CN116836965A - 一种n-乙酰葡萄糖胺异构酶突变体及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种N‑乙酰葡萄糖胺异构酶突变体及其应用。所述的N‑乙酰葡萄糖胺异构酶突变体，是对野生型N‑乙酰葡萄糖胺异构酶位于第73位谷氨酸、第110位谷氨酰胺、第171位亮氨酸、第172位丙氨酸或第198位丙氨酸中的任意一个或几个位点进行突变得到的。与野生型N‑乙酰葡萄糖胺异构酶相比，本发明所构建的N‑乙酰葡萄糖胺异构酶突变体，具有更高的催化活性，其酶活性提升了27‑55％。本发明改造过后的N‑乙酰葡萄糖胺异构酶突变体，可以更好的应用于N‑乙酰神经氨酸的制备上，更适于工业化应用。
Description
技术领域
本发明属于基因工程领域，具体涉及一种N-乙酰葡萄糖胺异构酶突变体及其应用。
背景技术
N-乙酰葡萄糖胺异构酶和N-乙酰神经氨酸裂合酶可以双酶偶联产N-乙酰神经氨酸，但在生产N-乙酰神经氨酸的生产过程中，N-乙酰神经氨酸异构酶活性降低，严重影响了N-乙酰神经氨酸的产量，为了提高N-乙酰神经氨酸的产量，需要去开发一种稳定性高的N-乙酰神经氨酸异构酶。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种N-乙酰葡萄糖胺异构酶突变体。
本发明还要解决的技术问题是上述N-乙酰葡萄糖胺异构酶突变体在制备N-乙酰甘露糖胺和在制备N-乙酰神经氨酸中的应用。
为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：
一种N-乙酰葡萄糖胺异构酶突变体，所述的N-乙酰葡萄糖胺异构酶突变体的氨基酸序列，是对野生型N-乙酰葡萄糖胺异构酶位于第73位谷氨酸、第110位谷氨酰胺、第171位亮氨酸、第172位丙氨酸或第198位丙氨酸中的任意一个或几个位点进行突变得到的，
其中，第73位谷氨酸Glu突变为甘氨酸Gly，第110位谷氨酰胺Gln突变成半胱氨酸Cys，第171位亮氨酸Leu突变成异亮氨酸Ile，第172位丙氨酸Ala突变成甘氨酸Gly，第198位丙氨酸Ala突变成天冬氨酸Asp。
优选的，一种N-乙酰葡萄糖胺异构酶突变体，所述的N-乙酰葡萄糖胺异构酶突变体的氨基酸序列，是对野生型N-乙酰葡萄糖胺异构酶位于第172位丙氨酸和第198位丙氨酸两个位点进行双突变得到的。
其中，第172位丙氨酸Ala突变成甘氨酸Gly，第198位丙氨酸Ala突变成天冬氨酸Asp。
其中，所述的野生型N-乙酰葡萄糖胺异构酶，来源于Anabaena sp.CH1中的N-acetylglucosamine 2-epimerase，其氨基酸序列如SEQ ID No.:1所示，对应的编码野生型N-乙酰葡萄糖胺异构酶的核苷酸序列如SEQ ID No.:2所示。
其中，所述的N-乙酰葡萄糖胺异构酶突变体，其氨基酸序列如SEQ ID No.:3-8中的任意一项所示。
优选的，N-乙酰葡萄糖胺异构酶突变体，其氨基酸序列如SEQ ID No.:8所示。
其中，所述的N-乙酰葡萄糖胺异构酶突变体，其核苷酸序列如SEQ ID No.:9-14中的任意一项所示。
优选的，N-乙酰葡萄糖胺异构酶突变体，其核苷酸序列如SEQ ID No.:14所示。
在对N-乙酰葡萄糖胺异构酶突变体的效果检测中发现，与野生型N-乙酰葡萄糖胺异构酶相比，所有突变体的酶活性均比WT高，酶活性提升了27-55％，展现了更高的催化活性。改造位点位于包括了活性口袋位点及稳定性相关位点，改造过后使酶更加趋于稳定，使其活性增强。
本发明所用技术方法和制备流程是利用本领域已知的技术，构建含有野生型N-乙酰葡萄糖胺异构酶基因的载体质粒，然后选择定点突变的位点以及突变后的氨基酸种类，合成相应的引物，以所述的N-乙酰葡萄糖胺异构酶基因的载体质粒为模板，PCR扩增突变DNA片段，然后以PCR将所得片段扩增为全长突变基因。通过将该全长突变基因克隆到适当的载体上并转化至适当的宿主细胞，经培养筛选出具有高酶活N-乙酰葡萄糖胺异构酶阳性克隆。最后从阳性克隆中提取质粒DNA，进行DNA序列测定分析，以确定引入的突变。
