KR19980042777A

KR19980042777A - 뉴클레오사이드－５＇－포스페이트 에스테르의 제조방법

Info

Publication number: KR19980042777A
Application number: KR1019970063122A
Authority: KR
Inventors: 야스히로 미하라; 다카시 우타가와; 히데아키 야마다; 야스히사시가 아사노
Original assignee: 에가시라 구니오; 아지노모토 가부시키가이샤
Priority date: 1996-11-21
Filing date: 1997-11-21
Publication date: 1998-08-17
Also published as: BR9705813A; US6355472B2; DE69721213D1; DE69721213T2; US20020004590A1; EP0857788A2; ES2199330T3; KR100458970B1; EP0857788B1; US6207435B1; CN1117870C; EP0857788A3; JPH10201481A; BR9705813B1; JP4304727B2; CN1184157A; US6015697A

Abstract

뉴클레오사이드-5'-포스페이트 에스테르의 제조방법은 뉴클레오사이드를 생화학적으로 인산화하여 저렴하고 효율적으로 제공된다.

뉴클레오사이드-5'-포스페이트 에스테르는 산 포스파타제, 특히 뉴클레오사이드에 대한 친화성이 증가되고/증가되거나 온도 안정성이 증가된 산 포스파타제 및 산 포스파타제 활성을 갖는 단백질을 암호화하는 유전자가 도입된 미생물을 pH 3.3 내지 5.5의 조건하에서 뉴클레오사이드 또는 폴리인산 또는 이의 염, 페닐인산 또는 이의 염 및 카바밀 포스페이트 및 이의 염으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 포스페이트 그룹 공여체 상에 작용시켜 뉴클레오사이드-5'-포스페이트 에스테르를 생성시켜 이를 수거함으로서 제조한다.

Description

뉴클레오사이드-5'-포스페이트 에스테르의 제조방법

본 발명은 뉴클레오사이드-5'-포스페이트 에스테르를 제조하는 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 신규한 산 포스파타제, 산 포스파타제를 암호화하는 유전자, 유전자를 함유하는 재조합 DNA 및 뉴클레오사이드-5'-포스페이트 에스테르를 제조하는데 유용한 재조합 DNA를 함유하는 미생물에 관한 것이다. 뉴클레오사이드-5'-포스페이트 에스테르는 조미료, 약제 및 이러한 기질을 제조하기 위한 원료로서 유용하다.

p-니트로페닐인산을 사용하는 방법(일본 특허공보 제39-29858호), 무기 인산을 사용하는 방법(일본 특허공보 제42-1186호), 폴리인산을 사용하는 방법(일본 공개특허공보 제53-56390호), 아세틸인산을 사용하는 방법(일본 공개특허공보 제56-82098호) 및 아데노신 트리포스페이트(ATP)(일본 공개특허공보 제63-230094호)를 사용하는 방법을 포함하여 포스페이트 그룹 공여체를 사용한 뉴클레오사이드를 생화학적으로 인산화함으로서 뉴클레오사이드-5'-포스페이트 에스테르를 제조하는 방법은 공지되어 있다. 그러나, 이들 방법은 사용할 기질이 값비싸거나, 반응에서 부산물이 생성되기 때문에 뉴클레오사이드-5'-포스페이트 에스테르를 효율적이고 값싸게 제조하는데 불만족스럽다.

따라서, 본 발명자들은 특정 미생물의 세포를 산성 조건하에서 뉴클레오사이드 및; 폴리인산 또는 이의 염, 페닐인산 또는 이의 염 및 카바밀 포스페이트 또는 이의 염으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 포스페이트 그룹 공여체상에 작용시켜 부산물인 2', 3-뉴클레오사이드 이성체를 생성시키지 않으면서 뉴클레오사이드-5'-포스페이트 에스테르를 효율적으로 제조하는 방법을 개발하였다(일본 공개특허공보 제7-231793호).

그러나, 이러한 방법도 다음의 결점을 갖는다. 즉, 예를 들면, 공교롭게도 사용할 미생물의 세포에서 미량으로 존재하는 뉴클레오사이드-분해 활성에 기인하여 기질의 일부분이 반응 동안 분해된다. 더욱이, 반응이 연속 수행되는 경우, 생성되고 축적되는 뉴클레오사이드-5'-포스페이트 에스테르가 분해된다. 따라서, 부산물이 반응 용액 내에 생성되어, 충분한 수율로 수득할 수 없다. 또한, 기질이 고농도로 가해지는 경우, 미생물 세포당 낮은 트랜스인산화 활성으로 인해 반응을 수행할 수 없다.

본 발명의 목적은 뉴클레오사이드-5'-포스페이트 에스테르를 값싸고 효율적으로 제조하는 방법을 제공하기 위한 것이다. 본 발명의 또 다른 목적은 효소, 효소를 암호화하는 유전자, 유전자를 함유하는 재조합 DNA 및 뉴클레오사이드-5'-포스페이트 에스테르를 제조하는 방법에 유용한 재조합 DNA를 함유하는 미생물을 제공하기 위한 것이다.

도 1은 모르가넬라 모르가니(Moganella morganii)로부터 유도된 효소를 사용하여 수행되는 반응에서 반응 pH 및 5'-이노신산의 생성량과의 관계를 나타낸 것이다.

도 2는 에스케리치아 블라태(Escherichia blattae)로부터 유도된 효소를 사용하여 수행되는 반응에서 반응 pH 및 5'-이노신산의 생성량과의 관계를 나타낸 것이다.

도 3은 산 포스파타제를 암호화하는 유전자를 함유하는 모르가넬라 모르가니의 염색체 DNA 단편의 제한 효소 지도를 나타낸 것이다.

도 4는 모르가넬라 모르가니로부터 유도된 포스파타제 유전자를 함유하는 균주를 사용하여 수행하는 반응에서 5'-이노신산의 생성량을 나타낸 것이다.

도 5는 산 포스파타제를 암호화하는 유전자를 함유하는 에스케리치아 블라태의 염색체 DNA 단편의 제한 효소 지도를 나타낸 것이다.

도 6은 에스케리치아 블라태로부터 유래된 산 포스파타제 유전자를 함유하는 균주를 사용하여 수행하는 반응에서 5'-이노신산의 생성량을 나타낸 것이다.

도 7은 각각 에스케리치아 블라태로부터 유래된 야생형 산 포스파타제 유전자를 함유하는 균주 및 돌연변이체 산 포스파타제 유전자를 함유하는 균주를 사용하여 수행하는 반응에서 5'-이노신산의 생성량을 나타낸 것이다.

도 8은 에스케리치아 블라태로부터 유도된 신규한 돌연변이체 산 포스파타제 유전자를 함유하는 균주를 사용하여 수행하는 반응에서 5'-이노신산의 생성량을 나타낸 것이다.

도 9는 산 포스파타제를 암호화하는 유전자를 함유하는 엔테로박터 아에로게네스(Enterobacter aerogenes)로부터 유도된 염색체 DNA 단편의 제한 효소 지도를 나타낸 것이다.

도 10은 산 포스파타제를 암호화하는 유전자를 함유하는 클렙시엘라 플란티 콜라(Klebsiella planticola)로부터 유도된 염색체 DNA 단편의 제한 효소 지도를 나타낸 것이다.

도 11은 산 포스파타제를 암호화하는 유전자를 함유하는 세라티아 피카리아(Serratia ficaris)로부터 유도된 염색체 DNA 단편의 제한 효소 지도를 나타낸 것이다.

도 12는 모르가넬라 모르가니, 에스케리치아 블라태, 프로비덴시아 스투아르티(Providencia etuartii), 엔테로박터 아에로게네스, 클렙시엘라 플란티콜라 및 세라티아 피카리아로부터 유도된 산 포스파타제의 뉴크레오타이드 서열로부터 추론된 1문자의 아미노산 서열을 나타낸 것이다. 이들 아미노산 서열은 3문자의 서열 목록에서 서열 4, 8, 22, 24, 26 및 28에 나타내었다. 도에서, 모든 아미노산 서열에 공통된 아미노산 잔기는 서열 아래에 *로 표시하였다.

도 13은 에스케리치아 블라태로부터 유도된 신규한 돌연변이체 포스파타제 유전자를 함유하는 균주로부터 제조된 세포 유리 추출 용액에서 산 포스파타제 활성의 온도 안전성을 나타내는 그래프이다.

통상의 방법에 비해 보다 효율적으로 뉴클레오사이드-5'-포스페이트 에스테르를 제조하기 위한 본 발명자들의 다양한 연구 결과, 뉴클레오사이드-5'-포스페이트 에스테르를 미생물의 세포-유리 추출물로부터 정제된 산 포스파타제를 pH 3.0 내지 5.5의 조건하에서 뉴클레오사이드 및; 폴리인산 또는 이의 염, 페닐인산 또는 이의 염 및 카바밀 포스페이트 또는 이의 염으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 포스페이트 그룹 공여체 상에 작용시킴으로서 고수율로 효율적으로 제조할 수 있다는 것을 밝혀내었다. 또한, 본 발명자들은 각종 세균으로부터 산 포스파타제를 암호화하는 야생형 유전자 및 에스케리치아 속에 속하는 세균으로부터 유도된 산 포스페이트상에 돌연변이를 도입시켜 야생형 산 포스파타제와 비교하여 뉴클레오사이드에 대한 친화성이 증가된 산 포스파타제를 암호화하는 유전자를 수득하는데 성공하였다. 더욱이, 본 발명자들은 뉴클레오사이드-5'-포스페이트 에스테르의 생산성을 유전자 공학 기술에 따라 유전자를 다량으로 발현시켜 현저하게 증진시킬 수 있다는 것을 밝혀내었다.

또한, 본 발명자들은 반응 속도가 향상되고 포스페이트 수용체의 농도가 반응 용액에서 높아지기 때문에 고온에서 산 포스파타제에 의해 포스페이트 전달 반응을 수행하여 뉴클레오사이드-5'-포스페이트를 보다 효율적으로 제조할 목적으로 온도 안정성이 증가된 돌연변이체 산 포스파타제를 제조하기 위해 시도하였다. 본 발명자들은 실시예 19에 기술된 돌연변이체 산 포스파타제에 비해 온도 안정성이 증가되고, 고온에서 반응에 사용할 수 있는 돌연변이체 산 포스파타제를 제조하는데 성공하여 본 발명을 완성하게 되었다.

즉, 본 발명은 뉴클레오사이드에 대한 친화성이 증가되고/증가되거나 온도 안정성이 증가된 산 포스파타제를 pH 3.0 내지 5.5의 조건하에서 뉴클레오사이드 및 바람직하게는 폴리인산 또는 이의 염, 페닐인산 또는 이의 염, 아세틸산 또는 이의 염 및 카바밀 포스페이트 또는 이의 염으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 포스페이트 그룹 공여체에 작용시켜 뉴클레오사이드-5'-포스페이트 에스테르를 생성시키는 단계 및 이를 수거하는 단계를 포함하여, 뉴클레오사이드-5'-포스페이트 에스테르를 제조하는 방법을 제공한다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 뉴클레오사이드에 대한 친화성이 증가되고/증가되거나 온도 안정성이 증가된 산 포스페이트를 암호화하는 유전자를 포함하는 재조합 DNA로 형질 전환된 미생물을 pH 3.0 내지 5.5의 조건하에서 뉴클레오사이드 및 포스페이트 그룹 공여체에 작용시켜 뉴클레오사이드-5'-포스페이트 에스테르를 생성시키는 단계 및 이를 수거하는 단계를 포함하여, 뉴클레오사이드-5'-포스페이트 에스테르를 제조하는 방법을 제공한다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 뉴클레오사이드에 대한 친화성이 증가되고/증가되거나 온도 안정성이 증가된 돌연변이체 산 포스파타제, 산 포스파타제를 암호화하는 유전자, 유전자를 함유하는 제조합 DNA 및 재조합 DNA를 함유하는 미생물을 제공한다.

(1) 산 포스타파제의 제조

본 발명에 사용되는 산 포스파타제는 pH 3.0 내지 5.5의 조건하에서 반응을 촉매화하여 폴리인산 또는 이의 염, 페닐인산 또는 이의 염, 아세틸인산 또는 이의 염 및 카바밀 포스페이트 또는 이의 염으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 포스페이트 그룹 공여체로부터 포스페이트 그룹을 뉴클레오사이드로 전이시켜 뉴클레오사이드-5'-포스페이트 에스테르를 생성시키는 한 특별히 한정되지 않는다. 이러한 산 포스파타제는 바람직하게는 미생물로부터 유도된 것을 포함한다. 특히 바람직한 양태에서, 본 발명은 모르가넬라, 에스케리치아, 프로비덴시아, 엔테로박터, 클렙시엘라 또는 세라티아 속에 속하는 세균으로부터 유도된 효소를 사용한다. 이런 한 세균의 대표적인 예는 다음의 세균 균주를 포함한다.

모르가넬라 모르가니 NCIMB 10466

모르가넬라 모르가니 IFO 3168

모르가넬라 모르가니 IFO 3848

에스케리치아 블라태 JCM 1650

에스케리치아 블라태 ATCC 33429

에스케리치아 블라태 ATCC 33430

프로비덴시아 스투아르티 ATCC 29851

프로비덴시아 스투아르티 ATCC 33672

엔테로박터 아에로게네스 IFO 12010

엔테로박터 아에로게네스 IFO 13534

클렙시엘라 플란티콜라 IFO 14939

클렙시엘라 플란티콜라 IAM 1133

세라티아 피카리아 IAM 13540

세라티아 마르세센스 IAM 12143

산 포스파타제(EC 3.1.3.2.)는 원래 산성 조건하에서 포스페이트 에스테르를 가수분해시키는 반응을 촉매화하는 효소이고, 트랜스인산화 반응에 의해 생성된 뉴클레오사이드-5'-포스페이트 에스테르를 분해시키는 뉴클레오티다제 활성(이후, 뉴클레오티다제 활성을 포스포모노에스테라제 활성이하 함)을 갖는다. 이러한 산 포스파타제도 본 발명의 뉴클레오사이드-5'-포스페이트 에스테르를 제조하는 방법에서 사용될 수 있다. 그러나, 고수율로 뉴클레오사이드-5'-포스페이트 에스테르를 수득하기 위하여, 뉴클레오사이드 상의 트랜스인산화 반응에서 뉴클레오사이드에 대한 친화성이 상기 기술한 세균에 의해 제조된 야생형 산 포스파타제와 비교하여 증가된 돌연변이체 산 포스파타제(이후, 필요한 경우, 간단히 돌연변이체 산 포스파타제라고 함)을 사용하는 것이 바람직하다. 바람직하게는 Km 값이 100mM 미만인 돌연변이체 산 포스파타제를 사용한다.

돌연변이체 산 포스파타제는 이후 기술하는 산 포스파타제를 암호화하는 유전자를 직접 돌연변이시켜 수득한 돌연변이체 유전자를 발현시켜 수득한다. 또는, 돌연변이체 산 포스파타제를 뉴클레오사이드에 대한 친화성이 증간된 산 포스파타제를 생성시키는 미생물을 자외선 조사 또는 인공 돌연변이에 통상 사용되는 돌연변이제, 예를 들면, N-메틸-N'-니트로-N-니트로소구아니딘(NTG)으로 처리하고, 돌연변이된 미생물을 배양하여 뉴클레오사이드에 대한 친화성이 증가된 돌연변이체 산 포스파타제를 생성시킴으로서 수득할 수 있다.

산 포스파타제 활성을 갖는 단백질은 상기 기술한 미생물로부터 활성을 갖는 미생물 균주를 적절한 배지에서 배양하고, 증식된 미생물 세포를 수거한 다음, 미생물 세포를 분쇄하여 세포-유리 추출물을 제조하고, 이로부터 단백질을 적절하게 정제하여 수득할 수 있다.

미생물을 배양하는 배지은 특별히 한정되지 않으며, 통상의 탄소원, 질소원, 무기 이온 및 임의로 유기 영양원을 함유하는 통상의 배지를 이용할 수 있다. 적절하게 사용되는 탄소원은, 예를 들면, 글루코즈 및 슈크로즈와 같은 사카라이드, 글리세롤과 같은 알콜 및 유기산을 포함한다. 사용되는 질소원은, 예를 들면, 암모니아 기체, 수성 암모니아 및 암모늄 염을 포함한다. 필요한 경우, 적절하게 사용되는 무기 이온은, 예를 들면, 마그네슘 이온, 포스페이트 이온, 칼륨 이온, 철 이온 망간 이온을 포함한다. 적절하게 사용되는 유기 영양원은, 예를 들면, 비타민 및 아미노산 뿐만 아니라 효모 추출물, 펩톤, 고기 추출물, 옥수수 침지액 카제인 가수분해물 및 콩 가수분해물을 함유하는 것들을 포함한다.

배양 조건도 특별히 한정되지 않는다. 미생물을, 예를 들면, 약 12 내지 48시간 동안 호기성 조건하에서 5 내지 8의 pH 범위 및 25 내지 40℃의 온도 범위를 적절하게 조절하면서 배양할 수 있다.

증식된 미생물 세포를 배양액으로부터, 예를 들면, 원심분리에 의해 수거할 수 있다. 세포-유리 추출물을 수거된 미생물 세포로부터 통상의 방법을 사용하여 제조한다. 즉, 세포-유리 추출물을 미생물 세포를 초음파 처리, 다이노-밀(Dyno-mill) 및 프렌치 프레스(French Press)와 같은 방법을 사용하여 분쇄하고, 세포 조각을 원심분리에 의해 제거하여 수득한다.

산 포스파타제를 세포-유리 추출물로부터 효소 정제에 통상 사용되는 기술, 예를 들면, 황산암모늄 분획화, 이온 교환 크로마토그래피, 소수성 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 겔 여과 크로마토그래피 및 등전 정제의 적절한 조합을 사용하여 정제한다. 침전에 대해서는, 산 포스파타제를 완전히 정제할 필요는 없다. 기질로서 뉴클레오사이드의 분해에 관여하는 효소와 같은 오염 물질의 제거를 달성하는 것만으로도 충분하다.

(2) 산 포스파타제 유전자의 제조

산 포스파타제 활성을 갖는 단백질을 암호화하는 구조 유전자를 함유하는 DNA 단편은, 예를 들면, 효소 활성을 갖는 미생물의 세포로부터 출발하여 클로닝될 수 있다. 클로닝 방법은, 예를 들면, 염색체 유전자 발현 라이브러리를 인데스로서 효소 활성을 사용하여 스크리닝하는 방법, 단백질에 대한 항체를 제조하여 염색체 유전자 발현 라이브러를 스크리닝하는 방법 및 아미노산 서열, 예를 들면, 정제된 단백질의 N-말단 서열을 프로브가 제조되어 유전자 라이브러리를 스크리닝하는 것에 기초하여 분석하는 방법을 포함한다.

구체적으로, 상기 기술한 모르가넬라 모르가니, 에스케리치아 블라태, 프로비덴시아 스투아르티, 엔테로박터 아에로게네스, 클렙시엘라 플란티콜라, 세라티아 피카리아 또는 세라티아 마르세센스의 산 포스파타제를 암호화하는 유전자는 각각의 미생물의 염색체 유전자 발현 라이브러리를 제조하고, 라이브러를 인덱스로서 포스파타제 황성을 사용하여 스크리닝하여 클로닝될 수 있다.

즉, 염색체 유전자 발현 라이브러리는 모르가넬라 모르가니 또는 에스케리치아 블라태로부터 염색체 DNA를 우선 제조하고, 이를 적절한 제한 효소로 부분적으로 분해한 다음, 에스케리치아 콜리에서 자발적으로 복제가능한 벡터로 결찰시키고, 에스케리치아 콜리를 수득된 재조합 DNA로 형질 전환시켜 제조할 수 있다. 침지 반응 시간을 조절하여 침지도를 조절하기 위하여 염색체 DNA를 침지시키기 위해 다양한 제한 효소를 사용할 수 있다. 에스케리치아 콜리에서 자발적으로 복제가능하다면, 임의의 벡터를 유전자를 클로닝하기 위해 사용할 수 있다. 예를 들면, pUC19, pUC118, pHSG298, pBR322 및 pBluescript II를 사용할 수 있다.

