Nampt1突变体的DNA，经DNA测序确定引入的点突变无误即获得突变体重组菌，与SEQ ID NO:2所示的亲本氨基酸序列相比，突变体的氨基酸序列在第366、368、369位点分别由Met（M）、Gly（G）、Ala（A）突变为Ile（I）、Ser（S）、Phe（F），其氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。
2、MrNampt2突变体（M366T\G368C\A369S）制备
分别以5’-GGAATTCCATATGGTGAAAACCCTCAACCCCCACAACCTC-3’、5’-GTGCTGCAAGAGACTACAGCCAGTGCCGAAGG-3’和5’-GGCCTTCGGCACTGGCTGTTCTCTCTTGCAG-3’、5’-CGGGATCCTTAAGCGTTGTTGCGCACCTCTTCC-3’为引物，以实施例2构建的pET-28a-Nampt为模板，利用上述PCR扩增反应体系和PCR扩增反应条件进行高保真PCR扩增突变体上游片段（结果如图4A所示）和下游片段（结果如图4B所示），经1.5％琼脂糖胶电泳分离并用商业试剂盒回收扩增产物，再以5’-GGAATTCCATATGGTGAAAACCCTCAACCCCCACAACCTC-3’、5’-CGGGATCCTTAAGCGTTGTTGCGCACCTCTTCC-3’为引物进行全长PCR（结果如图5所示），再将扩增产物用载体pET-28a连接（具体参考实施例2），得到质粒pET-28a-Nampt2突变体再转化感受态细菌细胞EcoliBL21（DE3），在Luria broth（LB）平板（含卡那霉素）上筛选出具有烟酰胺磷酸核糖转移酶活性的克隆菌落，从克隆菌落中提取质粒pET-28a-Nampt2的DNA，经DNA测序确定引入的点突变无误即获得突变体重组菌，与如SEQ ID NO:2所示的亲本氨基酸序列相比，突变体的氨基酸序列在第366、368、369位点分别由Met（M）、Gly（G）、Ala（A）突变为Thr（T）、Cys（C）、Ser（S），其氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。
实施例4：
酶的提取
将实施例2和实施例3中的突变体重组菌进行转接，经IPTG按一定比例诱导表达后分析蛋白的表达情况，SDS-PAGE电泳结果如图6、图7和图8所示，其中，1：重组全菌（IPTG未诱导）；2：重组全菌（IPTG诱导）；3：破碎沉淀（IPTG未诱导）；4：破碎沉淀（IPTG诱导）；5：破碎上清（IPTG未诱导）；6：破碎上清（IPTG诱导）；7：pET-28a(+)全菌（IPTG未诱导）；8：pET-28a(+)全菌（IPTG诱导），结果表明突变体表达的蛋白以可溶性形式表达；将重组菌转接至含有卡那霉素的LB培养基中扩大培养，加入IPTG后进行低温诱导，优选地，培养条件应为16℃、20 h；诱导结束后收集菌液，离心后收集沉淀并以生理盐水重悬3次后收集菌体，在缓冲液中进行超声破碎，优选地，工作参数应为65%，工作4 s停16 s，工作时间为4 min；破碎结束后，在低温离心机中以12000 rpm离心20 min，收集上清即为蛋白粗提液。
实施例5：
酶活测定
Nampt能将NAM转化为NMN，通过量化产品NMN，可以确定相对Nampt活性，NMN属于N-烷基吡啶化合物，可以通过与酮反应，然后在过量酸中加热而转化为荧光衍生物：将NMN依次与苯乙酮、氢氧化钾和甲酸反应，将其酶促产物NMN转化为荧光衍生物，用Tecan多功能酶标仪在激发光382 nm和发射光445 nm下测定荧光。
配置反应溶液：3.45 μL 1 mol/L Tris-HCl、1.38 μL 1% BSA、0.83 μL 1 mol/LMgCl2、1.38 μL 0.1 mol/L ATP、0.28 μL 0.1 mol/L PRPP、1.38 μL 0.1 mol/L二硫苏糖醇、58.10 μL纯水、1.5 μL酶液、0.69 μL 200 μmol/L烟酰胺。
在恒温震荡仪中反应，45 ℃，15 min，三组平行重复，设置纯水代替酶液的反应体系为空白对照；将离心管于95 ℃水浴1 min灭活酶；往离心管中加入27.7 μL 2 mol/LKOH，再加入27.7 μL 20%苯乙酮，短暂涡旋混匀后置于冰中冰浴2 min，加入125 μL 88%甲酸，低速短暂离心，在恒温震荡仪中反应，37 ℃，10 min；测定荧光：吸取离心管中240 μL液体至黑色96孔板测定孔中，用Tecan多功能酶标仪在激发光382 nm，发射光445 nm下测定荧光。
如图9所示，结合测定荧光值和标准曲线计算酶活，酶活测定结果显示，突变体M366I\G368S\A369F及M366T\G368C\A369S的酶活性较野生型分别提高26.7%和35.6%，并且标签类型及其位置对酶活性变化无显著性影响。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。
以上对本发明及其实施方式进行了描述，这种描述没有限制性，附图中所示的也只是本发明的实施方式之一，实际的方法并不局限于此。总而言之如果本领域的普通技术人员受其启示，在不脱离本发明创造宗旨的情况下，不经创造性的设计出与该技术方案相似的结构方式及实施例，均应属于本发明的保护范围。
