KR100458970B1

KR100458970B1 - 뉴클레오사이드-5'-포스페이트에스테르의제조방법

Info

Publication number: KR100458970B1
Application number: KR1019970063122A
Authority: KR
Inventors: 야스히로 미하라; 야스히사 아사노; 다카시 우타가와; 히데아키 야마다
Original assignee: 아지노모토 가부시키가이샤
Priority date: 1996-11-21
Filing date: 1997-11-21
Publication date: 2005-06-17
Also published as: US6015697A; US6207435B1; DE69721213D1; EP0857788A3; BR9705813B1; CN1184157A; JP4304727B2; BR9705813A; KR19980042777A; ES2199330T3; EP0857788B1; EP0857788A2; CN1117870C; JPH10201481A; US20020004590A1; US6355472B2; DE69721213T2

Abstract

뉴클레오사이드-5'-포스페이트 에스테르의 제조방법은 뉴클레오사이드를 생화학적으로 인산화하여 저렴하고 효율적으로 제공된다.

뉴클레오사이드-5'-포스페이트 에스테르는 산 포스파타제, 특히 뉴클레오사이드에 대한 친화성이 증가되고/증가되거나 온도 안정성이 증가된 산 포스파타제 및 산 포스파타제 활성을 갖는 단백질을 암호화하는 유전자가 도입된 미생물을 pH 3.3 내지 5.5의 조건하에서 뉴클레오사이드 또는 폴리인산 또는 이의 염, 페닐인산 또는 이의 염 및 카바밀 포스페이트 및 이의 염으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 포스페이트 그룹 공여체 상에 작용시켜 뉴클레오사이드-5'-포스페이트 에스테르를 생성시켜 이를 수거함으로서 제조한다.

Description

뉴클레오사이드-5'-포스페이트 에스테르의 제조방법

본 발명은 뉴클레오사이드-5'-포스페이트 에스테르를 제조하는 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 신규한 산 포스파타제, 산 포스파타제를 암호화하는 유전자, 유전자를 함유하는 재조합 DNA, 및 뉴클레오사이드-5'-포스페이트 에스테르를 제조하는데 유용한 재조합 DNA를 갖는 미생물에 관한 것이다. 뉴클레오사이드-5'-포스페이트 에스테르는 조미료, 약제 및 이러한 기질을 제조하기 위한 원료로서 유용하다.

p-니트로페닐인산을 사용하는 방법(일본 특허공보 제39-29858호), 무기 인산을 사용하는 방법(일본 특허공보 제42-1186호), 폴리인산을 사용하는 방법(일본 공개특허공보 제53-56390호), 아세틸인산을 사용하는 방법(일본 공개특허공보 제56-82098호) 및 아데노신 트리포스페이트(ATP)를 사용하는 방법(일본 공개특허공보 제63-230094호)을 포함하여, 포스페이트 그룹 공여체를 사용하여 뉴클레오사이드를 생화학적으로 인산화함으로써 뉴클레오사이드-5'-포스페이트 에스테르를 제조하는 방법은 공지되어 있다. 그러나, 이들 방법은 사용할 기질이 값비싸거나, 반응에서 부산물이 생성되기 때문에 뉴클레오사이드-5'-포스페이트 에스테르를 효율적이고 저렴하게 제조하는데는 불만족스러웠다.

따라서, 본 발명자들은 특정 미생물의 세포를 산성 조건하에서 뉴클레오사이드, 및 폴리인산 또는 이의 염, 페닐인산 또는 이의 염 및 카바밀 포스페이트 또는 이의 염으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 포스페이트 그룹 공여체에 작용시켜, 부산물인 2'- 및 3'-뉴클레오타이드 이성체를 생성시키지 않으면서 뉴클레오사이드-5'-포스페이트 에스테르를 효율적으로 제조하는 방법을 개발하였다(일본 공개특허공보 제7-231793호).

그러나, 이러한 방법도 다음의 결점을 갖는다 즉, 예를 들면, 공교롭게도 사용될 생물의 세포에 미량으로 존재하는 뉴클레오사이드-분해 활성으로 인해 기질의 일부분이 반응 동안에 분해된다. 더욱이, 반응이 연속 수행되는 경우, 생성되고 축적된 뉴클레오사이드-5'-포스페이트 에스테르가 분해된다. 따라서, 부산물이 반응 용액 내에 생성되어 충분한 수율을 수득할 수 없다. 또한, 기질이 고농도로 부가되는 경우, 미생물 세포당 낮은 인산전달 활성으로 인해 반응을 수행할 수 없다.

본 발명의 목적은 뉴클레오사이드-5'-포스페이트 에스테르를 저렴하고 효율적으로 제조하는 방법을 제공하는 것이다. 본 발명의 또 다른 목적은 효소, 효소를 암호화하는 유전자, 유전자를 함유하는 재조합 DNA, 및 뉴클레오사이드-5'-포스페이트 에스테르를 제조하는 방법에 유용한 재조합 DNA를 갖는 미생물을 제공하는 것이다.

통상의 방법에 비해 보다 효율적으로 뉴클레오사이드-5'-포스페이트 에스테르를 제조하기 위한 방법을 개발하기 위해 본 발명자들이 다양한 연구를 수행한 결과, 미생물의 세포 비함유 추출물로부터 정제된 산 포스파타제를 pH 3.0 내지 5.5의 조건하에서 뉴클레오사이드, 및 폴리인산 또는 이의 염, 페닐인산 또는 이의 염 및 카바밀 포스페이트 또는 이의 염으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 포스페이트 그룹 공여체에 작용시킴으로써 뉴클레오사이드-5'-포스페이트 에스테르를 고수율로 효율적으로 제조할 수 있다는 것을 밝혀내었다. 또한, 본 발명자들은 각종 세균으로부터 산 포스파타제를 암호화하는 야생형 유전자와 에스케리치아 속에 속하는 세균으로부터 유래된 산 포스파타제상에 돌연변이를 도입시켜 야생형 산 포스파타제와 비교하여 뉴클레오사이드에 대한 친화성이 증가된 산 포스파타제를 암호화하는 유전자를 수득하는데 성공하였다. 더욱이, 본 발명자들은 유전 공학 기술에 따라 유전자를 다량으로 발현시켜 뉴클레오사이드-5'-포스페이트 에스테르의 생산성을 현저하게 증진시킬 수 있다는 것도 밝혀내었다.

또한, 본 발명자들은, 반응 속도가 증가되면 반응 용액중 포스페이트 수용체의 농도를 높힐 수 있기 때문에, 고온에서 산 포스파타제에 의한 포스페이트 전달 반응을 수행하여 뉴클레오사이드-5'-포스페이트를 보다 효율적으로 제조할 목적으로 온도 안정성이 증가된 돌연변이 산 포스파타제를 제조하기 위해 노력하였다. 이에 본 발명자들은 공백에 기술된 돌연변이 산 포스파타제에 비해 온도 안정성이 증가되었고 고온에서 반응에 사용할 수 있는 돌연변이 산 포스파타제를 제조하는데 성공하여 본 발명을 완성하게 되었다.

즉, 본 발명은 뉴클레오사이드에 대한 친화성이 증가되고/증가되거나 온도 안정성이 증가된 산 포스파타제를, pH 3.0 내지 5.5의 조건하에서 뉴클레오사이드, 및 바람직하게는 폴리인산 또는 이의 염, 페닐인산 또는 이의 염, 아세틸인산 또는 이의 염 및 카바밀 포스페이트 또는 이의 염으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 포스페이트 그룹 공여체에 작용시켜 뉴클레오사이드-5'-포스페이트 에스테르를 생성시키는 단계 및 이를 수집하는 단계를 포함하여, 뉴클레오사이드-5'-포스페이트 에스테르를 제조하는 방법을 제공한다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 뉴클레오사이드에 대한 친화성이 증가되고/증가되거나 온도 안정성이 증가된 산 포스파타제를 암호화하는 유전자를 포함하는 재조합 DNA로 형질전환된 미생물을, pH 3.0 내지 5.5의 조건하에서 뉴클레오사이드 및 포스페이트 그룹 공여체에 작용시켜 뉴클레오사이드-5'-포스페이트 에스테르를 생성시키는 단계 및 이를 수집하는 단계를 포함하여, 뉴클레오사이드-5'-포스페이트 에스테르를 제조하는 방법을 제공한다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 뉴클레오사이드에 대한 친화성이 증가되고/증가되거나 온도 안정성이 증가된 돌연변이 산 포스파타제, 산 포스파타제를 암호화하는 유전자, 유전자를 함유하는 제조합 DNA, 및 재조합 DNA를 갖는 미생물을 제공한다.

(1) 산 포스파타제의 제조

본 발명에 사용되는 산 포스파타제는 pH 3.0 내지 5.5의 조건하에서 반응을 촉매하여, 폴리인산 또는 이의 염, 페닐인산 또는 이의 염, 아세틸인산 또는 이의 염 및 카바밀 포스페이트 또는 이의 염으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 포스페이트 그룹 공여체로부터의 포스페이트 그룹을 뉴클레오사이드로 전이시켜 뉴클레오사이드-5'-포스페이트 에스테르를 생성시키는 한 특별히 한정되지 않는다. 이러한 산 포스파타제는 바람직하게는 미생물로부터 유래된 것을 포함한다. 특히 바람직한 양태에서, 본 발명은 모르가넬라, 에스케리치아, 프로비덴시아, 엔테로박터, 클렙시엘라 또는 세라티아 속에 속하는 세균으로부터 유도된 효소를 사용한다. 이런한 세균의 대표적인 예는 다음의 세균 균주를 포함한다.

모르가넬라 모르가니(Morganella morgani) NCIMB 10466

모르가넬라 모르가니 IFO 3168

모르가넬라 모르가니 IFO 3848

에스케리치아 블라태(Escherichia blattae) JCM 1650

에스케리치아 블라태 ATCC 33429

에스케리치아 블라태 ATCC 33430

프로비덴시아 스투아르티(Providencia stuartii) ATCC 29851

프로비덴시아 스투아르티 ATCC 33672

엔테로박터 애로게네스(Enterobacter aerogenes) IFO 12010

엔테로박터 애로게네스 IFO 13534

클렙시엘라 플란티콜라(Klebsiella planticola) IFO 14939

클렙시엘라 플란티콜라 IAM 1133

세라티아 피카리아(Serratia ficaria) IAM 13540

세라티아 마르세센스(Serratia marcescens) IAM 12143

산 포스파타제(EC 3.1.3.2.)는 원래 산성 조건하에서 포스페이트 에스테르를 가수분해시키는 반응을 촉매하는 효소로, 인산전달 반응에 의해 생성되는 뉴클레오사이드-5'-포스페이트 에스테르를 분해시키는 뉴클레오티다제 활성(이후, 뉴클레오티다제 활성을 "포스포모노에스테라제 활성"이라 함)을 갖는다. 이러한 산 포스파타제도 본 발명의 뉴클레오사이드-5'-포스페이트 에스테르를 제조하는 방법에서 사용될 수 있다. 그러나, 고수율로 뉴클레오사이드-5'-포스페이트 에스테르를 수득하기 위해서는, 상기 기술한 세균에 의해 생성된 야생형 산 포스파타제와 비교하여 뉴클레오사이드에 대한 친화성이 증가된 돌연변이 산 포스파타제(이후, 필요한 경우, 간단히 "돌연변이 산 포스파타제"라고 함)를 인산전달 반응에서 사용하는 것이 바람직하다. 바람직하게는 Km 값이 100mM 미만인 돌연변이 산 포스파타제를 사용한다.

돌연변이 산 포스파타제는 이후 기술하는 산 포스파타제를 암호화하는 유전자를 직접 돌연변이시켜 수득한 돌연변이 유전자를 발현시켜 수득한다. 또는, 돌연변이 산 포스파타제는, 뉴클레오사이드에 대한 친화성이 증가된 산 포스파타제를 생성하는 미생물을 자외선으로 조사시키거나 인공 돌연변이에 통상 사용되는 돌연변이 유발제(예: N-메틸-N'-니트로-N-니트로소구아니딘(NTG))로 처리하고, 돌연변이된 미생물을 배양하여 뉴클레오사이드에 대한 친화성이 증가된 돌연변이 산 포스파타제를 생성시킴으로써 수득할 수 있다.

산 포스파타제 활성을 갖는 단백질은 적절한 배지에서 활성을 갖는 미생물 균주를 배양하고, 증식된 미생물 세포를 수집한 다음, 미생물 세포를 파쇄하여 세포 비함유 추출물을 제조하고, 이로부터 단백질을 적절하게 정제함으로써 상기 기술한 미생물로부터 수득할 수 있다.

미생물을 배양하는 배지는 특별히 한정되지 않으며, 통상의 탄소원, 질소원, 무기 이온 및 임의로 유기 영양원을 함유하는 통상의 배지를 이용할 수 있다. 적절하게 사용되는 탄소원은, 예를 들면, 글루코즈 및 슈크로즈와 같은 사카라이드, 글리세롤과 같은 알콜 및 유기산을 포함한다. 사용되는 질소원은, 예를 들면, 암모니아 가스, 수성 암모니아 및 암모늄 염을 포함한다. 필요한 경우, 적절하게 사용되는 무기 이온은, 예를 들면, 마그네슘 이온, 포스페이트 이온, 칼륨 이온, 철 이온 및 망간 이온을 포함한다. 적절하게 사용되는 유기 영양원은, 예를 들면, 비타민 및 아미노산 뿐만 아니라 이를 함유하는 것(예: 효모 추출물, 펩톤, 고기 추출물, 옥수수 침지액, 카제인 가수분해물 및 콩 가수분해물)을 포함한다.

배양 조건도 특별히 한정되지 않는다. 미생물은, 예를 들면, 호기성 조건하에서 5 내지 8의 pH 범위 및 25 내지 40℃의 온도 범위를 적절하게 조절하면서 약 12 내지 48시간 동안 배양할 수 있다.

증식된 미생물 세포는 예를 들면, 원심분리에 의해 배양액으로부터 수집할 수 있다. 세포 비함유 추출물은 통상의 방법을 사용하여 수집된 미생물 세포로부터 수득한다. 즉, 세포 비함유 추출물은, 미생물 세포를 초음파 처리, 다이노-밀(Dyno-mill) 및 프렌치 프레스(French Press)와 같은 방법을 사용하여 파쇄하고, 원심분리에 의해 세포 파쇄물을 제거하여 수득한다.

산 포스파타제는 효소 정제에 통상 사용되는 기술(예: 황산암모늄 분획화, 이온 교환 크로마토그래피, 소수성 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 겔 여과 크로마토그래피 및 등전점 정제)을 적절하게 조합 사용하여 세포 비함유 추출물로부터 정제한다. 침전의 경우, 산 포스파타제를 완전히 정제할 필요는 없다. 기질로서 뉴클레오사이드의 분해에 관여하는 효소와 같은 오염 물질을 제거하는 것만으로도 충분하다.

(2) 산 포스파타제 유전자의 제조

산 포스파타제 활성을 갖는 단백질을 암호화하는 구조 유전자를 함유하는 DNA 단편은, 예를 들면, 효소 활성을 갖는 미생물의 세포로부터 출발하여 클로닝할 수 있다. 클로닝 방법은, 예를 들면, 지표로서 효소 활성을 사용하여 염색체 유전자 발현 라이브러리를 스크리닝하는 방법, 단백질에 대한 항체를 제조하여 염색체 유전자 발현 라이브러리를 스크리닝하는 방법, 및 프로브를 제조하여 유전자 라이브러리를 스크리닝하는 것에 기초하여 아미노산 서열, 예를 들면, 정제된 단백질의 N-말단 서열을 분석하는 방법을 포함한다.

구체적으로, 상기 기술한 모르가넬라 모르가니, 에스케리치아 블라태, 프로비덴시아 스투아르티, 엔테로박터 애로게네스, 클렙시엘라 플란티콜라, 세라티아 피카리아 또는 세라티아 마르세센스의 산 포스파타제를 암호화하는 유전자는 각각의 미생물의 염색체 유전자 발현 라이브러리를 제조하고, 지표로서 포스파타제 활성을 사용하여 라이브러리를 스크리닝함으로써 클로닝할 수 있다.

즉, 염색체 유전자 발현 라이브러리는 모르가넬라 모르가니 또는 에스케리치아 블라태로부터 염색체 DNA를 우선 제조하고, 이를 적절한 제한효소로 부분적으로 분해한 다음, 에스케리치아 콜리에서 자발적으로 복제가능한 벡터와 함께 이를 결합시키고, 에스케리치아 콜리를 수득된 재조합 DNA로 형질전환시켜 제조할 수 있다. 분해도를 조절하도록 분해 반응 시간을 조절하여 염색체 DNA를 분해시키는데 다양한 제한효소를 사용할 수 있다. 에스케리치아 콜리에서 자발적으로 복제가능하다면, 유전자를 클로닝하기 위해 어떤 벡터도 사용할 수 있다. 예를 들면, pUC19, pUC118, pHSG298, pBR322 및 pBluescript II를 사용할 수 있다.

사전에 염색체 DNA를 분해시키는데 사용된 것과 동일한 제한효소, 또는 염색체 DNA 단편의 절단된 모서리와 상보적인 절단된 모서리를 생성시키는 제한효소로 벡터를 분해시키고, T4 DNA 리가제와 같은 리가제를 사용하여 DNA 단편과 벡터를 결합시킴으로써, 산 포스파타제를 암호화하는 유전자를 함유한 DNA 단편과 벡터를 결합시켜 재조합 DNA를 제조한다. 벡터의 복제에 적합하다면 어떤 미생물 균주도 제조된 재조합 DNA에 대한 수용체로서 사용할 수 있다. 예를 들면, HB101, JM109 및 DH5와 같은 에스케리치아 콜리의 미생물 균주를 사용할 수 있다.