具体的，上述N-乙酰葡萄糖胺异构酶突变体的构建方法，包括如下步骤：
(1)全基因合成N-乙酰葡萄糖胺异构酶基因anAGE，将经PCR扩增和切胶回收后的片段通过酶切连接至pET28a载体上，获得质粒pET28a-anAGE；
(2)以步骤(1)获得的质粒pET28a-anAGE为模板，利用野生型引物与突变位点引物进行分段PCR，纯化回收分段PCR产物后，再以分段PCR产物为模板，进行overlap PCR，获得具有突变位点的N-乙酰葡萄糖胺异构酶基因；
(3)将步骤(2)获得的具有突变位点的N-乙酰葡萄糖胺异构酶基因，分别进行酶切连接至pET28a载体上构建重组质粒，再分别将上述重组质粒转化入感受态大肠杆菌Rosetta(DE3)中，获得N-乙酰葡萄糖胺异构酶突变体。
其中，步骤(3)中，所述的重组质粒包括pET28a-anAGE-E73G、pET28a-anAGE-Q110C、pET28a-anAGE-L171I、pET28a-anAGE-A172G和pET28a-anAGE-A198D，其中，以重组质粒pET28a-anAGE-A172G为模板，将氨基酸序列中第198位的丙氨酸Ala突变为天冬氨酸Asp，获得N-乙酰葡萄糖胺异构酶双突变体anAGE-A172G-A198D。
本发明所述的N-乙酰葡萄糖胺异构酶突变体可以以未经纯化的粗酶形式使用，也可以是经部分纯化的或纯化的形式，也可以作为固相酶/固相细胞使用。
N-乙酰葡萄糖胺异构酶突变体在制备N-乙酰甘露糖胺中的应用也在本发明所包含的范围之内。
具体的，以N-乙酰葡萄糖胺为底物，将所述的N-乙酰葡萄糖胺异构酶突变体与N-乙酰葡萄糖胺进行酶反应。本领域技术人员能够理解，本发明所述的应用还可以包括使用制备N-乙酰甘露糖胺所需的其他试剂和材料。
N-乙酰葡萄糖胺异构酶突变体在制备N-乙酰神经氨酸中的应用也在本发明所包含的范围之内。
具体的，以N-乙酰葡萄糖胺、丙酮酸钠为底物，将所述的N-乙酰葡萄糖胺异构酶突变体与N-乙酰葡萄糖胺、丙酮酸钠、N-乙酰神经氨酸裂合酶进行酶反应。本领域技术人员能够理解，本发明所述的应用还可以包括使用制备N-乙酰神经氨酸所需的其他试剂和材料。
具体的，如图1所示，改造过后酶在48h反应过程中较为稳定，产量随时间的增长而增长，在18小时后达到平衡，且较野生菌有明显提升。
其中，制备N-乙酰甘露糖胺和N-乙酰神经氨酸可以利用本领域已知的常规方法进行，只要在各自的方法中，使用本发明所述的N-乙酰葡萄糖胺异构酶突变体作为相应步骤所需的酶即可。
有益效果：本发明通过对Anabaena sp.CH1的N-乙酰葡萄糖胺异构酶进行基因工程改造，提高了该酶催化活性。与野生型N-乙酰葡萄糖胺异构酶相比，本发明的N-乙酰葡萄糖胺异构酶突变体的酶活性提升了27-55％。在产N-乙酰神经氨酸的反应中，改造过后酶在反应过程中较为稳定，产量增加，且较野生菌有明显提升。本发明构建的N-乙酰葡萄糖胺异构酶突变体更适于工业化应用。
附图说明
下面结合附图和具体实施方式对本发明做更进一步的具体说明，本发明的上述和/或其他方面的优点将会变得更加清楚。
图1为针对WT和突变菌48小时反应示例
具体实施方式
以下通过具体实施方式的描述对本发明作进一步说明，但这并非是对本发明的限制，本领域技术人员根据本发明的基本思想，可以做出各种修改或改进，但是只要不脱离本发明的基本思想，均在本发明的范围之内。
下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
下述实施例中未注明具体条件的，均按常规条件或制造商建议的条件进行。除非特别说明，否则所述的百分比为体积百分比。