사전에 벡터를 염색체 DNA를 침지시키기 위해 사용한 것과 동일한 제한 효소 또는 염색체 DNA 단편의 분리된 모서리와 상보적인 분리된 모서리를 생성시키는 제한 효소로 침지시키고, T4 DNA 리가제와 같은 리가제를 사용하여 DNA 단편으로 결찰시킴으로서 벡터를 산 포스파타제를 암호화하는 유전자를 함유하는 DNA 단편으로 결찰시켜 제조된 재조합 DNA를 제조한다. 임의의 미생물 균주를 벡터의 복제에 적합하다면 제조된 재조합 DNA에 대한 수용체로서 사용할 수 있다. 예를 들면, HB101, JM109 및 DH5와 같은 에스케리치아 콜리의 미생물 균주를 사용할 수 있다.

수득한 형질전환체를 한천 배지 상에서 성장시켜 콜로니를 형성시킨다. 이후, p-니트로페닐인산을 함유하는 반응 용액을 배지의 표면에 부어 반응을 수행시키는 경우, 포스파타제 활성이 발현된 균주는 p-니트로페놀을 유리시켜 황색을 나타낸다. 목적 산 포스파타제를 암호화하는 유전자를 함유하는 DNA 단편을 포함하는 형질전환체는 상기 기술한 반응을 산성 조건하에서 수행하고, 형질전환체를 인덱스로서 색상 전개를 사용하여 선택하으로서 선택할 수 있다.

이후, 재조합 DNA를 선택된 형질전환체로부터 회수하여 벡터로 결찰시킨 산 포스파타제를 암호화하는 유전자를 함유하는 DNA 단편의 구조를 분석한다. 산 포스파타제를 암호화하는 유전자의 뉴클레오타이드 서열은 모르가넬라 모르가니 NCIMB 10466으로부터 유도된 유전자의 경우 서열 목록에서 서열 2에, 에스케리치아 블라태 JCM 1650으로부터 유도된 유전자의 경우 서열 목록에서 서열6에 프로비덴시아 스투아르티 ATCC 29851로부터 유도된 유전자의 경우 서열 목록에서 서열 21에, 엔테로박터 아에로게네스 IFO 12010으로부터 유도된 유전자의 경우 서열 목록에서 서열 23에, 클렙시엘라 플란티콜라 IFO 14939으로부터 유도된 유전자의 경우 서열 목록에서 서열 25에 또는 세라티아 피카리아 IAM 13540으로부터 유도된 유전자의 경우 서열 목록에서 서열 27에 니타내었다.

상기 유전자가 암호화하는 산 포스파타제의 유추된 아미노산 서열은 서열 4, 8, 22, 24, 26 및 28에 나타내었다. 상기 유전자가 암호화하는 산 포스파타제가 본 발명에서 바람직하게 사용된다. 또한, 상기 유전자가 암호화하는 산 포스파타제 중의 하나의 아미노산 서열과 사실상 동일한 아미노산 서열을 포함하는 산 포스파타제가 또한 본 발명에서 바람직하게 사용된다. 용어 사실상 동일함 이란 산 포스파타제의 아미노산 서열이 뉴클레오사이드-5'-포스페이트 에스테르를 생성시키 위해 활성(이후, 트랜스인산화 활성 이라 함) 손실 없이 아미노산 잔기 중의 하나 또는 다수가 치환, 결실, 삽입 또는 전이될 수 있다는 것을 의미한다.

(3) 돌연변이체 산 포스파타제를 암호화하는 유전자의 제조

상기 기술한 바와 같이 수득한 야생형 산 포스파타제는 포스포모노에스테라제 활성을 갖는다. 따라서, 포스포모노에스테라제 활성은 뉴클레오사이드-5'-포스페이트 에스테르의 제조에서 반응 시간이 경과함에 따라 생성물의 분해를 야기시키는 인자로서 작용하여 반응 수율을 저하시킨다. 이러한 환경을 극복하기 위해, 뉴클레오사이드에 대한 친화성이 증가되도록 산 포스파타제를 암호화하는 유전자 상에 인공적인 돌연변이를 야기시키는 것이 유익하다.

반응 속도가 향상되고 반응 용액에서 포스페이트 수용체의 농도가 높아질 수 있으므로, 고온에서 산 포스파타제에 의해 포스페이트 전이 반응을 수행하여, 뉴클레오사이드-5'-포스페이트 에스테르를 보다 효율적으로 제조할 수 있다. 이러한 목적으로, 온도 안정성이 증가되도록 산 포스파타제를 암호화하는 유전자 상에 인공적인 돌연변이를 야기시키는 것이 유익하다.

DNA의 목적 부위에서 목적 돌연변이를 야기시키는 부위-지시 돌연변이 방법은, 예를 들면, PCR을 사용하는 방법[참조: Higuchi, R., 61, in PCR technology, Erlich, H. A. Eds., Stockton press (1989); Carter, P., Meth. in Enzymol., 154, 382 (1987)] 및 파아지를 사용하는 방법[참조: Kramer, W. and Frits, H. J., Meth. in Enzymol., 154, 350 (1987); Kunkel, T. A. et al., Meth. in Enzymol., 154, 367 (1987)]을 포함한다.

뉴클레오사이드에 대한 친화성이 증가된 돌연변이체 산 포스파타제는 서열 목록에서 서열 4, 8, 22, 24, 26 및 28에 나타낸 서열로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열과 사실상 동일하고 야생형 산 포스파타제의 뉴클레오사이드에 대한 친화성이 증가되도록 돌연변이된 아미노산 서열을 포함하는 산 포스파타제로 예시된다. 결과적으로, 돌연변이체 산 포스타파제는 74번 글리신 잔기 및/또는 153번 이소류신 잔기가 서열 목록에서 서열 8에 나타낸 아미노산 서열 중의 또 다른 아미노산 잔기로 치환된 에스케리치아 블라태 JCM 1650으로부터 유도된 효소로 예시된다. 이후 기술하는 실시예에서, 돌연변이체 산 포스파타제를 암호화하는 유전자는 74번 글리신 잔기가 아스파트트산 잔기로 치환되고 153번 이소류신 잔기가 트레오닌 잔기로 치환된 예로 나타낸다.

또한, 63번 류신 잔기, 65번 알라닌 잔기, 66번 글루탐산 잔기, 69번 아스파르트산 잔기, 71번 세린 잔기, 72번 세린 잔기, 85번 세린 잔기, 92번 알라닌 잔기, 94번 알라닌 잔기, 116번 아스파르트산 잔기, 130번 세린 잔기, 135번 트레오닌 잔기 및/또는 136번 글루탐산 잔기가 서열 목록에서 서열 8주의 또 다른 아미노산으로 치환된 것으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 돌연변이는 산 포스타파제의 뉴클레오사이드에 대한 친화성을 추가로 증가시킨다.

뉴클레오사이드에 대한 친화성이 증가된 돌연변이체 산 포스파타제는 서열 목록에서 서열 4, 8, 22, 24, 26 및 28에 나타낸 서열로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열과 사실상 동일하고 야생형 산 포스파타제의 온도 안정성이 증가되도록 돌연변이된 아미노산 서열을 포함하는 산 포스파타제로 예시된다. 결과적으로, 돌연변이체 산 포스파타제는 104번 글루탐산 잔기 및/또는 151번 트레오닌 잔기가 서열 목록에서 서열 8에 나타낸 아미노산 서열 중의 또 다른 아미노산 잔기로 치환된 에스케리치아 블라태 JCM 1650으로으로부터 유도된 효소로 예시된다. 이후 기술하는 실시예에서, 돌연변이체 산 포스파타제를 암호화하는 유전자는 104번 글루탐산 잔기가 글리신 잔기로 치환되고 151번 트레오닌 잔기가 알라닌 잔기로 치환된 예로 나타낸다.

따라서, 뉴클레오타이드는 이들 돌연변이체 산 포스파타제를 암호화하도록 상기 기술한 부위-지시 돌연변이 방법에 따라 야생형 유전자의 특정 부위에서 치환 될 수 있다. 뉴클레오사이드에 대한 친화성을 증가시키기 위한 돌연변이는 야생형 산 포스파타제와 비교하여 뉴클레오사이드-5'-포스페이트 에스테르를 제조하는 활성을 사실상 저하시키지 않는 유형의 돌연변이다. 그러나, 뉴클레오사이드-5'-포스페이트 에스테르를 제조하는 활성이 저하되는 경우에도, 포스포모노에스테라제 활성의 저하도가 뉴클레오사이드-5'-포스페이트 에스테르를 제조하는 활성의 저하도 보다 큰 경우 충분하여, 야생형 산 포스파타제와 비교하여 돌연변이체 산 포스파타제의 뉴클레오사이드-5'-포스페이트 에스테르를 제조하는 활성에 대한 포스포모노에스테라제 활성의 비를 저하시킨다. 뉴클레오사이드에 대한 친화성의 증가도와 관련하여, 트랜스인산화 반응에서 뉴클레오사이드에 대한 Km 값은 바람직하게는 100Mm 미만이다.

온도 안정성을 증가시키는 돌연변이는 온도 처리후 야생형 산 포스파타제가 갖는 것보다 잔류 활성이 더 높다는 것을 의미한다. 온도 안정성 증가도는 바람직하게는 pH 7.0, 50℃, 30분 처리시 활성이 저하되지 않는 정도이다.

하기의 양태에서 나타낸 바와 같이, 에스케리치아 블라태 JCM 1650의 산 포스파타제의 아미노산 서열은 모르가넬라 모르가니 NCIMB 10466의 것과 고도로 상동성이며, 서열 4에 나타낸 아미노산 서열에서 72번 글리신 잔기, 102번 글루탐산 잔기, 149번 트레오닌 잔기 및 151번 이소류신 잔기는 서열 8에 나타낸 아미노산 서열에서 74번 글리신 잔기, 104번 글루탐산 잔기, 151번 트레온니 잔기 및 153번 이소류신 잔기에 각각 상응한다. 또한, 에스케리치아 블라태 JCM 1650 이외에, 프로비덴시아 스투아르티 ATCC 29851, 엔테로박터 아에로게네스 IFO 12010, 클렙시엘라 플란티콜라 IFO 14939및 세라티아 피카리아 IAM 13540과 같은 미생물로부터 유도된 산 포스파타제의 아미노산 서열은 모르가넬라 모르가니 NCIMB 10466의 것과 고도의 상동성이고, 이들 산 포스파타제의 아미노산 서열은 각각 서열 4에 나타낸 아미노산 서열 72번 글리신 잔기, 102번 글루탐산 잔기, 149번 트레오닌 잔기 및 151번 이소류신 잔기에 상응하는 아미노산 잔기를 포함한다. 따라서, 이들 미생물로부터 유도된 돌연변이체 산 포스파타제를 암호화하는 유전자는 상기 기술한 바와 같이 수득될 수 있다. 서열 22, 24 또는 26에 나타낸 프로비덴시아 스투아르티 ATCC 29851, 엔테로박터 아에로게네스 IFO 12010 또는 클렙시엘라 플란티콜라 IFO 14939로부터 유도된 산 포스파타제의 아미노산 서열에서 92번 글리신 잔기, 122번 글루탐산 잔기, 169번 트레오닌 잔기 및 171번 이소류신 잔기 및 서열 28에 나타낸 세라티아 피카리아 IAM 13540으로부터 유도된 산 포스파타제의 아미노산 서열에서 88번 글리신 잔기, 118번 글루탐산 잔기, 165번 트레오닌 잔기 및 167번 이소류신 잔기는 각각 서열 4에 나타낸 아미노산 서열에서 72번 글리신 잔기, 102번 글루탐산 잔기, 149번 트레오닌 잔기 및 151번 이소류신 잔기에 상응한다.

상기 산 포스파타제의 아미노산 서열 비교 결과를 도 12에 나타내었다. 도 12에 근거하여, 산 포스파타제의 아미노산 잔기가 또 다른 산 포스파타제의 또 다른 아미노산 잔기에 상응한다는 것이 결정된다.

(4)산 포스파타제 유전자의 숙주로의 도입

높은 수준으로 산 포스파타제 활성을 발현시키는 재조합 미생물은 DNA 단편을 적절한 벡터로 재조합시킨 후, 상기 기술한 바와 같이 수득한 산 포스파타제 활성을 갖는 단백질을 암호화하는 유전자를 함유하는 DNA 단편을 숙주의 세포에 도입시켜 수득할 수 있다. 이러한 방법에서, 야생형 산 포스파타제는 야생형 산 포스파타제를 암호화하는 유전자를 사용하여 발현시키는 반면, 돌연변이체 산 포스파타제는 돌연변이체 산 포스파타제를 암호화하는 유전자를 사용하여 발현시킨다.

숙주는 상기 기술한 HB101, JM109 및 DH5와 같은 에스케리치아 콜리의 미생물 균주를 포함한다. 이들 균주 이외에, 복제 기원의 작제된 재조합 DNA 및 산 포스파타제 유전자가 이의 기능을 하고, 재조합 DNA가 복제 가능하고, 산 포스파타제 유전자가 발현 가능하다면, 모든 세균을 숙주로서 이용할 수 있다. 가장 바람직한 숙주의 하나는 에스케리치아 콜리 JM109이다.

산 포스파타제를 암호화하는 유전자를 도입시키기 위한 벡터는 숙주 내에서 복제 가능하다면 특별히 한정되지 않는다. 에스케리치아 콜리가 숙주로서 사용되는 경우, 벡터를 이러한 세균에서 자발적으로 복제 가능한 플라스미드로 예시할 수 있다. 예를 들면, ColE1 유형 플라스미드, p15A 유형 플라스미드, R 인자 유형 플라스미드 및 파이지 유형 플라스미드를 사용할 수 있다. 이러한 플라스미드는 특히, 예를 들면, pBR322[참조: Gene, 2, 95 (1977)], pUC119[참조: Methods in Enzymology, 153, 3 (1987)], pACYC184[참조: J. Bacteriol., 134, 1141(1978)]및 pSC101[참조: Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 70,3240 (1973)]을 포함한다.

산 포스파타제를 암호화하는 유전자를 함유하는 DNA 단편이 숙주에서 기능성인 프로모터를 함유하는 경우, DNA 단편은 그 자제로서 벡터로 결찰시킬 수 있다. DNA 단편이 이러한 프로모터를 함유하지 않는 경우, lac, trp 및 PL과 같은 숙주 미생물에서 작용하는 또 다른 프로모터를 유전자로부터 상부 위치에서 결찰시킬 수 있다. DNA 단편이 프로모터를 함유하는 경우라도, 프로모터는 산 포스파타제를 암호화하는 유전자를 효율적으로 발현시키기 위해 또 다른 프로모터로 치환시킬 수 있다.

산 포스파타제를 암호화하는 유전자를 함유하는 DNA 단편으로 벡터를 결찰시켜 작제된 재조합 DNA를 숙주에 도입시키기 위한 방법은 특별히 한정되지 않는다. 재조합 DNA은 통상의 방법을 사용하여 숙주에 도입시킬 수 있다. 에스케리치아 콜리가 숙주로서 사용되는 경우, 예를 들면, 염화칼슘 방법[참조: J. Mol. Biol., 53, 159 (1970)], Hanahan 방법[참조: J. Mol., Biol., 166, 557 (1983)], Chung 등의 방법[참조:Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 86,2172 (1989)] 및 일렉트로포레이션(electroporation)[참조: Nucleic Acids Res., 16, 6127 (1988)]을 사용할 수 있다.

산 포스파타제 유전자는 상기 기술한 바와 같이 염색체외 DNA로서 숙주에 함유되도록 숙주에 도입시킬 수 있는 자발적으로 복제 가능한 벡터 DNA에 삽입시킬 수 있다. 또는, 산 포스파타제 유전자를 형질 도입, 트랜스포손[참조:Biotechnol., 1, 417 (1983)], Mu 파아지[참조: 일본 공개특허공보 제2-109985호] 또는 상동 재조합[참조:Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab. (1972)]을 사용하는 방법에 따라 숙주 미생물의 염색체에 도입시킬 수 있다.

(5) 재조합 미생물에 의한 산 포스파타제 유전자의 발현

산 포스파타제를 암호화하는 유전자를 함유하는 재조합 DNA를 도입시킨 상기 기술한 바와 같이 수득한 형질 전환체는 탄소원, 질소원, 무기 및 이온 및 임의로, 유기 영양원을 함유하는 적절한 배지에서 이를 배양시켜 세포에 높은 수준으로 산 포스파타제 활성을 발현시킬 수 있다. 적절하게 사용되는 탄소원은, 예를 들면, 글루코즈와 같은 탄수화물, 글리세롤 같은 알콜 및 유기 산을 포함한다. 사용되는 질소원은, 예를 들면, 암모니아 기체, 수성 암모니아 및 암모늄 염을 포함한다. 필요한 경우, 적절하게 사용되는 무기 이온은, 예를 들면, 마그네슘 이온, 포스페이트 이온, 칼륨 이온, 철 이온 및 망간 이온을 포함한다. 적절하게 사용되는 유기 영양원은, 예를 들며, 비타민 및 아미노산 뿐만 아니라 효모 추출물, 펩톤 고기 추출물, 옥수수 침지액, 카제인 가수분해물 및 콩 가수분해물을 함유하는 것들을 포함한다. 산 포스파타제 활성의 발현량은 배지에 IPTG(이소프로필-β-D-티오갈락토피라노사이드)와 같은 프로모터에 따라 발현-유도제를 가하여 증가시킬 수 있다.

배양 조건은 특별히 한정되지 않는다. 배양은, 예를 들면, 약 12 내지 48시간 동안 5 내지 8의 pH 범위 및 25 내지 40℃의 온도 범위를 적절하게 조절하면서 호기성 조건하에서 수행할 수 있다.

이후, 미생물 세포를 배양액으로부터 수거하고, 세포-유리 추출물을 분쇄하여 수득하고, 이로부터 산 포스파타제를 정제할 수 있다. 정제는 상기(1)에서 기술한 바와 같은 효소 정제에 통상적으로 사용되는 기술의 적절한 조합을 사용하여 수행한다. 정제에 있어서, 산 포스파타제를 완전히 정제할 필요는 없다. 기질로서 뉴클레오사이드의 분해에 관여하는 효소와 같은 오염 물질의 제거를 달성하는 것만으로도 충분하다.

(6) 뉴클레오사이드-5'-포스페이트 에스테르의 제조

뉴클레오사이드-5'-포스페이트 에스테르를 반응 혼합물 중에서 상기(1)에서 기술한 바와 같이 수득한 산 포스파타제 또는 상기(5)에 기술한 유전자 공학 기술에 따라 다량으로 유전자를 발현시켜 수득한 야생형 산 포스파타제 또는 돌연변이 산 포스파타제를 폴리인산 또는 이의 염, 페닐인산 또는 이의 염, 아세틸인산 또는 이의 염 및 카바밀 포스페이트 또는 이의 염으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 포스페이트 그룹 공여체와 접촉시켜 뉴클레오사이드의 반응을 야기시켜 제조할 수 있다. 이러한 반응에서 높은 생산성을 달성하기 위하여, 반응 용액의 pH를 3.0 내지 5.5의 약산성 범위로 조절하는 것이 중요하다.

