CN109295026B

CN109295026B - 一种n-脱氧核糖转移酶ii定向进化改造和生物催化应用

Info

Publication number: CN109295026B
Application number: CN201811214801.2A
Authority: CN
Inventors: 王洪钟; 李京美
Original assignee: Tsinghua University
Current assignee: Tsinghua University
Priority date: 2018-10-18
Filing date: 2018-10-18
Publication date: 2021-08-24
Anticipated expiration: 2038-10-18
Also published as: CN109295026A

Abstract

本发明公开了一种N‑脱氧核糖转移酶II定向进化改造和生物催化应用。本发明提供了N‑脱氧核糖转移酶Ⅱ(NDT)突变体，其为将序列表中序列2所示的氨基酸残基第10位的Gly突变为Ser，且其他氨基酸残基不变，得到的蛋白质。本发明通过序列比对瑞士乳杆菌来源的NDT(Lh NDT)和莱曼氏乳杆菌来源的NDT(Ll NDT)，同源建模，构建饱和突变体库，高通量筛选600个突变体，获得酶活力提高10.4倍瑞士乳杆菌来源的N‑脱氧核糖转移酶Ⅱ突变体。本发明提供的N‑脱氧核糖转移酶Ⅱ突变体可以高效催化制备抗艾滋病药物扎西他滨。

Description

一种N-脱氧核糖转移酶II定向进化改造和生物催化应用

技术领域

本发明属于酶的定向进化改造和生物催化应用技术领域，尤其涉及一种N-脱氧核糖转移酶II定向进化改造和生物催化应用。

背景技术

核苷类似物在临床上广泛应用于病毒和肿瘤疾病的治疗，目前使用的抗病毒药物中近50％是核苷类药物。如治疗疱疹病毒感染的阿昔洛韦、泛昔洛韦；治疗单纯疱疹及脑炎的阿糖腺苷，治疗丙型肝炎的利巴韦林、索非布韦，治疗艾滋病的HIV逆转录酶抑制剂齐多夫定、扎西他滨、司他夫定、拉米夫定，新一代抗肿瘤药物地西他滨、吉西他滨、奈拉滨等都属于核苷类药物。其中扎西他滨(Zalcitabine，DDC)，化学名2',3'-二脱氧胞苷，在细胞内转化为有活性的三磷酸代谢物，从而竞争性抑制逆转录酶活性，临床上主要用于艾滋病和艾滋病相关综合症的治疗。目前扎西他滨的制备采用化学合成法，步骤复杂，反应条件苛刻，收率低，生产成本高。

N-脱氧核糖转移酶(EC 2.4.2.6)可以催化脱氧核糖在不同碱基之间的转移，根据底物特异性的不同可以分为两类：N-脱氧核糖转移酶Ⅰ(NucleosidedeoxyribosyltransferaseⅠ,PDT)，只能催化脱氧核糖在嘌呤之间转移；N-脱氧核糖转移酶Ⅱ(Nucleoside deoxyribosyltransferaseⅡ,NDT)，催化脱氧核糖在嘌呤和嘧啶之间的转移。

NDT碱基识别范围广，可以识别多种天然和经过修饰的碱基，且转化率较高，因此被应用于多种脱氧核苷类似物的合成，如5-氟-2'-脱氧尿苷，6-氯-2'-脱氧胞苷等。但NDT对2'-脱氧核糖结构有高度底物特异性,对于带有糖基修饰的核苷类似物，如阿糖胞苷，司他夫定，吉西他滨和扎西他滨等，催化合成的效率极低，限制了NDT的应用。前期研究发现，瑞士乳杆菌来源的野生型NDT(Lh NDT)几乎不能催化2',3'-二脱氧核苷进行反应，如不能催化2',3'-二脱氧肌苷合成扎西他滨。因此需要通过对瑞士乳杆菌来源的野生型NDT定向进化改造，扩大NDT的底物识别范围或者增强对2',3'-二脱氧核苷的特异性，提高酶的活性和催化效率，获得高转化率的NDT。

发明内容

本发明是针对现有N-脱氧核糖转移酶Ⅱ(NDT)对带有糖基修饰的核苷类似物特别是2',3'-二脱氧核糖类似物催化效率低的问题,提供一种通过定向进化提高酶活力的N-脱氧核糖转移酶Ⅱ突变体的制备方法与应用。