수득한 형질전환체를 한천 배지 상에서 성장시켜 콜로니를 형성시킨다. 이후, p-니트로페닐인산을 함유하는 반응 용액을 배지의 표면에 부어 반응을 수행하면, 포스파타제 활성이 발현된 균주는 p-니트로페놀을 유리시켜 황색을 나타낸다. 목적하는 산 포스파타제를 암호화하는 유전자를 함유하는 DNA 단편을 갖는 형질전환체는, 상기 기술한 반응을 산성 조건하에서 수행하도록 하고 지표로서 발색시켜 형질전환체를 선별함으로서 선택할 수 있다.

이후, 재조합 DNA를 선별된 형질전환체로부터 회수하여 벡터와 결합된 산 포스파타제를 암호화하는 유전자를 함유하는 DNA 단편의 구조를 분석한다. 산 포스파타제를 암호화하는 유전자의 뉴클레오타이드 서열은 모르가넬라 모르가니 NCIMB 10466으로부터 유래된 유전자의 경우에는 서열 목록에서 서열 2, 에스케리치아 블라태 JCM 1650으로부터 유래된 유전자의 경우에는 서열 목록에서 서열 6, 프로비덴시아 스투아르티 ATCC 29851로부터 유래된 유전자의 경우에는 서열 목록에서 서열 21, 엔테로박터 애로게네스 IFO 12010으로부터 유래된 유전자의 경우에는 서열 목록에서 서열 23, 클렙시엘라 플란티콜라 IFO 14939로부터 유래된 유전자의 경우에는 서열 목록에서 서열 25 및 세라티아 피카리아 IAM 13540으로부터 유래된 유전자의 경우에는 서열 목록에서 서열 27에 나타내었다.

상기 유전자에 의해 암호화되는 산 포스파타제의 유추된 아미노산 서열은 서열 4, 8, 22, 24, 26 및 28에 나타내었다. 상기 유전자에 의해 암호화되는 산 포스파타제가 본 발명에서 바람직하게 사용된다. 또한, 상기 유전자에 의해 암호화되는 산 포스파타제 중의 하나의 아미노산 서열과 사실상 동일한 아미노산 서열을 포함하는 산 포스파타제가 또한 본 발명에서 바람직하게 사용된다. 용어 "사실상 동일함"이란 산 포스파타제의 아미노산 서열이 뉴클레오사이드-5'-포스페이트 에스테르를 생성시키는 활성(이후, "인산전달 활성"이라 함)의 손실 없이 아미노산 잔기 중의 하나 또는 다수가 치환, 결실, 삽입 또는 전이될 수 있다는 것을 의미한다.

(3) 돌연변이 산 포스파타제를 암호화하는 유전자의 제조

상기 기술한 바와 같이 수득한 야생형 산 포스파타제는 포스포모노에스테라제 활성을 갖는다. 따라서, 포스포모노에스테라제 활성은 뉴클레오사이드-5'-포스페이트 에스테르의 제조에서 반응 시간이 경과함에 따라 생성물의 분해를 야기시키는 인자로서 작용하여 반응 수율을 저하시킬 수 있다. 이러한 상황을 극복하기 위해, 뉴클레오사이드에 대한 친화성이 증가되도록 산 포스파타제를 암호화하는 유전자에 인공적인 돌연변이를 야기시키는 것이 유익하다.

반응 속도가 향상되고 반응 용액에서 포스페이트 수용체의 농도를 높힐 수 있으므로, 보다 고온에서 산 포스파타제에 의한 인산전달 반응을 수행하여 뉴클레오사이드-5'-포스페이트를 보다 효율적으로 제조할 수 있다. 이러한 목적으로, 온도 안정성이 증가되도록 산 포스파타제를 암호화하는 유전자에 인공적인 돌연변이를 야기시키는 것이 유익하다.

DNA의 목적 부위에 목적하는 돌연변이를 야시키기는 부위-지시 돌연변이 방법은, 예를 들면, PCR을 사용하는 방법[참조: Higuchi, R., 61, in PCR technology, Erlich, H. A. Eds., Stockton press (1989); Carter, P., Meth. in Enzymol., 154, 382 (1987)] 및 파아지를 사용하는 방법[참조: Kramer, W. and Frits, H. J., Meth. in Enzymol., 154, 350 (1987); Kunkel, T. A. et al., Meth. in Enzymol., 154, 367 (1987)]을 포함한다.

뉴클레오사이드에 대한 친화성이 증가된 돌연변이 산 포스파타제는, 서열 목록에서 서열 4, 8, 22, 24, 26 및 28에 나타낸 서열로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열과 사실상 동일하고 야생형 산 포스파타제의 뉴클레오사이드에 대한 친화성이 증가되도록 돌연변이시킨 아미노산 서열을 포함하는 산 포스파타제로 예시된다. 구체적으로, 돌연변이 산 포스파타제는 에스케리치아 블라태 JCM 1650으로부터 유래된 효소에 있어서 서열 목록에서 서열 8에 나타낸 아미노산 서열 중 74번 글리신 잔기 및/또는 153번 이소류신 잔기가 또 다른 아미노산 잔기로 치환된 것으로서 예시된다. 이후 기술하는 실시예에서는, 돌연변이 산 포스파타제를 암호화하는 유전자는 74번 글리신 잔기가 아스파르트산 잔기로 치환되고 153번 이소류신 잔기가 트레오닌 잔기로 치환된 예로 설명된다.

또한, 서열 목록에서 서열 8중 63번 류신 잔기, 65번 알라닌 잔기, 66번 글루탐산 잔기, 69번 아스파라긴 잔기, 71번 세린 잔기, 72번 세린 잔기, 85번 세린 잔기, 92번 알라닌 잔기, 94번 알라닌 잔기, 116번 아스파르트산 잔기, 130번 세린 잔기, 135번 트레오닌 잔기 및/또는 136번 글루탐산 잔기가 또 다른 아미노산으로 치환된 것으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 돌연변이는 산 포스파타제의 뉴클레오사이드에 대한 친화성을 추가로 증가시킨다.

온도 안정성이 증가된 돌연변이 산 포스파타제는 서열 목록에서 서열 4, 8, 22, 24, 26 및 28에 나타낸 서열로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열과 사실상 동일하고 야생형 산 포스파타제의 온도 안정성이 증가되도록 돌연변이시킨 아미노산 서열을 포함하는 산 포스파타제로 예시된다. 구체적으로, 돌연변이 산 포스파타제는 에스케리치아 블라태 JCM 1650으로부터 유래된 효소에 있어서, 서열 목록에서 서열 8에 나타낸 아미노산 서열 중 104번 글루탐산 잔기 및/또는 151번 트레오닌 잔기가 또 다른 아미노산 잔기로 치환된 것으로서 예시된다. 이후 기술하는 실시예에서, 돌연변이 산 포스파타제를 암호화하는 유전자는 104번 글루탐산 잔기가 글리신 잔기로 치환되고 151번 트레오닌 잔기가 알라닌 잔기로 치환된 예로 설명된다.

따라서, 뉴클레오타이드는 이들 돌연변이 산 포스파타제를 암호화하도록 상기 기술한 부위-지시 돌연변이 방법에 따라 야생형 유전자의 특정 부위에서 치환될 수 있다. 뉴클레오사이드에 대한 친화성을 증가시키기 위한 돌연변이는 야생형 산 포스파타제와 비교하여 뉴클레오사이드-5'-포스페이트 에스테르를 생성하는 활성을 사실상 저하시키지 않는 유형의 돌연변이가 바람직하다. 그러나, 뉴클레오사이드-5'-포스페이트 에스테르를 생성하는 활성이 저하되더라도, 포스포모노에스테라제 활성의 저하도가 뉴클레오사이드-5'-포스페이트 에스테르를 생성하는 활성의 저하도 보다 큰 경우에는 충분하여, 돌연변이 산 포스파타제의 뉴클레오사이드-5'-포스페이트 에스테르를 생성하는 활성에 대한 포스포모노에스테라제 활성의 비가 야생형 산 포스파타제와 비교시 저하된다. 뉴클레오사이드에 대한 친화성의 증가도와 관련하여, 인산전달 반응에서 뉴클레오사이드에 대한 Km 값은 바람직하게는 100mM 미만이다.

온도 안정성이 증가된 돌연변이는 온도 처리후 야생형 산 포스파타제가 갖는 것보다 잔류 활성이 더 높은 것을 의미한다. 온도 안정성 증가도는 바람직하게는 pH 7.0 및 50℃에서 30분 처리시 활성을 감소시키지 않는 것이다.

하기의 양태에서 나타낸 바와 같이, 에스케리치아 블라태 JCM 1650의 산 포스파타제의 아미노산 서열은 모르가넬라 모르가니 NCIMB 10466의 것과 상동성이 높으며, 서열 4에 나타낸 아미노산 서열에서 72번 글리신 잔기, 102번 글루탐산 잔기, 149번 트레오닌 잔기 및 151번 이소류신 잔기는 서열 8에 나타낸 아미노산 서열중 74번 글리신 잔기, 104번 글루탐산 잔기, 151번 트레오닌 잔기 및 153번 이소류신 잔기에 각각 상응한다. 또한, 에스케리치아 블라태 JCM 1650 외에도, 프로비덴시아 스투아르티 ATCC 29851, 엔테로박터 애로게네스 IFO 12010, 클렙시엘라 플란티콜라 IFO 14939 및 세라티아 피카리아 IAM 13540과 같은 미생물로부터 유래된 산 포스파타제의 아미노산 서열이 모르가넬라 모르가니 NCIMB 10466의 것과 상동성이 높고, 이들 산 포스파타제의 아미노산 서열은 각각 서열 4에 나타낸 아미노산 서열중 72번 글리신 잔기, 102번 글루탐산 잔기, 149번 트레오닌 잔기 및 151번 이소류신 잔기에 상응하는 아미노산 잔기를 포함한다. 따라서, 이들 미생물로부터 유래된 돌연변이 산 포스파타제를 암호화하는 유전자는 상기 기술한 바와 같이 수득할 수 있다. 서열 22, 24 또는 26에 나타낸 프로비덴시아 스투아르티 ATCC 29851, 엔테로박터 애로게네스 IFO 12010 또는 클렙시엘라 플란티콜라 IFO 14939로 부터 유래된 산 포스파타제의 아미노산 서열중 92번 글리신 잔기, 122번 글루탐산 잔기, 169번 트레오닌 잔기 및 171번 이소류신 잔기와 서열 28에 나타낸 세라티아 피카리아 IAM 13450으로부터 유도된 산 포스파타제의 아미노산 서열중 88번 글리신 잔기, 118번 글루탐산 잔기, 165번 트레오닌 잔기 및 167번 이소류신 잔기는 각각 서열 4에 나타낸 아미노산 서열중 72번 글리신 잔기, 102번 글루탐산 잔기, 149번 트레오닌 잔기 및 151번 이소류신 잔기에 상응한다.

상기한 산 포스파타제의 아미노산 서열 비교 결과는 도 12에 나타내었다. 도 12에 근거하여, 산 포스파타제의 아미노산 잔기가 또 다른 산 포스파타제의 또 다른 아미노산 잔기에 상응한다는 것이 분명하다.

(4) 숙주내로 산 포스파타제 유전자의 도입

높은 수준으로 산 포스파타제 활성을 발현시키는 재조합 미생물은 상기 기술한 바와 같이 수득한 산 포스파타제 활성을 갖는 단백질을 암호화하는 유전자를 함유하는 DNA 단편을 적절한 벡터와 재조합한 후, 이 DNA 단편을 숙주의 세포에 도입시켜 수득할 수 있다. 이러한 방법에서, 야생형 산 포스파타제는 야생형 산 포스파타제를 암호화하는 유전자를 사용하여 발현시키지만, 돌연변이 산 포스파타제는 돌연변이 산 포스파타제를 암호화하는 유전자를 사용하여 발현시킨다.

숙주는 상기 기술한 HB101, JM109 및 DH5와 같은 에스케리치아 콜리의 미생물 균주를 포함한다. 이들 균주 이외에, 작제된 재조합 DNA의 복제 기원 및 산 포스파타제 유전자가 기능할 수 있고 재조합 DNA가 복제 가능하며 산 포스파타제 유전자가 발현 가능하다면, 어떠한 세균도 숙주로서 이용할 수 있다. 가장 바람직한 숙주의 하나는 에스케리치아 콜리 JM109이다.

산 포스파타제 암호화 유전자 도입용 벡터는 숙주 내에서 복제가능하다면 특별히 한정되지 않는다. 에스케리치아 콜리가 숙주로서 사용되는 경우, 벡터는 이러한 세균에서 자발적으로 복제가능한 플라스미드일 수 있다. 예를 들면, ColE1 유형 플라스미드, p15A 유형 플라스미드, R 인자 유형 플라스미드 및 파아지 유형 플라스미드를 사용할 수 있다. 이러한 플라스미드는 특히, 예를 들면, pBR322[참조: Gene, 2, 95 (1977)], pUC19[참조: Gene, 33, 103 (1985)], pUCl19[참조: Methods in Enzymology, 153, 3 (1987)], pACYC184[참조: J. Bacteriol., 134, 1141 (1978)] 및 pSC101[참조: Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 70, 3240 (1973)]을 포함한다.

산 포스파타제를 암호화하는 유전자를 함유하는 DNA 단편이 숙주에서 기능할 수 있는 프로모터를 함유하는 경우, DNA 단편은 그 자제로서 벡터와 결합시킬 수 있다. DNA 단편이 이러한 프로모터를 함유하지 않는 경우, lac, trp 및 PL과 같은 숙주 미생물에서 작용하는 또 다른 프로모터를 유전자의 상부스트림에 결합시킬 수 있다. DNA 단편이 프로모터를 함유하는 경우라도, 프로모터는 산 포스파타제를 암호화하는 유전자를 효율적으로 발현시키기 위해 또 다른 프로모터로 대체할 수 있다.

산 포스파타제를 암호화하는 유전자를 함유하는 DNA 단편과 벡터를 결합시켜 작제한 재조합 DNA를 숙주에 도입시키기 위한 방법은 특별히 한정되지 않는다. 재조합 DNA은 통상의 방법을 사용하여 숙주에 도입시킬 수 있다. 에스케리치아 콜리가 숙주로서 사용되는 경우, 예를 들면, 염화칼슘 방법[참조: J. Mol. Biol., 53, 159 (1970)], 하나한(Hanahan) 방법[참조: J. Mol., Biol., 166, 557 (1983)], SME 방법[참조: Gene, 96, 23 (1990)], 청(Chung) 등의 방법[참조: Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 86, 2172 (1989)] 및 전기천공법(electroporation)[참조: Nucleic Acids Res., 16, 6127 (1988)]을 사용할 수 있다.

산 포스파타제 유전자는 상기 기술한 바와 같이 염색체외 DNA로서 숙주에 포함되도록 숙주에 도입될 수 있는, 자발적으로 복제가능한 벡터 DNA에 삽입시킬 수 있다. 또는, 산 포스파타제 유전자는 형질도입, 트랜스포존(transposon)[참조: Biotechnol., 1, 417 (1983)], Mu 파아지[참조: 일본 공개특허공보 제2-109985호] 또는 상동성 재조합[참조: Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab. (1972)]을 사용하는 방법에 따라 숙주 미생물의 염색체에 도입시킬 수 있다.

(5) 재조합 미생물에 의한 산 포스파타제 유전자의 발현

산 포스파타제를 암호화하는 유전자를 함유하는 재조합 DNA를 도입시켜 상기 기술한 바와 같이 수득한 형질전환체는 탄소원, 질소원, 무기 이온 및 임의의 유기 영양원을 함유하는 적절한 배지에서 이를 배양시켜 세포중에서 산 포스파타제 활성을 높은 수준으로 발현시킬 수 있다. 적절하게 사용되는 탄소원은, 예를 들면, 글루코즈와 같은 탄수화물, 글리세롤과 같은 알콜 및 유기 산을 포함한다. 사용되는 질소원은, 예를 들면, 암모니아 가스, 암모니아수 및 암모늄 염을 포함한다. 필요한 경우, 적절하게 사용되는 무기 이온은, 예를 들면, 마그네슘 이온, 포스페이트 이온, 칼륨 이온, 철 이온 및 망간 이온을 포함한다. 적절하게 사용되는 유기 영양원은, 예를 들면, 비타민 및 아미노산 뿐만 아니라 이를 포함하는 것(예: 효모 추출물, 펩톤, 고기 추출물, 옥수수 침지액, 카제인 가수분해물 및 콩 가수분해물)을 포함한다. 산 포스파타제 활성의 발현량은 IPTG(이소프로필-β -D-티오갈락토피라노사이드)와 같이 프로모터에 좌우되는 발현-유도제를 배지에 가하여 증가시킬 수 있다.

배양 조건은 또한 특별히 한정되지는 않는다. 배양은, 예를 들면, 5 내지 8의 pH 범위 및 25 내지 40℃의 온도 범위를 적절하게 조절하면서 약 12 내지 48 시간 동안 호기성 조건하에서 수행할 수 있다.

이후, 미생물 세포를 배양액으로부터 수집하고 이를 파쇄하여 세포 비함유 추출물을 수득하고, 이로부터 산 포스파타제를 정제할 수 있다. 정제는 상기(1)에서 기술한 바와 같은 효소 정제에 통상적으로 사용되는 기술을 적절하게 조합하여 수행한다. 정제에 있어서, 산 포스파타제를 완벽하게 정제할 필요는 없다. 기질로서 뉴클레오사이드의 분해에 관여하는 효소와 같은 오염 물질을 제거하는 것만으로도 충분하다.