산 포스파타제를 암호화하는 유전자를 유전자 공학 기술을 사용하여 다량으로 발현시키는 경우, 특히 뉴클레오사이드에 대한 친화성이 증가된 돌연변이체 산 포스파타제를 암호화하는 유전자를 다량으로 발현시키는 경우, 정제된 산 포스파타제 대신에, 예를 들면, 부동화 처리, 아세톤 처리 또는 동결건조 처리에 따라 형질 전환체의 미생물 세포를 함유하는 배양액, 배양액으로부터 분리되고 수거된 미생물 세포 또는 미생물 세포로부터 수득한 생성물을 사용하여 뉴클레오사이드-5'-포스페이트 에스테르를 값싸고 효율적으로 제조할 수 있다.

사용되는 뉴클레오사이드는, 예를 들면, 이노신, 구아노신, 아데노신, 크산토신, 퓨린 리보사이드, 6-메톡시퓨린 리보사이드, 2,6-디아미노퓨린 리보사이드, 6-플루오로퓨린 리보사이드, 6-티오퓨린 리보사이드, 2-아미노-6-티오퓨린 리보사이드 및 머캅토구아노신과 같은 퓨린 뉴클레오사이드 및 우리딘, 시티딘, 5-아미노우리딘, 5-하이드록시우리딘, 5-부로모우리딘 및 6-아자우리딘과 같은 피리미딘 뉴클레오사이드를 포함한다. 반응 결과로서, 이들 천연 유형의 뉴클레오사이드 및 비천연 유형의 뉴클레오사이드는 특히, 5'-위치에서 인산화되고, 상응하는 뉴클레오사이드-5'-포스페이트 에스테르를 각각 제조한다.

뉴클레오사이드는 바람직하게는 1 내지 20g/dl의 농도로 반응 용액에 가한다. 물에 난용성인 뉴클레오사이드를 사용하는 경우, 반응 수율은 붕산 또는 계면 활성제, 예를 들면, 디메틸 설폭사이드를 가하여 증진시킬 수 있다.

뉴클레오사이드를 발효에 의해 제조하는 경우, 발효 후, 발효 배지을 인산화 반응액에 가할 수 있다. 뉴클레오사이드-5'-포스페이트 에스테르를 분해하는 성분이 배지에 포함된 경우, 상기 성분을 제거하기 위해 정제 단계가 바람직하게 사용된다.

사용되는 포스페이트 그룹 공여체에 있어서, 폴리인산 또는 이의 염으로서 유용한 것은, 예를 들면, 피로인산, 트리폴리인산, 트리메타인산, 테트라메타인산, 헥사메타인산, 이의 혼합물, 이의 나트륨 염, 이의 칼륨 염 및 이들 염의 혼합물을 포함한다. 페닐인산 또는 이의 염으로서 유용한 것은, 예를 들면, 이나트륨 페닐 포스페이트, 이칼륨 페닐포스페이트, 0,0-디페닐인산 무수물 및 이의 혼합물을 포함한다. 카바밀 포스페이트 또는 이의 염으로서 유용한 것은, 예를 들면, 이나트륨 카바밀 포스페이트, 이칼륨 포스페이트, 이암모늄 카바밀 포스페이트, 이리튬 카바밀 포스페이트 및 이의 혼합물을 포함한다. 아세틸인산 또는 이의 염으로서 유용한 것은, 예를 들면, 리튬 칼륨 아세틸포스페이트를 포함한다. 포스페이트 그룹 공여체가 사용되는 농도는 포스페이트 그룹 수용체로서 뉴클레오사이드의 농도에 의해 결정된다. 포스페이트 그룹 공여체는 통상 뉴클레오사이드의 1 내지 5 배의 양으로 사용된다.

바람직한 결과는 통상 20 내지 60℃, 바람직하게는 30 내지 40℃의 온도에서 3.5 내지 6.5, 바람직하게는 4.0 내지 5.0의 약산성 pH에서의 반응시 수득된다. 온도 안정성이 등가된 돌연변이체 산 포스파타제를 사용하는 경우, 반응 온도는 20 내지 70℃, 바람직하게는 30 내지 60℃이다. 반응은 정지 방법 및 교반 방법 중의 어느 하나를 채택하여 수행할 수 있다. 반응 시간은 사용되는 효소의 활성 및 기질 농도와 같은 조건에 좌우되나. 1 내지 100 시간이다.

이와 같이 제조한 뉴클레오사이드-5'-포스페이트 에스테르를 흡착용 합성 수지를 사용하는 방법, 침전제를 사용하는 방법 및 수집 및 분리에 통상적인 기타 방법을 채택하여 반응 완결 후 혼합물로부터 수집하고 분리할 수 있다.

[실시예]

특히 본 발명은 하기 실시예를 참조로하여 설명될 것이지만 본 발명은 이들 실시예로 제한되지 않는다.

트랜스인산화 활성을 기질로서 이노신을 사용하여 하기의 조건하에서 측정한다. 이노신 40umol/ml, 나트륨 피로포스페이트 100umol/ml, 나트륨 아세테이트 완충액 100umol/ml(pH 5.0), 및 효소를 포함하는 반응 용액(1ml)중에서 10분동안 30℃, pH 5.0에서 반응을 수행한다. 2N 염산 200ul를 첨가하여 반응을 종료한다. 이후에 침전물을 원심분리하여 제거한다. 이어서, 트랜스인산화 반응에 의해 제조된 5'-이노신산을 정량적으로 측정한다. 상기 표준 조건하에서 1분당 5'-이노신산 1umol을 제조하는 효소의 양은 1유니트(unit)로서 정의한다.

포스포모노에스터라제 활성을 기질로서 5'-이노신산을 사용한 하기의 조건하에서 측정한다. 5'-이노신산 10umol/ml, MES/NaOH 완충액 100umol/ml(pH 6.0), 및 효소를 포함하는 반응 용액(1ml)중에서 10분동안 30℃에서 반응을 수행한다. 2N 염산 200ul를 첨가하여 반응을 종료한다. 이후에 침전물을 원심분리하여 제거한다. 이어서, 가수분해 반응에 의해 제조된 이노신을 정량적으로 측정한다. 상기 표준 반응 조건하에서 1분당 이노신 1umol을 제조하는 효소의 양을 1유니트로서 정의한다.

이노신 및 5'-이노신산을 고압 액상 크로마토그래픽(HPLC)를 사용하여 하기의 조건하에서 분석한다.

칼럼:코스모실 5C18-AR(4.6×150㎜)[나칼라이 기술에 의해 제조됨];

이동상:5mM 인산 칼륨 완충액(pH 2.8)/메탄올=95/5;

유속:1.0ml/분;

온도:실온;

검출:UV 245nm.

부수적으로, 원료 물질로서 이노신과는 다른 뉴클레오사이드를 사용한 뉴클레오사이드-5'-인산 에스테르를 제조하는반응에서, 원료 물질로서 뉴클레오사이드 및 제조된 뉴클레오사이드-5'-인산 에스테르를 상기 기술한 바와 같이 HPLC로 분석한다.

실시예 1: 모르가넬라 모르가니로부터 유도된 산 포스파타제의 정제 및 특징화

펩톤 1g/dl, 효모추출물 0.5g/dl, 및 염화 나트륨 1g/dl를 포함하는 영양 배지(pH 7.0, 50ml)를 20분동안 120℃에서 살균된 사카구치 플라스크(500ml)에 붓는다. 모르가넬라 모르가니 NCIMB 10466의 사면 배양물을 플라티늄 루프를 사용하여 한 번씩 플라스크의 각각에 접종하고 교반시키면서 16시간동안 30℃에서 배양한다. 원심분리하여 배양물에서 수거된 미생물 세포(약 3,000g)를 인산 칼륨 완충액(1L, pH 7.0)중에 현탁시킨다. 20분동안 4℃에서 초음파 처리하여 미생물 세포를 파쇄시킨다. 처리된 현탁액을 원심분리하여 이의 불용성 분취물을 제거한다. 이어서, 세포 유리 추출물을 제조한다.

30% 포화도에 이르도록 황산 암모늄을 세포 유리 추출물에 첨가한다. 발생된 침전물을 원심분리하여 제거함에 이어서 황산 암모늄을 추가로 상등액에 첨가하여 60% 포화도에 이르도록 한다. 발생한 침전물을 원심분리하여 수거하고 인산 칼륨 완충액 100mM중에 용해시킨다.

상기 조효소 용액을 5L의 인산 칼륨 완충액 100mM(pH 7.0)에 대해 4회 희석함에 이어서 20mM 인산 칼륨 완충액(pH 7.0)으로 평형화된 DEAE-토요페알 650M 칼럼(4.1×22㎝)에 적용시킴에 이어서 800ml의 20mM 인산 칼륨 완충액(pH 7.0)으로 세척한다. 트랜스인산화 활성이 칼럼을 통과하는 분취물에 나타나고 이어서 상기 분취물을 회수한다.

분취물에 황산 암모늄을 첨가하여 35% 포화도에 이르도록하고 35% 포화된 황산 암모늄을 포함하는 20mM 인산 칼륨 완충액(pH 7.0)으로 평형화시킨 부틸-토요필 칼럼에 흡착시킨다. 인산 칼륨 완충액(pH 7.0)중에서 35% 내지 20%의 포화에 이르는 선형 농도 구배를 사용하여 용출시킨다.

활성 분취물을 수거하고 1L의 50mM 인산 칼륨 완충액(pH 7.0)에 대해 희석시킴에 따라 이어서 50mM 인산 칼륨 완충액(pH 7.0)으로 평형화된 하이드록시애퍼타이트 칼럼(5×6.5㎝)에 적용시킨다. 50mM 내지 300mM의 인산 칼륨 완충액(pH 7.0)에 이르는 선형 농도 구배를 사용하여 용출시킨다.

활성 분취물을 수거하고 한외여과로 농축시킨다. 상기 효소 용액을 하이로드 TM 16/60 슈퍼덱스 200 칼럼(파마샤에 의해 제조됨)에 적용시킨다. 100mM 염화나트륨을 포함하는 50mM 인산 칼륨 완충액을 사용하여 분당 1.0ml의 유속으로 용출시킨다.

상기 기술된 바와 같은 방법에 따라 트랜스인산화 활성을 보여주는 효소를 약 10%의 회수율에서 결과적으로 약 550배로 농축된 세포 유리 추출물중에서 정제한다. 상기 정제 방법에서 비활성 및 회수율은 표 1에 나타낸다. 상기 효소 샘플은 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동상에서 균일하다.

[표 1]

정제된 효소는 하기의 성질을 갖는다.

(1)활성:인산 그룹을 폴리인산과 같은 인산 그룹 공여체로부터 뉴클레오사이드로 전달시키고 뉴클레오사이드-5'-인산 에스테르를 제조한다. 역으로, 상기 효소는 또한 인산 에스테르를 가수분해시키는 활성을 나타낸다.

(2) 기질 특이성:트랜스인산화 반응중에서 인산 그룹 공여체로서 작용하는 것은 예를들어 파이로인산, 트리폴리인산, 트리메타인산, 테트라메타인산, 헥사메타인산, 이나트륨 페닐인산, 이칼륨 페닐인산, 0,0-디페닐인산 무수물, 이나트륨 카바밀 인산, 이칼륨 카바밀 인산, 이암모늄 카바밀 인산 및 이리튬 카바밀 인산을 포함한다. 인산 그룹 수용체로서 작용하는 것은 예를들어 퓨린 리보사이드, 이노신, 구아노신, 아데노신, 산초신, 우리딘 및 시스티딘을 포함한다. 또 다른 한편, 인산 에스테르 가수분해 반응중에서 활성을 나타내는 것은 예를들어 파이로인산, 트리폴리인산, 트리메타인산, 테트라메타인산, 헥사메타인산과 같은 무기인산; 이 나트륨 페닐인산, 이칼륨 페닐인산, 0,0-디페닐인산 무수물, 이나트륨 카바밀 인산, 이칼륨 카바밀 포스페이트, 이암모늄 카바밀 포스페이트 및 이리튬 카바밀 포스페이트와 같은 포스페이트 에스테르; 5'-퓨린 리보타이드, 5'-이노신산, 5'-구아닐산, 5'-아데틸산, 5'산칠산, 5'-우리딜산 및 5'-시티딜산과 같은 5'-뉴클레로타이드를 포함한다.

(3)최적 pH: 5.2(트랜스인산화 반응), 6.5(포스페이트 에스테르 가수분해 반응)

(4)pH 안정성: pH3.0 내지 pH 12.0(30℃에서 60분동안 처리)

(5)최적 온도: 약 35℃

(6) 온도 안정성:30℃이하에서 안정함(pH 7.0에서 30분동안 처리)

(7)금속 이온 및 억제제의 첨가 효과:

상기 효소는 임의의 금속 이온의 첨가에따라 이의 활성에 적절한 활성화 현상을 보이지 않는다. 활성은 Ag²⁺, Pb²⁺, Hg²⁺, 및 Cu²⁺에 의해 억제된다. 활성은 또한 요오드아세트산에 의해 억제된다.

(8)분자량:계산된 분자량은 고압 액상 크로마토그래피(TSKgel G-3000SW, 도요 소다에 의해 제조됨)에 따라 약 190,000이다.

(9)서브유니트 분자량:계산된 서브유니트 분자량은 SDS-폴리아크릴아미드겔 전기영동에 따라 약 25,000이다.

상기 효소는 포스페이트 그룹을 뉴클레오사이드로 전달하는 활성 뿐만아니라 역으로 포스페이트 에스테르를 가수분해하는 활성을 보여준다. 더욱이 상기 효소는 포스페이트 에스테르 가수분해 활성(포스포모노에스터라제 활성)을 나타내는데 이는 20배이상 트랜스인산화 활성보다 높다. 또 다른 성질은 모르가넬라 속에 속하는 미생물에 의해 생산된 공지된 산 포스파타제의 성질과 일치한다[참조:Microbiology, 140, 1341-1350(1994)]. 따라서, 상기 효소가 산 포스파타제인 것이 명백하다.

나트륨 파이로포스페이트(10g/dl) 및 이노신(2g/dl)을 각각 pH 5.5, 5.0, 4.5, 4.0, 및 3.5를 갖는 나트륨 아세테이트 완충용액에 용해시키고 여기에 상기 기술한 효소를 첨가하여 50유니트/dl의 농도를 수득한다. 반응 혼합물을 6시간동안 30℃에서 반응시키면서 각각의 pH를 유지하고 생산된 5'이노신산의 양을 시간의 경과에 따라 측정한다. 생산된 이노신산은 단지 5'-이노신산을 포함한다. 2'-이노신산 및 3'-이노신산의 부산물은 전혀 관찰되지 않는다. 결과는 도 1에 나타낸다. 5'-이노신산 생산 속도는 pH 5.0에서 최대이다. 그러나, 최대로 축적된 5'-이노신산의 양은 보다 낮은 pH에서 높다. pH 4.0에서 반응 조건은 5'-이노신산의 생산을 위해 가장 효과적이고 5'-이노신산은 3시간동안 반응을 수행하여 2.60g/dl의 양으로 생산되고 축적된다.

실시예 2: 모르가넬라 모르가니로부터 유도된 산 포스파타제 샘플에 의한 다양한 뉴클레오사이드의 인산화 반응

포스페이트 그룹 수용체로서 나트륨 파이로포스페이트(10g/dl) 및 이노신, 구아노신, 우리딘 또는 시티딘은 나트륨 아세테이트 완충액중에 용해시키고 여기에 실시예 1에서 제조된 효소 샘플을 첨가하여 이의 농도가 50units/dl이 되게한다. 반응 혼합물을 3시간동안 30℃에서 반응시키면 pH를 4.0으로 유지한다. 반응에 의해 제조된 뉴클레오사이드-5'- 에스테르의 양은 표 2에 나타낸다.

생산된 뉴클레오타이드는 단지 뉴클레오사이드-5'-포스페이트 에스테르를 포함한다. 뉴클레오사이드-2'-에스테르 및 뉴클레오사이드-3'-에스테르의 부산물은 전혀 관찰되지 않는다.

[표 2]

실시예 3: 모르가넬라 모르가니로부터 유도된 산 포스파타제 샘플에 의해 포스페이트 그룹 공여체로서 다양한 포스페이트 화합물로부터 5'-이노신산의 생산

포스페이트 그룹 공여체로서 이노신(2g/dl) 및 나트륨 트리폴리포스페이트, 나트륨 폴리포스페이트(상표명:폴리곤 P, 기요다 케미컬에 의해 제조됨), 이나트륨 페닐포스페이트, 또는 이나트륨 카바밀 포스페이트(10g/dl)를 나트륨 아세테이트 완충액(pH 4.0)중에 용해시키고 여기에 실시예 1에서 제조된 효소 샘플을 첨가하여 이의 농도가 50units/dl이 되게 한다. 반응 혼합물을 3시간 동안 30℃에서 반응시키면서 pH를 4.0으로 유지시킨다. 반응에 의해 생산된 5'-이노신산의 양은 표 3에 나타낸다.

5'-이노신산을 효과적으로 생산하고 임의의 포스페이트 그룹 공여체를 사용하여 축적시킨다.

그러나 5'-이노신산의 축적된 양은 나트룸 폴리포스페이트가 포스페이트 그룹 공여체로서 사용되는 경우 가장 높다.

[표 3]

실시예 4: 에스케리치아 블라태로부터 유도된 산 포스파타제의 정제 및 특징화

펩톤 1g/dl, 효모추출물 0.5g/dl, 및 염화 나트륨 1g/dl를 포함하는 영양 배지(pH 7.0, 50ml)를 20분동안 120℃에서 살균된 사카구치 플라스크(500ml)에 붓는다. 에스케리치아 블라태 JCM 1650의 사면 배양물을 플라티늄 루프를 사용하여 한 번씩 플라스크의 각각에 접종하고 교반시키면서 16시간동안 30℃에서 배양한다. 원심분리하여 배양물에서 미생물을 수거한다. 미생물 세포(약 3,300g)를 인산 칼륨 완충액(1L, pH 7.0)중에 현탁시킨다. 20분동안 4℃에서 초음파 처리하여 미생물 세포를 파쇄시킨다. 처리된 현탁액을 원심분리하여 이의 불용성 분취물을 제거한다. 이어서, 세포 유리 추출물을 제조한다.

30% 포화도에 이르도록 황산 암모늄을 세포 유리 추출물에 첨가한다. 발생된 침전물을 원심분리하여 제거함에 이어서 황산 암모늄을 추가로 상등액에 첨가하여 60% 포화도에 이르도록 한다. 발생한 침전물을 원심분리하여 회수하고 인산 칼륨 완충액 100mM중에 용해시킨다.

상기 조효소 용액을 5L의 인산 칼륨 완충액 100mM(pH 7.0)에 대해 4회 투석함에 이어서 20mM 인산 칼륨 완충액(pH 7.0)으로 평형화된 DEAE-토요페알 650M 칼럼(6.2×35㎝)에 적용시킴에 이어서 800ml의 20mM 인산 칼륨 완충액(pH 7.0)으로 세척한다. 트랜스인산화 활성이 칼럼을 통과하는 분취물에 나타나고 이어서 상기 분취물을 회수한다.

활성 분취물에 황산 암모늄을 첨가하여 35% 포화도에 이르도록하고 35% 포화된 황산 암모늄을 포함하는 20mM 인산 칼륨 완충액(pH 7.0)으로 평형화시킨 부틸-토요필 칼럼(5.0×22.5)에 적용시킨다. 인산 칼륨 완충액(pH 7.0)중에서 35% 내지 20%의 포화에 이르는 선형 농도 구배를 사용하여 용출시킨다.

활성 분취물을 수거하고 1L의 100mM 인산 칼륨 완충액(pH 7.0)에 대해 투석시킴에 이어서 50mM 인산 칼륨 완충액(pH 7.0)으로 평형화된 하이드록시애퍼타이트 칼럼(3.0×7.0㎝)에 적용시킨다. 50mM 내지 300mM의 인산 칼륨 완충액(pH 7.0)에 이르는 선형 농도 구배를 사용하여 용출시키고 활성 분취물을 수거한다.

