CN116024189B - 烟酰胺磷酸核糖转移酶突变体及其制备方法和dna - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种烟酰胺磷酸核糖转移酶突变体及其制备方法和DNA，该烟酰胺磷酸核糖转移酶突变体的氨基酸序列为SEQ ID NO.1。该烟酰胺磷酸核糖转移酶突变体具有较高的比酶活和较大的最适温度、最适pH的范围，用于催化烟酰胺和磷酸核糖焦磷酸合成烟酰胺单核苷酸时，转化率较高。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种烟酰胺磷酸核糖转移酶突变体，同时本发明还涉及一种编码上述烟酰胺磷酸核糖转移酶突变体的DNA以及上述烟酰胺磷酸核糖转移酶突变体的制备方法。
背景技术
烟酰胺磷酸核糖转移酶(Nampt，EC 2.4.2.12)催化烟酰胺(Nicotinamide，NAM)和磷酸核糖焦磷酸(Phosphoribosylpyrophosphate，PRPP)合成烟酰胺单核苷酸(NMN)，是生物酶法合成NMN重要的酶。而NMN对防治癌症、帕金森病、肥胖、糖尿病及其他衰老相关疾病等有较好的治疗与康复效果。因而以NMN为活性成分的功能性保健食品有着很大的开发潜力和市场前景。
此外，制备NMN的方法中，生物酶法因无有机溶剂残留且不存在手性问题，成为最环保无公害的高效率生产方法之一，但利用生物酶法生产NMN仍然存在一些限制，例如Nampt催化烟酰胺和磷酸核糖焦磷酸合成NMN，文献报道及数据库中只有来源Homosapiens，Mus musculus和Rattus norvegicus的Nampt被表征，难以满足合成NMN的需求，缺乏可以高效催化合成NMN的烟酰胺磷酸核糖转移酶。因此，挖掘新来源的烟酰胺磷酸核糖转移酶便显得很有意义。
发明内容
有鉴于此，本发明提出了一种烟酰胺磷酸核糖转移酶突变体，以催化烟酰胺和磷酸核糖焦磷酸合成烟酰胺单核苷酸时，催化转化率较高。
为达上述目的，本发明的技术方案是这样实现的：
一种烟酰胺磷酸核糖转移酶突变体，所述烟酰胺磷酸核糖转移酶突变体的氨基酸序列为：SEQ ID NO.1。
本发明进一步提出了一种编码上述的烟酰胺磷酸核糖转移酶突变体的DNA，所述DNA的核苷酸序列为：SEQ ID NO.2。
本发明还提出了一种上述的烟酰胺磷酸核糖转移酶突变体的制备方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
活化菌株：将负载有SEQ ID NO.2基因的基因工程菌接种至LB培养基中，控制摇床温度35-38℃，转速150-200rpm，培养12-16h，获得种子液；
制备粗酶液：将所述种子液接种至TB培养基中，当OD600值为0.6-0.8时添加诱导剂，控制温度16-25℃，诱导表达15-23h，然后进行菌体破壁，冷冻离心分离，收集上清液，得到含有所述烟酰胺磷酸核糖转移酶突变体的粗酶液。
进一步的，所述基因工程菌的构建方法包括以下步骤：
以SEQ ID NO.2的基因为目的基因，以质粒pET-28a(+)为表达载体，将所述目的基因插入所述表达载体中获得重组质粒，将所述重组质粒转化到宿主菌株中，得到所述基因工程菌。
进一步的，所述宿主菌株为大肠杆菌BL21(DE3)。
进一步的，所述TB培养基中含有45-55μg·mL-1的卡那霉素。
本发明还提出了一种上述的烟酰胺磷酸核糖转移酶突变体用于合成烟酰胺单核苷酸的应用。
本发明的烟酰胺磷酸核糖转移酶突变体具有较高的酶活，较好的催化效率和较高的稳定性，在工业生产中能够有效延长半衰期，达到降低生产成本的目的。本发明的烟酰胺磷酸核糖转移酶突变体的制备方法采用基因工程技术，获取表达本发明烟酰胺磷酸核糖转移酶突变体的基因工程菌，利用该基因工程菌生产烟酰胺磷酸核糖转移酶突变体，适合于目前的工业生产。本发明的烟酰胺磷酸核糖转移酶突变体用于催化合成烟酰胺单核苷酸的过程中，转化率较高。
附图说明
构成本发明的一部分的附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：
图1为本发明实施例1烟酰胺磷酸核糖转移酶突变体粗酶液SDS-PAGE电泳结果图；
图2为本发明实施例2测试的烟酰胺磷酸核糖转移酶的蛋白标准曲线；
图3为本发明实施例2测试的荧光值与产物NMN浓度的标准曲线；
图4为本发明实施例2测试的对烟酰胺磷酸核糖转移酶的野生型和突变体进行的温度范围的测试图；
图5为本发明实施例2测试的对烟酰胺磷酸核糖转移酶的野生型和突变体进行的pH范围的测试图；
具体实施方式
需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。另外，除本实施例特别说明之外，本实施例中所涉及的各术语及工艺依照现有技术中的一般认知及常规方法进行理解即可。
实施例一
本实施例涉及一种烟酰胺磷酸核糖转移酶突变体的挖掘和突变过程，包括以下步骤：