(6) 뉴클레오사이드-5'-포스페이트 에스테르의 제조

뉴클레오사이드-5'-포스페이트 에스테르는, 반응 혼합물 중에서 상기(1)에서 기술한 바와 같이 수득한 산 포스파타제 또는 상기(5)에 기술한 유전 공학 기술에 따라 유전자를 다량으로 발현시켜 수득한 야생형 산 포스파타제 또는 돌연변이 산 포스파타제를, 폴리인산 또는 이의 염, 페닐인산 또는 이의 염, 아세틸인산 또는 이의 염 및 카바밀 포스페이트 또는 이의 염으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 포스페이트 그룹 공여체와 접촉시키고 뉴클레오사이드의 반응을 야기시켜 제조할 수 있다. 이러한 반응에서 높은 생산성을 달성하기 위하여, 반응 용액의 pH를 3.0 내지 5.5의 약산성 범위로 조절하는 것이 중요하다.

산 포스파타제를 암호화하는 유전자를 유전 공학 기술을 사용하여 다량으로 발현시키는 경우, 특히 뉴클레오사이드에 대한 친화성이 증가된 돌연변이 산 포스파타제를 암호화하는 유전자를 다량으로 발현시키는 경우, 형질전환체의 미생물 세포를 함유하는 배양액, 배양액으로부터 분리되고 수집된 미생물 세포 또는 예를 들면, 부동화 처리, 아세톤 처리 또는 동결건조 처리에 따라 이 미생물 세포로부터 수득한 생성물을 정제된 산 포스파타제 대신에 사용하여 뉴클레오사이드-5'-포스페이트 에스테르를 저렴하고 효율적으로 제조할 수 있다.

사용되는 뉴클레오사이드는, 예를 들면, 이노신, 구아노신, 아데노신, 크산토신, 퓨린 리보사이드, 6-메톡시퓨린 리보사이드, 2,6-디아미노퓨린 리보사이드, 6-플루오로퓨린 리보사이드, 6-티오퓨린 리보사이드, 2-아미노-6-티오퓨린 리보사이드 및 머캅토구아노신과 같은 퓨린 뉴클레오사이드; 및 우리딘, 시티딘, 5-아미노우리딘, 5-하이드록시우리딘, 5-브로모우리딘 및 6-아자우리딘과 같은 피리미딘 뉴클레오사이드를 포함한다. 반응의 결과로서, 이들 천연 유형의 뉴클레오사이드 및 비천연 유형의 뉴클레오사이드는 특히 5'-위치에서 인산화되고, 상응하는 뉴클레오사이드-5'-포스페이트 에스테르를 각각 생성한다.

뉴클레오사이드는 바람직하게는 1 내지 20g/dl의 농도로 반응 용액에 가한다. 물에서 난용성인 뉴클레오사이드를 사용하는 경우, 반응 수율은 붕산 또는 계면활성제(예: 디메틸 설폭사이드)를 가하여 향상시킬 수 있다.

발효에 의해 뉴클레오사이드를 제조하는 경우, 발효 후, 발효 배지를 그대로 인산화 반응액에 가할 수 있다. 뉴클레오사이드-5'-포스페이트 에스테르를 분해하는 성분이 배지에 포함된 경우, 바람직하게는 정제 단계를 사용하여 상기 성분을 제거한다.

사용되는 포스페이트 그룹 공여체에 있어서, 폴리인산 또는 이의 염으로서 유용한 것은, 예를 들면, 피로인산, 트리폴리인산, 트리메타인산, 테트라메타인산, 헥사메타인산 및 이의 혼합물, 이의 나트륨 염, 이의 칼륨 염 및 이들 염의 혼합물을 포함한다. 페닐인산 또는 이의 염으로서 유용한 것은, 예를 들면, 이나트륨 페닐포스페이트, 이칼륨 페닐포스페이트, 0,0-디페닐인산 무수물 및 이의 혼합물을 포함한다. 카바밀 포스페이트 또는 이의 염으로서 유용한 것은, 예를 들면, 이나트륨 카바밀 포스페이트, 이칼륨 카바밀 포스페이트, 이암모늄 카바밀 포스페이트, 이리튬 카바밀 포스페이트 및 이의 혼합물을 포함한다. 아세틸인산 또는 이의 염으로서 유용한 것은, 예를 들면, 리튬 칼륨 아세틸포스페이트를 포함한다. 포스페이트 그룹 공여체가 사용되는 농도는 포스페이트 그룹 수용체로서 뉴클레오사이드의 농도에 의해 결정된다. 포스페이트 그룹 공여체는 통상 뉴클레오사이드의 1 내지 5배의 양으로 사용된다.

바람직한 결과는 통상 20 내지 60℃, 바람직하게는 30 내지 40℃의 온도에서 3.5 내지 6.5, 바람직하게는 4.0 내지 5.0의 약산성 pH에서의 반응시 수득된다. 온도 안정성이 증가된 돌연변이 산 포스파타제를 사용하는 경우, 반응 온도는 20 내지 70℃, 바람직하게는 30 내지 60℃이다. 반응은 정지 방법 및 교반 방법 중의 어느 하나를 채택하여 수행할 수 있다. 반응 시간은 사용되는 효소의 활성 및 기질 농도와 같은 조건에 좌우되지만, 1 내지 100시간이다.

이와 같이 제조한 뉴클레오사이드-5'-포스페이트 에스테르는, 흡착용 합성 수지를 사용하는 방법, 침전제를 사용하는 방법 및 수집 및 분리에 통상적인 기타 방법을 채택하여 반응 완결 후 혼합물로부터 수집하고 분리할 수 있다.

실시예

특히 본 발명은 하기 실시예를 참조로하여 설명될 것이지만 본 발명이 이들 실시예로 제한되지는 않는다.

인산전달 활성은 기질로서 이노신을 사용하여 하기의 조건하에서 측정한다. 이노신 40μ mol/ml, 피로인산나트륨 100μ mol/ml, 나트륨 아세테이트 완충액 100μmol/ml(pH 5.0) 및 효소를 포함하는 반응 용액(1ml)중에서 10분 동안 30℃ 및 pH 5.0에서 반응을 수행한다. 2N 염산 200μl를 첨가하여 반응을 종료시킨다. 이후. 침전물을 원심분리하여 제거한다. 이어서, 인산전달 반응에 의해 제조된 5'-이노신산을 정량적으로 측정한다. 상기 표준 조건하에서 1분당 5'-이노신산 1μmol을 제조하는 효소의 양을 1유니트(unit)로서 정의한다.

포스포모노에스터라제 활성은 기질로서 5'-이노신산을 사용하여 하기의 조건하에서 측정한다. 5'-이노신산 10μmol/ml, MES/NaOH 완충액 100μmol/ml(pH 6.0) 및 효소를 포함하는 반응 용액(1ml)중 30℃에서 10분 동안 반응을 수행한다. 2N 염산 200μl를 첨가하여 반응을 종료시킨다. 이후, 침전물을 원심분리하여 제거한다. 이어서, 가수분해 반응에 의해 제조된 이노신을 정량적으로 측정한다. 상기 표준 반응 조건하에서 1분당 이노신 1μmol을 제조하는 효소의 양을 1유니트로서 정의한다.

이노신 및 5'-이노신산을 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)를 사용하여 하기의 조건하에서 분석한다.

칼럼: 코스모실(Cosmosil) 5C18-AR(4.6 x 150mm)[nacalai tesque];

이동상: 5mM 인산칼륨 완충액(pH 2.8)/메탄올=95/5;

유속: 1.0ml/분;

온도: 실온;

검출: UV 245nm.

부수적으로, 원료 물질로서 이노신 외의 다른 뉴클레오사이드를 사용하여 뉴클레오사이드-5'-포스페이트 에스테르를 제조하는 반응에서는, 원료 물질로서의 뉴클레오사이드 및 제조된 뉴클레오사이드-5'-포스페이트 에스테르를 상기 기술한 바와 같이 HPLC로 분석한다.

실시예 1: 모르가텔라 모르가니로부터 유래된 산 포스파타제의 정제 및 특성규명

펩톤 1g/dl, 효모 추출물 0.5g/dl 및 염화나트륨 1g/dl를 포함하는 영양 배지(pH 7.0, 50ml)를, 20분 동안 120℃에서 살균한 사카구치(Sakaguchi) 플라스크(500ml)에 붓는다. 모르가넬라 모르가니 NCIMB 10466의 사면 배양물은 백금 루프를 사용하여 한 번씩 플라스크의 각각에 접종하고, 교반시키면서 16시간 동안 30℃에서 배양한다. 원심분리하여 배양물로부터 수집한 미생물 세포(약 3,000g)를 100mM 인산칼륨 완충액(1L, pH 7.0)중에 현탁시킨다. 20분 동안 4℃에서 초음파 처리하여 미생물 세포을 파쇄시킨다. 처리된 현탁액을 원심분리하여 이의 불용성 분취물을 제거한다. 이어서, 세포 비함유 추출물을 제조한다.

30% 포화도에 이르도록 황산암모늄을 세포 비함유 추출물에 첨가한다. 발생된 침전물을 원심분리하여 제거한 다음, 상등액에 황산암모늄을 추가로 첨가하여 60% 포화도에 이르도록한다. 발생한 침전물을 원심분리하여 수집하고 100mM 인산칼륨 완충액중에 용해시킨다.

상기 조 효소 용액을 100mM 인산칼륨 완충액(pH 7.0) 5L에 대해 4회 투석한 다음, 20mM 인산칼륨 완충액(pH 7.0)으로 평형화시킨 DEAE-토요필 650M 칼럼(ø 4.1 x 22cm)에 적용시킨 다음, 20mM 인산칼륨 완충액(pH 7.0) 800ml로 세척한다. 인산 전달 활성이 칼럼을 통과한 분취물에 나타나면, 상기 분취물을 회수한다.

분취물에 황산암모늄을 첨가하여 35% 포화도에 이르도록 하고, 35% 포화된 황산암모늄을 포함하는 20mM 인산칼륨 완충액(pH 7.0)으로 평형화시킨 부틸-토요필 칼럼(ø 3.1 x 26cm)에 흡착시킨다. 인산칼륨 완충액(pH 7.0)중에서 35% 내지 20%의 포화도에 이르는 선형 농도 구배를 사용하여 용출시킨다.

활성 분취물을 수집하고 50mM 인산칼륨 완충액(pH 7.0) 1L에 대해 투석시킨 다음, 50mM 인산칼륨 완충액(pH 7.0)으로 평형화시킨 하이드록시애퍼타이트 칼럼(ø 5 x 6.5cm)에 적용시킨다. 50mM 내지 300mM의 인산칼륨 완충액(pH 7.0)에 이르는 선형 농도 구배를 사용하여 용출시킨다.

활성 분취물을 수집하고 한외여과로 농축시킨다. 상기 효소 용액을 하이로드(Hiload) TM 16/60 슈퍼덱스 200 칼럼(Pharmacia)에 적용시킨다. 100mM 염화나트륨을 포함하는 50mM 인산칼륨 완충액을 사용하여 분당 1.0ml의 유속으로 용출시킨다.

상기 기술된 바와 같은 방법에 따라, 인산전달 활성을 나타내는 효소를 결과적으로 약 550배로 농축되게 세포 비함유 추출물로부터 약 10%의 회수율로 정제한다. 상기 정제 방법에서의 비활성 및 회수율은 표 1에 나타내었다. 상기 효소 샘플은 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동상에서 균질하다.

[표 1]

정제된 효소는 하기의 성질을 갖는다.

(1) 작용: 폴리인산과 같은 포스페이트 그룹 공여체로부터의 포스페이트 그룹을 뉴클레오사이드로 전달하고 뉴클레오사이드-5'-포스페이트 에스테르를 생성한다. 역으로, 상기 효소는 포스페이트 에스테르를 가수분해시키는 활성을 또한 나타낸다.

(2) 기질 특이성: 인산전달 반응중에서 포스페이트 그룹 공여체로서 작용하는 것은, 예를 들어 피로인산, 트리폴리인산, 트리메타인산, 테트라메타인산, 헥사메타인산, 이나트륨 페닐포스페이트, 이칼륨 페닐포스페이트, 0,0-디페닐인산 무수물, 이나트륨 카바밀 포스페이트, 이칼륨 카바밀 포스페이트, 이암모늄 카바밀 포스페이트 및 이리튬 카바밀 포스페이트를 포함한다. 포스페이트 그룹 수용체로서 작용하는 것은, 예를 들어 퓨린 리보사이드, 이노신, 구아노신, 아데노신, 크산토신, 우리딘 및 시스티딘을 포함한다. 한편, 인산 에스테르 가수분해 반응중에서 작용하는 것은, 예를 들어 피로인산, 트리폴리인산, 트리메타인산, 테트라메타인산, 헥사메타인산과 같은 무기 인산; 이나트륨 페닐포스페이트, 이칼륨 페닐포스페이트, 0,0-디페닐인산 무수물, 이나트륨 카바밀 포스페이트, 이칼륨 카바밀 포스페이트, 이암모늄 카바밀 포스페이트 및 이리튬 카바밀 포스페이트와 같은 포스페이트 에스테르; 및 5'-퓨린 리보타이드, 5'-이노신산, 5'-구아닐산, 5'-아데닐산, 5'-크산틸산, 5'-우리딜산 및 5'-시티딜산과 같은 5'-뉴클레오타이드를 포함한다.

(3) 최적 pH: 5.2(인산전달 반응), 6.5(포스페이트 에스테르 가수분해 반응)

(4) pH 안정성: pH 3.0 내지 12.0(30℃에서 60분 동안 처리)

(5) 최적 온도: 약 35℃

(6) 온도 안정성: 30℃까지 안정함(pH 7.0에서 30분 동안 처리)

(7) 금속 이온 및 억제제의 첨가 효과: 상기 효소는 임의의 금속 이온을 첨가함에 따라 이의 활성과 관련된 활성화 현상을 나타내지 않는다. 활성은 Ag²⁺, Pb²⁺, Hg²⁺ 및 Cu²⁺에 의해 억제된다. 활성은 또한 요오드아세트산에 의해 억제된다.

(8) 분자량: 고성능 액체 크로마토그래피(TSKgel G-3000SW, Toyo Soda)에 따라 계산된 분자량은 약 190,000이다.

(9) 서브유니트 분자량: SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 따라 계산된 서브유니트 분자량은 약 25,000이다.

상기 효소는 포스페이트 그룹을 뉴클레오사이드로 전달하는 활성 뿐만 아니라, 역으로 포스페이트 에스테르를 가수분해하는 활성을 나타낸다. 더욱이 상기 효소는 인산전달 활성보다 20배 이상 높은 포스페이트 에스테르 가수분해 활성(포스포모노에스터라제 활성)을 나타낸다. 또 다른 특성은 모르가넬라 속에 속하는 세균에 의해 생산되는 공지된 산 포스파타제의 특성과 일치한다[참조: Microbiology, 140, 1341-1350(1994)]. 따라서, 상기 효소가 산 포스파타제인 것이 명백하다.

피로인산나트륨(10g/dl) 및 이노신(2g/dl)을, 각각 pH 5.5, 5.0, 4.5, 4.0 및 3.5를 갖는 나트륨 아세테이트 완충액중에 용해시키고, 여기에 상기 기술한 효소 샘플을 첨가하여 50유니트/dl의 농도를 수득한다. 각각의 pH를 유지하면서 반응 혼합물을 6시간 동안 30℃에서 항온처리하고, 생산된 5'이노신산의 양을 시간의 경과에 따라 측정한다. 생산된 이노신산은 단지 5'-이노신산만을 포함한다. 2'-이노신산 및 3'-이노신산 부산물은 전혀 관찰되지 않는다. 결과는 도 1에 나타내었다. 5'-이노신산 생산 속도는 pH 5.0에서 최대이다. 그러나, 5'-이노신산의 최대 축적량은 보다 낮은 pH에서 더 높다. pH 4,0에서의 반응 조건이 5'-이노신산의 생산에 가장 효과적이고, 5'-이노신산은 3시간 동안 반응을 수행하여 2.60g/dl의 양으로 생산되고 축적된다.

실시예 2: 모르가넬라 모르가니로부터 유래된 산 포스파타제 샘플에 의한 다양한 뉴클레오사이드의 인산화 반응

포스페이트 그룹 수용체로서 피로인산나트륨(10g/dl), 및 이노신, 구아노신, 우리딘 또는 시티딘(2g/dl)을 나트륨 아세테이트 완충액중에 용해시키고, 여기에 실시예 1에서 제조한 효소 샘플을 첨가하여 이의 농도가 50유니트/dl이 되게한다. 반응 혼합물을 3시간 동안 30℃에서 항온처리하면서 pH를 4.0으로 유지한다. 반응에 의해 생성된 뉴클레오사이드-5'-에스테르의 양은 표 2에 나타내었다.

생산된 뉴클레오타이드는 단지 뉴클레오사이드-5'-에스테르만을 포함한다. 뉴클레오사이드-2'-에스테르 및 뉴클레오사이드-3'-에스테르 부산물은 전혀 관찰되지 않는다.

[표 2]

실시예 3: 모르가넬라 모르가니로부터 유래된 산 포스파타제 샘플에 의해, 포스페이트 그룹 공여체로서의 다양한 포스페이트 화합물로부터 5'-이노신산의 생산

포스페이트 그룹 공여체로서 이노신(2g/dl) 및 트리폴리인산나트륨, 폴리인산나트륨(상표명: 폴리곤 P, Chiyoda Chemical), 이나트륨 페닐포스페이트 또는 이나트륨 카바밀 포스페이트(10g/dl)를 나트륨 아세테이트 완충액(pH 4.0)중에 용해시키고, 여기에 실시예 1에서 제조한 효소 샘플을 첨가하여 이의 농도가 50유니트/dl이 되게 한다. 반응 혼합물을 3시간 동안 30℃에서 항온처리하면서 pH를 4.0으로 유지시킨다. 반응에 의해 생성된 5'-이노신산의 양은 표 3에 나타내었다.

어떤 포스페이트 그룹 공여체를 사용하더라도 5'-이노신산이 효율적으로 생산되고 축적된다.