상기 효소 용액을 1L의 10mM 인산 칼륨 완충액( pH 6.0)에 대해 투석시킴에 이어서 10mM 인산 칼륨 완충액(pH 6.0)으로 평형화된 CM-토요필 칼럼(2.0×14.0㎝)에 적용시킨다. 0mM 내지 300mM의 염화 칼륨을 포함하는 인산 칼륨 완충액(pH 6.0)에 이르는 선형 농도 구배를 사용하여 용출시킨다. 칼럼에서 용출된 활성 분취물을 수거한다.

상기 기술된 바와 같은 방법에 따라 트랜스인산화 활성을 보여주는 효소를 약 16%의 회수율에서 결과적으로 약 600배로 농축된 세포 유리 추출물중에서 정제한다. 상기 정제 방법에서 비활성 및 회수율은 표 4에 나타낸다. 상기 효소 샘플은 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동상에서 균일하다.

[표 4]

정제된 효소는 하기의 성질을 갖는다.

(1)활성:포스페이트 그룹을 폴리인산과 같은 포스페이트 그룹 공여체로부터 뉴클레오사이드로 전달시키고 뉴클레오사이드-5'-포스페이트 에스테르를 제조한다. 역으로, 상기 효소 또한 인산 에스테르를 가수분해시키는 활성을 나타낸다.

(2) 기질 특이성:트랜스인산화 반응중에서 포스페이트 그룹 공여체로서 작용하는 것은 예를들어 파이로인산, 트리폴리인산, 트리메타인산, 테크라메타인산, 헥사메타인산, 이나트륨 페닐포스페이트, 이칼륨 페닐포스페이트, 0,0-디페닐인산 무수물, 이나트륨 카바밀 포스페이트, 이칼륨 카바밀 포스페이트, 이암모늄 카바밀 포스페이트 및 이리튬 카바밀 포스페이트를 포함한다. 인산 그룹 수용체로서 작용하는 것은 예를들어 퓨린 리보사이드, 이노신, 구아노신, 아데노신, 산초신, 우리딘 및 시티딘을 포함한다. 또 다른 한편, 포스페이트 에스테르 가수분해 반응중에서 활성을 나타내는 것은 예를들어 파이로인산, 트리폴리인산, 트리메타인산, 테트라메타인산, 헥사메타인산과 같은 무기인산; 이나트륨 페닐포스페이트, 이칼륨 페닐포스페이트, 0,0-디페닐인산 무수물, 이나트륨 카바밀 포스페이트, 이칼륨 카바밀 포스페이트, 이암모늄 카바밀 포스페이트 및 이리튬 카바밀 포스페이트와 같은 포스페이트 에스테르; 5'-퓨린 리보타이드, 5'-이노신산, 5'-구아닐산, 5'-아데틸산, 5'산칠산, 5'-우리딜산 및 5'-시티딜산과 같은 5'-뉴클레로타이드를 포함한다.

(4)pH 안정성: pH3.0 내지 pH 12.0(30℃에서 60분동안 처리)

(5)최적 온도: 약 35℃

(6) 온도 안정성:40℃이하에서 안정함(pH 7.0에서 30분동안 처리)

(7)금속 이온 및 억제제의 첨가 효과:

상기 효소는 임의의 금속 이온의 첨가에따라 이의 활성에 적절한 활성화 현상을 보이지 않는다. 활성은 Fe²⁺, Ag²⁺, Pb²⁺, Hg²⁺및 Cu²⁺에 의해 억제된다. 활성은 또한 요오드아세트산에 의해 억제된다.

(8)분자량:계산된 분잘량은 고압 액상 크로마토그래피(TSKgel G-3000SW, 도요 소다에 의해 제조됨)에 따라 약 188,000이다.

(9)서브유니트 분자량:계산된 서브유니트 분자량은 SDS-폴리아크릴아미드겔 전기영동에 따라 약 24,500이다.

상기 효소는 모르가넬라 모르가니 NCIMB 10466의 세포 유리 추출물로부터 정제된 효소와 동일한 방식으로 포스페이트 그룹을 뉴크레오사이드로 전달하는 활성 뿐만아니라 역으로 포스페이트 에스테르를 가수분해하는 활성을 보여준다. 더욱이 상기 효소는 포스페이트 에스테르 가수분해 활성(포스포모노에스터라제 활성)을 나타내는데 이는 30배이상 트랜스인산화 활성보다 높다. 따라서, 상기 효소가 산 포스파타제인 것이 명백하다.

나트륨 파이로포스페이트(15g/dl) 및 이노신(3g/dl)을 각각 pH 5.5, 5.0, 4.5, 4.0, 및 3.5를 갖는 나트륨 아세테이트 완충용액에 용해시키고 여기에 상기 기술한 효소를 첨가하여 50유니트/dl의 농도를 수득한다. 반응 혼합물을 6시간동안 30℃에서 반응시키면서 각각의 pH를 유지하고 생산된 5'이노신산의 양을 시간의 경과에 따라 측정한다. 생산된 이노신산은 단지 5'-이노신산을 포함한다. 2'-이노신산 및 3'-이노신산의 부산물은 전혀 관찰되지 않는다. 결과는 도 2에 나타낸다. 5'-이노신산 생산 속도는 pH 5.0에서 최대이다. 그러나, 최대로 축적된 5'-이노신산의 양은 보다 낮은 pH에서 높다. pH 4.0에서 반응 조건은 5'-이노신산의 생산을 위해 가장 효과적이고 5'-이노신산은 3시간pH 4.0, 30℃에서 반응을 수행하여 1.56g/dl의 양으로 생산되고 축적된다.

실시예 5: 에스케리치아 블라태로부터 유도된 산 포스파타제 샘플에 의한 다양한 뉴클레오사이드의 인산화 반응

나트륨 파이로포스페이트(15g/dl) 및 이노신, 구아노신, 우리딘 또는 시티딘(3g/dl)은 나트륨 아세테이트 완충액(pH 4.0)중에 용해시키고 여기에 실시예 4에서 제조된 효소 샘플을 첨가하여 이의 농도가 50units/dl이 되게한다. 반응 혼합물을 3시간동안 35℃에서 반응시키면 pH를 4.0으로 유지한다. 반응에 의해 제조된 뉴클레오사이드-5'-에스테르의 양은 표 5에 나타낸다.

생산된 뉴클레오타이드는 단지 뉴클레오사이드-5'-에스테르를 포함한다. 뉴클레오사이드-2'-에스테르 및 뉴클레오사이드-3'-에스테르의 부산물은 전혀 관찰되지 않는다.

[표 5]

실시예 3: 에스케리치아 블라태로부터 유도된 산 포스파타제 샘플에 의해 포스페이트 그룹 공여체로서 다양한 포스페이트 화합물로부터 5'-이노신산의 생산

포스페이트 그룹 공여체로서 이노신(2g/dl) 및 나트륨 트리폴리포스페이트, 나트륨 폴리포스페이트(상표명:폴리곤 P, 기요다 케미컬에 의해 제조됨), 이나트륨 페닐포스페이트, 또는 이나트륨 카바밀 포스페이트(10g/dl)를 나트륨 아세테이트 완충액(pH 4.0)중에 용해시키고 여기에 실시예 4에서 제조된 효소 샘플을 첨가하여 이의 농도가 50units/dl이 되게 한다. 반응 혼합물을 3시간 동안 35℃에서 반응시키면서 pH를 4.0으로 유지시킨다. 생산된 5'-이노신산의 양은 표 6에 나타낸다.

5'-이노신산을 효과적으로 생산하고 임의의 포스페이트 그룹 공여체를 사용하여 축적시킨다. 그러나, 5'-이노신산의 축적된 양은 나트룸 폴리포스페이트가 포스페이트 그룹 공여체로서 사용되는 경우 가장 높다.

실시예 7 : 모르가넬라 모르가니의 염색체로부터 산 포스파타제를 암호화하는 유전자의 분리

(1) N-말단 아미노산 서열의 결정

실시예 1에서 기술한 방법에 따라 모르가넬라 모르가니 NCIMB 10466의 세포 유리 추출물로부터 정제된 산 포스파타제를 DITC 막(밀리겐/바이오서치에 의해 제조됨)에 흡착시키고 이의 N-말단 아미노산 서열을 프로서열화기 6625(밀리겐/바이오리서치에 의해 제조됨)를 사용하여 결정한다. 서열 목록의 서열 1에 나타낸 20개 잔기를 포함하는 N-말단 아미노산 서열을 결정한다.

(2) 산 포스파타제를 암호화하는 유전자를 포함하는 DNA 단편의 분리

무레이 및 톰슨의 방법[참조: Nucl. Acid Res., 4321, 8(1980)]에 따라 염색체성 DNA를 모르가넬라 모르가니 NCIMB 10466의 배양된 미생물 세포로부터 추출한다. 염색체 DNA를 제한 효소 Sau3AI를 사용하여 부분적으로 분해한다. 이후에 3 내지 6kbp의 DNA 단편을 슈크로즈 밀도 구배 원심분리에 의해 분획시킨다. 플라스미드 벡터 pUC118(타카라 슈조에 의해 제조됨)를 제한효소 BamHI로 분해하고 부분적으로 분해된 염색체 DNA 단편과 결합시킨다. 지정된 방법에 따라 DNA 결합 키트(다카라 슈조에 의해 제조됨)을 사용하여 DNA를 결합시킨다. 이후에 에스케리치아콜리 JM109(다카라 슈조에 의해 제조됨)를 통상적인 방법에 따라 수득한 DNA 혼합물로 형질전환시킨다. 형질전환체를 앰피실린 100ug/ml을 포함하는 L 한천 배지상에 플레이팅하고 유전자 라이브러리를 준비하기 위해 증식시킨다.

4mM p-니트로페닐인산 및 100mM MES/NaOH 완충액(pH 6.0)을 포함하는 반응용액을 형질전환체가 증식하는 한천 배지상의 표면에 붓고 온도를 15분동안 30℃◎◎유지시킨다. 포스파타제 활성을 나타내는 균주는 p-니트로페놀을 유리하고 황색을 나타낸다. 따라서, 형질전환체는 상기 현상을 지표로서 사용하여 선별된다. 약 20,000 균주의 형질전환체를 포함하는 유전자 발현 라이브러리에 대한 검색의 결과로서 포스파타제 활성을 나타내는 30 균주의 형질전환체가 수득된다.

포스파타제 활성을 나타내는 형질전환체(30 균주)는 단독의 콜로니로 분리된다. 단독의 콜로니를 앰피실린 100ug/ml을 포함한 L-배지(2.5ml)에 접종하고 이들을 16시간동안 37℃에서 배양시킨다. 이노신(2g/dl) 및 나트륨 파이로포스페이트(10g/dl)을 포함하는 나트륨 아세테이트 완충액(100mM, pH 5.0, 50ul)을 배양물에서 수거한 미생물 세포로 첨가하고 반응 혼합물을 16시간 동안 30℃에서 반응시킨다. 5'-이노신산의 생산을 HPLC 분석으로 검출하여 트랜스인산화 활성을 갖는 미생물 균주를 선별한다. 결과로서, 본 연구가는 트랜스인산화 활성을 나타내고 목적하는 산 포스파타제 유전자를 포함하는 DNA 단편을 함유한 것으로 추정되는 5 균주의 형질전환체를 수득하는데 성공하였다.

실시예 8 : 모르가넬라 모르가니 NCIMB 10466으로부터 유래된 산 포스파타제 유전자의 뉴클레오타이드 서열의 결정

삽입된 DNA 단편을 알카린 용균 방법[참조 : Molecular Cloning 2nd edition, J. Sambrook, E. F. Fritsh and T. Maniatis, Cold Spring Harbour Laboratory Press, pl. 25(1989)]에 따라 실시예 7에서 수득한 모르가넬라 모르가니 NCIMB 10466에서 유래된 산 포스파타제 유전자를 포함하는 DNA를 함유한 것으로 추정되는 한 균주의 형질전환체로부터 플라스미드를 제조함으로써 분석한다. 상기 플라스미드를 pMPI501로서 지정한다. 도 3은 삽입된 DNA 단편의 결정된 제한 효소 지도를 보여준다.

산 포스파타제 유전자의 영역은 추가로 서브클로닝에 의해 특정화된다. 결과로서 이것은 상기 산 포스파타제 유전자가 제한효소 HindIII 및 EcoRI에 의해 절단된 1.2kbp의 크기를 갖는 단편에 포함된다는 것을 제안한다. 따라서 뉴클레오타이드 서열을 결정하기 위하여 플라스미드 DNA를 1.2kbp의 단편을 HindIII 및 EcoRI로 분해된 pUC118과 결합시켜 작제한다. 에스케리치아 콜리 JM109(다카라 슈조에 의해 제조됨)를 통상적인 방법에 따라 pMPI505로서 지정된 상기 플라스미드 DNA로 형질전환시키고 앰피실린 100ug/ml을 포함하는 L 한천 배지상에 플레이팅시켜 형질전환체를 수득한다.

플라스미드를 pMPI505를 함유하는 에스케리치아 콜리 JM109(다카라 슈조에 의해 제조됨)의 형질전환체로부터 알카린 용균 방법에 따라 추출하여 뉴클레오타이드 서열을 결정한다. 뉴클레오타이드 서열은 생거(Sanger) 방법[참조 : J. Mol. Biol., 143, 161(1980)에 따라 타크 다이데옥시 터미네이터 사이클 시쿼싱 키트(응용된 바이오케미컬에 의해 제조됨)를 사용함으로써 결정한다. 결정된 개방 판독 프레임의 뉴클레오타이드 서열은 서열목록의 서열 2에 보여진다. 뉴클레오타이드 서열로부터 추론된 단백질의 아미노산 서열은 서열 목록의 서열 3에 보여진다. 정제된 효소의 N-말단 아미노산 서열과 완전히 일치하는 부분적인 서열은 아미노산 서열에서 발견된다. 정제된 효소의 N-말단은 서열 3에 나타낸 서열중 21번째 알라닌 전기에서 시작된다. 따라서, 서열 3에 보여지는 아미노산 서열은 전구체 단백질의 서열이고 첫 번째 메티오닌 잔기에서 20번째 알라닌 잔기의 범위를 포함하는 펩티드는 해독후 제거되는 것으로 추정된다. 따라서 추론된 성숙한 단백질의 아미노산 서열은 서열 목록의 서열 4에 보여진다. 아미노산 서열로부터 평가된 성숙한 단백질의 분자량은 24.9 킬로돌턴인 것으로 계산되었고 이것은 정제된 효소에 대한 SDS-PAGE의 결과와 일치한다. 상기 기술한 결과에 따라 상기 단편을 포함하는 플라스미드를 함유하는 형질전환체는 트랜스인산화 활성을 나타낸다는 사실 때문에 상기 개방 판독 프레임은 목적하는 산 포스파타제를 암호화하는 영역인 것으로 확인된다.

뉴클레오타이드 서열 및 아미노산 서열을 각각 상동성에 대해서 비교한다. EMBL 및 SWISS-PROT의 정보 베이스를 사용한다. 결과로서 54번째 G가 A이고, 72번째 G가 A이고, 276번째 T가 G이고, 378번째 T가 C이고, 420번째 G가 T이고, 525번째 C가 G이고, 529번째 C가 T이고, 531번째 G가 A이며 서열 목록의 서열 4의 나타낸 아미노산 서열이 모르가넬라 모르가니로부터 유래된 산 포스파타제 유전자의 서열과 동일한 것을 제외하고는 서열 목록의 서열 2에 나타낸 뉴클레오타이드 서열이 모르가넬라 모르가니로부터 유래된 공지된 산 포스파타제 유전자의 뉴클레오타이드 서열과 일치한다는 것을 밝힌다.[참조 : Thaller, M. C. et al., Microbiology, 140, 1341(1994)]. 즉 서열 목록의 서열 4에 나타낸 아미노산 서열로 이루어진 단백질을 암호화하는 유전자는 모르가넬라 모르가니 NCIMB 10466의 산 포스파타제 유전자이다.

전구체 단백질은 249개의 아미노산으로 구성되고, 이의 서열로부터 추론된 단백질의 분자량은 27.0 킬로돌턴이다.

플라스미드 pMPI505에 의해 형질전환된 에스케리치아 콜리 JM109의 균주를 AJ13143으로서 지정하였고 이것은 부다페스트 조약하에 1996년 2월 23일에 기탁기관[National Institute of Bioscience and Human Technology of Agency of Industrial Science and Technology; 주소: 우편번호 305, 1-3, Higashi 1-chome, Tsubuka-shi, Ibaraki-ken, Japan]에 기탁되었고 수탁번호 FERM BP-5422를 수여받았다.

실시예 9 : 모르가넬라 모르가니 NCIMB 10466으로부터 유래된 산 포스파타제의 유전자를 발현시킴에 의한 활성의 증대

실시예 8에서 작제된 에스케리치아 콜리 JM109/pMPI505를 앰피실린 100ug/ml 및 IPTG 1mM를 포함하는 L-배지(50ml)에 접종하고 16시간동안 37℃에서 배양한다. 미생물 세포를 원심분리하여 이의 배양물로부터 수거하고 생리 식염수로 1회 세척한다. 미생물 세포를 100mM 인산 칼륨 완충액(5ml, pH 7.2)중에 현탁시키고 이들을 20분동안 4℃에서 초음파 처리로 파쇄한다. 처리된 용액을 원심분리하여 불용성 분취물을 제거함에 이어서 세포 유리 추출물을 제조한다.

수득한 세포 유리 추출물의 트랜스인산화 활성을 상기 상술한 바와 같이 동일한 방법으로 플라스미드 pUC118로 형질전환된 야생형의 모르가넬라 모르가니 및 에스케리치아 콜리 JM109로 부터 제조된 세포 유리 추출물의 대조구를 사용하여 측정한다. 결과는 표 7에 나타낸다. 트랜스인산화 활성은 에스케리치아 콜리 JM109/pUC118에서 검출되지 않는다. 트랜스인산화 활성은 또한 모르가넬라 모르가니의 야생형 균주에서 낮다. 또 다른 한편, 에스케리치아 콜리 JM109/pMPI505는 비활성에 있어서 야생형의 모르가넬라 모르가니의 활성 보다 150배 높다. 결과에 따라서, 이것은 도입된 DNA 단편이 에스케리치아 콜리가 높은 수준의 산 포스파타제를 발현하도록 한다는 것을 입증한다.

실시예 11 : 에스케리치아 블라태의 염색체로부터 산 포스파타제를 암호화하는 유전자의 추출

(1) N-말단 아미노산 서열의 결정

에스케리치아 블라태 JCM 1650의 세포 유리 추출물로부터 정제된 산 포스파타제를 DITC 막(밀리겐/바이오서치에 의해 제조됨)에 흡착시키고 이의 N-말단 아미노산 서열을 프로서열화기 6625(밀리겐/바이오리서치에 의해 제조됨)를 사용하여 결정한다. 서열 목록의 서열 8에 나타낸 15개 잔기를 포함하는 N-말단 아미노산 서열을 결정한다.

무레이 및 톰슨의 방법[참조: Nucl. Acid Res., 4321, 8(1980)]에 따라 염색체성 DNA를 에스케리치아 블라태 JCM 1650의 배양된 미생물 세포로부터 추출한다. 염색체 DNA를 제한 효소 Sau3AI를 사용하여 부분적으로 분해한다. 이후에 3 내지 6kbp의 DNA 단편을 슈크로즈 밀도 구배 원심분리에 의해 분획시킨다. 플라스미드 벡터 pUC118(타카라 슈조에 의해 제조됨)를 제한효소 BamHI로 분해하고 부분적으로 분해된 염색체 DNA 단편과 결합시킨다. 지정된 방법에 따라 DNA 결합 키트(다카라 슈조에 의해 제조됨)을 사용하여 DNA를 결합시킨다. 이후에 에스케리치아 콜리 JM109(다카라 슈조에 의해 제조됨)를 통상적인 방법에 따라 수득한 DNA 혼합물로 형질전환시킨다. 형질전환체를 앰피실린 100ug/ml을 포함하는 L 한천 배지 상에 플레이팅하고 유전자 라이브러리를 준비하기 위해 증식시킨다.