实施例1：N-乙酰葡萄糖胺异构酶基因的克隆和质粒pET28a-anAGE的构建
根据DNA序列数据库(EC号：EC 5.1.3.8)的N-乙酰葡萄糖胺异构酶DNA序列，运用软件Gene Designer 2.0，根据宿主细胞的密码子偏好性将该DNA序列优化。根据该基因序列设计引物anAGE-T1和anAGE-B1(表1)。
合成上述DNA序列，获得质粒Top10-anAGE，以质粒Top10-anAGE为模板，用引物对anAGE-T1和anAGE-B1进行PCR，扩增得到1167bp产物。
其中，PCR反应条件为：300ng质粒Top10-anAGE，60ng引物(anAGE-T1+anAGE-B1)，5μL 10x缓冲液，4μl 2.5mM dNTP，1μL PrimerStar聚合酶(TaKaRa公司)，用无菌水调反应体积至50μL。
其中，PCR反应扩增程序为：95℃5分钟，30个循环：94℃30秒、55℃30秒和72℃1.5分钟，最后72℃10分钟。
扩增反应得到野生型N-乙酰葡萄糖胺异构酶基因，通过1％(1g琼脂糖置于100mL1×TBE，微波炉加热至沸腾加入10μL GelRed染料，凝固后制得凝胶)琼脂糖电泳，利用DNA凝胶回收试剂盒(TaKaRa公司)提纯PCR产物，分离纯化大小为1167bp的片段，经XhoI和NotI(TaKaRa公司)酶切后以T4DNA连接酶(TaKaRa公司)连接至pET28a载体，获得质粒pET28a-anAGE。将该质粒转化入感受态大肠杆菌Rosetta(DE3)，在含34mg/L氯霉素和20mg/L卡那霉素的LB平板上37℃培养，挑取单菌落，用plasmid DNA purification试剂盒(TaKaRa公司)提取质粒pET28a-anAGE，经DNA测序确定序列。
实施例2：N-乙酰葡萄糖胺异构酶氨基酸位点73的定点突变
定点突变技术参考“PCR Protocols(John M.S.Bartlett和DavidStirling.Totowa,N.J.:Humana Press,2003)”一书之描述。
以实施例1构建的质粒pET28a-anAGE为模板，设计引物对73T1和73B1(表1)，将原始氨基酸序列中第73位的谷氨酸(Glu)突变为甘氨酸(Gly)，获得突变体anAGE-E73G。
具体而言，以质粒pET28a-anAGE为模板，用引物anAGE-T1和73B1扩增模板片段73-1；用引物anAGE-B1和73-T1扩增模板片段73-2。其中，PCR反应条件为：300ng质粒pET28a-anAGE，60ng引物(anAGE-T1+73B1)或60ng引物(anAGE-B1+73-T1)，5μL 10x缓冲液，4μL2.5mM dNTP，1μL PrimerStar聚合酶(TaKaRa公司)，用无菌水调反应体积至50μL。
其中，PCR反应扩增程序为：95℃5分钟，30个循环：94℃30秒、55℃30秒和72℃1.5分钟，最后72℃10分钟。
扩增得到模板片段73-1和模板片段73-2，通过1％(1g琼脂糖置于100mL 1×TBE，微波炉加热至沸腾加入10μL GelRed染料，凝固后制得凝胶)琼脂糖电泳，用DNA凝胶回收试剂盒(TaKaRa公司)提纯PCR产物，之后用引物anAGE-T1和anAGE-B1扩增全长基因。其中，PCR反应条件为：200ng模板片段73-1，200ng模板片段73-2，60ng引物(anAGE-T1+anAGE-B1)，5μL 10x缓冲液，4μL 2.5mM dNTP，1μL PrimerStar聚合酶(TaKaRa公司)，用无菌水调反应体积至50μL。
其中，PCR反应扩增程序为：95℃5分钟，30个循环：94℃30秒、55℃30秒和72℃1.5分钟，最后72℃10分钟。