序列表
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<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1392
<212> DNA
<213> Meiothermus ruber DSM 1279
<400> 1
atgaaaaccc tcaaccccca caacctcatc ctcaacaccg acagctacaa agccagtcac 60
tttgcccagt tccccaaagg catgacctat gccagttggt acatcgagag ccggggcggc 120
gactcgaatt ttgtgcgttt ctttggccta caggccttct taatcgagta cctcagcaaa 180
ggggtcagcc tggccgatgt ggaggaggcc caggaagttt tcctggccca cggcctgccc 240
ttccccacag aaggctggcg ctacatcgct caggacttag gagggcggct gccggtgcgc 300
atccgggccg tgcccgaggg taaggtggtt cccgtacaca accccctggt catcatcgag 360
agcaccgacc ccaaagtgcc ctggctgccg ggttggctcg agaccgcgct gctgcgggcg 420
gtctggtacc ccaccacggt ctgcacggtc tcctggggta tccgcaacac catcaaggag 480
tacctggaga aaaccgccga cgaccccgag gccgagctgc ccttcaagct gcacgacttt 540
ggcgcgcgcg gggtgagcag cctcgagagc gccgggctgg gcgggatggc ccacctggtg 600
aactttatgg gcaccgacac cgtcaccgcc ctgatctacg cccgcaacta ctacggggcc 660
gagatggccg gctacagcat cccggccatg gagcacagca ccgtgaccag ctttggccgc 720
accggcgagg cccaggccta ccgccagatg ctcgagacct ttgccaagcc gggggccctg 780
atggccatgg tgattgattc gtacaaccgc gagcacgccg tgggccagat tatcggcgaa 840
gaactgcgcg agctcatcca gcagtcgggg gccaccgtgg tcatccggcc cgactcgggc 900
gacccgccct tcgtggtgct gcgcaccgtg cagaccctcg aggccaaatt tggcgccacc 960
ctcaaccgca agggctacaa ggtgctgaac ggggtgcggg tcatccaggg cgatggggtg 1020
aacgccgact ccatccgcaa ggtgctgttt ttgctcgagc agtggggcta cagcgcctcc 1080
aacgtggcct tcggcatggg cggggccctc ttgcagcacc cccaccgcga tacccagaag 1140
ttcgcccaga agctgcacct ggtcacggtg aacggcgaga cctacggggt gggcaagagc 1200
ccggtggacg accccggcaa actctccaag aagggccgtc tggacgttat ccaggacgag 1260
cgcggcatcc gcacggtgga gctgccgctg gaggccgccc agccgcaccc ccagagcatc 1320
ctgcaaaccg tattcgagaa cgggtcgatt acccggcgct acacctggga agaggtgcgc 1380
aacaacgctt ag 1392
<210> 2
<211> 463
<212> PRT
<213> Meiothermus ruber DSM 1279
<400> 2
Met Lys Thr Leu Asn Pro His Asn Leu Ile Leu Asn Thr Asp Ser Tyr
1 5 10 15
Lys Ala Ser His Phe Ala Gln Phe Pro Lys Gly Met Thr Tyr Ala Ser
20 25 30
Trp Tyr Ile Glu Ser Arg Gly Gly Asp Ser Asn Phe Val Arg Phe Phe
35 40 45
Gly Leu Gln Ala Phe Leu Ile Glu Tyr Leu Ser Lys Gly Val Ser Leu
50 55 60
Ala Asp Val Glu Glu Ala Gln Glu Val Phe Leu Ala His Gly Leu Pro