4mM p-니트로페닐인산 및 100mM MES/NaOH 완충액(pH 6.5)을 포함하는 반응용액을 형질전환체가 증식하는 한천 배지상의 표면에 붓고 온도를 15분동안 30℃에서 유지시킨다. 포스파타제 활성을 나타내는 균주는 p-니트로페놀을 유리하고 황색을 나타낸다. 따라서, 형질전환체는 상기 현상을 지표로서 사용하여 선별된다. 약 8,000 균주의 형질전환체를 포함하는 유전자 발현 라이브러리에 대한 검색의 결과로서 포스파타제 활성을 나타내는 14 균주의 형질전환체가 수득된다.

포스파타제 활성을 나타내는 형질전환체(14 균주)는 단독의 콜로니로 분리된다. 단독의 콜로니를 앰피실린 100ug/ml을 포함한 L-배지(2.5ml)에 접종하고 이들을 16시간동안 37℃에서 배양시킨다. 이노신(2g/dl) 및 나트륨 파이로포스페이트(10g/dl)을 포함하는 나트륨 아세테이트 완충액(100mM, pH 5.0, 50ul)을 배양물에서 수거한 미생물 세포에 첨가하여 16시간 동안 30℃에서 반응시킨다. 5'-이노신산의 생산을 HPLC 분석으로 검출하여 트랜스인산화 활성을 갖는 미생물 균주를 선별한다. 결과로서, 본 연구가는 트랜스인산화 활성을 나타내고 목적하는 산 포스파타제 유전자를 포함하는 DNA 단편을 함유한 것으로 추정되는 3 균주의 형질전환체를 수득하는데 성공하였다.

실시예 12 : 에스케리치아 블라태 JCM 1650으로부터 유래된 산 포스파타제 유전자의 뉴클레오타이드 서열의 결정

삽입된 DNA 단편을 알카린 용균 방법에 따라 실시예 11에서 수득한 에스케리치아 블라태 JCM 1650에서 유래된 산 포스파타제 유전자를 포함하는 DNA 단편을 함유한 것으로 추정되는 한 균주의 형질전환체로부터 플라스미드를 제조함으로써 분석한다. 상기 플라스미드를 pEPI301로서 지정한다. 도 5는 삽입된 DNA 단면의 결정된 제한 효소 지도를 보여준다.

산 포스파타제 유전자의 영역은 추가로 서브클로닝에 의해 특정화된다. 결과로서 이것은 상기 산 포스파타제 유전자가 제한효소 ClaI 및 BamHI에 의해 절단된 2.4kbp의 크기를 갖는 단편에 포함된다는 것을 제안한다. 따라서 뉴클러오타이드 서열을 결정하기 위하여 플라스미드 DNA를 단편을 ClaI 및 BamHI로 분해된 p블루스크립트 KS(+)와 결합시켜 작제한다. 에스케리치아 콜리 JM109(다카라 슈조에 의해 제조됨)를 통상적인 방법에 따라 pEPI305로서 지정된 상기 플라스미드 DNA로 형질전환시키고 앰피실린 100ug/ml을 포함하는 L 한천 배지상에 플레이팅시켜 형질전환체를 수득한다.

플라스미드를 pEPI305를 함유하는 에스케리치아 콜리 JM109(다카라 슈조에 의해 제조됨)의 형질전환체로부터 알카린 용균 방법에 따라 추출하여 뉴클레오타이드 서열을 결정한다. 결정된 개방 판독 프레임의 뉴클레오타이드 서열은 서열목록의 서열 6에 보여진다. 뉴클레오타이드 서열로부터 추론된 단백질의 아미노산 서열은 서열 목록의 서열 7에 보여진다. 정제된 효소의 N-말단 아미노산 서열과 완전히 일치하는 부분적인 서열은 아미노산 서열에서 발견된다. 정제된 효소의 N-말단은 서열 7에 나타낸 서열중 19번째 류신 전기에서 시작된다. 따라서, 서열 7에 보여지는 아미노산 서열은 전구체 단백질의 서열이고 첫 번째 메티오닌 잔기에서 18번째 알라닌 잔기의 범위를 포함하는 펩티드는 해독후 제거되는 것으로 추정된다. 따라서 추론된 성숙한 단백질의 아미노산 서열은 서열 목록의 서열 8에 보여진다. 성숙한 단백질의 분자량은 25.1 킬로돌턴인 것으로 계산되었고 이것은 정제된 효소에 대한 SDS-PAGE의 결과와 일치한다. 상기 기술한 결과에 따라 상기 단편을 포함하는 플라스미드를 함유하는 형질전환체는 트랜스인산화 활성을 나타낸다는 사실 때문에 상기 개방 판독 프레임은 목적하는 산 포스파타제를 암호화하는 영역인 것으로 확인된다.

즉 서열 목록의 서열 8에 나타낸 아미노산 서열로 이루어진 단백질을 암호화하는 유전자는 에스케리치아 블라태 JCM 1650의 산 포스파타제 유전자이다.

뉴클레오타이드 서열 및 아미노산 서열을 각각 상동성에 대해서 비교한다. EMBL 및 SWISS-PROT의 정보 베이스를 사용한다. 결과로서 서열 8에 나타낸 단백질 및 이를 암호화하는 DNA가 신규한 것임을 밝힌다. 상기 유전자에 의해 암호화된 전구체 단백질은 249개의 아미노산으로 구성되고 이의 서열로부터 추론된 단백질의 분자량은 27.0 킬로돌턴이다.

아미노산 서열은 각각 상동에 대해 공지된 서열과 비교한다. 결과로서, 상기 단백질은 프로비덴시아 스투아르티(Providencia stuartii)의 산 포스파타제(77%), 실시예 8의 모르가넬라 모르가니(Morganella morganii)의 산 포스파타제(77.1%) 및 살모넬라 타이피무리엄(Salmonella typhimurium)의 산 포스파타제(44.3%)와 고도의 상동성을 나타낸다.

플라스미드 pMPI305에 의해 형질전환된 에스케리치아 콜리 JM109의 균주를 AJ13144으로서 지정하였고 이것은 부다페스트 조약하에 1996년 2월 23일에 기탁기관[National Institute of Bioscience and Human Technology of Agency of Industrial Science and Technology; 주소: 우편번호 305, 1-3, Higashi 1-chome, Tsubuka-shi, Ibaraki-ken, Japan]에 기탁되었고 수탁번호 FERM BP-5423을 수여받았다.

실시예 13 : 에스케리치아 블라태 JCM 1650로부터 유래된 산 포스파타제의 유전자를 발현시킴에 의한 활성의 증대

실시예 12에서 작제된 에스케리치아 콜리 JM109/pEPI305를 앰피실린 100ug/ml 및 IPTG 1mM를 포함하는 L-배지(50ml)에 접종하고 16시간동안 37℃에서 배양한다. 미생물 세포를 원심분리하여 이의 배양물로부터 수거하고 생리 식염수로 1회 세척한다. 미생물 세포를 100mM 인산 칼륨 완충액(5ml, pH 7.2)중에 현탁시키고 이들을 20분동안 4℃에서 초음파 처리로 파쇄한다. 처리된 용액을 원심분리하여 불용성 분취물을 제거함에 이어서 세포 유리 추출물을 제조한다.

수득한 세포 유리 추출물의 트랜스인산화 활성을 상기 상술한 바와 같이 동일한 방법으로 플라스미드 p블루스크립트 KS(+)로 형질전환된 야생형의 에스케리치아 블라태 및 에스케리치아 콜리 JM109로 부터 제조된 세포 유리 추출물의 대조구를 사용하여 측정한다. 결과는 표 8에 나타낸다. 트랜스인산화 활성은 에스케리치아 콜리 JM109/p블루스크립트 KS(+)에서 검출되지 않는다. 트랜스인산화 활성은 또한 에스케리치아 블라태의 야생형 균주에서 낮다. 또 다른 한편, 에스케리치아 콜리 JM109/pEPI305는 비활성에 있어서 야생형의 에스체리치아 블라태의 활성 보다 120배 높은 트랜스인산화 활성을 나타낸다. 결과에 따라서, 이것은 도입된 DNA 단편이 에스케리치아 콜리가 높은 수준의 산 포스파타제를 발현하도록 한다는 것을 입증한다.

실시예 14 : 에스케리치아 블라태 JCM 1650에서 유래된 산 포스파타제 유전자를 함유하는 균주를 사용하여 이노신으로부터 5'-이노신산의 제조

나트륨 파이로포스페이트(12g/dl) 및 이노신(6g/dl)을 100M 나트륨 아세테이트 완충액(pH 4.0)중에 용해시키고 여기에 상기 기술한 에스케리치아 콜리 JM109/pEPI305의 미생물 세포를 첨가하여 미생물 세포의 건조 중량으로 전환된 20mg/dl의 세포 농도를 수득한다. 반응 혼합물을 10시간 동안 35℃에서 반응시키면서 pH를 4.0으로 유지시키고 생산된 5'-이노신산의 양을 시간의 경과에 따라 측정한다. 생산된 이노신산은 5'-이노신산만을 함유한다. 2'-이노신산 및 3'-이노신산의 부산물을 전혀 관찰되지 않는다. 결과는 도 6에 나타낸다. 5'-이노신산을 반응에서 짧은 시간내에 최대 효율로 생산하고 축적시켜 상기 미생물을 사용하여 파이로포스페이트 및 이노신으로부터 5'-이노신산을 생산한다.

실시예 15 : 저하된 포스포모노에스터라제 활성을 가진 산 포스파타제를 암호화하는 A 유전자의 제조

실시예 13 및 14에서 기술한 바와 같이 에스케리치아 블래태로부터 유래된 산 포스파타제 유전자를 함유하는 균주는 상당한 양의 산 포스파타제를 발현하고 5'-이노신산을 반응에서 짧은 시간내에 최대 효율로 생산하고 축적시켜 상기 미생물을 사용하여 파이로포스페이트 및 이노신으로부터 5'-이노신산을 생산한다. 하지만 축적된 양의 5'-이노시산은 산 포스파타제가 지니는 포스포모노에스터라제 활성으로 인해 분해되기 때문에 어느 정도를 초과하지 않는다. 따라서 PCR을 사용함으로써 부위 지시된 돌연변이에 따라 실시예 11에서 클론된 에스케리치아 블래태에서 유래된 산 포스파타제 유전자에 돌연변이를 도입하여 상기 효소를 개선시키려 한다.

서열 목록의 서열 9, 10, 및 11에 나타낸 올리고뉴클레오타이드 MUT300, MUT310, 및 MUT320을 각각 DNA 합성기(Applied Biosystem에 의해 제조된 모델 394)를 상용하여 포스포아미디트 방법에 따라 각각 합성한다.

실시예 12에서 제조된 주형으로서 플라즈미드 pEPI305(1ng), 프라이머로서 M 13 프라이머 RV(다카라 슈조에 의해 제조됨) 및 MUT310 올리고뉴클레오타이드(각각 2.5umol) 및 타크 DNA 폴리머라제(2.5 유니트, 다카라 슈조에 의해 제조됨)를 dATP, dCTP, dGTP, dTTP(각각 200uM), 염화 칼륨(50mM), 및 염화 마그네숨(1.5mM)을 포함하는 100mM 트리스-HCl 완충액(pH 8.3, 100ul)에 첨가하고 PCR 반응을 수행하고 94℃, 30초로 구성되는 싸이클을 25회 반복한다. PCR 반응을 열 싸이클러 PJ2000형(다카라 슈조에 의해 제조됨)을 사용하여 수행한다. 또한 주형으로서 플라스미드 pEPI305(1ng), 프라이머로서 M13 프라이머 M3(다카라 슈조에 의해 제조됨) 및 MUT300 올리고뉴클레오타이드를 사용하여 상기 기술한 것과 동일한 방법으로 PCR 반응을 수행한다. 각각의 반응 용액을 겔 여과로 정제하여 마이크로스핀 칼럼(Microspin column) S-400(파마샤에 의해 제조됨)을 사용하여 프라이머를 제거한다.

각각의 PCR 반응 산물(1ul)을 dATP, dCTP, dGTP, dTTP(각각 200uM), 염화 칼륨(50mM), 및 염화 마그네슘(1.5mM)을 포함하는 100mM 트리스-HCl 완충액(pH 8.3, 95ul)에 첨가하고 10분동안 94℃에서 가열함에 이어서 60분 이상 37℃로 냉각한다. 이후에 온도를 15분동안 37℃에서 유지하여 헤테로듀플렉스(heteroduplex)를 형성한다. 타크 DNA 폴리머라제(2.5유니트)를 여기에 첨가하여 3분동안 72℃에서 반응을 수행하여 헤테로듀플렉스를 완료한다. 이후에 M13 프라이머 RV 및 M13 프라이머 M3(각각 2,5umol)을 상기 반응용액에 첨가하여 PCR 반응을 수행하고 94℃에서 30초, 55℃에서 2분 및 72℃에서 3분으로 이루어진 싸이클을 10회 반복한다.

두 번째 PCR 반응의 산물을 ClaI 및 BamHI로 분해하고 페놀/클로로포름으로 추출한 다음 에탄올로 침전시킨다. 상기 DNA 단편을 ClaI 및 BamHI으로 분해시킨 p블루스크립트 KS(+)와 결합시킨다. 에스케리치아 콜리 JM109(다카라 슈조에 의해 제조됨)를 통상적인 방법에 따라 수득한 플라스미드 DNA로 형질전환시키고 앰피실린 100ug/ml을 포함하는 L 한천 배지상에 플레이팅하여 형질전환체를 수득한다.

플라스미드를 알카린 용균 방법에 따라 형질전환체로부터 추출하여 이의 뉴클레오타이드 서열을 결정하여 목적하는 뉴클레오타이드가 치환되었는지 확인한다. 따라서 성숙한 단백질의 74번째 글라이신 잔사(GGG)가 아스파르트산 전기(G^*A^*T)로 대체된 돌연변이 포스파타제를 암호화하는 돌연변이 유전자를 제조한다. 상기 돌연변이 유전자를 포함하는 플라스미드는 pEPI310으로써 지정되었다.

주형으로서 pEPI305 및 프라이머로서 MUT300 및 MUT320을 사용하는 상기 기술한 것과 동일한 방법에 따라 성숙한 단백질의 153번째 이소류신 잔기(ATC)를 트레오닌 잔기(A^*CC)로 대체된 돌연변이 포스파타제를 암호화하는 돌연변이 유전자를 제조한다. 상기 돌연변이 유전자를 포함하는 플라스미드를 pEPI320으로서 명명하였다. 추가로, 상기 기술한 방법에 따라 주형으로서 pEPI310을 사용하고 프라이머로서 MUT300 및 MUT320 올리고뉴클레오타이드를 사용하여 돌연변이 단백질의 74번 글라이신 잔지(GGG)가 아스파르트산 잔기(G^*A^*T)로 대체되고 돌연변이 단백질의 153번 이소루이신 잔기(ATC)가 트레오닌 잔기(A^*CC)로 대체된 돌연변이 포스파타제를 암호화하는 돌연변이 유전자를 제조한다. 상기 돌연변이 유전자를 함유하는 플라스미드를 pEPI330으로 지정하였다.

각각 돌연변이된 산 포스파타제를 포함하는 플라스미드가 도입된 에스케리치아 콜리 JM109/pEPI310, 에스케리치아 콜리 JM109/pEPI320 및 에스케리치아 콜리 JM109/pEPI330; 및 야생형 산 포스파타제 유전자를 포함하는 플라스미드가 도입된 에스케리치아 콜리 JM109/pEPI305를 앰피실린 100ug/ml 및 IPTG 1mM을 포함한 L-배지(50ml)에 접종하고 이들을 16시간동안 37℃에서 배양한다. 미생물 세포를 이의 배양물로부터 수거하고 이들을 생리 식염수로 1회 세척한다. 미생물 세포를 100mM 인산 칼륨 완충액(5ml, pH 7.0)중에 현탁시키고 20분동안 4℃에서 초음파 처리하여 파쇄한다. 처리된 용액을 원심분리하여 불용성 분획물에 제거함에 이어서 세포 유리 추출물을 제조한다. 수득한 세포 유리 추출물의 포스포모노에스터라제 활성 및 트랜스인산화 활성을 pH 4.0에서 측정하고 이를 야생 균주의 활성과 비교한다.

표 9는 저하된 포스포모노에스터라제 활성을 가진 야생형 포스파타제 및 산 포스파타제의 포스포모노에스터라제 활성 및 트랜스인산화 활성의 측정 결과를 보여준다. 저하된 포스포모에스터라제 활성을 가진 포스포모노에스터라제 활성과 트랜스 인산화 활성 모두가 야생형 산 포스파타제와 비교하여 저하되고 포스포모노에스터라제 활성의 감소 정도가 트랜스인산화 활성의 감소보다 크며 그 결과로서 돌연변이 산 포스포타제의 포스포모노에스터라제 활성과 트랜스인산화의 비가 야생형 산 포스파타제와 비교하여 낮아진다는 것을 보여준다.

1) : 포스포모노에스터라제 활성 대 뉴클레오사이드-5'-포스페이트 에스테르를 생상하는 활성의 비율

실시예 16 : 저하된 포스포모노에스테라제 활성을 지닌 산 포스파타제를 암호화하는 A 유전자를 함유하는 균주를 사용하여 이노신으로부터 5'-이노신산의 생산

저하된 포스포모노에스터라제 활성을 지닌 산 포스파타제를 암호화하는 플라스미드가 도입된 에스케리치아 콜리 JM109/pEPI310, 에스케리치아 콜리 JM109/pEPI320 및 에스케리치아 콜리 JM109/pEPI330; 및 야생형 산 포스파타제 유전자를 포함하는 플라스미드가 도입된 에스케리치아 콜리 JM109/pEPI305를 앰피실린 100ug/ml 및 IPTG 1mM을 포함한 L-배지(50ml)에 접종하고 이들을 16시간동안 37℃에서 배양한다.

나트륨 파이로포스페이트(12g/dl) 및 이노신(6g/dl)을 나트륨 아세테이트 완충액(pH 4.0)중에 용해시키고 상기 기술한 배양에 의해 수득된 에스케리치아 콜리의 균주 각각의 미생물 세포를 첨가하여 미생물 세포의 건조 중량으로 전환된 세포 농도 200mg/dl를 수득한다. 반응 혼합물을 32시간동안 35℃에서 배양하면서 pH를 4.0으로 유지하고 생산된 5'-아미노신산의 양을 시간 경과에 따라 측정한다. 결과는 도 8에 나타낸다.

도 7에서, 세로좌표 축은 5'-이노신산(mg/dl)의 농도를 나타내고 가로좌표 축은 반응시간(h)을 나타낸다. 반응의 진행은 각각의 균주의 세포에 의해 측정된 바와 같이 에스케리치아 콜리 JM109/pEPI305에 대해서는 원형 실선, 에스케리치아 콜리 JM109/pEPI310에 대해서는 삼각형 실선, 에스케리치아 콜리 JM109/pEPI320에 대해서는 원형 점선, 및 에스케리치아 콜리 JM109/pEPI330에 대해서는 사각형 점선에 의해 표시된다.