그러나, 5'-이노신산의 축적량은 포스페이트 그룹 공여체로서 폴리인산나트륨이 사용되는 경우에 가장 높다.

[표 3]

실시예 4: 에스케리치아 블라태로부터 유래된 산 포스파타제의 정제 및 특성규명

펩톤 1g/dl, 효모 추출물 0.5g/dl 및 염화나트륨 1g/dl를 포함하는 영양 배지(pH 7.0, 50ml)를, 20분 동안 120℃에서 살균한 사카구치 플라스크(500ml)에 붓는다. 에스케리치아 블라태 JCM 1650의 사면 배양물은 백금 루프를 사용하여 한번씩 플라스크의 각각에 접종하고, 교반시키면서 16시간 동안 30℃에서 배양한다. 원심분리하여 배양물로부터 미생물 세포를 수집한다. 미생물 세포(약 3,300g)를 100mM 인산칼륨 완충액(1L, pH 7.0)중에 현탁시킨다. 20분 동안 4℃에서 초음파 처리하여 미생물 세포을 파쇄시킨다. 처리된 현탁액을 원심분리하여 이의 불용성 분취물을 제거한다. 이어서, 세포 비함유 추출물을 제조한다.

30% 포화도에 이르도록 황산암모늄을 세포 비함유 추출물에 첨가한다. 발생된 침전물을 원심분리하여 제거한 다음, 상등액에 황산암모늄을 추가로 첨가하여 60% 포화도에 이르도록한다. 발생한 침전물을 원심분리하여 회수하고 100mM 인산칼륨 완충액중에 용해시킨다.

상기 조 효소 용액을 100mM 인산칼륨 완충액(pH 7.0) 5L에 대해 4회 투석한 다음, 20mM 인산칼륨 완충액(pH 7.0)으로 평형화시킨 DEAE-토요필 650M 칼럼(ø 6.2 x 35cm)에 적용시킨 다음, 20mM 인산칼륨 완충액(pH 7.0)으로 세척한다. 인산전달 활성이 칼럼을 통과한 분취물에 나타나면, 상기 분취물을 수집한다.

활성 분취물에 황산암모늄을 첨가하여 35% 포화도에 이르도록 하고, 35% 포화된 황산암모늄을 포함하는 20mM 인산칼륨 완충액(pH 7.0)으로 평형화시킨 부틸-토요필 칼럼(ø 5.0 x 22.5cm)에 적용시킨다. 인산칼륨 완충액(pH 7.0)중에서 35% 내지 20%의 포화도에 이르는 선형 농도 구배를 사용하여 용출시킨다.

활성 분취물을 수집하고 100mM 인산칼륨 완충액(pH 7.0) 1L에 대해 투석시킨 다음, 100mM 인산칼륨 완충액(pH 7.0)으로 평형화시킨 하이드록시애퍼타이트 칼럼(ø 3.0 x 7.0cm)에 적용시킨다. 50mM 내지 100mM의 인산칼륨 완충액(pH 7.0)중 선형 농도 구배를 사용하여 용출시키고 활성 분취물을 수집한다.

상기 효소 용액을 10mM 인산칼륨 완충액(pH 6.0) 1L에 대해 투석시킨 다음, 10mM 인산칼륨 완충액(pH 6.0)으로 평형화시킨 CM-토요필 칼럼(ø 2.0 x 14.0cm)에 적용시킨다. 0mM 내지 300mM의 염화칼륨을 포함하는 인산칼륨 완충액(pH 6.0)중 선형 농도 구배를 사용하여 용출시킨다. 칼럼으로부터 용출된 활성 분취물을 수집한다.

상기 기술된 바와 같은 방법에 따라, 인산전달 활성을 나타내는 효소를 결과적으로 약 600배로 농축되게 세포 비함유 추출물로부터 약 16%의 회수율로 정제한다. 상기 정제 방법에서의 비활성 및 회수율은 표 4에 나타내었다. 상기 효소 샘플은 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동상에서 균질하다.

[표 4]

정제된 효소는 하기의 성질을 갖는다.

(2) 기질 특이성: 인산전달 반응중에서 포스페이트 그룹 공여체로서 작용하는 것은, 예를 들어 피로인산, 트리폴리인산, 트리메타인산, 테트라메타인산, 헥사메타인산, 이나트륨 페닐포스페이트, 이칼륨 페닐포스페이트, 0,0-디페닐인산 무수물, 이나트륨 카바밀 포스페이트, 이칼륨 카바밀 포스페이트, 이암모늄 카바밀 포스페이트 및 이리튬 카바밀 포스페이트를 포함한다. 포스페이트 그룹 수용체로서 작용하는 것은, 예를 들어 퓨린 리보사이드, 이노신, 구아노신, 아데노신, 크산토신, 우리딘 및 시티딘을 포함한다. 한편, 포스페이트 에스테르 가수분해 반응중에서 작용하는 것은, 예를 들어 피로인산, 트리폴리인산, 트리메타인산, 테트라메타인산, 헥사메타인산과 같은 무기 인산; 이나트륨 페닐포스페이트, 이칼륨 페닐포스페이트, 0,0-디페닐인산 무수물, 이나트륨 카바밀 포스페이트, 이칼륨 카바밀 포스페이트, 이암모늄 카바밀 포스페이트 및 이리튬 카바밀 포스페이트와 같은 포스페이트 에스테르; 및 5'-퓨린 리보타이드, 5'-이노신산, 5'-구아닐산, 5'-아데닐산, 5'-크산틸산, 5'-우리딜산 및 5'-시티딜산과 같은 5'-뉴클레오타이드를 포함한다.

(4) pH 안정성: pH 3.5 내지 12.0(30℃에서 60분 동안 처리)

(5) 최적 온도: 약 35℃

(6) 온도 안정성: 40℃까지 안정함(pH 7.0에서 30분 동안 처리)

(7) 금속 이온 및 억제제의 첨가 효과: 상기 효소는 임의의 금속 이온을 첨가함에 따라 이의 활성과 관련된 활성화 현상을 나타내지 않는다. 활성은 Fe²⁺, Ag²⁺, Pb²⁺, Hg²⁺ 및 Cu²⁺에 의해 억제된다. 활성은 또한 요오드아세트산에 의해 억제된다.

(8) 분자량: 고성능 액체 크로마토그래피(TSKgel G-3000SW, Toyo Soda)에 따라 계산된 분자량은 약 188,000이다.

(9) 서브유니트 분자량: SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 따라 계산된 서브유니트 분자량은 약 24,500이다.

상기 효소는 모르가넬라 모르가니 NCIMB 10466의 세포 비함유 추출물로부터 정제된 효소와 동일한 방식으로 포스페이트 그룹을 뉴클레오사이드로 전달하는 활성 뿐만아니라 역으로 포스페이트 에스테르를 가수분해하는 활성을 나타낸다. 더욱이 상기 효소는 인산전달 활성보다 30배 이상 높은 포스페이트 에스테르 가수분해 활성(포스포모노에스터라제 활성)을 나타낸다. 따라서, 상기 효소가 산 포스파타제인 것이 명백하다.

피로인산나트륨(15g/dl) 및 이노신(3g/dl)을, 각각 pH 5.5, 5.0, 4.5, 4.0 및 3.5를 갖는 나트륨 아세테이트 완충액중에 용해시키고, 여기에 상기 기술한 효소 샘플을 첨가하여 50유니트/dl의 농도를 수득한다. 각각의 pH를 유지하면서 반응 혼합물을 6시간 동안 30℃에서 항온처리하고, 생산된 5'이노신산의 양을 시간의 경과에 따라 측정한다. 생산된 이노신산은 단지 5'-이노신산만을 포함한다. 2'-이노신산 및 3'-이노신산 부산물은 전혀 관찰되지 않는다. 결과는 도 2에 나타내었다. 5'-이노신산 생산 속도는 pH 5.0에서 최대이다. 그러나, 5'-이노신산의 최대 축적량은 보다 낮은 pH에서 더 높다. pH 4.0에서의 반응 조건이 5'-이노신산의 생산에 가장 효과적이다. 5'-이노신산은 3시간 동안 pH 4.0 및 30℃에서 반응을 수행하여 1.56g/dl의 양으로 생산되고 축적된다.

실시예 5: 에스케리치아 블라태로부터 유래된 산 포스파타제 샘플에 의한 다양한 뉴클레오사이드의 인산화 반응

피로인산나트륨(15g/dl), 및 이노신, 구아노신, 우리딘 또는 시티딘(3g/dl)을 나트륨 아세테이트 완충액(pH 4.0)중에 용해시키고 여기에 실시예 4에서 제조한 효소 샘플을 첨가하여 이의 농도가 50유니트/dl이 되게한다. 반응 혼합물을 3시간 동안 35℃에서 항온처리하면서 pH를 4.0으로 유지한다. 생성된 뉴클레오사이드-5'-에스테르의 양은 표 5에 나타내었다.

[표 5]

실시예 6: 에스케리치아 블라태부터 유래된 산 포스파타제 샘플에 의해, 포스페이트 그룹 공여체로서의 다양한 포스페이트 화합물로부터 5'-이노신산의 생산

포스페이트 그룹 공여체로서 이노신(2g/dl) 및 트리폴리인산나트륨, 폴리인산나트륨(상표명: 폴리곤 P, Chiyoda Chemical), 이나트륨 페닐포스페이트 또는 이나트륨 카바밀 포스페이트(10g/dl)를 나트륨 아세테이트 완충액(pH 4.0)중에 용해시키고, 여기에 실시예 4에서 제조한 효소 샘플을 첨가하여 이의 농도가 50유니트/dl이 되게 한다. 반응 혼합물을 3시간 동안 35℃에서 항온처리하면서 pH를 4.0으로 유지시킨다. 생성된 5'-이노신산의 양은 표 6에 나타내었다.

어떤 포스페이트 그룹 공여체를 사용하더라도 5'-이노신산이 효율적으로 생산되고 축적된다. 그러나 5'-이노신산의 축적된 양은 폴리인산나트륨이 포스페이트 그룹 공여체로서 사용되는 경우 가장 높다.

[표 6]

실시예 7: 모르가넬라 모르가니의 염색체로부터 산 포스파타제를 암호화하는 유전자의 분리

(1) N-말단 아미노산 서열의 결정

실시예 1에서 기술한 방법에 따라 모르가넬라 모르가니 NCIMB 10466의 세포 비함유 추출물로부터 정제된 산 포스파타제를 DITC 막(Milligen/Biosearch)에 흡착시키고 이의 N-말단 아미노산 서열을 프로서열화기 6625(Milligen/Biosearch)를 사용하여 결정한다. 서열 목록의 서열 1에 나타낸 20개 잔기를 포함하는 N-말단 아미노산 서열이 결정된다.

(2) 산 포스파타제를 암호화하는 유전자를 포함하는 DNA 단편의 분리

머레이 및 톰슨의 방법[참조: Nucl. Acid Res., 4321, 8(1980)]에 따라 모르가넬라 모르가니 NCIMB 10466의 배양된 미생물 세포로부터 염색체 DNA를 추출한다. 염색체 DNA를 제한효소 Sau3AI를 사용하여 부분적으로 분해한다. 이후에 3 내지 6kbp의 DNA 단편을 슈크로즈 밀도 구배 원심분리에 의해 분별한다. 플라스미드 벡터 pUC118(Takara Shuzo)를 제한효소 BamHI로 분해하고 부분적으로 분해된 염색체 DNA 단편과 결합시킨다. 지정된 방법에 따라 DNA 결합 키트(Takara Shuzo)를 사용하여 DNA를 결합시킨다. 이후에 통상적인 방법에 따라 에스케리치아 콜리 JM109(Takara Shuzo)를 수득한 DNA 혼합물로 형질전환시킨다. 형질전환체를 앰피실린 100μg/ml을 포함하는 L 한천 배지 상에 도말하고, 유전자 라이브러리를 준비하기위해 이를 증식시킨다.

4mM p-니트로페닐인산 및 100mM MES/NaOH 완충액(pH 6.0)을 포함하는 반응 용액을 형질전환체가 증식하는 한천 배지의 표면에 분주하고 온도를 15분 동안 30℃에서 유지시킨다. 포스파타제 활성을 나타내는 균주는 p-니트로페놀을 유리시켜 황색을 나타낸다. 따라서, 형질전환체는 상기 현상을 지표로서 사용하여 선별한다. 약 20,000개의 형질전환체 균주를 포함하는 유전자 발현 라이브러리를 스크리닝한 결과로서, 포스파타제 활성을 나타내는 30개의 형질전환체 균주가 수득된다.

포스파타제 활성을 나타내는 형질전환체(30개 균주)는 단독의 콜로니로 분리한다. 단독 콜로니는 앰피실린 100μg/ml을 포함한 L-배지(2.5ml)에 접종하고, 이들은 16시간 동안 37℃에서 배양시킨다. 이노신(2g/dl) 및 피로인산나트륨(10g/dl)을 포함하는 나트륨 아세테이트 완충액(100mM, pH 5.0, 50μl)을 배양물로 부터 수집한 미생물 세포에 첨가하고 반응 혼합물을 16시간 동안 30℃에서 항온처리한다. 5'-이노신산의 생산을 HPLC 분석으로 검출하여 인산전달 활성을 갖는 미생물 균주를 선별한다. 그 결과, 인산전달 활성을 나타내고 목적하는 산 포스파타제 유전자를 포함하는 DNA 단편을 함유한 것으로 추정되는 5개의 형질전환체 균주를 수득하는데 성공하였다.

실시예 8: 모르가넬라 모르가니 NCIMB 10466으로부터 유래된 산 포스파타제 유전자의 뉴클레오타이드 서열의 결정

삽입된 DNA 단편은 알칼리 용균 방법[참조: Molecular Cloning 2nd edition, J. Sambrook, E. F. Fritsch and T. Maniatis, Cold Spring Harbour Laboratory Press, pl. 25(1989)]에 따라 실시예 7에서 수득한 모르가넬라 모르가니 NCIMB 10466에서 유래된 산 포스파타제 유전자를 포함하는 DNA를 함유한 것으로 추정되는 형질전환체 균주 하나로부터 플라스미드를 제조하여 분석한다. 상기 플라스미드를 pMPI501로서 지정한다. 도 3은 삽입된 DNA 단편의 결정된 제한효소 지도를 보여준다.

산 포스파타제 유전자의 영역은 서브클로닝에 의해 추가로 구체화된다. 그 결과, 상기 산 포스파타제 유전자가 제한효소 HindIII 및 EcoRI에 의해 절단되는 1.2kbp의 크기를 갖는 단편내에 포함되는 것으로 제안되었다. 따라서, 뉴클레오타이드 서열을 결정하기 위하여, 1.2kbp의 단편을 HindIII 및 EcoRI로 분해된 pUC118과 결합시켜 플라스미드 DNA를 작제한다. 에스케리치아 콜리 JM109(Takara Shuzo)를 통상적인 방법에 따라 pMPI505로서 지정된 상기 플라스미드 DNA로 형질전환시키고, 앰피실린 100μg/ml을 포함하는 L 한천 배지상에 도말하여 형질전환체를 수득한다.

뉴클레오타이드 서열을 결정하기 위해 pMPI505를 함유하는 에스케리치아 콜리 JM109(Takara Shuzo)의 형질전환체로부터 알칼리 용균 방법에 따라 플라스미드를 추출한다. 뉴클레오타이드 서열은 생거(Sanger) 방법[참조: J. Mol. Biol., 143, 161(1980)]에 따라 택 다이데옥시 터미네이터 사이클 서열분석 키트(Taq DyeDeoxy Terminator Cycle Sequencing Kit; Applied Biochemical)를 사용하여 결정한다. 결정된 개방 판독 프레임의 뉴클레오타이드 서열은 서열 목록의 서열 2에 나타내었다. 뉴클레오타이드 서열로부터 추론된 단백질의 아미노산 서열은 서열목록의 서열 3에 나타내었다. 정제된 효소의 N-말단 아미노산 서열과 완전히 일치하는 일부 서열이 아미노산 서열에서 발견된다. 정제된 효소의 N-말단은 서열 3에 나타낸 서열중 21번째 알라닌 잔기에서 시작된다. 따라서, 서열 3에 나타낸 아미노산 서열은 전구체 단백질의 서열이고 첫 번째 메티오닌 잔기에서 20번째 알라닌 잔기의 범위를 포함하는 펩티드는 해독후 제거되는 것으로 추정된다. 따라서, 추론된 성숙한 단백질의 아미노산 서열은 서열 목록의 서열 4에 나타내었다. 아미노산 서열로부터 추정되는 성숙한 단백질의 분자량은 24.9킬로돌턴인 것으로 계산되었고, 이것은 정제된 효소에 대한 SDS-PAGE의 결과와 일치한다. 상기 기술한 결과에 따라, 상기 단편을 포함하는 플라스미드를 함유하는 형질전환체가 인산전달 활성을 나타낸다는 사실 때문에, 상기 개방 판독 프레임은 목적하는 산 포스파타제를 암호화하는 영역인 것으로 확인된다.

뉴클레오타이드 서열 및 아미노산 서열은 각각 상동성에 대해서 공지된 서열과 비교한다. EMBL 및 SWISS-PROT의 데이타베이스를 사용한다. 그 결과, 서열 목록의 서열 2에 나타낸 뉴클레오타이드 서열은 54번째 G가 A이고, 72번째 G가 A이고, 276번째 T가 G이고, 378번째 T가 C이고, 420번째 G가 T이고, 525번째 C가 G이고, 529번째 C가 T이고, 531번째 G가 A인 것을 제외하고는 모르가넬라 모르가니로부터 유래된 공지된 산 포스파타제 유전자의 뉴클레오타이드 서열과 일치하고, 서열 목록의 서열 4에 나타낸 아미노산 서열은 모르가넬라 모르가니로부터 유래된 공지된 산 포스파타제 유전자의 아미노산 서열과 일치하는 것으로 밝혀졌다[참조: Thaller, M. C. et al., Microbiology, 140, 1341(1994)]. 즉, 서열 목록의 서열 4에 나타낸 아미노산 서열로 이루어진 단백질을 암호화하는 유전자는 모르가넬라 모르가니 NCIMB 10466의 산 포스파타제 유전자이다.