(1)数据库基因挖掘、突变技术获得烟酰胺磷酸核糖转移酶基因
根据已报道的烟酰胺磷酸核糖转移酶外源表达文献，选择具有较高烟酰胺磷酸核糖转移酶活力的氨基酸序列为模板，在Uniprot数据库中检索Blast 500条，选取相似度30％-90％的序列，分区间使用MEGA6构建进化树，筛去冗余序列后继续分区间使用MEGA6构建进化树，筛去部分亲缘关系较近的序列，优先选择来源为极端或嗜性微生物的蛋白序列，根据构建好的进化树，每个分支选取若干代表性序列。将保留的序列合并，使用MEGA6再次构建进化树，按照进化距离远近，从每个分支上选取5个以上的代表序列，同样优先选择来源为极端或者嗜性微生物的蛋白序列，最终选定12条代表序列。使用ESPript 3.0(https://espript.ibcp.fr)进行位点比对，选定具有潜在的烟酰胺磷酸核糖转移酶酶活性的基因，筛选得到的基因来源于Methanobrevibactersp。
(2)PCR扩增烟酰胺磷酸核糖转移酶基因
a1.来自Methanobrevibactersp的烟酰胺磷酸核糖转移酶(Nampt)进行序列分析、突变和功能验证，将这些氨基酸位点进行突变，第112位的N突变为P，第232位的H突变为A，第300位的F突变为I，第334位的F突变为L，第378位的S突变为Q，第458位的D突变为E，得到如SEQ ID NO.1所示的烟酰胺磷酸核糖转移酶突变体Nampt-M的氨基酸序列。将Nampt-M进行了密码子优化，获得如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。
a2.以经合成的核苷酸序列设计引物，通过PCR扩增烟酰胺磷酸核糖转移酶突变体的基因。PCR扩增反应在20μL体系中进行，反应体系中加入10μL2xEs Taq MasterMix，8μL的dd H2O，0.4μL的模板DNA，上下游引物各0.8μL。反应条件为在94℃预变性5min后开始循环：94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，共30个循环；72℃终延伸10min。PCR产物进行电泳鉴定后回收纯化并克隆至pET-28a(+)载体构建重组质粒，将重组质粒转化至E.coli，挑取多个阳性转化子至LB液体培养基中，37℃，180rpm培养12h～16h，提取质粒后进行双酶切验证，将验证正确的进行序列测定。
(3)重组表达质粒的构建
将表达质粒和验证正确的含有目的基因的重组克隆质粒同时用用Nco I和XhoⅠ两个限制酶进行双酶切，37℃酶切4h后进行核酸电泳验证并割胶回收目的基因和目的质粒，回收产物用T4DNA连接酶在16℃过连接，连接产物转化至宿主细胞大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，涂布于含卡那霉素抗性(50mg·mL-1)的LB固体培养基中培养10h～12h，挑取阳性克隆子至含卡那霉素(50mg·mL-1)的LB液体培养基中培养，在37℃，180rpm条件下培养12h～16h后提取质粒并命名为pET-28a(+)-Nampt-M。
(4)重组表达菌株的构建
将重组质粒经42℃热击90s转化至宿主细胞大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，涂布于含卡那霉素抗性(50mg·mL-1)的LB固体培养基中培养10h～12h，挑取阳性克隆子至含卡那霉素(50mg·mL-1)的LB液体培养基中培养过夜，次日按1％接种量接种于含卡那霉素(50mg·mL-1)的50mL新鲜的TB液体培养基中培养约2h至OD600为0.6-0.8时加入0.3-0.4mM的IPTG进行诱导，诱导条件为16-25℃，180rpm，21h。培养后的重组大肠杆菌细胞冷冻离心(10000rpm，15min)，并用生理盐水清洗两次，用测定酶活力的缓冲液充分悬浮细胞(20MTris-HCl，pH值7)，匀浆破碎细胞(700-900KPa，共45s)，破壁后的菌体10000rpm，冷冻离心15min，获得上清粗酶液。
(5)烟酰胺磷酸核糖转移酶突变体的SDS-PAGE分析
根据蛋白胶试剂盒的说明制备分离胶与浓缩胶，取80μL上述获得的上清粗酶液，然后加入20μL 5x loading buffer，充分混匀后与沸水浴中放置5min使蛋白变性。然后进行上样并加入Marker。上层浓缩胶用105V电压，当样品移动至分离胶时(约20min)用155V电压，当样品条带移动至分离胶底部约1cm处关闭电源，电泳结束。取出分离胶，在培养皿中用考马斯亮蓝R250进行染色，充分染色后用脱色液脱色，大概每4h换一次脱色液直到脱色完成，最后观察蛋白的表达情况并记录分子量大小，测得烟酰胺磷酸核糖转移酶突变体分子量大小约为55KDa。图1为烟酰胺磷酸核糖转移酶突变体粗酶液SDS-PAGE电泳结果图。
实施例二