저하된 포스포모노에스터라제 활성을 지닌 산 포스파타제를 함유하는 균주를 사용하여 이노신으로부터 5'-이노신산을 제조하기 위한 반응에서 분해속도가 감소한다. 결과로서, 수율 및 축적된 5'-이노신산의 양은 증가한다. 최대로 축적된 5'-이노신산은 저하된 포스포모노에스터라제 활성을 지니고 74번째 글라이신 잔기 및 153번째 이소류신 잔기가 각각 아스파르트산 잔기 및 트레오닌 잔기로 대체된 산 포스파타제를 암호화하는 유전자를 함유하는 균주로서 에스케리치아 콜리 JM109/pEPI330에 의해 보여진다.

실시예 17 : 저하된 포스포모노에스터라제 활성을 지닌 산 포스파타제를 암호화하는 A 유전자를 함유한 균주를 사용하여 다양한 뉴클레오사이드-5'-포스페이트 에스테르의 생산

저하된 포스포모노에스터라제 활성을 지닌 산 포스파타제를 암호화하는 유전자를 포함하는 플라스미드가 도입된 에스케리치아 콜리 JM109/pEPI330을 앰피실린 100ug/ml 및 IPTG 1mM을 포함하는 L-배지(50ml)에 접종하고 16시간동안 37℃에서 배양한다.

포스페이트 그룹 수용체로서 나트륨 파이로포스페이트(12g/dl), 및 이노신, 구아노신, 우리딘, 또는 시티딘(6g/dl)을 100mM 나트륨 아세테이트 완충액(pH 4.0)중에 용해시키고 여기에 상기 기술한 미생물 세포를 첨가하여 세포의 건조 중량으로 전환된 세포 농도 200mg/dl을 수득한다. 반응 혼합물을 32시간동안 35℃에서 배양하면서 pH 4.0으로 유지시킨다. 생산된 뉴클레오사이드-5'-포스페이트 에스테르의 양을 표 10에 나타낸다. 생산된 뉴클레오타이드는 뉴클레오사이드-5'-포스페이트 에스테르를 포함한다. 뉴클레오사이드-2'-포스페이트 에스테르 및 뉴클레오사이드-3'-포스페이트 에스테르의 부산물은 전혀 관찰되지 않는다.

실시예 18 : 저하된 포스포모노에스터라제 활성을 지닌 산 포스파타제를 암호화하는 A 유전자를 함유한 균주를 사용하여 포스페이트 그룹으로서 다양한 포스페이트 화합물로부터 5'-이노신산의 생산

돌연변이 산 포스파타제를 포함하는 플라스미드가 도입된 에스케리치아 콜리 JM1009/pEPI330을 앰피실린 100ug/ml 및 IPTG 1mM을 포함하는 L-배지(50mM)에 접종하고 이를 16시간동안 37℃에서 배양한다.

포스페이트 그룹 공여체로서 이소신(6g/dl) 및 나트륨 트리폴리포스페이트, 나트륨 폴리포스페이트(상표명: 폴리곤 피, 치요다 케미칼에 의해 제조됨), 이나트륨 페닐포스페이트, 또는 이나트륨 카바밀 포스페이트(12g/dl)를 나트륨 아세테이트 완충액(pH 4.0)100mM에 용해시키고 여기에 상기 기술한 미생물 세포를 첨가하여 세포의 건조 중량으로 전환된 세포 농도 200mg/dl을 수득한다. 반응 혼합물을 32시간동안 35℃에서 배양하면서 pH 4.0으로 유지시킨다. 생산된 5'-이노신산의 양은 표 11에 나타낸다. 5'-이노신산은 임의의 포스페이트 공여체를 사용하여 효과적으로 생산되고 축적된다. 그러나, 5'-이노신산의 축적된 양은 폴리인산이 포스페이트 그룹 공여체로서 사용되는 경우에 가장 높다.

실시예 19

이. 블래태 JCM1650에서 유래된 신규 돌연변이 산 포스파타제 유전자의 생산에 관한 연구 및 돌연변이 산 포스파타제 유전자의 효소적 성질 :

실시예 19 내지 22에서, 뉴클레오사이드에 대한 트랜스인산화 활성을 하기의 조건하에서 측정한다. 이노신 4umol/ml, 나트륨 파이로포스페이트 100umol/ml, 나트륨 아세테이트 완충액(pH 4.0)100umol 및 효소를 포함한 반응용액 1ml을 사용하여 30℃ 및 pH 4.0에서 10분동안 반응을 수행한다. 2-N 염산을 첨가하여 상기 반응을 종료한다. 따라서 침전물을 원심분리를 통하여 제거하고 트랜스인산화를 통해 형성된 5'-이노신산의 양을 상기 언급한 조건하에서 결정한다. 이들 표준 조건하에서 1umol의 이노신산을 생산하는 효소의 양을 1유니트로서 정의한다.

추가로, 트랜스인산화 활성을 상기 언급한 조성물의 반응 조건하에서 10에서 100umol/ml로 이노신 농도를 변화시켜 측정하고 트랜스인산화 활성중에 이노신의 일정한 비율을 한스-울프 플롯을 사용하여 결정한다[참조: Biochem. J., 26, 1406(1932)].

이후에 기술된 바와 같이 각각의 돌연변이 효소와 함께 실시예 15에서 기술된 뉴클레오사이드-5'-포스페이트 에스테르의 생산성을 개선시키기 위한 상세한 분석을 수행한다. 결과적으로 돌연변이 효소의 뉴클레오타이드에 대한 친화도가 야생형 효소의 진화도와 비교하여 2배 개선되었다는 것을 밝혔다. 따라서 본 발명가는 뉴클레오사이드-5'-포스페이트 에스테르의 생산성이 상기 언급한 효소의 뉴클레오사이드에 대한 친화도를 증가시킴으로써 개선된다는 것을 고려하였고 추가로 유전 기술방법에 의해 효소를 변형시켰다.

실시예 15에서 유래된 야생형 산 포스파타제를 암호화하는 유전자를 포함하는 플라스미드 pEPI305를 사용하고 부위 특이적인 돌연변이가 유전 기술 방법에 의해 상기 플라스미드 DNA에 도입되어 돌연변이 산 포스파타제를 암호화하는 유전자를 생산한다. pEPI305는 이.블래태 JCM1650에서 유래된 야생형 산 포스파타제를 암호화하는 유전자를 포함하는 제한 엔도뉴클레아제 ClaI 및 BamHI로 절단된 2.4Kbp의 DNA 단편을 ClaI 및 BamHI로 절단된 p블루스크립트 KS(+)[스트라타진(stratagene)에 의해 제공됨]에 결합시켜 형성된 플라스미드 DNA이다. 산 포스파타제를 암호화하는 유전자의 염기 서열은 서열 목록의 서열 6에 의해 나타낸다. 추가로 상기 염기 서열로부터 예상되는 전구체 단백질의 아미노산 서열은 서열 목록의 서열 7에 의해 나타낸다. 정제된 효소(실시예 4에서 기술됨)의 분석 결과로부터 성숙한 단백질의 아미노산 서열은 서열 목록의 서열 8로 나타낼 수 있는 것으로 추정된다.

서열 목록의에서 보이는 서열을 갖는 올리고뉴클레오타이드 MUT300(서열 목록의 서열 9), MUT310(서열 목록의 서열 10), MUT320(서열 목록의 서열 11), MUT330(서열 목록의 서열 12), MUT340(서열 목록의 서열 13), MUT350(서열 목록의 서열 14), MUT350(서열 목록의 서열 14), MUT360(서열 목록의 서열 15), MUT370(서열 목록의 서열 16), MUT380(서열 목록의 서열 17) 및 MUT390(서열 목록의 서열 18)을 DNA 합성기(어플라이드 바이오시스템에 의해 제공된 모델 394)를 사용한 포스포아미디트 방법으로 합성한다.

주형으로서 pEPI305의 1ng, M13 프라이머 RV(다카라 슈조에 의해 공급됨) 2.5 umol, 올리고뉴클레오타이드 MUT310 2.5umol 및 타크 DNA 폴리머라제(다카슈조에 의해 공급됨) 2.5유니트를 dATP 200uM, dCTP 200uM, dGTP 200uM, dTTP 200uM, 염화 칼륨 50mM 및 염화 마그네슘 1.5mM를 포함하는 트리스-염화수소 완충액(pH 8.3) 100㎕에 첨가한다. 나누어진 3단계 즉, 30초동안 94℃, 2분동안 55℃, 3분동안 94℃에서 25회 반복하는 PCR을 수행한다. 상기 반응에서, 열 싸이클러 PJ2000 모델(다타라 슈조에 의해 공급됨)을 사용한다. 별도로 주형으로서 플라스미드 DNA pEPI305 1ng, 프라이머로서 M13 프라이머 M3(다카라 슈조에의 공급됨) 2.5umol, 및 올리고뉴클레오타이드 MUT300 2.5umol를 사용하여 PCR을 수행한다. 각각의 반응용액을 마이크로스핀 칼럼 S-400(파마시아에 의해 공급됨)을 사용하는 겔 여과로 정제하여 프라이머를 제거한다.

각각의 PCR 용액 1ml를 dATP 200uM, dCTP 200uM, dGTP 200uM, dTTP 200uM, 염화 칼륨 50mM 및 염화 마그네슘 1.5mM를 포함하는 트리스-염화수소 완충액(pH 8.3) 50㎕에 첨가한다. 혼합물을 10분 동안 94℃에서 가열시킴에 이어서 60분이상 37℃로 냉각하고 37℃에서 15분동안 가온하여 헤테로듀프렉스를 형성한다. 여기에 2.5유니트의 타크 DNA 폴리머라제를 첨가하고 반응을 72℃에서 3분동안 수행하여 헤테로듀프렉스를 완성한다. 이어서 M13 프라이머 2.5umol 및 M13프라이머 M3 2.5umol를 반응 용액에 첨가하고 나누어진 3단계 즉, 30초동안 94℃, 2분동안 55℃, 및 3분동안 72℃에서 10회 반복하는 PCR을 수행한다.

두 번째 PCR 산물을 ClaI 및 BamHI으로 절단함에 이어서 페놀 및 클로로포름의 혼합물로 추출하고 에탄올로 침전시킨다. 상기 DNA 단편을 ClaI 및 BamHI로 절단한 p블루스크립트 KS(+)에 결합시킨다. 이. 콜리 JM109(다카라 슈조에 의해 공급됨)를 수득한 플라스미드 DNA로 사용하여 통상적인 방법으로 형질전환시킨다. 이것을 앰피실린 100ug/ml를 포함하는 L-한천 배지상에 플레이팅하여 형질전환체를 수득한다. 플라스미드를 알카리 세균용균 방법을 사용하여 형질전환체로부터 제조하고 염기 서열을 결정하며 목적하는 염기가 대체되었는지를 확인한다. 염기 서열의 결정은 타크 다이데옥시 터미네이터 사이클 시퀀싱 키트(어플라이드 바이오케미칼에 의해 공급됨)를 사용하여 생거 방법[참조: J. Mol. Biol., 143, 161(1980)]에 의해 수행된다. 상기 방법으로 성숙한 단백질의 74번째 글라이신 잔기(GGG)가 아스파르트산 전기(G^*A^*T)로 대체된 돌연변이 포스파타제를 암호화하는 돌연변이 유전자를 제조한다. 상기 돌연변이 유전자 함유 플라스미드를 pEPI310으로 지정하였다(실시예 15).

주형으로 도입된 돌연변이를 가지는 플라스미드를 사용하여 상기 언급한 방법을 반복하여 부위-특이적인 돌연변이를 누적하여 도입한다. 플라스미드를 알카리 세균용균 방법에 의해 형질전환체로부터 제조하고 염기서열을 결정하며 목적하는 염기가 대체되었는지 확인한다. 돌연변이 포스파타제 및 돌연변이 부위를 암호화하는 수득한 돌연변이 유전자는 표 12에 나타낸다. 돌연변이 부위내 아미노산 잔기는 서열 목록의 서열 8에 의해 나타낸 성숙한 단백질의 아미노산 서열의 아미노산 잔기를 나타낸다.

돌연변이 산 포스파타제 유전자를 포함하는 플라스미드가 도입된 각각의 이. 콜리 JM109/pEPI330, 이. 콜리 JM109/pEPI340, 이. 콜리 JM109/pEPI350, 이. 콜리 JM109/pEPI360, 이. 콜리 JM109/pEPI370, 이. 콜리 JM109/pEPI380, 이. 콜리 JM109/pEPI390 및 이. 콜리 JM109/pEPI400 및 야생형 산 포스파타제 유전자를 포함하는 플라스키드가 도입된 이. 콜리 JM109/pEPI305를 앰피실린 100ug/ml 및 IPTG 1mM을 포함하는 50ml의 L배지에 첨가하고 16시간동안 37℃에서 배양한다. 세포를 원심분리하여 각각 균주의 2ℓ 배양물로부터 수거하고 생리 식염수로 1회 세척한다. 세포를 50ml의 100-mM 포스페이트 완충액(pH 7.0)중에 현탁시키고 4℃에서 20분동안 초음파처리하여 세포를 파쇄한다. 처리된 용액을 원심분리하여 불용성 분취물을 제거하고 세포 유리 추출물을 제조한다. 각각의 산 포스파타제는 실시예 4에서 기술한 방법에 의해 세포 유리 추출물 각각으로부터 정제한다. 각각의 효소 산물은 SDS-폴리아크릴아미드 전기영동에서 균일하다.

정제된 돌연변이 산 포스파타제 및 야생형 산 포스파타제의 트랜스인산화중에 이노신의 일정한 비율을 측정하고 결과를 표 13에 나타낸다. 실시예 15에서 기술된 뉴클레오사이드-5'-포스페이트 에스테르의 개선된 생산성을 가지는 이. 콜리 JM109/pEPI330에 발현된 돌연변이 효소는 Vmax가 감소되었지만 이노신에 대한 Km치가 크게 감소하는 것으로 보아 이. 콜리 JM109/pEPI305에서 발현된 야생형 효소와 비교하여 2배이상 이노신에 대한 친화성이 증가하였음을 나타낸 것이다. 이것은 상기 돌연변이 효소의 뉴클레오사이드-5'-포스페이트 에스테르의 생산성이 뉴클레오티다제 활성의 감소뿐만아니라 중요한 인자인 뉴클레오사이드에 대한 친화성의 증가로 크게 개선되었다는 것을 제안한다. 따라서, 뉴클레오사이드에 대한 친화도의 증가가 생산성을 개선시킨 것으로 예상된다.

상기 실시예에서 생산된 새로운 돌연변이 효소가 도입된 이. 콜리 JM109에서 발현되는 새로운 돌연변이 효소는 실시예 15에서 기술한 이. 콜리 JM109/pEPI330의 친화도보다 개선된 이노신의 친화도를 보여준다. 따라서 뉴클레오사이드-5'-포스페이트 에스테르의 생산성이 개선된 것으로 예상된다. 추가로, 이. 콜리 JM109/pEPI380에서 발현된 돌연변이 효소는 야생형 효소와 비교하여 이노신에 대한 친화도가 개선되었을 뿐만 아니라 Vmax값이 증가한다. 추가로 여전히 뉴클레오사이드-5'-포스페이트 에스테르가 개선된 것을 예상된다.

실시예 20

신규 돌연변이 산 포스파타제 유전자 함유 균주를 사용한 5'-이노신산의 생산

돌연변이 산 포스파타제 유전자를 포함하는 플라스미드가 도입된 각각의 이. 콜리 JM109/pEPI330, 이. 콜리 JM109/pEPI340, 이. 콜리 JM109/pEPI360, 이. 콜리 JM109/pEPI370, 이. 콜리 JM109/pEPI380을 앰피실린 100ug/ml 및 IPTG 1mM을 포함하는 50ml의 L배지에 첨가하고 16시간동안 37℃에서 배양한다.

파이로인산(15g/dl) 및 이노신 8g/dl을 아세테이트 완충액(pH 4.0)중에 용해시킨다. 상기 언급한 돌연변이 및 야생형 산 포스파타제 유전자가 도입된 이. 콜리 JM109 균주를 용액에 첨가하여 건조 세포 중량을 기준으로 세포 농도가 200mg/dl이 되게한다. 반응을 35℃에서 32시간동안 수행하면서 pH를 4.0으로 유지하고 시간 경과동안 5'- 이노신산의 양을 측정한다. 형성된 이노신산은 5'-이노신산이고 부산물로서 2'-이노신산 및 3'-이노신산의 형성은 전혀 관찰되지 않는다. 결과는 도 8에 나타낸다.

실시예 15에서 기술한 이. 콜리 JM109/pEPI330은 대량의 5'-이노신산의 축적을 나타낸다. 기질이 아직 남아있다 할지라도 5'-이노신산의 형성은 축적된 5'-이노신산의 양이 7.5g/dl에 도달할 때 종료되어 5'-이노신산의 양은 더 이상 증가되지 않는다. 반대로, 신규 돌연변이 산 포스파타제 유전자 함유 균주는 대향으로 축적된 5'-이노신산을 제공한다. 특히, 이. 콜리 JM109/pEPI370 및 이. 콜리 JM109/pEPI380을 사용한 반응에서, 대향으로 축적된 5'-이노신산이 제공된다. 추가로, 반응율은 높고 5'-이노신산의 생산성이 크게 개선되는 것을 보여준다. 특히, 이. 콜리 JM109/pEPI380에서 반응율은 높고 매우 높은 반응성을 보여준다.

실시예 21

신규 돌연변이 산 포스파타제 유전자 함유 균주를 사용한 다양한 노클레오사이드-5'-포스페이트 에스테르의 생산

신규 돌연변이 산 포스파타제 유전자를 함유한 플라스미드가 도입된 이. 콜리 JM109/pEPI330을 앰피실린 100ug/ml 및 IPTG 1mM을 포함하는 L배지 50ml에 접종하고 16시간동안 37℃에서 배양한다.

파이로인산(15g/dl) 및 포스페이트 수용체로서 이노신, 구아닌, 우리딘 또는 시티딘 8g/dl을 100mM 아세테이트 완충액(pH 4.5)중에 용해시킨다. 여기서 상기 언급한 균주를 첨가하여 건조 세포 중량을 기준으로 세포 농도가 100mg/dl에 이르도록한다. 12시간동안 35℃에서 반응을 수행하면서 pH를 4.0으로 유지한다. 형성된 뉴클레오사이드-5'-포스페이트 에스테르의 양은 표 4에 나타낸다. 뉴클레오사이드와 함께 인산화를 진행시켜 상응하는 뉴클레오사이드-5'-포스페이트 에스테르를 형성하고 축적한다. 형성된 뉴클레오타이드는 단지 뉴클레오사이드-5'-포스페이트 에스테르이고 부산물로서 뉴클레오사이드-2'-포스페이트 에스테르 및 뉴클레오사이드-3'-포스페이트 에스테르의 형성은 전혀 관찰되지 않는다.

[표 14]

실시예 22

포스페이트 공여체로서 신규 산 포스파타제 유전자 함유 균주 및 다양한 인산 화합물을 사용한 5'-이노신산의 생산

신규 돌연변이 산 포스파타제 유전자를 포함하는 플라스미드가 도입된 이. 콜리 JM109/pEPI380을 앰피실린 100ug/ml 및 IPTG 1mM을 포함하는 L배지 50ml에 접종하고 16시간동안 37℃에서 배양한다.

이노신(6g/dl) 및 트리폴리포스페이트, 폴리포스페이트(폴리곤 P, 치요다카가쿠 케이. 케이.의 상품에 대한 상표명), 이나트륨 페닐아세테이트 또는 이나트륨 카바밀포스페이트를 100-mM 아세테이트 완충액(pH 4.0)중에 용해시킨다. 여기서 상기 언급한 균주를 첨가하여 건조 세포 중량을 기준으로 세포 농도가 100mg/dl에 이르도록한다. 12시간동안 35℃에서 반응을 수행하면서 pH를 4.0으로 유지한다. 형성된 뉴클레오사이드-5'-포스페이트 에스테르의 양은 표 15에 나타낸다. 임의의 포스페이트 공여체와 함께 우수한 효율로 5'-이노신산이 형성되고 축적된다. 특히, 폴리포스페이트가 포스페이트 공여체로서 사용될 때 5'-이노신산이 대량으로 축적된다.