本发明一个目的是提供蛋白质。

本发明提供的蛋白质，为N-脱氧核糖转移酶Ⅱ(NDT)突变体，命名为THNDT，其为将序列表中序列2所示的氨基酸残基第10位的Gly突变为Ser，且其他氨基酸残基不变，得到的蛋白质。

在如上蛋白基础上，做出如下变形的蛋白也都属与本发明的蛋白的保护范围,如下变形的蛋白为1)或2)或3)：

1)氨基酸序列是序列表中序列4所示的蛋白质；

2)在序列表中序列4所示的蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；

3)将1)或2)所示的蛋白质经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与带有糖基修饰的核苷类似物合成相关的蛋白质；

或，所述蛋白质作为N-脱氧核糖转移酶II催化效率高于序列4所示的N-脱氧核糖转移酶II的催化效率。

上述中，所述催化效率是指催化2',3'-二脱氧核苷类化合物发生糖基转移反应生成不同碱基2',3'-二脱氧核苷类似物的转化率；

DNA是由脱氧核苷酸组成，包括三部分。一个碱基、一个脱氧核糖和一个磷酸，此处脱氧核糖是指2'-脱氧核苷类化合物。2',3'-二脱氧核苷类化合物是指脱氧核糖中另外一个羟基即3'-羟基被H取代，有几种药物是2',3'-二脱氧核苷类化合物，包括扎西他滨。

和/或，所述催化效率是指催化底物2',3'-二脱氧肌苷合成扎西他滨的转化率。

上述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加为不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。

编码上述蛋白质的核酸分子也是本发明保护的范围。

上述核酸分子为如下(a1)或(a2)或(a3)或(a4)所示的DNA分子：

(a1)编码区包括序列表中序列3的DNA分子；

(a2)核苷酸序列是序列表中序列3的DNA分子；

(a3)与(a1)或(a2)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码上述蛋白质的DNA分子；

(a4)在严格条件下与(a1)或(a2)限定的核苷酸序列杂交，且编码上述蛋白质的DNA分子。

上述严格条件可为用6×SSC，0.5％SDS的溶液，在65℃下杂交，然后用2×SSC，0.1％SDS和1×SSC，0.1％SDS各洗膜一次。

含有上述核酸分子的表达盒、重组载体或重组微生物也是本发明保护的范围。

b1)-b6)中任一种的应用也是本发明保护的范围：

b1)上述蛋白质，或，上述核酸分子，或，上述的表达盒、重组载体或重组微生物，在催化合成带有糖基修饰的核苷类似物中的应用；

b2)上述蛋白质，或，上述核酸分子，或，上述的表达盒、重组载体或重组微生物，在提高催化合成带有糖基修饰的核苷类似物产量中的应用；

b3)上述蛋白质，或，上述核酸分子，或，上述的表达盒、重组载体或重组微生物，在催化或识别2',3'-二脱氧核苷中的应用；

b4)上述蛋白质，在作为N-脱氧核糖转移酶Ⅱ中的应用；

b5)上述蛋白质，或，上述核酸分子，或，上述的表达盒、重组载体或重组微生物，在提高N-脱氧核糖转移酶II催化效率中的应用；

b6)上述蛋白质，或，上述核酸分子，或，含有上述核酸分子的表达盒、重组载体或重组微生物在制备扎西他滨中的应用。

上述应用中，所述带有糖基修饰的核苷类似物为2',3'-二脱氧核糖类似物；

和/或，所述2',3'-二脱氧核糖类似物为扎西他滨。

本发明另一个目的是提供一种获得2',3'-二脱氧胞苷的方法，也就是制备抗艾滋病药物扎西他滨的方法。

本发明提供的方法，包括如下步骤：用上述蛋白质，或，上述核酸分子，或，上述的表达盒、重组载体或重组微生物催化2',3'-二脱氧肌苷和胞嘧啶，得到扎西他滨。

本发明第3个目的是提供一种提高N-脱氧核糖转移酶II催化效率的方法，为将序列表中序列4所示的氨基酸残基为序列表中序列2所示的氨基酸残基，所述序列表中序列2所示的氨基酸残基的N-脱氧核糖转移酶II催化效率高于序列表中序列4所示的氨基酸残基。