本实施例涉及的是烟酰胺磷酸核糖转移酶突变体的酶活测试过程。
c1.加入34.5μL 1mol/LTris-HCl、13.8μL 1％BSA、8.3μL 1mol/LMgCl2、13.8μL0.1mol/L ATP、2.8μL 0.1mol/L PRPP、13.8μL 0.1mol/L二硫苏糖醇、580μL纯水、15μL稀释一定倍数的纯酶液、6.9μL 200μmol/L NAM。在恒温震荡仪中45℃反应15min后，于95℃水浴1min灭活酶。
随后，加入277μL 2mol/L KOH,，再加入277μL 20％苯乙酮，涡旋混匀后充分冰浴2min。加入1250μL 88％甲酸，低速短暂离心后，在37℃恒温震荡仪中反应10min。吸取离心管中液体于荧光分度光度计在激发光382nm，发射光445nm下测定荧光。以纯水作为空白对照。
结合测定荧光值和标准曲线计算酶活。酶活力单位(1U)定义为：每分钟生成1μmol产物NMN所需的酶量。
其中，采用Bradford法测定反应体系中Nampt-M的蛋白浓度，蛋白标准曲线如图2所示。产物NMN标准曲线如图3所示。
c2.烟酰胺磷酸核糖转移酶突变体的温度应用范围
取适量酶液，分别在25-65℃范围内孵育5min后，在pH 7下测定不同温度的酶活力，以各自在最适温度下的酶活力作为对照(100％)。得到的结果如图4所示，突变体的温度作用范围广于野生型，并且在不同的温度条件下，突变体酶活均高于野生型菌体。
c3.烟酰胺磷酸核糖转移酶突变体的pH度应用范围
取适量酶液，分别于不同pH(5.5-9.0)的缓冲液中孵育5min，在最适温度下，测定野生型和突变体在不同pH缓冲液中的酶活力，以各自在最适pH条件下的酶活力作为对照(100％)。得到的结果如图5所示，突变体的pH作用范围广于野生型，并且在不同的pH条件下，突变体酶活均高于野生型。
实施例三
本实施例涉及一种烟酰胺磷酸核糖转移酶突变体进行催化合成烟酰胺单核苷酸的应用。
在2mL的离心管中，加入终浓度为0.1mM底物，50mM的Tris-HCl(pH 7.0)，12mMMgCl2、2mM ATP以及0.05g/L的Nampt-M酶，混合均匀。将反应液置于45℃，200rpm的条件下反应10min，进行荧光分析，检测底物和产物的转化率。上述底物包括烟酰胺(NAM)和磷酸核糖焦磷酸(PRPP)，NAM：PRPP的摩尔比＝1：1，产物为烟酰胺单核苷酸(NMN)。
由以上实施例二和实施例三的实验过程可知，烟酰胺磷酸核糖转移酶突变体在较宽范围的温度和pH下，酶活力均可维持在较高水平，有利于此后应用于温度和pH变化较大的工业生产反应。利用该烟酰胺磷酸核糖转移酶突变体进行催化生产烟酰胺单核苷酸(NMN)，产量可达到18mg/L，反应5min时补加一次，NMN最高产量可达30mg/L，转化率可达93％。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
Claims (7)
1.一种烟酰胺磷酸核糖转移酶突变体，其特征在于，所述烟酰胺磷酸核糖转移酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.一种编码权利要求1所述的烟酰胺磷酸核糖转移酶突变体的DNA分子，其特征在于，所述DNA分子的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
3.根据权利要求1所述的烟酰胺磷酸核糖转移酶突变体的制备方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
活化菌株：将负载有如SEQ ID NO.2所示基因的基因工程菌接种至LB培养基中，控制摇床温度35-38℃，转速150-200rpm，培养12-16h，获得种子液；
制备粗酶液：将所述种子液接种至TB培养基中，当OD600值为0.6-0.8时添加诱导剂，控制温度16-25℃，诱导表达15 -23h，然后进行菌体破壁，冷冻离心分离，收集上清液，得到含有所述烟酰胺磷酸核糖转移酶突变体的粗酶液。
4.根据权利要求3所述的烟酰胺磷酸核糖转移酶突变体的制备方法，其特征在于，所述基因工程菌的构建方法包括以下步骤：
以SEQ ID NO.2所示的基因为目的基因，以质粒pET-28a(+)为表达载体，将所述目的基因插入所述表达载体中获得重组质粒，将所述重组质粒转化到宿主菌株中，得到所述基因工程菌。
5.根据权利要求4所述的烟酰胺磷酸核糖转移酶突变体的制备方法，其特征在于：所述宿主菌株为大肠杆菌BL21(DE3)。
6.根据权利要求3所述的烟酰胺磷酸核糖转移酶突变体的制备方法，其特征在于：所述TB培养基中含有浓度45-55μg·mL-1的卡那霉素。
7.权利要求1所述的烟酰胺磷酸核糖转移酶突变体在合成烟酰胺单核苷酸中的应用。
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