65 70 75 80
Phe Pro Thr Glu Gly Trp Arg Tyr Ile Ala Gln Asp Leu Gly Gly Arg
85 90 95
Leu Pro Val Arg Ile Arg Ala Val Pro Glu Gly Lys Val Val Pro Val
100 105 110
His Asn Pro Leu Val Ile Ile Glu Ser Thr Asp Pro Lys Val Pro Trp
115 120 125
Leu Pro Gly Trp Leu Glu Thr Ala Leu Leu Arg Ala Val Trp Tyr Pro
130 135 140
Thr Thr Val Cys Thr Val Ser Trp Gly Ile Arg Asn Thr Ile Lys Glu
145 150 155 160
Tyr Leu Glu Lys Thr Ala Asp Asp Pro Glu Ala Glu Leu Pro Phe Lys
165 170 175
Leu His Asp Phe Gly Ala Arg Gly Val Ser Ser Leu Glu Ser Ala Gly
180 185 190
Leu Gly Gly Met Ala His Leu Val Asn Phe Met Gly Thr Asp Thr Val
195 200 205
Thr Ala Leu Ile Tyr Ala Arg Asn Tyr Tyr Gly Ala Glu Met Ala Gly
210 215 220
Tyr Ser Ile Pro Ala Met Glu His Ser Thr Val Thr Ser Phe Gly Arg
225 230 235 240
Thr Gly Glu Ala Gln Ala Tyr Arg Gln Met Leu Glu Thr Phe Ala Lys
245 250 255
Pro Gly Ala Leu Met Ala Met Val Ile Asp Ser Tyr Asn Arg Glu His
260 265 270
Ala Val Gly Gln Ile Ile Gly Glu Glu Leu Arg Glu Leu Ile Gln Gln
275 280 285
Ser Gly Ala Thr Val Val Ile Arg Pro Asp Ser Gly Asp Pro Pro Phe
290 295 300
Val Val Leu Arg Thr Val Gln Thr Leu Glu Ala Lys Phe Gly Ala Thr
305 310 315 320
Leu Asn Arg Lys Gly Tyr Lys Val Leu Asn Gly Val Arg Val Ile Gln
325 330 335
Gly Asp Gly Val Asn Ala Asp Ser Ile Arg Lys Val Leu Phe Leu Leu
340 345 350
Glu Gln Trp Gly Tyr Ser Ala Ser Asn Val Ala Phe Gly Met Gly Gly
355 360 365
Ala Leu Leu Gln His Pro His Arg Asp Thr Gln Lys Phe Ala Gln Lys
370 375 380
Leu His Leu Val Thr Val Asn Gly Glu Thr Tyr Gly Val Gly Lys Ser
385 390 395 400
Pro Val Asp Asp Pro Gly Lys Leu Ser Lys Lys Gly Arg Leu Asp Val
405 410 415
Ile Gln Asp Glu Arg Gly Ile Arg Thr Val Glu Leu Pro Leu Glu Ala
420 425 430
Ala Gln Pro His Pro Gln Ser Ile Leu Gln Thr Val Phe Glu Asn Gly
435 440 445
Ser Ile Thr Arg Arg Tyr Thr Trp Glu Glu Val Arg Asn Asn Ala
450 455 460
<210> 3
<211> 463
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Met Lys Thr Leu Asn Pro His Asn Leu Ile Leu Asn Thr Asp Ser Tyr
1 5 10 15
Lys Ala Ser His Phe Ala Gln Phe Pro Lys Gly Met Thr Tyr Ala Ser
20 25 30
Trp Tyr Ile Glu Ser Arg Gly Gly Asp Ser Asn Phe Val Arg Phe Phe
35 40 45
Gly Leu Gln Ala Phe Leu Ile Glu Tyr Leu Ser Lys Gly Val Ser Leu
50 55 60