[표 15]

실시예 23

프로비덴시아 스투아르티의 염색체로부터 유래된 산 포스파타제 유전자의 추출 및 유전자의 뉴클레오타이드 서열의 결정

서열 목록의 서열 19 및 20에서 설명된 뉴클레오타이드를 갖는 올리고뉴클레오타이드인 PRP1 및 PRP2를 각각 합성한다. 이들 올리고뉴클레오타이드는 프로비덴시아 스투아르티(EMBL 승인 번호 x64820의 데이터베이스)의 산 포스파타제를 암호화는 유전자의 공지된 뉴클레오타이드 서열을 기초로하여 프로비덴시아 스투아르티의 산 포스파타제를 암호화하는 유전자를 증폭시키도록 디자인되어 있다.

염색체 DNA를 무레이 및 톰슨[참조: Nucl. Acid ReS., 4321, 8(1980)]의 방법에 따라 프로비덴시아 스투아르티 ATCC 29851의 배양된 미생물 세포로부터 추출한다. 주형으로서 염색체 DNA(0.1ng), 프라이머로서 올리고뉴클레오타이드 PRP1 및 PRP2(각각 2.5umol) 및 Taq DNA 폴리머라제(2.5 유니트, 타카라 슈조에 의해 제조됨)를 dATP, dCRTP, dGTP, dTTP(각각 200uM), 염화 칼륨(50mM), 및 염화 마그네숨(1.5mM)을 포함하는 100mM 트리스-HCl 완충액(pH 8.3, 100㎕)에 첨가하여 94℃에서 30초, 55℃에서 2분, 및 72℃에서 3분으로 구성되는 한 사이클을 30회 반복한다. 반응 용액을 한천로스 전기영동한 다음 유리 분말(다카라 슈조에 의헤 제조됨)을 사용하여 약 1kbp의 증폭된 DNA 단편을 회수한다. 유전자 단편을 BamHI로 분해가고 BamHI로 분해된 pUC118로 결합한다. 상기 기술한 바와 같이 수득한 플라스미드를 pPRP100으로서 지정한다.

pPRP100이 도입된 형질전환체인 에스케리치아 콜리 JM109/pPRP100의 포스포모노에스터라제 활성 및 트랜스인산화 활성을 측정한다. 결과로서, 균주는 뉴클레오사이드로 트랜스인산화시키는 활성 뿐만 아니라 포스포모노에스터라제 활성을 보여준다.

플라스미드를 알카린 용균 방법에 따라 에스케리치아 콜리 M109/pPRP100으로부터의 형질전환체로부터 추출하여 뉴클레오타이드 서열을 결정한다. 결정된 개방 판독 프레임의 뉴클레오타이드 서열 및 뉴클레오타이드 서열로부터 추론된 단백질의 아미노산 서열은 목록의 서열 21 및 22에 보여진다. 개방 판독 프레임의 뉴클레오타이드 서열은 프로비덴시아 스투아르티의 공지된 산 포스파타제 유전자의 뉴클레오타이드 서열과 완전히 일치한다.

실시예 24

엔테로박터 에메로게네스, 클렙시엘라 프랜티콜라 및 세라티아 피카리다 염색체로부터 유래된 산 포스파타제 유전자의 추출 및 유전자의 뉴클레오타이드 서열의 결정

염색체 DNA를 무레이 및 톰슨[참조: Nucl. Acid Res., 4321, 8(1980)]의 방법에 따라 엔테로박터 에메로게네스 IFO 12010, 크렙시엘라 플란티콜라 IFO 14939 및 세라티아 피카리다 IAM 13540의 배양된 세포로부터 추출한다. 이어서, 실시예 7(2)에 기술한 방법에 따라, 에스케리치아 콜리 JM109의 약 20,000으로 구성되는 염색체 유전자 발현 라이브러리를 만들고 검색하여 트랜스인산화 활성을 보여주는 형질전환체를 수득한다. 이들 각각의 형질전환체는 각각의 고유 균주로부터 유래된 산 포스파타제 유전자를 함유한다.

알카린 용균 방법에 따라 엔테로박터 에메로게네스 IFO 12010에서 유래한 산 포스파타제 유전자를 함유한 것으로 여겨지는 에스케리치아 콜리의 형질전환체중 하나로부터 플라스미드 DNA를 추출하고 플라스미드의 삽입된 DNA를 분석한다. 상기 플라스미드를 pENP100으로서 지정한다. 엔테로박터 에메로게네스 IFO 12010으로부터 유래된 삽입된 DNA의 제한 효소 지도는 도 9에 나타낸다.

서브클로닝에 의해 산 포스파타제 유전자의 영역을 특정화한 결과로서 산 포스파타제 유전자가 제한 효소인 SalI 및 KpnI에 의해 절단된 1.6kbp 단편에 함유되어 있다는 것을 제안한다. 따라서 SalI-KpnI 단편을 SalI 및 KpnI로 분해한 pUC118와 결합시켜 플라스미드를 작제한다. 수득한 플라스미드를 pENP110으로서 지정한다.

상기 기술한 방법에 따라서 알카린 용균 방법에 따라 크렙시엘라 플란티콜라 IFO 14939에서 유래한 산 포스파타제 유전자를 함유한 것으로 여겨지는 에스케리치아 콜리의 형질전환체중 하나로부터 플라스미드 DNA를 추출하고 플라스미드의 삽입된 DNA를 분석한다. 상기 플라스미드를 pENP100으로서 지정한다. 크렙시엘라 플란티콜라 IFO 14939로부터 유래된 삽입된 DNA의 제한 효소 지도는 도 10에 나타낸다.

서브클로닝에 의해 산 포스파타제 유전자의 영역을 특정화한 결과로서 산 포스파타제 유전자가 제한 효소인 KpnI 및 EcoRI에 의해 절단된 2.2kbp 단편에 함유되어 있다는 것을 제안한다. 따라서 KpnI EcoRI 단편을 KpnI 및 EcoRI로 분해한 pUC118와 결합시켜 플라스미드를 작제한다. 수득한 플라스미드를 pKLP110으로서 지정한다.

유사하게, 알카린 용균 방법에 따라 세라티아 피카리아 IAM 13540에서 유래한 산 포스파타제 유전자를 함유한 것으로 여겨지는 에스케리치아 콜리의 형질전환체중 하나로부터 플라스미드 DNA를 추출하고 플라스미드의 삽입된 DNA를 분석한다. 상기 플라스미드를 pSEP100으로서 지정한다. 세라티아 피카리아 IAM 13540으로부터 유래된 삽입된 DNA의 제한 효소 지도는 도 11에 나타낸다.

서브클로닝에 의해 산 포스파타제 유전자의 영역을 특정화한 결과로서 산 포스파타제 유전자가 제한 효소인 HindIII에 의해 절단된 1.4kbp 단편에 함유되어 있다는 것을 제안한다. 따라서 HindIII 단편을 HindIII로 분해한 pUC118와 결합시켜 플라스미드를 작제한다. 수득한 플라스미드를 pSEP110으로서 지정한다.

따라서, 플라스미드 DNA를 형질전환체인 에스케리치아 콜리 JM109/pENP110, 에스케리치아 콜리 JM109/pKLP110 및 에스케리치아 콜리 JM109/pSEP110으로부터 추출하고 여기에 pENP110, pKLP110 및 pSEP110을 알카린 용균 방법에 따라 각각 도입한다. 이들 플라스미드의 삽입체의 뉴클레오타이드 서열은 실시예 8에서 기술한 방법에 따라서 결정한다. 결정된 삽입체의 개방 판독 프레임의 뉴클레오타이드 서열은 엔테로박터 에메로게네스 IFO 12010에 대해서는 서열 23, 크렙시엘라 플란티 콜라 IFO 14939에 대해서는 서열 25 및 세라티아 피카리아 IAM 13540에 대해서는 서열 27에 나타낸다. 추가로 추론된 아미노산 서열은 서열 24, 서열 26 및 서열 28에 각각 나타낸다. 이들 단편을 포함한 플라스미드를 함유한 형질전환체는 트랜스인산화 활성을 나타내고 이들 개방 판독 프레임이 목적하는 산 포스파타제 유전자인 것이 확인된다.

뉴클레오타이드 서열 및 추론된 아미노산 서열을 각각 상동성에 대해 공지된 서열과 비교한다. EMBL 및 SWISS-PROT의 데이터 베이스를 사용한다. 결과로서, 이것은 서열 목록의 서열 23, 25 및 27에 나타낸 유전자가 신규한 유전자라는 것을 밝힌다. 엔테로박터 에메로게네스 IFO 12010에서 유래한 유전자에 의해 암호화된 단백질이 248개의 아미노산 잔기로 구성되고 크렙시엘라 플랜티콜라 IFO 12010에서 유래한 유전자에 의해 암호화된 단백질이 248개의 아미노산 잔기로 구성되며 세라티아 피카리아 IAM 13540에서 유래한 유전자에 의해 암호화된 단백질이 244개의 아미노산으로 구성되는 것으로 추정된다. 이들 단백질의 모르가넬라 모르가니 및 에스케리치아 블래태에서 유래산 산 포스파타제와 같은 전구체 단백질일 수 있는 가능성이 있다.

뉴클레오타이드 서열에서 추론된 아미노산 서열은 실시예 8에서 수득한 모르가넬라 모르가니 NCIMB 10466에서 유래한 산 포스파타제의 추론된 아미노산 서열, 실시예 12에서 수득한 에스케리치아 블래태 JCM 1650의 아미노산 서열 및 프로비덴시아 스튜아티(EMBL 승인번호 X64820)의 산 포스파타제의 공지된 아미노산 서열과 함께 한 문자로 도 12에 나타낸다. 모든 아미노산 서열 중 일반적인 아미노산 잔기를 도 12에 서열하에 별표로 표시한다.

도 12에 나타낸 바와 같이 6개의 균주중에서 유래한 산 포스파타제의 아미노산 서열은 서로간에 상당한 상동성을 나타내며 130개의 아미노산 잔기가 모든 아미노산 서열중에 공통인 것으로 나타난다. 따라서, 산 포스파타제가 유사한 기능을 갖는 것으로 추정된다.

실시예 25

엔테로박터 에메로게네스, 크렙시엘라 플란티콜라 및 세라티아 피카리아에서 유래한 산 포스파타제의 유전자를 발현시킴에 의한 활성의 증폭

실시예 23에서 작제된 에스케리치아 콜리 JM109/pPRP100, 실시예 24에서 작제한 에스케리치아 콜리 JM109/pENP110, 에스케리치아 콜리 JM109/pKLP110 및 에스케리치아 콜리 JM109/pSEP110을 앰피실린 100ug/ml 및 IPTG 1mM를 포함하는 L-배지에 접종하고 16시간동안 37℃에서 배양시킨다.

미생물 세포를 원심분리하여 이들 배양물에서 수거하고 이들을 생리 식염수로 1회 세척한다. 미생물 세포를 인산 칼륨 완충액(5ml, pH 7.0)중에 현탁시키고 이들을 20분동안 4℃에서 초음파 처리로 파쇄한다. 처리된 용액을 원심분리하여 불용성 분취물을 제거함에 이어서 세포 유리 추출물을 제조한다.

수득한 세포 유리 추출물의 트랜스인산화 활성을 측정하면서 상기 기술한 것과 동일한 방법으로 플라스미드 pUC118로 형질전환된 프로비덴시아 스투아르티 ATCC 29851, 엔테로박터 에메로게네스 IFO 12010, 크렙시엘라 플란티콜라 IFO 14939, 세라티아 피카리아 IAM 13450 및 에스케리치아 콜리 JM109에서 제조한 세포 유리 추출물의 대조구를 사용한다. 결과는 표 16에 나타낸다. 프렌스인산화 활성은 모든 야생형 균주에서 낮다. 트랜스인산화 활성은 에스케리치아 콜리 JM109/pUC118중에서 검출되지 않는다. 또 다른 한편, 산 포스파타제 유전자가 도입된 에스케리치아 콜리 JM109의 형질전환체는 야생형 균주와 비교하여 높은 트랜스인산화 활성을 보여준다. 결과에 따라서 도입된 DNA 단편 각각은 에스케리치아 콜리가 고농도로 산 포스파타제를 발현하도록 한다는 것이 입증되었다.

[표 16]

실시예 26

개선된 온도 안정성을 가지는 돌연변이 포스파타제 유전자의 생산

실시예 20, 21 및 22에서 기술한 바와 같이 실시예 19에서 제조된 이. 블래태-유래된 돌연변이 산 포스파타제 유전자 함유 균주는 상당한 양의 산 포스파타제를 발현한다. 상기 균주를 사용한 파이로인산 및 이노신으로부터의 5'-이노신산의 생산에 있어서, 고전환율로 5'-이노신산이 형성되고 축적된다. 상기 산 포스파타제의 최적 반응 온도는 35℃이다. 그러나, 상기 반응이 보다 높은 온도에서 수행되는 경우 반응율은 증가하고 반응 용액중에 포스페이트 수용체의 뉴클레오사이드 농도를 증가켜 반응을 수행한다. 따라서, 뉴클레오사이드-5'-포스페이트 에스테르가 짧은 시간동안 보다 효과적으로 제조될 수 있다고 예상된다. 따라서, 효소의 온도 안정성은 실시예 19에서 클론된 이. 블래태-유래 산 포스파타제 유전자를 PCR을 사용한 부위 특이적 돌연변이 방법으로 돌연변이시켜 개선된다.

실시예 19에서 기술한 이. 블래태 JCM1650-유래 돌연변이 산 포스파타제를 암호화하는 유전자를 포함하는 플라스미드 pEPI380을 사용하고 유전자 조작 기술 방법으로 부위 특이적 돌연변이를 상기 플라스미드 DNA에 도입하여 증가된 온도 안정성을 갖는 돌연변이 산 포스파타제를 암호화하는 유전자를 생산한다. pEPI380은 이. 블래태 JCM1650에서 유래되고 제한 엔도뉴클레아제 ClaI 및 BamHI로 절단시킨 돌연변이 산 포스파타제를 암호화는 유전자를 포함한 2.4kb의 DNA 단편을 ClaI 및 BamHI로 절단시킨 p블루스크립트 KS(+)(스트라타겐에 의해 공급됨)에 결합시킴으로서 수득한 플라스미드 DNA이다. 산 포스파타제를 암호화하는 유전자의 염기 서열로부터 예상되는 성숙한 단백질의 아미노산 서열은 서열 목록의 서열 8에 의해 나타낸 서열중에 실시예 19의 표 12에 나타낸 11개의 아미노산 잔기라고 추정된다.

서열 표에 나타낸 서열을 갖는 올리고뉴클레오타이드 MUT300(서열 목록의 서열 9), MUT400(서열 목록의 서열 29) 및 MUT410(서열 목록의 서열 30)을 DNA 합성기(어플라이드 바이오시스템에 의해 공급된 모델 394)를 사용한 포스포아미디트 방법으로 합성한다.

성숙한 돌연변이의 104번째 글루탐산 잔사(GAG)가 글라이신 전기(GG^*T^*)로 대체된 돌연변이 포스파타제를 암호화하는 돌연변이 유전자를 돌연변이 시키기 위해 주형으로서 실시예 19에 기술한 pEPI380을 사용사고 프라이머로서 MUT330 및 MUT410을 사용하는 실시예 15에서와 같이 PCR을 사용한 방법으로 제조한다. 상기 돌연변이 유전자 함유 플라스미드는 pEPI410으로 지정한다. 마찬가지로 151번째 트레오닌 잔기(ACC)가 알라닌 잔기(G^*CC)로 대체된 돌연변이 포스파타제를 암호화하는 돌연변이 유전자를 돌연변이 시키기 위해 주형으로서 pEPI380을 사용하고 프라이머로서 올리고뉴클레오타이드 MUT300, MUT310 및 MUT420을 사용하여 제조한다. 상기 돌연변이 유전자 함유 플라스미드를 pEPI420으로 지정한다.

알카리 세균용균 방법에 의해 돌연변이 포스파타제 유전자를 포함하는 플라스미드 pEPI410 및 pEPI420가 도입된 이. 콜리 JM109의 형질전환체로부터의 플라스미드를 제조하고 염기서열을 결정하며 목적하는 염기가 대체되었는지를 확인한다.

상기 실시예에서 제조된 바와 같은 돌연변이 산 포스파타제 유전자가 도입된 각각의 이. 콜리 JM109/pEPI410 및 이. 콜리 JM109/pEPI420 및 실시예 19에서 기술한 이. 콜리 JM109/pEPI380을 앰피실린 100ug/ml 및 IPTG 1mM을 포함한 L-배지 50ml에 접종하고 16시간동안 37℃에서 배양한다. 세포를 각각의 균주 배양액50ml로부터 세포를 수거하고 생리 식염수로 1회 세척한다. 이들 세포를 100mM 포스페이트 완충액(pH 7.0) 5ml에 현탁시키고 20분동안 4℃에서 초음파 처리하여 세포를 파쇄시킨다. 처리된 용액을 원심분리하여 불용성 분획물에 제거하고 세포 유리 추출물을 제조한다.

균주 각각에서 형성된 세포 유리 추출물을 pH 7.0에서 30분동안 0℃ 내지 80℃의 온도 범위에서 가온시킨다. 기온시킨후 트랜스인산화를 다양한 온도에서 처리된 세포 유리 추출물을 사용하여 pH 4.0 및 30℃ 표준 반응 조건하에서 트랜스인산화를 수행하고 잔여 활성을 측정한다. 결과는 도 13에 나타낸다. 실시예 19에서 발현된 돌연변이 효소는 30분동안 40℃처리에서 안정하지만 활성의 감소는 보다 높은 온도에서 관찰된다. 반대로 상기 실시예에서 제조된 신규한 돌연변이 효소 유전자가 도입된 이.콜리 JM109/pEPI410 및 이. 콜리 JM109/pEPI420에서 발현된 신규한 돌연변이 효소의 온도 안정성이 개선되었고 활성의 감소는 30분동안 50℃에서 처리과정중에서도 관찰되지 않았다. 따라서 뉴클레오사이드-5'-포스페이트 에스테르가 높은 온도에서 이들 균주를 사용하여 제조되고 생산성이 추가로 개선되었다는 것이 예상된다.

실시예 27

개선된 온도 안정성을 가지는 돌연변이 산 포스파타제 유전자 함유 균주를 사용한 5'-이노신산 및 5'-구아닐산의 생산

돌연변이 산 포스파타제 유전자가 도입된 각각의 이. 콜리 JM109/pEPI410 및 이. 콜리 JM109/pEPI420 및 실시예 19에서 기술한 이. 콜리 JM109/pEPI380을 앰피실린 100ug/ml 및 IPTG 1mM을 포함한 L-배지 50ml에 접종하고 16시간동안 37℃에서 배양한다.

파이로인산(15g/dl) 및 이노신 또는 구아노신 8g/dl을 아세테이트 완충액(pH 4.0)중에 용해시킨다. 여기에 각각의 돌연변이 산 포스파타제 유전자가 도입된 이. 콜리 JM109 균주를 첨가하여 농도가 건조 세포 중량을 기준으로 100mg/dl이 되도록한다. 50℃에서 9시간동안 반응을 수행하면서 pH를 4.0으로 유지시키고 형성된 5'-아미노산 또는 5'-구이닐산의 양을 측정한다. 결과는 표 17에 나타낸다. 형성된 뉴클레오사이드 포스페이트 에스테르는 단지 뉴클레오사이드-5'-포스페이트 에스테르이고 부산물로서 뉴클레오사이드-2'-포스페이트 에스테르 및 뉴클레오사이드-3'-포스페이트 에스테르의 생성이 전혀 관찰되지 않는다. 또한 반응을 대조구로서 이.콜리 JM109/pEPI380을 사용하여 12시간동안 35℃에서 수행한다. 또한 결과는 표 17에 나타낸다.