本发明的实验证明，本发明构建了瑞士乳杆菌来源的NDT重组工程菌株。通过序列比对，对瑞士乳杆菌来源的NDT(LhNDT)进行同源建模，通过饱和定点突变与高通量筛选，获得瑞士乳杆菌来源的酶活力提高5.2倍的N-脱氧核糖转移酶Ⅱ突变体。本发明提供的N-脱氧核糖转移酶Ⅱ突变体可以高效催化制备抗艾滋病药物扎西他滨(2',3'-二脱氧胞苷)。利用表达THNDT的全细胞催化2',3'-二脱氧肌苷和胞嘧啶合成2',3'-二脱氧胞苷，通过HPLC检测，仅反应8h转化率达到23.8％，酶活较野生型提高了10.4倍。本发明提供N-脱氧核糖转移酶Ⅱ突变体THNDT可以用于全细胞催化合成抗艾滋病药物扎西他滨。

附图说明

图1为N-脱氧核糖转移酶Ⅱ-胞苷脱氨酶偶联显色反应。

图2为参与酶与底物相互作用的活性位点分析。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下面通过具体的实施方案叙述本发明方法。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。

下面通过具体的实施例来进行介绍。

实施例1、N-脱氧核糖转移酶Ⅱ(NDT)突变体的获得

1、N-脱氧核糖转移酶Ⅱ(NDT)重组工程菌株的构建

以瑞士乳杆菌(CGMCC 1.1877)菌液为模板进行PCR扩增获得目的基因ndt的片段(核苷酸序列为序列表中序列1)，该基因编码的蛋白的氨基酸序列为序列表中序列2。

依据Genbank中查找得到的瑞士乳杆菌N-脱氧核糖转移酶Ⅱ基因(ndt)的核酸序列，设计一对扩增引物：

ndt(+):5’–CGCCATATGATGAACAAGAAAAAGAC-3’

ndt(-):5’–CGGGAATTCTTAATATACAGCTCCG-3’

将回收纯化后的PCR产物与pMD18-T质粒进行连接得到克隆质粒pMD18-T-ndt。将连接产物pMD18-T-ndt转化进入大肠杆菌Trans5α感受态细胞中。过夜培养后，挑选并鉴定阳性克隆。提取pMD18-T-ndt质粒，与pET-28a(+)质粒进行酶切连接。将连接产物pET-28a(+)-ndt转入表达菌株E.coli BL21(DE3)中，过夜培养后，挑选并鉴定阳性克隆。阳性克隆测序，选择目的序列正确的菌株进行甘油保菌，并于-80℃超低温冰箱中保存。

2、N-脱氧核糖转移酶Ⅱ(NDT)突变体文库的制备

通过序列比对选择与瑞士乳杆菌来源的NDT(Lh NDT)序列最相近的莱曼氏乳杆菌来源的NDT(Ll NDT),以该三维结构为模板利用Swiss-model同源建模，模拟Lh NDT的三维结构。利用Discovery Studio软件分析Ll NDT与五甲基脱氧假尿苷结合的结构(PDB code1F8X)，得到酶与底物相互作用的关键位点(图2A)。分析Ll NDT距离脱氧核糖上2’C和3’C

以内的氨基酸(图2B)。利用HotSpot Wizard在线分析Lh NDT结构中同源位点的可突变性。

结合上述软件分析结果选出进行饱和定点突变的氨基酸位点:Gly10，Ala11，Leu96。

根据选择的位点设计简并引物，以pET-28a(+)-ndt为模板进行全质粒PCR。产物通过DpnI消化去除模板后转入E.coli BL21(DE3)感受态细胞，菌液涂布含有的卡那霉素50μg/L的平板得到定点饱和突变文库。

G10N-F 5'-TTNNKGCCGGTTGGTTTAATGAAAAGCA-3'

G10N-R 5'-CCAACCGGCMNNAAAATATAAAGTCTT-3'

A11N-F 5'-GGTNNKGGTTGGTTTAATGAAAAGCA-3'

A11N-R 5'-CCAMNNGGCACCAAAATATAAAGTCTT-3'

L96N-F 5'-GGCNNKGGCATGGAACTGGGCTACGCAT-3'

L96N-R 5'-GCCMNNGCCGACGTCTTCTTCTTCTGG-3'