Ala Asp Val Glu Glu Ala Gln Glu Val Phe Leu Ala His Gly Leu Pro
65 70 75 80
Phe Pro Thr Glu Gly Trp Arg Tyr Ile Ala Gln Asp Leu Gly Gly Arg
85 90 95
Leu Pro Val Arg Ile Arg Ala Val Pro Glu Gly Lys Val Val Pro Val
100 105 110
His Asn Pro Leu Val Ile Ile Glu Ser Thr Asp Pro Lys Val Pro Trp
115 120 125
Leu Pro Gly Trp Leu Glu Thr Ala Leu Leu Arg Ala Val Trp Tyr Pro
130 135 140
Thr Thr Val Cys Thr Val Ser Trp Gly Ile Arg Asn Thr Ile Lys Glu
145 150 155 160
Tyr Leu Glu Lys Thr Ala Asp Asp Pro Glu Ala Glu Leu Pro Phe Lys
165 170 175
Leu His Asp Phe Gly Ala Arg Gly Val Ser Ser Leu Glu Ser Ala Gly
180 185 190
Leu Gly Gly Met Ala His Leu Val Asn Phe Met Gly Thr Asp Thr Val
195 200 205
Thr Ala Leu Ile Tyr Ala Arg Asn Tyr Tyr Gly Ala Glu Met Ala Gly
210 215 220
Tyr Ser Ile Pro Ala Met Glu His Ser Thr Val Thr Ser Phe Gly Arg
225 230 235 240
Thr Gly Glu Ala Gln Ala Tyr Arg Gln Met Leu Glu Thr Phe Ala Lys
245 250 255
Pro Gly Ala Leu Met Ala Met Val Ile Asp Ser Tyr Asn Arg Glu His
260 265 270
Ala Val Gly Gln Ile Ile Gly Glu Glu Leu Arg Glu Leu Ile Gln Gln
275 280 285
Ser Gly Ala Thr Val Val Ile Arg Pro Asp Ser Gly Asp Pro Pro Phe
290 295 300
Val Val Leu Arg Thr Val Gln Thr Leu Glu Ala Lys Phe Gly Ala Thr
305 310 315 320
Leu Asn Arg Lys Gly Tyr Lys Val Leu Asn Gly Val Arg Val Ile Gln
325 330 335
Gly Asp Gly Val Asn Ala Asp Ser Ile Arg Lys Val Leu Phe Leu Leu
340 345 350
Glu Gln Trp Gly Tyr Ser Ala Ser Asn Val Ala Phe Gly Ile Gly Ser
355 360 365
Phe Leu Leu Gln His Pro His Arg Asp Thr Gln Lys Phe Ala Gln Lys
370 375 380
Leu His Leu Val Thr Val Asn Gly Glu Thr Tyr Gly Val Gly Lys Ser
385 390 395 400
Pro Val Asp Asp Pro Gly Lys Leu Ser Lys Lys Gly Arg Leu Asp Val
405 410 415
Ile Gln Asp Glu Arg Gly Ile Arg Thr Val Glu Leu Pro Leu Glu Ala
420 425 430
Ala Gln Pro His Pro Gln Ser Ile Leu Gln Thr Val Phe Glu Asn Gly
435 440 445
Ser Ile Thr Arg Arg Tyr Thr Trp Glu Glu Val Arg Asn Asn Ala
450 455 460
<210> 4
<211> 463
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Met Lys Thr Leu Asn Pro His Asn Leu Ile Leu Asn Thr Asp Ser Tyr
1 5 10 15
Lys Ala Ser His Phe Ala Gln Phe Pro Lys Gly Met Thr Tyr Ala Ser
20 25 30
Trp Tyr Ile Glu Ser Arg Gly Gly Asp Ser Asn Phe Val Arg Phe Phe
35 40 45
Gly Leu Gln Ala Phe Leu Ile Glu Tyr Leu Ser Lys Gly Val Ser Leu