전구체 단백질은 249개의 아미노산으로 구성되고 이의 서열로부터 추론된 단백질의 분자량은 27.0킬로돌턴이다.

플라스미드 pMPI505에 의해 형질전환된 에스케리치아 콜리 JM109 균주를 AJ13143으로서 지정하였고, 이를 부다페스트 조약하에 1996년 2월 23일에 통상산업성 공업기술원 생명공학공업기술연구소[National Institute of Bioscience and Human Technology of Agency of Industrial Science and Technology; 주소: 우편번호 305; 1-3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japan]에 국제 기탁하였고 수탁번호 FERM BP-5422를 부여받았다.

실시예 9: 모르가넬라 모르가니 NCIMB 10466으로부터 유래된 산 포스파타제 유전자 발현에 의한 활성의 증폭

실시예 8에서 작제된 에스케리치아 콜리 JM109/pMPI505를 앰피실린 100μg/ml 및 IPTG 1mM를 포함하는 L-배지(50ml)에 접종하고 16시간 동안 37℃에서 배양한다. 미생물 세포를 원심분리하여 이의 배양물로부터 수집하고 생리 식염수로 1회 세척한다. 미생물 세포를 100mM 인산칼륨 완충액(5ml, pH 7.2)중에 현탁시키고 이들을 20분 동안 4℃에서 초음파 처리로 파쇄한다. 처리된 용액을 원심분리하여 불용성 분취물을 제거한 다음, 세포 비함유 추출물을 제조한다.

수득한 세포 비함유 추출물의 인산전달 활성은, 상기 기술한 바와 동일한 방법으로 플라스미드 pUC118로 형질전환된 야생형 모르가넬라 모르가니 및 에스케리치아 콜리 JM109 균주로부터 제조한 세포 비함유 추출물의 대조구를 사용하여 측정한다. 결과는 표 7에 나타내었다. 인산전달 활성은 에스케리치아 콜리 JM109/pUC118에서 검출되지 않았다. 인산전달 활성은 또한 모르가넬라 모르가니의 야생형 균주에서도 낮다. 한편, 에스케리치아 콜리 JM109/pMPI505는 비활성에 있어서 야생형의 모르가넬라 모르가니 균주의 활성보다 150배 높은 인산전달 활성을 나타낸다. 결과에 따르면, 도입된 DNA 단편이 에스케리치아 콜리가 높은 수준의 산 포스파타제를 발현하도록 하는 것으로 입증된다.

[표 7]

실시예 11: 에스케리치아 블라태의 염색체로부터 산 포스파타제를 암호화하는 유전자 분리

(1) N-말단 아미노산 서열의 결정

에스케리치아 블라태 JCM 1650의 세포 비함유 추출물로부터 정제된 산 포스파타제를 DITC 막(Milligen/Biosearch)에 흡착시키고, 이의 N-말단 아미노산 서열은 프로서열화기 6625(Milligen/Biosearch)를 사용하여 결정한다. 서열 목록의 서열 8에 나타낸 15개 잔기를 포함하는 N-말단 아미노산 서열이 결정된다.

머레이 및 톰슨의 방법[참조: Nucl. Acid Res., 4321, 8(1980)]에 따라 에스케리치아 블라태 JCM 1650의 배양된 세포로부터 염색체 DNA를 추출한다. 염색체 DNA를 제한효소 Sau3AI를 사용하여 부분적으로 분해한다. 이후에 3 내지 6kbp의 DNA 단편을 슈크로즈 밀도 구배 원심분리에 의해 분별한다. 플라스미드 벡터 pUC118(Takara Shuzo)를 제한효소 BamHI로 분해하고, 부분적으로 분해된 염색체 DNA 단편과 결합시킨다. 지정된 방법에 따라 DNA 결합 키트(Takara Shuzo)를 사용하여 DNA를 결합시킨다. 이후에 통상적인 방법에 따라 에스케리치아 콜리 JM109(Takara Shuzo)를 수득한 DNA 혼합물로 형질전환시킨다. 형질전환체를 앰피실린 100μg/ml을 포함하는 L 한천 배지 상에 도말하고, 유전자 라이브러리를 준비하기위해 이를 증식시킨다.

4mM p-니트로페닐인산 및 100mM MES/NaOH 완충액(pH 6.5)을 포함하는 반응 용액을 형질전환체가 증식하는 한천 배지의 표면에 분주하고 온도를 15분 동안 30℃에서 유지시킨다. 포스파타제 활성을 나타내는 균주는 p-니트로페놀을 유리시켜 황색을 나타낸다. 따라서, 형질전환체는 상기 현상을 지표로서 사용하여 선별한다. 약 8,000개의 형질전환체 균주를 포함하는 유전자 발현 라이브러리를 스크리닝한 결과, 포스파타제 활성을 나타내는 14개의 형질전환체 균주가 수득된다.

포스파타제 활성을 나타내는 형질전환체(14개 균주)는 단독의 콜로니로 분리한다. 단독 콜로니는 앰피실린 100μg/ml을 포함한 L-배지(2.5ml)에 접종하고, 이들은 16시간 동안 37℃에서 배양시킨다. 이노신(2g/dl) 및 피로인산나트륨(10g/dl)을 포함하는 나트륨 아세테이트 완충액(100mM, pH 5.0, 50μl)을 배양물로부터 수집한 미생물 세포에 첨가하여 16시간 동안 30℃에서 반응시킨다. 5'-이노신산의 생산을 HPLC 분석으로 검출하여 인산전달 활성을 갖는 미생물 균주를 선별한다. 그 결과, 인산전달 활성을 나타내고 목적하는 산 포스파타제 유전자를 포함하는 DNA 단편을 함유한 것으로 추정되는 3개의 형질전환체 균주를 수득하는데 성공하였다.

실시예 12: 에스케리치아 블라태 JCM 1650으로부터 유래된 산 포스파타제 유전자의 뉴클레오타이드 서열의 결정

삽입된 DNA 단편은 실시예 11에서 수득한 에스케리치아 블라태 JCM 1650에서 유래된 산 포스파타제 유전자를 포함하는 DNA 단편을 함유한 것으로 추정되는 형질전환체 균주 하나로부터 알칼리 용균 방법에 따라 플라스미드를 추출하여 분석한다. 상기 플라스미드를 pEPI301로 지정한다. 도 5는 삽입된 DNA 단편의 결정된 제한효소 지도를 보여준다.

산 포스파타제 유전자의 영역은 서브클로닝에 의해 추가로 구체화된다. 그 결과, 상기 산 포스파타제 유전자가 제한효소 ClaI 및 BamHI에 의해 절단되는 2.4kbp의 크기를 갖는 단편내에 포함되는 것으로 제안되었다. 따라서, 뉴클레오타이드 서열을 결정하기 위하여, 단편을 ClaI 및 BamHI로 분해된 pBluescript KS(+)와 결합시켜 플라스미드 DNA를 작제한다. 에스케리치아 콜리 JM109(Takara Shuzo)를 통상적인 방법에 따라 pEP1305로서 지정된 상기 플라스미드 DNA로 형질전환시키고, 앰피실린 100μg/ml을 포함하는 L 한천 배지상에 도말하여 형질전환체를 수득한다.

뉴클레오타이드 서열을 결정하기 위해 pEPI305를 함유하는 에스케리치아 콜리 JM109(Takara Shuzo)의 형질전환체로부터 알칼리 용균 방법에 따라 플라스미드를 추출한다. 결정된 개방 판독 프레임의 뉴클레오타이드 서열은 서열 목록의 서열 6에 나타내었다. 뉴클레오타이드 서열로부터 추론된 단백질의 아미노산 서열은 서열 목록의 서열 7에 나타내었다. 정제된 효소의 N-말단 아미노산 서열과 완전히 일치하는 일부 서열이 아미노산 서열에서 발견된다. 정제된 효소의 N-말단은 서열 7에 나타낸 서열중 19번째 류신 잔기에서 시작된다. 따라서, 서열 7에 나타낸 아미노산 서열은 전구체 단백질의 서열이고 첫 번째 메티오닌 잔기에서 18번째 알라닌 잔기의 범위를 포함하는 펩티드는 해독후 제거되는 것으로 추정된다. 따라서, 추론된 성숙한 단백질의 아미노산 서열은 서열 목록의 서열 8에 나타내었다. 성숙한 단백질의 추정된 분자량은 25.1킬로돌턴인 것으로 계산되었고 이것은 정제된 효소에 대한 SDS-PAGE의 결과와 일치한다. 상기 기술한 결과에 따라, 상기 단편을 포함하는 플라스미드를 함유하는 형질전환체가 인산전달 활성을 나타낸다는 사실때문에, 상기 개방 판독 프레임은 목적하는 산 포스파타제를 암호화하는 영역인 것으로 확인된다.

즉, 서열 목록의 서열 8에 나타낸 아미노산 서열로 이루어진 단백질을 암호화하는 유전자는 에스케리치아 블라태 JCM 1650의 산 포스파타제 유전자이다.

뉴클레오타이드 서열 및 아미노산 서열은 각각 상동성에 대해서 공지된 서열과 비교한다. EMBL 및 SWISS-PROT의 데이타베이스를 사용한다. 그 결과, 서열 8에 나타낸 단백질 및 이를 암호화하는 DNA가 신규한 것으로 밝혀졌다. 상기 유전자에 의해 암호화된 전구체 단백질은 249개의 아미노산으로 구성되고 이의 서열로부터 추론된 단백질의 분자량은 27.0킬로돌턴이다.

아미노산 서열은 각각 상동성에 대해 공지된 서열과 비교한다. 그 결과, 상기 단백질은 프로비덴시아 스투아르티의 산 포스파타제(77%), 실시예 8의 모르가넬라 모르가니의 산 포스파타제(77.1%) 및 살모렐라 티피무리엄(Salmonella typhimurium)의 산 포스파타제(44.3%)와의 높은 고도의 상동성을 나타낸다.

플라스미드 pEP1305에 의해 형질전환된 에스케리치아 콜리 JM109 균주를 AJ13144으로 지정하였고, 이를 부다페스트 조약하에 1996년 2월 23일에 통상산업성 공업기술원 생명공학공업기술연구소[National Institute of Bioscience and Human Technology of Agency of Industrial Science and Technology; 주소: 우편번호 305; 1-3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japan]에 국제 기탁하였고 수탁번호 FERM BP-5423을 부여받았다.

실시예 13: 에스케리치아 블라태 JCM 1650로부터 유래된 산 포스파타제 유전자 발현에 의한 활성의 증폭

실시예 12에서 작제된 에스케리치아 콜리 JM109/pEP1305를 앰피실린 100μ g/ml 및 IPTG 1mM를 포함하는 L-배지(50ml)에 접종하고 16시간 동안 37℃에서 배양한다. 미생물 세포를 원심분리하여 이의 배양물로부터 수집하고 생리 식염수로 1회 세척한다. 미생물 세포를 100mM 인산칼륨 완충액(5ml, pH 7.2)중에 현탁시키고 이들을 20분 동안 4℃에서 초음파 처리로 파쇄한다. 처리된 용액을 원심분리하여 불용성 분취물을 제거한 다음, 세포 비함유 추출물을 제조한다.

수득한 세포 비함유 추출물의 인산전달 활성은, 상기 기술한 바와 동일한 방법으로 플라스미드 pBluescript KS(+)로 형질전환된 야생형 에스케리치아 블라태 및 에스케리치아 콜리 JM109 균주로부터 제조한 세포 비함유 추출물의 대조구를 사용하여 측정한다. 결과는 표 8에 나타내었다. 인산전달 활성은 에스케리치아 콜리 JM109/pBluescript KS(+)에서 검출되지 않는다. 인산전달 활성은 또한 에스케리치아 블라태의 야생형 균주에서도 낮다. 한편, 에스케리치아 콜리 JM109/pEPI305는 비활성에 있어서 야생형 에스케리치아 블라태 균주의 활성보다 120배 높은 인산전달 활성을 나타낸다. 결과에 따르면, 도입된 DNA 단편이 에스케리치아 콜리가 높은 수준의 산 포스파타제를 발현하도록 하는 것으로 입증된다.

[표 8]

실시예 14: 에스케리치아 블라태 JCM 1650에서 유래된 산 포스파타제 유전자를 함유하는 균주를 사용하여 이노신으로부터 5'-이노신산 생산

피로인산나트륨(12g/dl) 및 이노신(6g/dl)을 100M 나트륨 아세테이트 완충액(pH 4.0)중에 용해시키고, 여기에 상기 기술한 에스케리치아 콜리 JM109/pEPI305의 미생물 세포를 첨가하여 미생물 세포의 건식 중량으로 전환시 200mg/dl인 세포 농도를 수득한다. 반응 혼합물을 10시간 동안 35℃에서 항온처리하면서 pH를 4.0으로 유지시키고, 생산된 5'-이노신산의 양을 시간의 경과에 따라 측정한다. 생산된 이노신산은 5'-이노신산만을 함유한다. 2'-이노신산 및 3'-이노신산 부산물은 전혀 관찰되지 않는다. 결과는 도 6에 나타내었다. 반응에 상기 미생물을 사용하여 피로포스페이트 및 이노신으로부터 짧은 시간내에 최대 효율로 5'-이노신산을 생산하고 축적시켜 5'-이노신산을 생산한다.

실시예 15: 포스포모노에스터라제 활성이 저하된 산 포스파타제를 암호화하는 유전자의 제조

실시예 13 및 14에서 기술한 바와 같이, 에스케리치아 블라태로부터 유래된 산 포스파타제 유전자를 함유하는 균주는 상당한 양의 산 포스파타제를 발현하며, 반응에 상기 미생물을 사용하여 피로인산 및 이노신으로부터 짧은 시간내에 최대 효율로 5'-이노신산을 생산하고 축적시켜 5'-이노신산을 생산한다. 그러나, 생산된 5'-이노신산이 산 포스파타제 자체가 지니는 포스포모노에스터라제 활성으로 인해 분해되기 때문에, 5'-이노신산의 축적량은 어느 정도를 초과하지 않는다. 따라서 PCR 사용에 의한 부위-지시된 돌연변이에 따라, 실시예 11에서 클로닝된 에스케리치아 블라태에서 유래된 산 포스파타제 유전자에 돌연변이를 도입하여 상기 효소를 개선시키고자 한다.

서열 목록의 서열 9, 10 및 11에 나타낸 올리고뉴클레오타이드 MUT300, MUT310 및 MUT320은 DNA 합성기(모델 394, Applied Biosystems)를 사용하여 포스포아미디트 방법에 따라 각각 합성한다.

주형으로서 실시예 12에서 제조한 플라스미드 pEPI305(1ng), 프라이머로서 M13 프라이머 RV(Takara Shuzo) 및 MUT310 올리고뉴클레오타이드(각각 2.5μmol) 및 택 DNA 폴리머라제(2.5유니트, Takara Shuzo)를 dATP, dCTP, dGTP, dTTP(각각 200μM), 염화칼륨(50mM) 및 염화마그네슘(1.5mM)을 포함하는 100mM 트리스-HCl 완충액(pH 8.3, 100μl)에 첨가하고, 94℃에서 30초, 55℃에서 2분 및 72℃에서 3분으로 구성되는 싸이클을 25회 반복하여 PCR 반응을 수행한다. PCR 반응은 열 순환기 PJ2000형(Takara Shuzo)을 사용하여 수행한다. 또한, 주형으로서 플라스미드 pEPI305(1ng), 프라이머로서 M13 프라이머 M3(Takara Shuzo) 및 MUT300 올리고뉴클레오타이드(각각 2.5μmol)를 사용하여 상기 기술한 것과 동일한 방법으로 PCR 반응을 수행한다. 각각의 반응 용액을 겔 여과로 정제하고 마이크로스핀(Microspin)칼럼 S-400(Pharmacia)을 사용하여 프라이머를 제거한다.

각각의 PCR 반응 산물(1μl)을 dATP, dCTP, dGTP, dTTP(각각 200uM), 염화칼륨(50mM) 및 염화마그네슘(1.5mM)을 포함하는 100mM 트리스-HCl 완충액(pH 8.3, 95 μl)에 첨가하고 10분 동안 94℃에서 가열한 다음, 60분 이상 37℃로 냉각한다. 이후에 온도를 15분 동안 37℃에서 유지하여 이종이본쇄(heteroduplex)를 형성한다. 택 DNA 폴리머라제(2.5유니트)를 여기에 첨가하여 3분 동안 72℃에서 반응을 수행하여 이종이본쇄를 완성시킨다. 이후에, M13 프라이머 RV 및 M13 프라이머 M3(각각 2.5μmol)을 상기 반응 용액에 첨가하여 PCR 반응을 수행하고, 94℃에서 30초, 55℃에서 2분 및 72℃에서 3분으로 이루어진 싸이클을 10회 반복한다.

두 번째 PCR 반응 산물을 ClaI 및 BamHI로 분해하고 페놀/클로로포름으로 추출한 다음, 에탄올로 침전시킨다. 상기 DNA 단편을, ClaI 및 BamHI으로 분해시킨 pBluescript KS(+)와 결합시킨다. 에스케리치아 콜리 JM109(Takara Shuzo)를 통상적인 방법에 따라 수득한 플라스미드 DNA로 형질전환시키고, 앰피실린 100μg/ml을 포함하는 L 한천 배지상에 도말하여 형질전환체를 수득한다.