3、N-脱氧核糖转移酶Ⅱ突变体(THNDT)催化制备扎西他滨

通过联合胞苷脱氨酶(CDA)和靛酚蓝比色法，建立了基于全细胞催化和96孔板筛选的NDT突变体高通量筛选方法(图1)。NDT催化2',3'-二脱氧肌苷与胞嘧啶生成2',3'-二脱氧胞苷(1)。CDA可以催化2',3'-二脱氧胞苷的不可逆脱氨反应，生成2',3'-二脱氧尿苷和氨(2)。2',3'-二脱氧胞苷分解生成的氨，在催化剂亚硝酰铁的催化下，在碱性环境中与次氯酸钠、苯酚反应生成靛酚蓝(3)。因此可以通过检测反应液在630nm处的吸光度，测定NDT催化生成2',3'-二脱氧胞苷或其类似物的量。

采用上述高通量筛选方法，以2',3'-二脱氧肌苷和胞嘧啶为底物进行反应，对600个突变体进行筛选。在饱和突变体与底物反应的96孔板中筛选出4个吸光度明显增强的突变子，经测序4个突变子均为Ser突变，将该NDT突变体命名为THNDT，其氨基酸序列为序列4，该突变体的编码基因THNDT为序列表中序列3。

与未突变的野生型NDT(序列2)相比，其为将序列表中序列2所示的氨基酸残基第10位的Gly突变为Ser，得到序列4所示的蛋白质THNDT；

与未突变的野生型NDT编码基因(序列1)相比，其为将序列表中序列1所示的核苷酸序列第28位的G突变为A，得到序列3所示的THNDT。

实施例2、NDT突变体THNDT的制备及功能检测

一、NDT突变体THNDT的制备

1、表达NDT突变体THNDT的重组菌

表达NDT突变体THNDT的重组菌为将重组质粒pET-28a(+)-THNDT导入表达菌株E.coli BL21(DE3)中得到的重组菌。上述重组质粒pET-28a(+)-THNDT为将序列表中序列1所示的NDT突变体THNDT编码基因替换pET-28a(+)载体的Nde I和EcoR I酶切位点间的片段得到的质粒，该质粒表达NDT突变体THNDT。

表达NDT的重组菌为将重组质粒pET-28a(+)-NDT导入表达菌株E.coli BL21(DE3)中得到的重组菌。上述重组质粒pET-28a(+)-NDT为将序列表中序列3所示的NDT编码基因替换pET-28a(+)载体的Nde I和EcoR I酶切位点间的片段得到的质粒，该质粒表达序列2所示的NDT。

2、表达NDT突变体THNDT的重组菌的诱导表达

将表达NDT突变体THNDT的重组菌和表达NDT的重组菌分别以1％的比例接种于自诱导培养基(含有蛋白胨1％，酵母提取物0.5％，甘油0.5％，乳糖0.2％，葡萄糖0.05％，Na₂HPO₄ 25mM，NH₄Cl 50mM，KH₂PO₄ 25mM，Na₂SO₄ 5mM，MgSO₄ 2mM，FeCl₃ 100μM，试剂购买于Oxoid公司)，220rpm,37℃培养12h。6000rpm离心后收集诱导表达菌体,用pH 6.0的PBS缓冲液清洗两次，收集THNDT重组菌体和NDT重组菌体。

3、表达NDT突变体THNDT的重组菌的功能验证

反应底物溶液为将5mM 2',3'-二脱氧肌苷和10mM胞嘧啶溶解于pH 6.0，50mM PBS缓冲液(磷酸二氢钾8.34g与磷酸氢二钾0.87g,NaOH(0.1M)调节pH至6.0,加水至1000ml)中得到的溶液；

向上述底物溶液中分别加入THNDT重组菌体和NDT重组菌体，且每种菌体的浓度均为2mg/mL；220rpm,50℃催化反应12h，得到反应产物。

HPLC(反应产物用超纯水稀释50倍，经过0.02μm的滤器过滤后进行检测，流动相为15％甲醇和85％水，流速为1mL/min，检测波长为245nm,2',3'-二脱氧胞苷标准品的保留时间为5.7min)检测反应产物，

结果如下：

扎西他滨(2',3'-二脱氧胞苷)的转化率(T)的计算方法为：T＝(实际2',3'-二脱氧胞苷的产物峰面积/理论所得2',3'-二脱氧胞苷的产物峰面积)×100％