50 55 60
Ala Asp Val Glu Glu Ala Gln Glu Val Phe Leu Ala His Gly Leu Pro
65 70 75 80
Phe Pro Thr Glu Gly Trp Arg Tyr Ile Ala Gln Asp Leu Gly Gly Arg
85 90 95
Leu Pro Val Arg Ile Arg Ala Val Pro Glu Gly Lys Val Val Pro Val
100 105 110
His Asn Pro Leu Val Ile Ile Glu Ser Thr Asp Pro Lys Val Pro Trp
115 120 125
Leu Pro Gly Trp Leu Glu Thr Ala Leu Leu Arg Ala Val Trp Tyr Pro
130 135 140
Thr Thr Val Cys Thr Val Ser Trp Gly Ile Arg Asn Thr Ile Lys Glu
145 150 155 160
Tyr Leu Glu Lys Thr Ala Asp Asp Pro Glu Ala Glu Leu Pro Phe Lys
165 170 175
Leu His Asp Phe Gly Ala Arg Gly Val Ser Ser Leu Glu Ser Ala Gly
180 185 190
Leu Gly Gly Met Ala His Leu Val Asn Phe Met Gly Thr Asp Thr Val
195 200 205
Thr Ala Leu Ile Tyr Ala Arg Asn Tyr Tyr Gly Ala Glu Met Ala Gly
210 215 220
Tyr Ser Ile Pro Ala Met Glu His Ser Thr Val Thr Ser Phe Gly Arg
225 230 235 240
Thr Gly Glu Ala Gln Ala Tyr Arg Gln Met Leu Glu Thr Phe Ala Lys
245 250 255
Pro Gly Ala Leu Met Ala Met Val Ile Asp Ser Tyr Asn Arg Glu His
260 265 270
Ala Val Gly Gln Ile Ile Gly Glu Glu Leu Arg Glu Leu Ile Gln Gln
275 280 285
Ser Gly Ala Thr Val Val Ile Arg Pro Asp Ser Gly Asp Pro Pro Phe
290 295 300
Val Val Leu Arg Thr Val Gln Thr Leu Glu Ala Lys Phe Gly Ala Thr
305 310 315 320
Leu Asn Arg Lys Gly Tyr Lys Val Leu Asn Gly Val Arg Val Ile Gln
325 330 335
Gly Asp Gly Val Asn Ala Asp Ser Ile Arg Lys Val Leu Phe Leu Leu
340 345 350
Glu Gln Trp Gly Tyr Ser Ala Ser Asn Val Ala Phe Gly Thr Gly Cys
355 360 365
Ser Leu Leu Gln His Pro His Arg Asp Thr Gln Lys Phe Ala Gln Lys
370 375 380
Leu His Leu Val Thr Val Asn Gly Glu Thr Tyr Gly Val Gly Lys Ser
385 390 395 400
Pro Val Asp Asp Pro Gly Lys Leu Ser Lys Lys Gly Arg Leu Asp Val
405 410 415
Ile Gln Asp Glu Arg Gly Ile Arg Thr Val Glu Leu Pro Leu Glu Ala
420 425 430
Ala Gln Pro His Pro Gln Ser Ile Leu Gln Thr Val Phe Glu Asn Gly
435 440 445
Ser Ile Thr Arg Arg Tyr Thr Trp Glu Glu Val Arg Asn Asn Ala
450 455 460

Claims (3)

1.一种重组表达型烟酰胺磷酸核糖转移酶突变体，其特征在于：包括如SEQ ID No:2所示的氨基酸序列发生突变后的突变体，所述突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO:3或SEQ IDNO:4所示。
2.根据权利要求1所述一种重组表达型烟酰胺磷酸核糖转移酶突变体，其特征在于：所述突变体的表达形式包括细胞内表达和分泌形式表达。
3.一种根据权利要求2所述的重组表达型烟酰胺磷酸核糖转移酶突变体的应用，其特征在于：所述突变体应用于烟酰胺单核苷酸的制备。
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