플라스미드를 알칼리 용균 방법에 따라 형질전환체로부터 추출하여 이의 뉴클레오타이드 서열을 결정하여, 목적하는 뉴클레오타이드가 치환되었는지 확인한다. 이로써, 성숙한 단백질의 74번째 글리신 잔기(GGG)가 아스파르트산 잔기(G^*A^*T)로 치환된 돌연변이 포스파타제를 암호화하는 돌연변이 유전자가 제조된다. 상기 돌연변이 유전자를 포함하는 플라스미드는 pEPI310으로 지정한다.

주형으로서 pEPI305 및 프라이머로서 MUT300 및 MUT320을 사용하여 상기 기술한 것과 동일한 방법에 따라, 성숙한 단백질의 153번째 이소류신 잔기(ATC)가 트레오닌 잔기(A^*CC)로 치환된 돌연변이 포스파타제를 암호화하는 돌연변이 유전자를 제조한다. 상기 돌연변이 유전자를 포함하는 플라스미드를 pEPI320으로 지정하였다. 추가로, 상기 기술한 방법에 따라 주형으로서 pEPI310을 사용하고 프라이머로서 MUT300 및 MUT320 올리고뉴클레오타이드를 사용하여, 성숙한 단백질의 74번 글리신 잔기(GGG)가 아스파르트산 잔기(G^*A^*T)로 치환되고 성숙한 단백질의 153번 이소류신 잔기(ATC)가 트레오닌 잔기(A^*CC)로 치환된 돌연변이 포스파타제를 암호화하는 돌연변이 유전자를 제조한다. 상기 돌연변이 유전자를 함유하는 플라스미드를 pEPI330으로 지정하였다.

돌연변이된 산 포스파타제를 포함하는 플라스미드가 각각 도입된 에스케리치아 콜리 JM109/pEPI310, 에스케리치아 콜리 JM109/pEPI320 및 에스케리치아 콜리 JM109/pEPI330, 및 야생형 산 포스파타제 유전자를 포함하는 플라스미드가 도입된 에스케리치아 콜리 JM109/pEPI305를, 앰피실린 100μg/ml 및 IPTG 1mM을 포함한 L-배지(50ml)에 접종하고 이들을 16시간 동안 37℃에서 배양한다. 미생물 세포를 이의 배양물로부터 수집하고 이들을 생리 식염수로 1회 세척한다. 미생물 세포를 100mM 인산칼륨 완충액(5ml, pH 7.0)중에 현탁시키고 20분 동안 4℃에서 초음파 처리하여 파쇄한다. 처리된 용액을 원심분리하여 불용성 분획물을 제거한 다음, 세포 비함유 추출물을 제조한다. 수득한 세포 비함유 추출물의 포스포모노에스터라제 활성 및 인산전달 활성을 pH 4.0에서 측정하고 이를 야생 균주의 활성과 비교한다.

표 9는 야생형 산 포스파타제와 포스포모노에스터라제 활성이 저하된 산 포스파타제의 포스포모노에스터라제 활성 및 인산전달 활성의 측정 결과를 보여준다. 포스포모노에스터라제 활성이 저하된 산 포스파타제의 포스포모노에스터라제 활성 및 인산전달 활성 모두는 야생형 산 포스파타제의 것과 비교하여 저하되었고, 포스포모노에스터라제 활성의 감소 정도는 인산전달 활성의 감소보다 크며, 그 결과로 돌연변이 산 포스포타제의 인산전달 활성에 대한 포스포모노에스터라제의 비는 야생형 산 포스파타제와 비교하여 낮다는 것을 보여준다.

[표 9]

1): 뉴클레오사이드-5'-포스페이트 에스테르를 생산하는 활성에 대한 포스포모노에스터라제 활성의 비

실시예 16: 포스포모노에스터라제 활성이 저하된 산 포스파타제를 암호화하는 유전자를 함유하는 균주를 사용하여 이노신으로부터 5'-이노신산 생산

포스포모노에스터라제 활성이 저하된 산 포스파타제를 암호화하는 유전자를 함유한 플라스미드가 도입된 에스케리치아 콜리 JM109/pEPI310, 에스케리치아 콜리 JM109/pEPI320 및 에스케리치아 콜리 JM109/pEPI330; 및 야생형 산 포스파타제 유전자를 함유하는 플라스미드가 도입된 에스케리치아 콜리 JM109/pEPI305를, 앰피실린 100μg/ml 및 IPTG 1mM을 포함한 L-배지(50ml)에 접종하고 이들을 16시간 동안 37℃에서 배양한다.

피로인산나트륨(12g/dl) 및 이노신(6g/dl)을 나트륨 아세테이트 완충액(pH 4.0)중에 용해시키고 상기 기술한 배양에 의해 수득된 에스케리치아 콜리의 균주 각각의 미생물 세포를 첨가하여 미생물 세포의 건식 중량으로 전환시 200mg/dl인 세포 농도를 수득한다. 반응 혼합물을 32시간 동안 35℃에서 배양하면서 pH를 4.0으로 유지하고, 생산된 5'-이노신산의 양을 시간 경과에 따라 측정한다. 결과는 도 8에 나타내었다.

도 7에서, 세로좌표 축은 5'-이노신산(mg/dl)의 농도를 나타내고 가로좌표축은 반응 시간(h)을 나타낸다. 반응의 진행은 각각의 균주의 세포를 사용하여 측정한 바와 같이 에스케리치아 콜리 JM109/pEPI305에 대해서는 검정 원, 에스케리치아 콜리 JM109/pEPI310에 대해서는 검정 삼각형, 에스케리치아 콜리 JM109/pEPI320에 대해서는 공백 원, 및 에스케리치아 콜리 JM109/pEPI330에 대해서는 공백 사각형에 의해 표시된다.

포스포모노에스터라제 활성이 저하된 산 포스파타제를 함유하는 균주를 사용하여 이노신으로부터 5'-이노신산을 생산하는 반응에서는 생산된 5'-이노신산의 분해 속도가 감소한다. 그 결과, 5'-이노신산의 수율 및 축적량이 증가한다. 5'-이노신산의 최대 축적량은 포스포모노에스터라제 활성이 저하되고 74번째 글리신 잔기 및 153번째 이소류신 잔기가 각각 아스파르트산 잔기 및 트레오닌 잔기로 치환된 산 포스파타제를 암호화는 유전자를 함유하는 균주로서 에스케리치아 콜리 JM109/pEPI330에 의해 나타난다.

실시예 17: 포스포모노에스터라제 활성이 저하된 산 포스파타제를 암호화하는 유전자를 함유한 균주를 사용하여 다양한 뉴클레오사이드-5'-포스페이트 에스테르 생산

포스포모노에스터라제 활성이 저하된 산 포스파타제를 암호화하는 유전자를 함유하는 플라스미드가 도입된 에스케리치아 콜리 JM109/pEPI330을, 앰피실린 100 μg/ml 및 IPTG 1mM을 포함하는 L-배지(50ml)에 접종하고 16시간 동안 37℃에서 배양한다.

포스페이트 그룹 수용체로서 피로인산나트륨(12g/dl), 및 이노신, 구아노신, 우리딘 또는 시티딘(6g/dl)을 100mM 나트륨 아세테이트 완충액(pH 4.0)중에 용해시키고, 여기에 상기 기술한 미생물 세포를 첨가하여 세포의 건식 중량으로 전환시 200mg/dl인 세포 농도를 수득한다. 반응 혼합물을 32시간 동안 35℃에서 배양하면서 pH 4.0으로 유지시킨다. 생산된 뉴클레오사이드-5'-포스페이트 에스테르의 양을 표 10에 나타내었다. 생산된 뉴클레오타이드는 뉴클레오사이드-5'-포스페이트 에스테르만을 포함한다. 뉴클레오사이드-2'-포스페이트 에스테르 및 뉴클레오사이드-3'-포스페이트 에스테르 부산물은 전혀 관찰되지 않는다.

[표 10]

실시예 18: 포스포모노에스터라제 활성이 저하된 산 포스파타제를 암호화하는 유전자를 함유한 균주를 사용하여 포스페이트 그룹으로서의 다양한 포스페이트 화합물로부터 5'-이노신산 생산

돌연변이 산 포스파타제 유전자를 함유하는 플라스미드가 도입된 에스케리치아 콜리 JM109/pEPI330을, 앰피실린 100μg/ml 및 IPTG 1mM을 포함하는 L-배지(50mM)에 접종하고 이를 16시간 동안 37℃에서 배양한다.

포스페이트 그룹 공여체로서 이노신(6g/dl) 및 트리폴리인산나트륨, 폴리인산나트륨(상표명: 폴리곤 P, Chiyoda Chemical), 이나트륨 페닐포스페이트 또는 이나트륨 카바밀 포스페이트(12g/dl)를 100mM 나트륨 아세테이트 완충액(pH 4.0)에 용해시키고, 상기 기술한 미생물 세포를 첨가하여 세포의 건식 중량으로 전환시 200mg/dl인 세포 농도를 수득한다. 반응 혼합물을 32시간 동안 35℃에서 배양시키면서 pH를 4.0으로 유지시킨다. 생산된 5'-이노신산의 양은 표 11에 나타내었다. 5'-이노신산은 어떤 포스페이트 공여체를 사용하여서도 효율적으로 생산되고 축적된다. 그러나, 5'-이노신산의 축적량은 포스페이트 그룹 공여체로서 폴리인산이 사용되는 경우에 가장 높다.

[표 11]

실시예 19

이. 블라태 JCM1650에서 유래된 신규한 돌연변이 산 포스파타제 유전자의 생산 및 돌연변이 산 포스파타제 유전자의 효소적 특성에 관한 연구

실시예 19 내지 22에서, 뉴클레오사이드에 대한 인산전달 활성을 하기의 조건하에서 측정한다. 이노신 4μmol/ml, 피로인산나트륨 100μmol/ml, 나트륨 아서테이트 완충액(pH 4.0) 100μmol/ml 및 효소를 포함한 반응 용액 1ml을 사용하여 30℃ 및 pH 4.0에서 10분 동안 반응을 수행한다. 2-N 염산 200μl를 첨가하여 상기 반응을 종료한다. 이어서, 침전물을 원심분리시켜 제거하고 인산전달을 통해 형성된 5'-이노신산의 양을 상기 언급한 조건하에서 결정한다. 이들 표준 반응 조건하에서 1μmol의 이노신산을 생산하는 효소의 양을 1유니트로서 정의한다.

추가로, 상기 언급한 조성물의 반응 조건하에 10에서 100μmol/ml로 이노신 농도를 변화시켜 인산전달 활성을 측정하고, 인산전달 활성중에 이노신의 속도상수는 한스-울프 플롯을 사용하여 측정한다[참조: Biochem. J., 26, 1406(1932)].

이후에 기술되는 바와 같이, 실시예 15에서 기술된 뉴클레오사이드-5'-포스페이트 에스테르의 생산성을 개선시키는 각각의 돌연변이 효소에 대해 상세한 분석을 수행한다. 결과적으로, 돌연변이 효소의 뉴클레오사이드에 대한 친화도가 야생형 효소의 친화도와 비교하여 2배 개선되었다는 것을 밝혀내었다. 따라서, 본 발명자는 뉴클레오사이드-5'-포스페이트 에스테르의 생산성이 상기 언급한 효소의 뉴클레오사이드에 대한 친화도를 증가시킴으로써 개선되는 것으로 간주하여 유전 공학 방법에 의해 효소를 추가로 변형시켰다

실시예 15에서 기술한 이. 블라태로부터 유래된 야생형 산 포스파타제를 암호화하는 유전자를 함유하는 플라스미드 pEPI305를 사용하고, 유전 공학 방법에 의해 상기 플라스미드 DNA에 부위 특이적인 돌연변이를 도입하여, 돌연변이 산 포스파타제를 암호화하는 유전자를 제조한다. pEPI305는 이. 블라태 JCM1650에서 유래된 야생형 산 포스파타제를 암호화하는 유전자를 포함하고 제한 엔도뉴클레아제 ClaI 및 BamHI로 절단된 2.4Kbp의 DNA 단편을, ClaI 및 BamHI로 절단된 pBluescript KS(+)[Stratagene]에 결합시켜 형성된 플라스미드 DNA이다. 산 포스파타제를 암호화하는 유전자의 염기 서열은 서열 목록의 서열 6에 나타내었다. 추가로 상기 염기 서열로부터 예상되는 전구체 단백질의 아미노산 서열은 서열 목록의 서열 7에 의해 나타내었다. 정제된 효소(실시예 4에서 기술됨)의 분석 결과로부터, 성숙한 단백질의 아미노산 서열은 서열 목록의 서열 8로 나타낸 바와 같은 것으로 추정된다.

서열 목록의 서열을 갖는 올리고뉴클레오타이드 MUT300(서열 목록의 서열 9), MUT310(서열 목록의 서열 10), MUT320(서열 목록의 서열 11), MUT330(서열 목록의 서열 12), MUT340(서열 목록의 서열 13), MUT350(서열 목록의 서열 14), MUT360(서열 목록의 서열 15), MUT370(서열 목록의 서열 16), MUT380(서열 목록의 서열 17) 및 MUT390(서열 목록의 서열 18)은 DNA 합성기(모델 394; Applied Biosystem)를 사용하는 포스포아미디트 방법으로 합성한다.

주형으로서 pEPI305 1ng, M13 프라이머 RV(Takara Shuzo) 2.5μmol, 올리고뉴클레오타이드 MUT310 2.5μmol 및 택 DNA 폴리머라제(Takara Shuzo) 2.5유니트를, dATP 200μM, dCTP 200μM, dGTP 200μM, dTTP 200μM, 염화칼륨 50mM 및 염화마그네슘 1.5mM를 포함하는 트리스-염산염 완충액(pH 8.3) 100㎕에 첨가한다. 3단계, 즉 30초 동안 94℃, 2분 동안 55℃ 및 3분 동안 72℃에서 25회 반복하는 PCR을 수행한다. 상기 반응에서, 열 순환기 PJ2000 모델(Takara Shuzo)을 사용한다. 별도로, 주형으로서 플라스미드 DNA pEPI305 1ng, 프라이머로서 M13 프라이머 M3(Takara Shuzo) 2.5μmol 및 올리고뉴클레오타이드 MUT300 2.5μmol를 사용하여 PCR을 수행한다. 각각의 반응 용액을 마이크로스핀 칼럼 S-400(Pharmacia)을 사용하여 겔 여과에 의해 정제하여 프라이머를 제거한다.

각각의 PCR 용액 1㎕를 dATP 200μM, dCTP 200μM, dGTP 200μM, dTTP 200μM, 50mM 염화칼륨 및 1.5mM 염화마그네슘을 포함하는 100mM 트리스-염산염 완충액(pH 8.3) 95㎕에 첨가한다. 혼합물을 10분 동안 94℃에서 가열한 다음, 60분 이상동안 37℃로 냉각하고 37℃에서 15분 동안 가온하여 이종이본쇄를 형성한다. 여기에 2.5유니트의 택 DNA 폴리머라제를 첨가하고 반응을 72℃에서 3분 동안 수행하여 이종이본쇄를 완성한다. 이어서 M13 프라이머 RV 2.5μmol 및 M13 프라이머 M3 2.5μmol를 반응 용액에 첨가하고, 3단계, 즉 30초 동안 94℃, 2분 동안 55℃ 및 3분 동안 72℃에서 10회 반복하는 PCR을 수행한다.

두 번째 PCR 산물을 ClaI 및 BamHI으로 절단한 다음, 페놀 및 클로로포름의 혼합물로 추출하고 에탄올로 침전시킨다. 상기 DNA 단편을 ClaI 및 BamHI로 절단한 pBluescript KS(+)에 결합시킨다. 이. 콜리 JM109(Takara Shuzo)는 수득한 플라스미드 DNA를 사용하여 통상적인 방법으로 형질전환시킨다. 이것을 앰피실린 100㎍/ml를 포함하는 L-한천 배지상에 도말하여 형질전환체를 수득한다. 플라스미드를 알카리 세균 용균 방법을 사용하여 형질전환체로부터 제조하고, 염기 서열을 결정하여, 목적하는 염기가 치환되었는지를 확인한다. 염기 서열의 결정은 택 다이데옥시 터미네이터 사이클 서열분석 키트(Applied Biochemical)를 사용하여 생거 방법[참조: J. Mol. Biol., 143, 161(1980)]에 의해 수행한다. 상기 방법으로 성숙한 단백질의 74번째 글리신 잔기(GGG)가 아스파르트산 잔기(G^*A^*T)로 치환된 돌연변이 포스파타제를 암호화하는 돌연변이 유전자를 제조한다. 상기 돌연변이 유전자 함유 플라스미드를 pEPI310으로 지정하였다(실시예 15).

주형으로서 도입된 돌연변이가 도입된 플라스미드를 사용하여 상기 언급한 방법을 반복하여 부위-특이적인 돌연변이를 누적 도입한다. 플라스미드를 알카리 세균 용균 방법에 의해 형질전환체로부터 제조하고, 염기 서열을 결정하여, 목적하는 염기가 치환되었는지 확인한다. 돌연변이 포스파타제를 암호화하는, 수득된 돌연변이 유전자 및 돌연변이 부위를 표 12에 나타내었다. 돌연변이 부위내 아미노산 잔기는 서열 목록의 서열 8에 나타낸 성숙한 단백질의 아미노산 서열의 아미노산 잔기를 나타낸다.