실시예 21에서 기술한 바와 같이, 뉴클레오사이드-5'-포스페이트 에스테르가 효과적으로 이.콜리 JM109/pEPI380과 함께 형성되고 축적된다. 반대로 실시예 26에서 제조된 바와 같은 이. 블래태에서 유래된 신규한 돌연변이 산 포스파타제 유전자가 도입된 이. 콜리 JM109/pEPI410 및 이. 콜리 JM109/pEPI420을 사용하여 반응을 수행하는 경우 동일량의 5'-이노신산 또는 5'-구아닐산이 형성되고 짧은 시간동안 축적된다. 따라서, 뉴클레오사이드-5'-포스페이트 에스테르가 보다 효과적으로 생산될 수 있다. 특히 이. 콜리 JM109/pEPI420을 사용하는 경우 반응시간이 단축될 뿐만 아니라 5'-이노신산 및 5'-구아닐산이 대량으로 축적되고 매우 높은 생산성을 나타낸다.

[표 17]

서열목록

서열 1에 대한 정보:

(ⅰ) 서열 특징:

(A) 길이: 20개의 아미노산

(B) 유형: 아미노산

(D) 형태: 선형

(ⅱ) 분자유형: 펩티드

(ⅴ) 단백질 단편 유형: N-말단

(ⅵ) 공급원:

(A) 유기체: 모르가넬라 모르가니

(B) 균주: NCIMB 10466

(xi) 서열 기술:

[서열 1]

서열 2에 대한 정보;

(ⅰ) 서열 특징:

(A) 길이: 750개의 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 쇄: 이본쇄

(D) 형태: 선형

(ⅱ) 분자유형: 게놈 DNA

(ⅲ) 가설: 없음

(ⅳ) 앤티센스: 없음

(ⅵ) 공급원:

(A) 유기체: 모르가넬라 모르가니

(B) 균주: NCIMB 10466

(ⅸ) 특징:

(A) 명칭/키이: CDS

(B) 위치: 1..747

(ⅸ) 특징

(A) 명칭/키이: sig_펩티드

(B) 위치: 1..60

(ⅸ) 특징:

(A) 명칭/키이: mat_펩티드

(B) 위치: 61..747

(xi) 서열기술:

[서열 2]

서열 3에 대한 정보:

(ⅰ) 서열 특징:

(A) 길이: 249개의 염기쌍

(B) 유형: 아미노산

(D) 형태: 선형

(ⅱ) 분자유형: 단백질

(ⅵ) 공급원:

(A) 유기체: 모르가넬라 모르가니

(B) 균주: NCIMB 10466

(xi) 서열기술:

[서열 3]

서열 4에 대한 정보:

(ⅰ) 서열 특징:

(A) 길이: 229개의 염기쌍

(B) 유형: 아미노산

(D) 형태: 선형

(ⅱ) 분자유형: 단백질

(ⅵ) 공급원:

(A) 유기체: 모르가넬라 모르가니

(B) 균주: NCIMB 10466

(xi) 서열 기술:

[서열 4]

서열 5에 대한 정보:

(ⅰ) 서열 특징:

(A) 길이: 15개의 염기쌍

(B) 유형: 아미노산

(D) 형태: 선형

(ⅱ) 분자유형: 펩티드

(ⅴ) 단백질 단편 유형: N-말단

(ⅵ) 공급원:

(A) 유기체: 에스케리치아 블라태

(B) 균주: JCM 1650

(xi) 서열 기술:

[서열 5]

서열 6에 대한 정보:

(ⅰ) 서열 특징:

(A) 길이: 750개의 염기쌍

(B) 유형: 아미노산

(C) 쇄: 이본쇄

(D) 형태: 선형

(ⅱ) 분자유형: 게놈 DNA

(ⅲ) 가설: 없음

(ⅳ) 앤티센스: 없음

(ⅵ) 공급원:

(A) 유기체: 에스케리치아 블라태

(B) 균주: JCM 1650

(ⅸ) 특징:

(A) 명칭/키이: CDS

(B) 위치: 1..747

(ⅸ) 특징

(A) 명칭/키이: sig_펩티드

(B) 위치: 1..54

(ⅸ) 특징:

(A) 명칭/키이: mat_펩티드

(B) 위치: 55..747

(xi) 서열 기술:

[서열 6]

서열 7에 대한 정보:

(ⅰ) 서열 특징:

(A) 길이: 249개의 염기쌍

(B) 유형: 아미노산

(D) 형태: 선형

(ⅱ) 분자유형: 단백질

(ⅵ) 공급원:

(A) 유기체: 에스케리치아 블라태

(B) 균주: JCM 1650

(xi) 서열 기술:

[서열 7]

서열 8에 대한 정보:

(ⅰ) 서열 특징:

(A) 길이: 231개의 아미노산

(B) 유형: 아미노산

(D) 형태: 선형

(ⅱ) 분자유형: 단백질

(ⅵ) 공급원:

(A) 유기체: 에스케리치아 블라태

(B) 균주: JCM 1650

(xi) 서열 기술:

[서열 8]

서열 9에 대한 정보:

(ⅰ) 서열 특징:

(A) 길이: 20개의 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 쇄: 이본쇄

(D) 형태: 선형

(ⅱ) 분자유형: 다른 DNA..합성 DNA

(ⅲ) 가설: 없음

(ⅳ) 앤티센스: 없음

(xi) 서열 기술:

[서열 9]

CCTCGAGGTC GACGGTATCG20

서열 10에 대한 정보:

(ⅰ) 서열 특징:

(A) 길이: 21개의 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 쇄: 일본쇄

(D) 형태: 선형

(ⅱ) 분자유형: 다른 DNA..합성 DNA

(ⅲ) 가설: 없음

(ⅳ) 앤티센스: 없음

(xi) 서열 기술:

[서열 10]

ATTCGCCACA TCGCCACTGC T21

서열 11에 대한 정보:

(ⅰ) 서열 특징:

(A) 길이: 22개의 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 쇄: 일본쇄

(D) 형태: 선형

(ⅱ) 분자유형: 다른 DNA..합성 DNA

(ⅲ) 가설: 없음

(ⅳ) 앤티센스: 없음

(xi) 서열 기술:

[서열 11]

TAGCCCAGCC GGTAGAGGTA TG22

서열 12에 대한 정보:

(ⅰ) 서열 특징:

(A) 길이: 23개의 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 쇄: 일본쇄

(D) 형태: 선형

(ⅱ) 분자유형: 다른 DNA..합성 DNA

(ⅲ) 가설: 없음

(ⅳ) 앤티센스: 없음

(xi) 서열 기술:

[서열 12]

TGCATCTGCC TDCGCCTGCT TAC23

서열 13에 대한 정보:

(ⅰ) 서열 특징:

(A) 길이: 20개의 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 쇄: 일본쇄

(D) 형태: 선형

(ⅱ) 분자유형: 다른 DNA..합성 DNA

(ⅲ) 가설: 없음

(ⅳ) 앤티센스: 없음

(xi) 서열 기술:

[서열 13]

AACGCGCCGT AGAAAGCATT20

서열 14에 대한 정보:

(ⅰ) 서열 특징:

(A) 길이: 21개의 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 쇄: 일본쇄

(D) 형태: 선형

(ⅱ) 분자유형: 다른 DNA..합성 DNA

(ⅲ) 가설: 없음

(ⅳ) 앤티센스: 없음

(xi) 서열 기술:

[서열 14]

GTCCTGGTCT TTGGTATTAC A21

서열 15에 대한 정보:

(ⅰ) 서열 특징:

(A) 길이: 26개의 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 쇄: 일본쇄

(D) 형태: 선형

(ⅱ) 분자유형: 다른 DNA..합성 DNA

(ⅲ) 가설: 없음

(ⅳ) 앤티센스: 없음

(xi) 서열 기술:

[서열 15]

CACATCGCCA GCGGCCAGGT CTGCAT26

서열 16에 대한 정보:

(ⅰ) 서열 특징:

(A) 길이: 21개의 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 쇄: 일본쇄

(D) 형태: 선형

(ⅱ) 분자유형: 다른 DNA..합성 DNA

(ⅲ) 가설: 없음

(ⅳ) 앤티센스: 없음

(xi) 서열 기술:

[서열 16]

GCATATAGTG TTCTTTCGCG C21

서열 17에 대한 정보:

(ⅰ) 서열 특징:

(A) 길이: 22개의 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 쇄: 일본쇄

(D) 형태; 선형

(ⅱ) 분자유형: 다른 DNA..합성 DNA

(ⅲ) 가설: 없음

(ⅳ) 앤티센스: 없음

(xi) 서열 기술:

[서열 17]

ATTACAGGTT TCGACCCCAT AA22

서열 18에 대한 정보:

(ⅰ) 서열 특징:

(A) 길이: 25개의 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 쇄: 일본쇄

(D) 형태: 선형

(ⅱ) 분자유형: 다른 DNA..합성 DNA

(ⅲ) 가설: 없음

(ⅳ) 앤티센스: 없음

(xi) 서열 기술:

[서열 18]

TGATGCATGT CCGGGCTGTC TTTTT25

서열 19에 대한 정보:

(ⅰ) 서열 특징:

(A) 길이: 25개의 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 쇄: 일본쇄

(D) 형태: 선형

(ⅱ) 분자유형: 다른 DNA..합성 DNA

(ⅲ) 가설: 없음

(ⅳ) 앤티센스: 있음

(xi) 서열 기술:

[서열 19]

CTGGATCCTG TGGCTATCAT CACCT25

서열 20에 대한 정보:

(ⅰ) 서열 특징:

(A) 길이: 25개의 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 쇄: 일본쇄

(D) 형태: 선형

(ⅱ) 분자유형: 다른 DNA..합성 DNA

(ⅲ) 가설: 없음

(ⅳ) 앤티센스: 없음

(xi) 서열 기술:

[서열 20]

CTGGATCCGA CGCGATTTTA CCATA25

서열 21에 대한 정보:

(ⅰ) 서열 특징:

(A) 길이: 747개의 염기쌍

(B) 유형: 아미노산

(C) 쇄: 이본쇄

(D) 형태: 선형

(ⅱ) 분자유형: 게놈 DNA

(ⅲ) 가설: 없음

(ⅳ) 앤티센스: 없음

(ⅵ) 공급원:

(A) 유기체: 프로비덴시마 스투아르티

(B) 균주: ATCC 29851

(ⅸ) 특징:

(A) 명칭/키이: CDS

(B) 위치: 1..744

(xi) 서열 기술:

[서열 21]

서열 22에 대한 정보:

(ⅰ) 서열 특징:

(A) 길이: 248개의 아미노산

(B) 유형: 아미노산

(D) 형태: 선형

(ⅱ) 분자유형: 단백질

(ⅵ) 공급원:

(A) 유기체: 프로비덴시마 스투아르티

(B) 균주: ATCC 29851

(xi) 서열 기술:

[서열 22]

서열 23에 대한 정보:

(ⅰ) 서열 특징:

(A) 길이: 744개의 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 쇄: 이본쇄

(D) 형태; 선형

(ⅱ) 분자유형: 게놈 DNA

(ⅲ) 가설: 없음

(ⅳ) 앤티센스: 없음

(ⅵ) 공급원:

(A) 유기체: 엔테로박터 에메로게네스

(B) 균주: IFO 12010

(ⅸ) 특징:

(A) 명칭/키이: CDS

(B) 위치: 1..744

(xi) 서열 기술:

[서열 23]

서열 24에 대한 정보:

(ⅰ) 서열 특징:

(A) 길이: 248개의 아미노산

(B) 유형: 아미노산

(D) 형태: 선형

(ⅱ) 분자유형: 단백질

(ⅵ) 공급원:

(A) 유기체: 엔테로박터 에메로게네스

(B) 균주: IFO 12010

(xi) 서열 기술:

[서열 24]

서열 25에 대한 정보:

(ⅰ) 서열 특징:

(A) 길이: 747개의 염기쌍

(B) 유형: 아미노산

(C) 쇄: 이본쇄

(D) 형태: 선형

(ⅱ) 분자유형: 게놈 DNA

(ⅲ) 가설: 없음

(ⅳ) 앤티센스: 없음

(ⅵ) 공급원:

(A) 유기체: 클렙시엘라 플란티콜라

(B) 균주: IFO 14939

(ⅸ) 특징:

(A) 명칭/키이: CDS

(B) 위치: 1..747

(xi) 서열 기술:

[서열 25]

서열 26에 대한 정보:

(ⅰ) 서열 특징:

(A) 길이: 248개의 아미노산

(B) 유형: 아미노산

(D) 형태: 선형

(ⅱ) 분자유형: 단백질

(ⅵ) 공급원:

(A) 유기체: 클렙시엘라 플란티콜라

(B) 균주: IFO 14939

(xi) 서열 기술:

[서열 26]

서열 27에 대한 정보:

(ⅰ) 서열 특징:

(A) 길이: 735개의 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 쇄: 이본쇄

(D) 형태: 선형

(ⅱ) 분자유형: 게놈 DNA

(ⅲ) 가설: 없음

(ⅳ) 앤티센스: 없음

(ⅵ) 공급원:

(A) 유기체: 세라티아 피카리아

(B) 균주: IAM 13540

(ⅸ) 특징:

(A) 명칭/키이: CDS

(B) 위치: 1..732

(xi) 서열 기술:

[서열 27]

서열 28에 대한 정보:

(ⅰ) 서열 특징:

(A) 길이: 244개의 아미노산

(B) 유형: 아미노산

(D) 형태: 선형

(ⅱ) 분자유형: 단백질

(ⅵ) 공급원:

(A) 유기체: 세라티아 피카리아

(B) 균주: IAM 13540

(xi) 서열 기술:

[서열 28]

서열 29에 대한 정보:

(ⅰ) 서열 특징:

(A) 길이: 21개의 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 쇄: 일본쇄

(D) 형태: 선형

(ⅱ) 분자유형: 다른 DNA.. 합성 DNA

(ⅲ) 가설: 없음

(ⅳ) 앤티센스: 없음

(xi) 서열 기술:

[서열 29]

CCCGGCGTCA CCAATCATAT T21

서열 30에 대한 정보:

(ⅰ) 서열 특징:

(A) 길이: 21개의 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 쇄: 일본쇄

(D) 형태: 선형

(ⅱ) 분자유형: 다른 DNA..합성 DNA

(ⅲ) 가설: 없음

(ⅳ) 앤티센스: 없음

(xi) 서열 기술:

[서열 30]

GCCGGTAGAG GCATGCCCGG A21

산 포스파타제를 돌연변이시켜 뉴클레오사이드에 대한 친화성과 온도 안정성을 증가시킴으로써 저렴하고 효율적으로 뉴클레오사이드-5'-포스페이트 에스테를 제조할 수 있다.

Claims

뉴클레오사이드에 대한 친화성이 증가되고/증가되거나 온도 안정성이 증가된 산 포스파타제를 pH 3.0 내지 5.5의 조건하에서 뉴클레오사이드 및 포스페이트 그룹 공여체에 작용시켜 뉴클레오사이드-5'-포스페이트 에스테르를 생성시키는 단계 및 이를 수거하는 단계를 포함하는, 뉴클레오사이드-5'-포스페이트 에스테르의 제조방법.
뉴클레오사이드에 대한 친화성이 증가되고/증가되거나 온도 안정성이 증가된 산 포스파타제를 암호화하는 유전자를 포함하는 재조합 DNA로 형질 전환된 미생물을 pH 3.0 내지 5.5의 조건하에서 뉴클레오사이드 및 포스페이트 그룹 공여체에 작용시켜 뉴클레오사이드-5'-포스페이트 에스테르를 생성시키는 단계 및 이를 수거하는 단계를 포함하는, 뉴클레오사이드-5'-포스페이트 에스테르의 제조방법.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 뉴클레오사이드에 대한 Km 값이 100mM 미만인 뉴클레오사이드-5'-포스페이트 에스테르의 제조방법.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 산 포스파타제가 50℃◎서 안정한 뉴클레오사이드-5'-포스페이트 에스테르의 제조방법.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 뉴클레오사이드에 대한 친화성이 증가된 산 포스파타제가 에스케리치아 속, 모그가렐라 속, 프로비덴시아 속, 엔테로박터 속, 클렙시엘라 속 또는 세라티아 속에 속하는 세균으로부터 유도되는 뉴클레오사이드-5'-포스페이트 에스테르의 제조 방법.
제 5 항에 있어서, 산 포스파타제가 서열 목록에서 서열 4, 8, 25, 27, 29 및 31에 나타낸 서열로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열과 사실상 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 산 포스파타제가 서열 목록에서 서열 4, 8, 25, 27, 29 및 31에 나타낸 서열로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열상에서 돌연변이되어 뉴클레오사이드에 대한 친화성이 증가되고/증가되거나 온도 안정성이 증가된 것을 특징으로 하는, 뉴클레오사이드-5'-포스페이트 에스테르의 제조방법.
제 5 항에 있어서, 돌연변이가 63번 류신 잔기, 65번 알라닌 잔기, 66번 글루탐산 잔기, 69번 아스파르트산 잔기, 71번 세린 잔기, 72번 세린 잔기, 74번 글리신 잔기, 85번 세린 잔기, 92번 알라닌 잔기, 94번 알라닌 잔기, 104번 글루탐산 잔기, 116번 아스파르트산 잔기, 130번 세린 잔기, 135번 트레오닌 잔기, 136번 글루탐산 잔기, 151번 트레오닌 잔기 및/또는 153번 이소류신 잔기가 서열 목록에서 서열 8의 또 다른 아미노산으로 치환된 것으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 뉴클레오사이드-5'-포스페이트 에스테르의 제조방법.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 포스페이트 그룹 공여체가 폴리인산 또는 이의 염, 페닐인산 또는 이의 염, 아세틸인산 또는 이의 염 및 카바밀 포스페이트 또는 이의 염으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 뉴클레오사이드-5'-포스페이트 에스테르의 제조방법.
서열 목록에서 서열 4, 8, 25, 27, 29 및 31에 나타낸 서열로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열과 사실상 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 산 포스파타제가 서열 목록에서 서열 4, 8, 25, 27, 29 및 31에 나타낸 서열로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열상에서 돌연변이되어, 뉴클레오사이드에 대한 친화성이 증가되고/증가되거나 온도 안정성이 증가된 것을 특징으로 하는 돌연변이 산 포스파타제.
제 9 항에 있어서, 돌연변이가 63번 류신 잔기, 65번 알라닌 잔기, 66번 글루탐산 잔기, 69번 아스파르트산 잔기, 71번 세린 잔기, 72번 세린 잔기, 74번 글리신 잔기, 85번 세린 잔기, 92번 알라닌 잔기, 94번 알라닌 잔기, 104번 트레오닌 잔기, 116번 아스파르트산 잔기, 130번 세린 잔기, 135번 트레오닌 잔기, 136번 글루탐산 잔기, 151번 트레오닌 잔기 및/또는 153번 이소류신 잔기가 서열 목록에서 서열 8의 또 다른 아미노산으로 치환된 것으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 돌연변이 산 포스파타제.
제 9 항에 따른 산 포스파타제를 암호화하는 유전자.
제 11 항에 따른 유전자를 포함하는 재조합 DNA.
제 12 항에 따른 재조합 DNA를 함유하는 미생물.