THNDT重组菌体催化2',3'-二脱氧肌苷获得扎西他滨(2',3'-二脱氧胞苷)的转化率达到23.8％；

NDT重组菌体催化2',3'-二脱氧肌苷获得扎西他滨(2',3'-二脱氧胞苷)的转化率达到2.3％。

上述结果表明，突变体THNDT催化2',3'-二脱氧肌苷和胞嘧啶合成2',3'-二脱氧胞苷的催化活性是野生型NDT的10.4倍。

序列表

<110> 清华大学

<120>一种N-脱氧核糖转移酶II定向进化改造和生物催化应用

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 477

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

atgaacaaga aaaagacttt atattttggt gccggttggt ttaatgaaaa gcaaaacaaa 60

gcttacaaag aagcaatggc agctttaaaa gaaaatccaa cagttgattt agaaaatagt 120

tatgtgcccc ttgaaaacca atacaagggt attcgcattg atgaacatcc agaatacttg 180

cacaacattg aatgggcttc tgcaacctac cacaatgatt tagtaggaat taagacttct 240

gatgtcatgc ttggcgtata tttgccagaa gaagaagacg tcggcttagg catggaactg 300

ggctacgcat tatctcaagg aaaatatatt ttattggtta tcccagatga agattacggc 360

aagccaatca acttaatgag ctggggcgtt tgtgacaatg ccatcaagat cagtgaatta 420

aaagacttcg actttaacaa gcctcgctac aatttctacg acggagctgt atattaa 477

<210> 2

<211> 158

<212> PRT

<213>人工序列

<400> 2

Met Asn Lys Lys Lys Thr Leu Tyr Phe Gly Ala Gly Trp Phe Asn Glu

1 5 10 15

Lys Gln Asn Lys Ala Tyr Lys Glu Ala Met Ala Ala Leu Lys Glu Asn

20 25 30

Pro Thr Val Asp Leu Glu Asn Ser Tyr Val Pro Leu Glu Asn Gln Tyr

35 40 45

Lys Gly Ile Arg Ile Asp Glu His Pro Glu Tyr Leu His Asn Ile Glu

50 55 60

Trp Ala Ser Ala Thr Tyr His Asn Asp Leu Val Gly Ile Lys Thr Ser

65 70 75 80

Asp Val Met Leu Gly Val Tyr Leu Pro Glu Glu Glu Asp Val Gly Leu

85 90 95

Gly Met Glu Leu Gly Tyr Ala Leu Ser Gln Gly Lys Tyr Ile Leu Leu

100 105 110

Val Ile Pro Asp Glu Asp Tyr Gly Lys Pro Ile Asn Leu Met Ser Trp

115 120 125

Gly Val Cys Asp Asn Ala Ile Lys Ile Ser Glu Leu Lys Asp Phe Asp

130 135 140

Phe Asn Lys Pro Arg Tyr Asn Phe Tyr Asp Gly Ala Val Tyr

145 150 155

<210> 3

<211> 477

<212> DNA

<213>人工序列

<400> 3

atgaacaaga aaaagacttt atattttagt gccggttggt ttaatgaaaa gcaaaacaaa 60

gcttacaaag aagcaatggc agctttaaaa gaaaatccaa cagttgattt agaaaatagt 120

tatgtgcccc ttgaaaacca atacaagggt attcgcattg atgaacatcc agaatacttg 180

cacaacattg aatgggcttc tgcaacctac cacaatgatt tagtaggaat taagacttct 240

gatgtcatgc ttggcgtata tttgccagaa gaagaagacg tcggcttagg catggaactg 300

ggctacgcat tatctcaagg aaaatatatt ttattggtta tcccagatga agattacggc 360