[표 12]

돌연변이 산 포스파타제 유전자를 포함하는 플라스미드가 각각 도입된 이. 콜리 JM109/pEPI330, 이. 콜리 JM109/pEPI340, 이. 콜리 JM109/pEPI350, 이. 콜리 JM109/pEPI360, 이. 콜리 JM109/pEPI370, 이. 콜리 JM109/pEPI380, 이. 콜리 JM109/pEPI390 및 이. 콜리 JM109/pEPI400과 야생형 산 포스파타제 유전자를 포함하는 플라스미드가 도입된 이. 콜리 JM109/pEPI305를, 앰피실린 100㎍/ml 및 IPTG 1mM을 포함하는 50ml의 L 배지에 접종하고 16시간 동안 37℃에서 배양한다. 세포를 원심분리하여 각 균주의 2ℓ 배양물로부터 수집하고 생리 식염수로 1회 세척한다. 세포를 100mM 포스페이트 완충액(pH 7.0) 50ml 중에 현탁시키고 4℃에서 20분 동안 초음파 처리하여 세포를 파쇄한다. 처리된 용액을 원심분리하여 불용성 분취물을 제거하고 세포 비함유 추출물을 제조한다. 각각의 산 포스파타제는 실시예 4에서 기술한 방법에 의해 세포 비함유 추출물 각각으로부터 정제한다. 각각의 효소 산물은 SDS-폴리아크릴아미드 전기영동에서 균질하다.

정제된 돌연변이 산 포스파타제 및 야생형 산 포스파타제의 인산전달 반응중이노신의 속도상수를 측정하고 결과를 표 13에 나타내었다. 실시예 15에서 기술된 뉴클레오사이드-5'-포스페이트 에스테르의 생산성이 개선된 이. 콜리 JM109/pEPI330에서 발현되는 돌연변이 효소는 Vmax가 감소되었지만 이노신에 대한 Km 값이 크게 감소하는 것으로 보아 이. 콜리 JM109/pEPI305에서 발현된 야생형 효소와 비교하여 이노신에 대한 친화성이 2배 이상 증가하였음을 의미한다. 이것은 뉴클레오티다제 활성의 감소뿐만 아니라 중요한 인자인 뉴클레오사이드에 대한 친화성이 증가되어 상기 돌연변이 효소의 뉴클레오사이드-5'-포스페이트 에스테르의 생산성이 크게 개선되었다는 것을 제시한다. 따라서, 뉴클레오사이드에 대한 친화성의 증가가 생산성을 개선시킨 것으로 예상된다.

상기 실시예에서 제조한 신규한 돌연변이 효소 유전자가 도입된 이. 콜리 JM109에서 발현되는 신규한 돌연변이 효소는 실시예 15에서 기술한 이. 콜리 JM109/pEPI330의 친화성보다 개선된 이노신에 대한 친화성을 보여준다. 따라서, 뉴클레오사이드-5'-포스페이트 에스테르의 생산성이 개선된 것으로 예상된다. 추가로, 이. 콜리 JM109/pEPI380에서 발현된 돌연변이 효소는 야생형 효소와 비교하여 이노신에 대한 친화성이 개선되었을뿐만 아니라 Vmax값도 증가한다. 추가로 뉴클레오사이드-5'-포스페이트 에스테르의 생산성이 개선된 것으로 예상된다.

[표 13]

실시예 20

신규한 돌연변이 산 포스파타제 유전자 함유 균주를 사용한 5'-이노신산의 생산

돌연변이 산 포스파타제 유전자를 함유하는 플라스미드가 도입된 이. 콜리 JM109/pEPI330, 이. 콜리 JM109/pEPI340, 이. 콜리 JM109/pEPI360, 이. 콜리 JM109/pEPI370 및 이. 콜리 JM109/pEPI380 각각을, 앰피실린 100㎍/ml 및 IPTG 1mM을 포함하는 50ml의 L 배지에 접종하고 16시간 동안 37℃에서 배양한다.

피로인산(15g/dl) 및 이노신 8g/dl을 아세테이트 완충액(pH 4.0)중에 용해시킨다. 상기 언급한 돌연변이 및 야생형 산 포스파타제 유전자가 도입된 이. 콜리 JM109 균주를 용액에 첨가하여 건식 세포 중량을 기준으로 세포 농도가 200mg/dl이 되게한다. 반응을 35℃에서 32시간 동안 수행하면서 pH를 4.0으로 유지하고, 이 시간 동안 형성된 5'-이노신산의 양을 측정한다. 형성된 이노신산은 5'-이노신산뿐이고, 부산물로서 2'-이노신산 및 3'-이노신산의 형성은 전혀 관찰되지 않는다. 결과는 도 8에 나타내었다.

실시예 15에서 기술한 이. 콜리 JM109/pEPI330은 대량의 5'-이노신산의 축적을 나타낸다. 기질이 아직 남아있다 할지라도 5'-이노신산의 형성은 축적된 5'-이노신산의 양이 7.5g/dl에 도달할 때 종료되어 5'-이노신산의 양은 더 이상 증가되지 않는다. 반대로, 신규한 돌연변이 산 포스파타제 유전자 함유 균주는 대량의 축적된 5'-이노신산을 제공한다. 특히, 이. 콜리 JM109/pEPI370 및 이. 콜리 JM109/pEPI380을 사용한 반응에서, 대량의 축적된 5'-이노신산이 제공된다. 추가로, 반응 속도는 높고 5'-이노신산의 생산성이 크게 개선되는 것으로 나타난다. 특히, 이. 콜리 JM109/pEPI380에서 반응 속도는 높고 매우 높은 반응성을 보여준다.

실시예 21

신규한 돌연변이 산 포스파타제 유전자 함유 균주를 사용한 다양한 뉴클레오사이드-5'-포스페이트 에스테르의 생산

신규한 돌연변이 산 포스파타제 유전자를 함유한 플라스미드가 도입된 이. 콜리 JM109/pEPI380을 앰피실린 100㎍/ml 및 IPTG 1mM을 포함하는 L 배지 50ml에 접종하고 16시간 동안 37℃에서 배양한다.

포스페이트 수용체로서 피로인산(15g/dl) 및 이노신, 구아닌, 우리딘 또는 시티딘 8g/dl을 100mM 아세테이트 완충액(pH 4,5)중에 용해시킨다. 여기에 상기 언급한 균주를 첨가하여 건식 세포 중량을 기준으로 세포 농도가 100mg/dl에 이르도록한다. 12시간 동안 35℃에서 반응을 수행하면서 pH를 4.0으로 유지한다. 형성된 뉴클레오사이드-5'-포스페이트 에스테르의 양은 표 14에 나타내었다. 뉴클레오사이드와 함께 인산화를 진행시켜 상응하는 뉴클레오사이드-5'-포스페이트 에스테르를 형성하고 축적시킨다. 형성된 뉴클레오타이드는 단지 뉴클레오사이드-5'-포스페이트 에스테르뿐이고, 부산물로서 뉴클레오사이드-2'-포스페이트 에스테르 및 뉴클레오사이드-3'-포스페이트 에스테르의 형성은 전혀 관찰되지 않는다.

[표 14]

실시예 22

신규한 산 포스파타제 유전자 함유 균주, 및 포스페이트 공여체로서 다양한 인산화합물을 사용한 5'-이노신산의 생산

이노신(6g/dl) 및 트리폴리인산, 폴리인산 ("폴리곤 P", Chiyoda kagaku k.k.), 이나트륨 페닐아세테이트 또는 이나트륨 카바밀포스페이트를 100mM 아세테이트 완충액(pH 4.0)중에 용해시킨다. 여기에 상기 언급한 균주를 첨가하여 건식 세포 중량을 기준으로 세포 농도가 100mg/dl에 이르도록한다. 12시간 동안 35℃에서 반응을 수행하면서 pH를 4.0으로 유지한다. 형성된 5'-이노신산의 양은 표 15에 나타내었다. 어떤 포스페이트 공여체를 사용하여서도 우수한 효율로 5'-이노신산이 형성되고 축적된다. 특히, 폴리포스페이트가 포스페이트 공여체로서 사용될 때 5'-이노신산이 대량으로 축적된다.

[표 15]

실시예 23

프로비덴시아 스투아르티의 염색체로부터 유래된 산 포스파타제 유전자의 분리 및 유전자의 뉴클레오타이드 서열의 결정

서열 목록의 서열 19 및 20에 기술된 뉴클레오타이드 서열을 갖는 올리고뉴클레오타이드 PRP1 및 PRP2를 각각 합성한다. 이들 올리고뉴클레오타이드는 프로비덴시아 스투아르티(EMBL 승인 번호 X64820의 데이터베이스)의 산 포스파타제를 암호화하는 유전자의 공지된 뉴클레오타이드 서열을 기초로하여, 프로비덴시아 스투아르티의 산 포스파타제를 암호화는 유전자를 증폭시키도록 디자인되어 있다.

염색체 DNA를 머레이 및 톰슨[참조: Nucl. Acid Res., 4321, 8(1980)]의 방법에 따라 프로비덴시아 스투아르티 ATCC 29851의 배양된 미생물 세포로부터 추출한다. 주형으로서 염색체 DNA(0.1ng), 프라이머로서 올리고뉴클레오타이드 PRP1 및 PRP2(각각 2.5μmol), 및 택 DNA 폴리머라제(2.5유니트, Takara Shuzo)를 dATP, dCTP, dGTP, dTTP(각각 200μM), 염화칼륨(50mM) 및 염화마그네슘(1.5mM)을 포함한 100mM 트리스-HCl 완충액(pH 8.3, 100㎕)에 첨가하여, 94℃에서 30초, 55℃에서 2분 및 72℃에서 3분으로 이루어진 한 사이클을 30회 반복하여 PCR 반응을 수행한다. 반응 용액을 아가로스 겔 전기영동한 다음, 유리 분말(Takara Shuzo)을 사용하여 약 1kbp의 증폭된 DNA 단편을 회수한다. 유전자 단편을 BamHI로 분해하고 BamHI로 분해된 pUC118과 결합시킨다. 상기 기술한 바와 같이 수득한 플라스미드를 pPRP100으로서 지정한다.

pPRP100이 도입된 형질전환체인 에스케리치아 콜리 JM109/pPRP100의 포스포모노에스터라제 활성 및 인산전달 활성을 측정한다. 그 결과, 균주는 뉴클레오사이드로의 인산전달 활성뿐만 아니라 포스포모노에스터라제 활성을 보여준다.

플라스미드를 알칼리 세균 용균 방법에 따라 에스케리치아 콜리 JM109/pPRP100의 형질전환체로부터 추출하여 뉴클레오타이드 서열을 결정한다. 결정된 개방 판독 프레임의 뉴클레오타이드 서열 및 뉴클레오타이드 서열로부터 추론된 단백질의 아미노산 서열은 서열 목록의 서열 21 및 22에 나타내었다. 개방 판독 프레임의 뉴클레오타이드 서열은 프로비덴시아 스투아르티의 공지된 산 포스파타제 유전자의 뉴클레오타이드 서열과 완전히 일치한다.

실시예 24

엔테로박터 애로게네스, 클렙시엘라 플란티콜라 및 세라티아 피카리아의 염색체로부터 유래된 산 포스파타제 유전자의 분리 및 유전자의 뉴클레오타이드 서열의 결정

염색체 DNA를 머레이 및 톰슨[참조: Nucl. Acid Res., 4321, 8(1980)]의 방법에 따라 엔테로박터 애로게네스 IFO 12010, 클렙시엘라 플란티콜라 IFO 14939 및 세라티아 피카리아 IAM 13540의 배양된 세포로부터 추출한다. 이어서, 실시예 7(2)에 기술한 방법에 따라, 에스케리치아 콜리 JM109의 약 20,000개의 형질전환체를 포함하는 염색체 유전자 발현 라이브러리를 작제하고 스크리닝하여 인산전달 활성을 나타내는 형질전환체를 수득한다. 이들 각각의 형질전환체는 각각의 고유 균주로부터 유래된 산 포스파타제 유전자를 함유하는 것으로 여겨진다.

알칼리 세균 용균 방법에 따라 엔테로박터 애로게네스 IFO 12010에서 유래한 산 포스파타제 유전자를 함유하는 것으로 여겨지는 에스케리치아 콜리의 형질전환체중 하나로부터 플라스미드 DNA를 추출하고, 플라스미드의 삽입된 DNA를 분석한다. 상기 플라스미드를 pENP100으로서 지정한다. 엔테로박터 애로게네스 IFO 12010으로부터 유래된 삽입된 DNA의 제한효소 지도는 도 9에 나타내었다.

서브클로닝에 의해 산 포스파타제 유전자의 영역을 구체화한 결과, 산 포스파타제 유전자가 제한효소인 SalI 및 KpnI에 의해 절단된 1.6kbp 단편에 함유되어 있는 것으로 나타났다. 따라서, SalI-KpnI 단편을, SalI 및 KpnI로 분해한 pUC118와 결합시켜 플라스미드를 작제한다. 수득한 플라스미드를 pENP110으로 지정한다.

상기 기술한 방법에 따라서, 알칼리 세균 용균 방법에 따라 클렙시엘라 플란티콜라 IFO 14939에서 유래한 산 포스파타제 유전자를 함유한 것으로 여겨지는 에스케리치아 콜리의 형질전환체중 하나로부터 플라스미드 DNA를 추출하고, 플라스미드의 삽입된 DNA를 분석한다. 상기 플라스미드를 pKLP100으로서 지정한다. 클렙시엘라 플란티콜라 IFO 14939로부터 유래된 삽입된 DNA의 제한효소 지도는 도 10에 나타내었다.

서브클로닝에 의해 산 포스파타제 유전자의 영역을 구체화한 결과, 산 포스파타제 유전자가 제한효소인 KpnI 및 EcoRI에 의해 절단된 2.2kbp 단편에 함유되어 있는 것으로 나타났다. 따라서, KpnI-EcoRI 단편을, KpnI 및 EcoRI로 분해한 pUC118와 결합시켜 플라스미드를 작제한다. 수득한 플라스미드를 pKLP110으로 지정한다.

유사하게, 알칼리 세균 용균 방법에 따라 세라티아 피카리아 IAM 13540에서 유래한 산 포스파타제 유전자를 함유한 것으로 여겨지는 에스케리치아 콜리의 형질전환체중 하나로부터 플라스미드 DNA를 추출하고, 플라스미드의 삽입된 DNA를 분석한다. 상기 플라스미드를 pSEP100으로 지정한다. 세라티아 피카리아 IAM 13540으로부터 유래된 삽입된 DNA의 제한효소 지도는 도 11에 나타내었다.

서브클로닝에 의해 산 포스파타제 유전자의 영역을 구체화한 결과, 산 포스파타제 유전자가 제한효소인 HindIII에 의해 절단된 1.4kbp 단편에 함유되어 있는 것으로 나타났다. 따라서, HindIII 단편을, HindIII로 분해한 pUC118와 결합시켜 플라스미드를 작제한다. 수득한 플라스미드를 pSEP110으로서 지정한다.

따라서, 플라스미드 DNA를 형질전환체인 에스케리치아 콜리 JM109/pENP110, 에스케리치아 콜리 JM109/pKLP110 및 에스케리치아 콜리 JM109/pSEP110으로부터 추출하고 여기에 pENP110, pKLP110 및 pSEP110을 알칼리 세균 용균 방법에 따라 각각 도입한다. 이들 플라스미드의 삽입체의 뉴클레오타이드 서열은 실시예 8에서 기술한 방법에 따라서 결정한다. 삽입체의 개방 판독 프레임의 결정된 뉴클레오타이드 서열은 엔테로박터 애로게네스 IFO 12010의 경우에는 서열 23, 클렙시엘라 플란티콜라 IFO 14939의 경우에는 서열 25 및 세라티아 피카리아 IAM 13540의 경우에 서열 27에 나타낸다. 추가로 추론된 아미노산 서열은 서열 24, 서열 26 및 서열 28에0 각각 나타낸다. 이들 단편을 포함한 플라스미드를 갖는 형질전환체가 인산전달 활성을 나타낸다는 사실 때문에, 이들 개방 판독 프레임이 목적하는 산 포스파타제 유전자인 것이 확인된다.

뉴클레오타이드 서열 및 추론된 아미노산 서열을 각각 상동성에 대해 공지된 서열과 비교한다. EMBL 및 SWISS-PROT의 데이터베이스를 사용한다. 그 결과, 서열 목록의 서열 23, 25 및 27에 나타낸 유전자가 신규한 유전자인 것으로 밝혀졌다. 엔테로박터 애로게네스 IFO 12010에서 유래한 유전자에 의해 암호화된 단백질은 248개의 아미노산 잔기로 구성되고, 클렙시엘라 플란티콜라 IFO 14939에서 유래한 유전자에 의해 암호화된 단백질은 248개의 아미노산 잔기로 구성되며, 세라티아 피카리아 IAM 13540에서 유래한 유전자에 의해 암호화된 단백질은 244개의 아미노산으로 구성되는 것으로 추정된다. 이들 단백질은 모르가넬라 모르가니 및 에스케리치아 블라태에서 유래한 산 포스파타제와 같은 전구체 단백질일 수 있다.

뉴클레오타이드 서열에서 추론된 아미노산 서열은 실시예 8에서 수득한 모르가넬라 모르가니 NCIMB 10466에서 유래한 산 포스파타제의 추론된 아미노산 서열, 실시예 12에서 수득한 에스케리치아 블라태 JCM 1650의 아미노산 서열 및 프로비덴시아 스투아르티(EMBL 승인번호 X64820)의 산 포스파타제의 공지된 아미노산 서열과 함께 한 문자로 도 12에 나타내었다. 모든 아미노산 서열중 공통의 아미노산 잔기는 도 12의 서열에서 별표로 표시하였다.

도 12에 나타낸 바와 같이, 6개의 균주에서 유래한 산 포스파타제의 아미노산 서열은 서로간에 상당한 상동성을 나타내며, 130개의 아미노산 잔기가 모든 아미노산 서열에서 공통인 것으로 나타난다. 따라서, 산 포스파타제가 유사한 기능을 갖는 것으로 추정된다.

실시예 25

엔테로박터 애로게네스, 클렙시엘라 플란티콜라 및 세라티아 피카리아에서 유래한 산 포스파타제의 유전자 발현에 의한 활성 증폭

실시예 23에서 작제한 에스케리치아 콜리 JM109/pPRP100, 및 실시예 24에서 작제한 에스케리치아 콜리 JM109/pENP110, 에스케리치아 콜리 JM109/pKLP110 및 에스케리치아 콜리 JM109/pSEP110을, 앰피실린 100㎍/ml 및 IPTG 1mM을 포함한 L-배지에 접종하고 16시간 동안 37℃에서 배양시킨다.