扩增反应得全长突变基因，通过1％(1g琼脂糖置于100mL 1×TBE，微波炉加热至沸腾加入10μL GelRed染料，凝固后制得凝胶)琼脂糖电泳，用DNA凝胶回收试剂盒(TaKaRa公司)提纯PCR产物，分离纯化大小为1167pb的全长突变基因anAGE-E73G。
按照与上述类似的方法构建突变体anAGE-Q110C(第110位谷氨酰胺突变成半胱氨酸)、anAGE-L171I(第171位亮氨酸突变成异亮氨酸)、anAGE-A172G(第172位丙氨酸突变成甘氨酸)、anAGE-A198D(第198位丙氨酸突变成天冬氨酸)，所用引物见表1。
实施例3：质粒pET28a-anAGE-E73G的构建
用XhoI+NotI(TaKaRa公司)对突变基因anAGE-E73G和载体pET28a进行酶切，通过1％(1g琼脂糖置于100mL 1×TBE，微波炉加热至沸腾加入10μL GelRed染料，凝固后制得凝胶)琼脂糖电泳，用DNA片段纯化试剂盒(TaKaRa公司)提纯anAGE-E73G酶切后的产物，以进行分离纯化，以T4 DNA连接酶(TaKaRa公司)连接至酶切后的pET28a载体，再转化入感受态大肠杆菌Rosetta(DE3)，在含34mg/L氯霉素和20mg/L卡那霉素的LB平板上37℃培养，挑取单菌落，用plasmid DNA purification试剂盒(TaKaRa公司)提取质粒pET28a-anAGE-E73G，经DNA测序确定序列。
按照上述类似的方法构建质粒pET28a-anAGE-Q110C、pET28a-anAGE-L171I、pET28a-anAGE-A172G、pET28a-anAGE-A198D。
实施例4：N-乙酰葡萄糖胺异构酶双突变组合anAGE-A172G-A198D的构建
定点突变技术参考“PCR Protocols(John M.S.Bartlett和DavidStirling.Totowa,N.J.:Humana Press,2003)”一书之描述。
以实施例3构建的质粒pET28a-anAGE-A172G为模板，将氨基酸序列中第198位的丙氨酸(Ala)突变为天冬氨酸(Asp)，获得突变体anAGE-A172G-A198D。
具体而言，以质粒pET28a-anAGE-A172G为模板，用引物anAGE-T1和198-B1(表1)扩增模板片段73G198D-1；用引物anAGE-B1和198-T1扩增模板片段73G198D-2。其中，PCR反应条件为：300ng质粒pET28a-anAGE-A172G，60ng引物(anAGE-T1+198-B1)或60ng引物(anAGE-B1+198-T1)，5μL 10x缓冲液，4μL 2.5mM dNTP，1μL PrimerStar聚合酶(TaKaRa公司)，用无菌水调反应体积至50μL。
其中，PCR反应扩增程序为：95℃5分钟，30个循环：94℃30秒、55℃30秒和72℃1.5分钟，最后72℃10分钟。
扩增得模板片段73G198D-1和模板片段73G198D-2，通过1％(1g琼脂糖置于100mL1×TBE，微波炉加热至沸腾加入10μL GelRed染料，凝固后制得凝胶)琼脂糖电泳，用DNA凝胶回收试剂盒(TaKaRa公司)提纯PCR产物，之后用引物anAGE-T1和anAGE-B1扩增全长基因。其中，PCR反应条件为：200ng模板片段73G198D-1和200ng模板片段73G198D-2，60ng引物(anAGE-T1+anAGE-B1)，5μL 10x缓冲液，4μL 2.5mM dNTP，1μL PrimerStar聚合酶(TaKaRa公司)，用无菌水调反应体积至50μL。
其中，PCR反应扩增程序为：95℃5分钟，30个循环：94℃30秒、55℃30秒和72℃1.5分钟，最后72℃10分钟。