aagccaatca acttaatgag ctggggcgtt tgtgacaatg ccatcaagat cagtgaatta 420

aaagacttcg actttaacaa gcctcgctac aatttctacg acggagctgt atattaa 477

<210> 4

<211> 158

<212> PRT

<213>人工序列

<400> 4

Met Asn Lys Lys Lys Thr Leu Tyr Phe Ser Ala Gly Trp Phe Asn Glu

1 5 10 15

Lys Gln Asn Lys Ala Tyr Lys Glu Ala Met Ala Ala Leu Lys Glu Asn

20 25 30

Pro Thr Val Asp Leu Glu Asn Ser Tyr Val Pro Leu Glu Asn Gln Tyr

35 40 45

Lys Gly Ile Arg Ile Asp Glu His Pro Glu Tyr Leu His Asn Ile Glu

50 55 60

Trp Ala Ser Ala Thr Tyr His Asn Asp Leu Val Gly Ile Lys Thr Ser

65 70 75 80

Asp Val Met Leu Gly Val Tyr Leu Pro Glu Glu Glu Asp Val Gly Leu

85 90 95

Gly Met Glu Leu Gly Tyr Ala Leu Ser Gln Gly Lys Tyr Ile Leu Leu

100 105 110

Val Ile Pro Asp Glu Asp Tyr Gly Lys Pro Ile Asn Leu Met Ser Trp

115 120 125

Gly Val Cys Asp Asn Ala Ile Lys Ile Ser Glu Leu Lys Asp Phe Asp

130 135 140

Phe Asn Lys Pro Arg Tyr Asn Phe Tyr Asp Gly Ala Val Tyr

145 150 155

Claims

1.蛋白质，其为将序列表中序列2所示的氨基酸残基第10位的Gly突变为Ser，且其他氨基酸残基不变，得到的蛋白质。

2.根据权利要求1所述的蛋白质，其特征在于：所述蛋白质为如下1)或2)：

1)氨基酸序列是序列表中序列4所示的蛋白质；

2)在序列表中序列4所示的蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质。

3.编码权利要求1或2所述蛋白质的核酸分子。

4.如权利要求3所述的核酸分子，其特征在于：所述核酸分子为如下(a1)或(a2)所示的DNA分子：

(a1)编码区包括序列表中序列3的DNA分子；

(a2)核苷酸序列是序列表中序列3的DNA分子。

5.含有权利要求3或4所述核酸分子的表达盒、重组载体或重组微生物。

6.b1)-b6)中任一种的应用：

b1)权利要求1或2所述蛋白质，或，权利要求3或4所述核酸分子，或，权利要求5所述的表达盒、重组载体或重组微生物，在催化合成带有糖基修饰的核苷类似物中的应用；

b2)权利要求1或2所述蛋白质，或，权利要求3或4所述核酸分子，或，权利要求5所述的表达盒、重组载体或重组微生物，在提高催化合成带有糖基修饰的核苷类似物产量中的应用；

b3)权利要求1或2所述蛋白质，或，权利要求3或4所述核酸分子，或，权利要求5所述的表达盒、重组载体或重组微生物，在催化或识别2',3'-二脱氧核苷中的应用；

b4)权利要求1或2所述蛋白质，在作为N-脱氧核糖转移酶Ⅱ中的应用；

b5)权利要求1或2所述蛋白质，或，权利要求3或4所述核酸分子，或，权利要求5所述的表达盒、重组载体或重组微生物，在提高N-脱氧核糖转移酶II催化效率中的应用；

b6)权利要求1所述蛋白质，或，权利要求2或3所述核酸分子，或，含有权利要求2或3所述核酸分子的表达盒、重组载体或重组微生物在制备扎西他滨中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：

所述带有糖基修饰的核苷类似物为2',3'-二脱氧核糖类似物；

和/或，所述2',3'-二脱氧核糖类似物为扎西他滨。

8.一种获得扎西他滨的方法，包括如下步骤：用权利要求1或2所述蛋白质，或，权利要求3或4所述核酸分子，或，权利要求5所述的表达盒、重组载体或重组微生物催化2',3'-二脱氧肌苷和胞嘧啶，得到扎西他滨。

9.一种提高N-脱氧核糖转移酶II催化效率的方法，为将序列表中序列4所示的氨基酸残基为序列表中序列2所示的氨基酸残基，所述序列表中序列2所示的氨基酸残基的N-脱氧核糖转移酶II催化效率高于序列表中序列4所示的氨基酸残基。

10.根据权利要求2所述的蛋白或权利要求6所述的应用或权利要求9所述的方法，其特征在于：

所述催化效率是指催化2',3'-二脱氧核苷类化合物发生糖基转移反应生成不同碱基2',3'-二脱氧核苷类似物的转化率；