미생물 세포를 원심분리하여 배양물로부터 수집하고, 이들을 생리 식염수로 1회 세척한다. 미생물 세포를 100mM 인산칼륨 완충액(5ml, pH 7.0)중에 현탁시키고 이들을 20분 동안 4℃에서 초음파 처리를 하여 파쇄한다. 처리된 용액을 원심 분리하여 불용성 분취물을 제거한 다음, 세포 비함유 추출물을 제조한다.

상기 기술한 것과 동일한 방법으로 플라스미드 pUC118로 형질전환시킨 프로비덴시아 스투아르티 ATCC 29851, 엔테로박터 애로게네스 IFO 12010, 클렙시엘라 플란티콜라 IFO 14939, 세라티아 피카리아 IAM 13450 및 에스케리치아 콜리 JM109로부터 제조한 세포 비함유 추출물을 대조구로 사용하여, 상기 수득한 세포 비함유 추출물의 인산전달 활성을 측정한다. 결과는 표 16에 나타내었다. 인산전달 활성은 모든 야생형 균주에서 낮다. 인산전달 활성은 에스케리치아 콜리 JM109/pUC118에서는 검출되지 않는다. 한편, 산 포스파타제 유전자가 도입된 에스케리치아 콜리 JM109의 형질전환체는 야생형 균주와 비교하여 높은 인산전달 활성을 보여준다. 결과에 따르면, 도입된 DNA 단편 각각은 에스케리치아 콜리가 고농도로 산 포스파타제를 발현하도록 한다는 것이 입증된다.

[표 16]

실시예 26

개선된 온도 안정성을 갖는 돌연변이 산 포스파타제 유전자의 제조

실시예 20, 21 및 22에서 기술한 바와 같이, 실시예 19에서 제조한 이. 블라태 유래된 돌연변이 산 포스파타제 유전자 함유 균주는 상당한 양의 산 포스파타제를 발현한다. 상기 균주를 사용하여 피로인산 및 이노신으로부터 5'-이노신산 생산시, 고전환율로 5'-이노신산이 형성되고 축적된다. 상기 산 포스파타제의 최적 반응 온도는 35℃이다. 그러나, 상기 반응이 보다 높은 온도에서 수행되는 경우 반응 속도가 증가되고, 반응 용액중에 포스페이트 수용체의 뉴클레오사이드 농도를 증가시켜 반응을 수행한다. 따라서, 뉴클레오사이드-5'-포스페이트 에스테르가 짧은 시간동안 보다 효율적으로 생산될 수 있을 것으로 예상된다. 따라서, 효소의 온도 안정성은, PCR을 사용한 부위 특이적 돌연변이 방법으로 돌연변이를 실시예 19에서 클로닝한 이. 블라태 유래의 산 포스파타제 유전자내로 도입하여 개선시킨다.

실시예 19에서 기술한 이. 블라태 JCM1650 유래된 돌연변이 산 포스파타제를 암호화하는 유전자를 함유하는 플라스미드 pEPI380을 사용하고, 유전 공학 방법에 의해 부위 특이적 돌연변이를 상기 플라스미드 DNA에 도입하여, 온도 안정성이 증가된 돌연변이 산 포스파타제를 암호화하는 유전자를 제조한다. pEPI380은, 이. 블라태 JCM1650에서 유래되고 제한 엔도뉴클레아제 ClaI 및 BamHI로 절단한 돌연변이 산 포스파타제를 암호화하는 유전자를 포함한 2.4kb의 DNA 단편을, ClaI 및 BamHI로 절단한 pBluescript KS(+)(Stratagen)에 결합시킴으로서 수득한 플라스미드 DNA이다. 산 포스파타제를 암호화하는 유전자의 염기 서열로부터 예상되는 성숙한 단백질의 아미노산 서열은 서열 목록의 서열 8에 나타낸 서열중에 실시예 19의 표 12에 나타낸 11개의 아미노산 잔기인 것으로 추정된다.

서열 목록에 나타낸 서열을 갖는 올리고뉴클레오타이드 MUT300(서열 목록의 서열 9), MUT400(서열 목록의 서열 29) 및 MUT410(서열 목록의 서열 30)은 DNA 합성기(모델 394, Applied Biosystems)를 사용한 포스포아미디트 방법으로 합성한다.

성숙한 단백질의 104번째 글루탐산 잔기(GAG)가 글리신 잔기(GG^*T^*)로 치환된 돌연변이 포스파타제를 암호화하는 돌연변이 유전자는, 돌연변이 도입용 주형으로서 실시예 19에서 기술한 pEPI380을 사용하고 프라이머로서 MUT300 및 MUT410을 사용하여 실시예 15에서와 같이 PCR로 제조한다. 상기 돌연변이 유전자 함유 플라스미드는 pEPI410으로 지정한다. 마찬가지로, 151번째 트레오닌 잔기(ACC)가 알라닌 잔기(G^*CC)로 치환된 돌연변이 포스파타제를 암호화하는 돌연변이 유전자는, 돌연변이 도입용 주형으로서 pEPI380을 사용하고 프라이머로서 올리고뉴클레오타이드 MUT300, MUT310 및 MUT420을 사용하여 제조한다. 상기한 돌연변이 유전자 함유 플라스미드는 pEPI42O으로 지정한다.

알카리 세균 용균 방법에 의해 돌연변이 포스파타제 유전자를 포함하는 플라스미드 pEPI410 및 pEPI420이 도입된 이. 콜리 JM109 형질전환체로부터 플라스미드를 제조하고, 염기 서열을 결정하여 목적하는 염기가 치환되었는지를 확인한다.

상기 실시예에서 제조된 바와 같이 돌연변이 산 포스파타제 유전자가 도입된 이. 콜리 JM109/pEPI410 및 이.콜리 JM109/pEPI420, 및 실시예 19에서 기술한 이. 콜리 JM109/pEPI380 각각을, 앰피실린 100μg/ml 및 IPTG 1mM을 포함한 L-배지 50ml에 접종하고 16시간 동안 37℃에서 배양한다. 각각의 균주 배양액 50ml로부터 세포를 수집하고 생리 식염수로 1회 세척한다. 이들 세포를 100mM 인산염 완충액(pH 7.0) 5ml에 현탁시키고 20분 동안 4℃에서 초음파처리하여 세포를 파쇄시킨다. 이로서 처리된 용액을 원심분리하여 불용성 분취물을 제거하고 세포 비함유 추출물을 제조한다.

균주 각각에서 형성된 세포 비함유 추출물을 pH 7.0에서 30분 동안 0℃ 내지 80℃의 온도 범위에서 가온시킨다. 가온시킨 후, 다양한 온도에서 처리한 세포 비함유 추출물을 사용하여 pH 4.0 및 30℃의 표준 반응 조건하에 인산전달 반응을 수행하고 잔류 활성을 측정한다. 결과는 도 13에 나타내었다. 실시예 19에 기술한 이. 콜리 JM109/pEPI380에서 발현되는 돌연변이 효소는 30분 동안의 40℃ 처리에서는 안정하지만, 보다 높은 온도에서는 활성이 감소되는 것으로 관찰된다. 반대로, 상기 실시예에서 제조된 신규한 돌연변이 효소 유전자가 도입된 이. 콜리 JM109/pEPI410 및 이. 콜리 JM109/pEPI420에서 발현된 신규한 돌연변이 효소는 온도 안정성이 개선되었고, 30분 동안 50℃에서 처리하더라도 활성의 감소는 관찰되지 않았다. 따라서 높은 온도에서 이들 균주를 사용하여 뉴클레오사이드-5'-포스페이트 에스테르를 생산하는 경우, 생산성이 추가로 개선된다는 것이 예상된다.

실시예 27

온도 안정성이 개선된 돌연변이 산 포스파타제 유전자 함유 균주를 사용한 5'-이노신산 및 5'-구아닐산의 생산

돌연변이 산 포스파타제 유전자가 도입된 각각의 이. 콜리 JM109/pEPI410 및 이. 콜리 JM109/pEPI420, 및 실시예 19에서 기술한 이. 콜리 JM109/pEPI380을, 앰피실린 100μg/ml 및 IPTG 1mM을 포함한 L-배지 50ml에 접종하고 16시간 동안 37℃에서 배양한다.

피로인산(15g/dl) 및 이노신 또는 구아노신 8g/dl을 아세테이트 완충액(pH 4.0)중에 용해시킨다. 여기에 각각의 돌연변이 산 포스파타제 유전자가 도입된 이. 콜리 JM109 균주를 첨가하여, 건식 세포 중량을 기준으로 농도가 100mg/dl이 되도록한다. 50℃에서 9시간 동안 반응을 수행하면서 pH를 4.0으로 유지시키고, 형성된 5'-이노신산 또는 5'-구이닐산의 양을 측정한다. 결과는 표 17에 나타내었다. 형성된 뉴클레오사이드 포스페이트 에스테르는 뉴클레오사이드-5'-포스페이트 에스테르만이고, 부산물로서 뉴클레오사이드-2'-포스페이트 에스테르 및 뉴클레오사이드-3'-포스페이트 에스테르의 생성은 전혀 관찰되지 않는다. 또한 대조구로서 이. 콜리 JM109/pEPI380을 사용하여 12시간 동안 35℃에서 반응을 수행한다. 결과는 또한 표 17에 나타내었다.

실시예 21에서 기술한 바와 같이, 이. 콜리 JM109/pEPI380을 사용하면 뉴클레오사이드-5'-포스페이트 에스테르가 효율적으로 형성되고 축적된다. 반대로, 실시예 26에서 제조된 바와 같은 이. 블라태에서 유래된 신규한 돌연변이 산 포스파타제 유전자가 도입된 이. 콜리 JM109/pEPI410 및 이. 콜리 JM109/pEPI420을 사용하여 반응을 수행하는 경우, 짧은 시간동안 동일량의 5'-이노신산 또는 5'-구아닐산이 형성되고 축적된다. 따라서, 뉴클레오사이드-5'-포스페이트 에스테르가 보다 효율적으로 생산될 수 있다. 특히 이. 콜리 JM109/pEPI420을 사용하는 경우, 반응시간이 단축될 뿐만 아니라 5'-이노신산 및 5'-구아닐산이 보다 다량으로 축적되고 매우 높은 생산성을 나타낸다.

[표 17]

산 포스파타제를 돌연변이시켜 뉴클레오사이드에 대한 친화성과 온도 안정성을 증가시킴으로써 저렴하고 효율적으로 뉴클레오사이드-5'-포스페이트 에스테르를 제조할 수 있다.

도 1은 모르가넬라 모르가니(Morganella morganii)로부터 유래된 효소를 사용하여 수행되는 반응에서 반응 pH와 5'-이노신산의 생산량과의 관계를 나타낸 것이다.

도 2는 에스케리치아 블라태(Escherichia blattae)로부터 유래된 효소를 사용하여 수행되는 반응에서 반응 pH와 5'-이노신산의 생산량과의 관계를 나타낸 것이다.

도 3은 산 포스파타제를 암호화하는 유전자를 함유하는 모르가넬라 모르가니의 염색체 DNA 단편의 제한효소 지도를 나타낸 것이다.

도 4는 모르가넬라 모르가니로부터 유래된 포스파타제 유전자를 함유하는 균주를 사용하여 수행되는 반응에서 5'-이노신산의 생산량을 나타낸 것이다.

도 5는 산 포스파타제를 암호화하는 유전자를 함유하는 에스케리치아 블라태의 염색체 DNA 단편의 제한효소 지도를 나타낸 것이다.

도 6은 에스케리치아 블라태로부터 유래된 산 포스파타제 유전자를 함유하는 균주를 사용하여 수행되는 반응에서 5'-이노신산의 생산량을 나타낸 것이다.

도 7은 각각 에스케리치아 블라태로부터 유래된 야생형 산 포스파타제 유전자를 함유하는 균주 및 돌연변이 산 포스파타제 유전자를 함유하는 균주를 사용하여 수행되는 반응에서 5'-이노신산의 생산량을 나타낸 것이다.

도 8은 에스케리치아 블라태로부터 유래된 신규한 돌연변이 산 포스파타제 유전자를 함유하는 균주를 사용하여 수행되는 반응에서 5'-이노신산의 생산량을 나타낸 것이다.

도 9는 산 포스파타제를 암호화하는 유전자를 함유하는 엔테로박터 애로네스(Enterobacter aerogenes)로부터 유래된 염색체 DNA 단편의 제한효소 지도를 나타낸 것이다.

도 10은 산 포스파타제를 암호화하는 유전자를 함유하는 클렙시엘라 플란티콜라(Klebsiella planticola)로부터 유래된 염색체 DNA 단편의 제한효소 지도를 나타낸 것이다.

도 11은 산 포스파타제를 암호화하는 유전자를 함유하는 세라티아 피카리아(Serratia ficaria)로부터 유래된 염색체 DNA 단편의 제한효소 지도를 나타낸 것이다.

도 12는 모르가넬라 모르가니, 에스케리치아 블라태, 프로비덴시아 스투아르티(Providencia stuartii), 엔테로박터 애로게네스, 클렙시엘라 플란티콜라 및 세라티아 피카리아로부터 유래된 산 포스파타제의 뉴클레오타이드 서열로부터 추론된 1문자의 아미노산 서열을 나타낸 것이다. 이들 아미노산 서열은 서열 목록의 서열 4, 8, 22, 24, 26 및 28에 3문자로 나타내었다. 도에서, 모든 아미노산 서열에 공통된 아미노산 잔기는 서열에 *로 표시하였다.

도 13은 에스케리치아 블라태로부터 유래된 신규한 돌연변이 산 포스파타제 유전자를 함유하는 균주로부터 제조된 세포 비함유 추출액에서 산 포스파타제 활성의 온도 안정성을 나타내는 그래프이다.

Claims

서열 목록에서 서열 8에 나타낸 아미노산 서열을 포함하며, 당해 서열중 63번 류신 잔기, 65번 알라닌 잔기, 66번 글루탐산 잔기, 69번 아스파라긴 잔기, 71번 세린 잔기, 72번 세린 잔기, 74번 글리신 잔기, 85번 세린 잔기, 92번 알라닌 잔기, 94번 알라닌 잔기, 104번 글루탐산 잔기, 116번 아스파르트산 잔기, 130번 세린 잔기, 135번 트레오닌 잔기, 136번 글루탐산 잔기, 151번 트레오닌 잔기 및/또는 153번 이소류신 잔기가 다른 아미노산으로 치환됨으로써 돌연변이된, 뉴클레오사이드에 대한 친화성이 증가되고/증가되거나 온도 안정성이 증가된 돌연변이 산 포스파타제를 pH 3.0 내지 5.5의 조건하에서 뉴클레오사이드 및 포스페이트 그룹 공여체에 작용시켜 뉴클레오사이드-5'-포스페이트 에스테르를 생성시키는 단계 및 이를 수집하는 단계를 포함하는, 뉴클레오사이드-5'-포스페이트 에스테르의 제조방법.
서열 목록에서 서열 8에 나타낸 아미노산 서열을 포함하며, 당해 서열중 63번 류신 잔기, 65번 알라닌 잔기, 66번 글루탐산 잔기, 69번 아스파라긴 잔기, 71번 세린 잔기, 72번 세린 잔기, 74번 글리신 잔기, 85번 세린 잔기, 92번 알라닌 잔기, 94번 알라닌 잔기, 104번 글루탐산 잔기, 116번 아스파르트산 잔기, 130번 세린 잔기, 135번 트레오닌 잔기, 136번 글루탐산 잔기, 151번 트레오닌 잔기 및/또는 153번 이소류신 잔기가 다른 아미노산으로 치환됨으로써 돌연변이된 뉴클레오사이드에 대한 친화성이 증가되고/증가되거나 온도 안정성이 증가된 것을 특징으로 하는 돌연변이 산 포스파타제.
제2항에 따른 산 포스파타제를 암호화하는 유전자.
제3항에 따른 유전자를 포함하는 재조합 DNA.
제4항에 따른 재조합 DNA를 함유하는 미생물.
제1항에 있어서, 돌연변이가 서열 8의 104번 글루탐산 잔기 또는 151번 트레오닌 잔기에서 다른 아미노산으로 치환됨을 포함하는, 뉴클레오사이드-5'-포스페이트 에스테르의 제조방법.
제1항 또는 제6항에 있어서, 인산전달 반응이 35℃ 이상의 온도에서 수행되는, 뉴클레오사이드-5'-포스페이트 에스테르의 제조방법.
제1항 또는 제6항에 있어서, 돌연변이 산 포스파타제가 뉴클레오사이드에 대해 100mM 미만의 Km 값을 갖는, 뉴클레오사이드-5'-포스페이트 에스테르의 제조방법.
제1항 또는 제6항에 있어서, 돌연변이 산 포스파타제가 50℃에서 안정한, 뉴클레오사이드-5'-포스페이트 에스테르의 제조방법.
제1항 또는 제6항에 있어서, 돌연변이 산 포스파타제가 뉴클레오사이드에 대해 감소된 Km 값을 갖는, 뉴클레오사이드-5'-포스페이트 에스테르의 제조방법.
제1항 또는 제6항에 있어서, 포스페이트 그룹 공여체가 폴리인산 또는 이의 염, 페닐인산 또는 이의 염, 아세틸인산 또는 이의 염 및 카바밀 포스페이트 또는 이의 염으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 뉴클레오사이드-5'-포스페이트 에스테르의 제조방법.
제11항에 있어서, 인산전달 반응이 35℃ 이상의 온도에서 수행되는, 뉴클레오사이드-5'-포스페이트 에스테르의 제조방법.