扩增反应得全长突变基因，通过1％(1g琼脂糖置于100mL 1×TBE，微波炉加热至沸腾加入10μL GelRed染料，凝固后制得凝胶。)琼脂糖电泳，用DNA凝胶回收试剂盒(TaKaRa公司)提纯PCR产物，分离纯化大小为1167pb的全长突变基因anAGE-A172G-A198D。
用XhoI+NotI(TaKaRa公司)对突变基因anAGE-A172G-A198D和载体pET28a进行酶切，通过1％(1g琼脂糖置于100mL 1×TBE，微波炉加热至沸腾加入10μLGelRed染料，凝固后制得凝胶。)琼脂糖电泳，用DNA片段纯化试剂盒(TaKaRa公司)提纯anAGE-A172G-A198D酶切后的产物，以进行分离纯化，以T4 DNA连接酶(TaKaRa公司)连接至酶切后的pET28a载体，再转化入感受态大肠杆菌Rosetta(DE3)，在含34mg/L氯霉素和20mg/L卡那霉素的LB平板上37℃培养，挑取单菌落，用plasmid DNA purification试剂盒(TaKaRa公司)提取质粒pET28a-anAGE-A172G-A198D，经DNA测序确定序列。
表1上述突变体构建过程中所用引物表
实施例5：N-乙酰葡萄糖胺异构酶突变体的效果检测
将含有突变体表达载体及野生型表达载体的大肠杆菌分别在TB培养基中培养至OD600＝0.6-0.8时，加入终浓度为0.2mM的IPTG以诱导蛋白表达。培养24h后收集菌体，用于催化反应。
制备标准反应混合物(10ml)：20g/L N-乙酰葡萄糖胺，20g/L MgCl2.6H2O，1g/LATP，1‰TritonX-100，10g/L N-乙酰葡萄糖胺异构酶。上述反应通透液，在37℃下以200rpm搅拌反应混合物6h，并通过添加5mol/L碱溶液将反应pH维持在7.5，评估突变菌与野生菌的酶活(催化活性定义为在1分钟内，每1g含酶湿菌体催化生成的SA的μmol量)。表2列出了野生型N-乙酰葡萄糖胺异构酶与各N-乙酰葡萄糖胺异构酶突变体的酶活。
实验结果如表2所示，在催化反应过程中，所有突变体的活性均比WT高，展现了更高的催化活性。改造位点位于包括了活性口袋位点及稳定性相关位点，改造过后使酶更加趋于稳定，使其活性增强。
表2野生型N-乙酰葡萄糖胺异构酶与各N-乙酰葡萄糖胺异构酶突变体的酶活
| 序列表序列编号 | N-乙酰葡萄糖胺异构酶 | 酶活(％) |
| SEQ ID No.:2 | WT | 100 |
| SEQ ID No.:3 | pET28a-anAGE-E73G | 130 |
| SEQ ID No.:4 | pET28a-anAGE-Q110C | 137 |
| SEQ ID No.:5 | pET28a-anAGE-L171I | 127 |
| SEQ ID No.:6 | pET28a-anAGE-A172G | 145 |
| SEQ ID No.:7 | pET28a-anAGE-A198D | 150 |
| SEQ ID No.:8 | pET28a-anAGE-A172G-A198D | 155 |
实施例6：N-乙酰葡萄糖50mL体系生产N-乙酰神经氨酸
按以下反应体系制备N-乙酰神经氨酸：50g/L N-乙酰葡萄糖胺异构酶，50g/L N-乙酰神经氨酸裂合酶，20g/L MgCl2.6H2O，1‰TritonX-100，120g/L N-乙酰葡萄糖胺，70g/L丙酮酸。上述反应通透液，在37℃下以200rpm搅拌反应混合物48h，并通过添加5mol/L碱溶液将反应pH维持在7.5，评估突变菌与野生菌的产量及酶稳定性。
结果如图1所示，从图中可以看出，改造过后酶在48h反应过程中较为稳定，产量随时间的增长而增长，在18小时后达到平衡，且较野生菌有明显提升。
本发明提供了一种N-乙酰葡萄糖胺异构酶突变体及其应用的思路及方法，具体实现该技术方案的方法和途径很多，以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。本实施例中未明确的各组成部分均可用现有技术加以实现。
Claims (10)
1.一种N-乙酰葡萄糖胺异构酶突变体，其特征在于，所述的N-乙酰葡萄糖胺异构酶突变体的氨基酸序列，是对野生型N-乙酰葡萄糖胺异构酶位于第73位谷氨酸、第110位谷氨酰胺、第171位亮氨酸、第172位丙氨酸或第198位丙氨酸中的任意一个或几个位点进行突变得到的，其中，第73位谷氨酸Glu突变为甘氨酸Gly，第110位谷氨酰胺Gln突变成半胱氨酸Cys，第171位亮氨酸Leu突变成异亮氨酸Ile，第172位丙氨酸Ala突变成甘氨酸Gly，第198位丙氨酸Ala突变成天冬氨酸Asp。
2.根据权利要求1所述的N-乙酰葡萄糖胺异构酶突变体，其特征在于，所述的野生型N-乙酰葡萄糖胺异构酶，来源于Anabaena sp.CH1中的N-acetylglucosamine 2-epimerase，其氨基酸序列如SEQ ID No.:1所示，对应的编码野生型N-乙酰葡萄糖胺异构酶的核苷酸序列如SEQ ID No.:2所示。
3.根据权利要求1所述的N-乙酰葡萄糖胺异构酶突变体，其特征在于，所述的N-乙酰葡萄糖胺异构酶突变体，其氨基酸序列如SEQ ID No.:3-8中的任意一项所示。
4.根据权利要求1所述的N-乙酰葡萄糖胺异构酶突变体，其特征在于，所述的N-乙酰葡萄糖胺异构酶突变体，其核苷酸序列如SEQ ID No.:9-14中的任意一项所示。
5.权利要求1所述的N-乙酰葡萄糖胺异构酶突变体的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)全基因合成N-乙酰葡萄糖胺异构酶基因anAGE，将经PCR扩增和切胶回收后的片段通过酶切连接至pET28a载体上，获得质粒pET28a-anAGE；
(2)以步骤(1)获得的质粒pET28a-anAGE为模板，利用野生型引物与突变位点引物进行分段PCR，纯化回收分段PCR产物后，再以分段PCR产物为模板，进行overlap PCR，获得具有突变位点的N-乙酰葡萄糖胺异构酶基因；
(3)将步骤(2)获得的具有突变位点的N-乙酰葡萄糖胺异构酶基因，分别进行酶切连接至pET28a载体上构建重组质粒，再分别将上述重组质粒转化入感受态大肠杆菌Rosetta(DE3)中，获得N-乙酰葡萄糖胺异构酶突变体。
6.根据权利要求5所述的构建方法，其特征在于，步骤(3)中，所述的重组质粒包括pET28a-anAGE-E73G、pET28a-anAGE-Q110C、pET28a-anAGE-L171I、pET28a-anAGE-A172G和pET28a-anAGE-A198D，其中，以重组质粒pET28a-anAGE-A172G为模板，将氨基酸序列中第198位的丙氨酸Ala突变为天冬氨酸Asp，获得N-乙酰葡萄糖胺异构酶双突变体anAGE-A172G-A198D。
7.权利要求1-3中任意一项所述的N-乙酰葡萄糖胺异构酶突变体在制备N-乙酰甘露糖胺中的应用。
8.权利要求1-3中任意一项所述的N-乙酰葡萄糖胺异构酶突变体在制备N-乙酰神经氨酸中的应用。
9.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，以N-乙酰葡萄糖胺为底物，将权利要求1-3中任意一项所述的N-乙酰葡萄糖胺异构酶突变体与N-乙酰葡萄糖胺进行酶反应。
10.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，以N-乙酰葡萄糖胺、丙酮酸钠为底物，将权利要求1-3中任意一项所述的N-乙酰葡萄糖胺异构酶突变体与N-乙酰葡萄糖胺、丙酮酸钠、N-乙酰神经氨酸裂合酶进行酶反应。
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