CN112315836A - 一种高效的外用pdrn的制备方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种高效的外用PDRN的制备方法及其应用，解决了现有技术PDRN的提取收率低，在较高温度下使用酸降解DNA降低分子量的过程中需高温反应条件、加碱中和、超声波分解破碎过程中产生局部高温，易发生美拉德反应，导致产品颜色发黄，影响产品质量，并且在降解过程中不易控制产品分子量的分布范围等问题，用胰酶对鱼精巢细胞进行裂解，用SDS/NaCl溶液离心沉淀蛋白，添加无水乙醇对DNA进行沉淀、冻干得到大分子的DNA；再使用限制性内切酶Sau3 AI和/或脱氧核糖核酸酶对DNA进行降解，获得PDRN。本发明在温和的反应条件下以较高的收率将PDRN限制在小于10kD的范围内，提高了产品质量、降低了生产成本。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种高效的外用PDRN的制备 方法及其应用。
背景技术
PDRN(Polydeoxyribonucleotide)，多聚脱氧核糖核苷酸，是大分子 DNA降解后的小片段的产物。自1952年Mastelli公司首次对PDRN的药 理活性进行研究以来，PDRN能够加速DNA的合成，作为皮肤天然的保 护剂和修复剂，具有的防晒、消炎、促进细胞再生、组织修复、促进伤 口愈合、减少疤痕生成、祛皱等美容修复功效逐渐被人熟知，被广泛用 于美容产品中。例如，Placentex-PDRN具有伤口治疗、骨骼软组织再生 的功效。PDRN能够缩短皮肤代谢周期，使皮肤回到白嫩、光滑、富有 弹性的婴儿皮肤状态，PDRN婴儿针现已成为女性美容市场的火热产品， 普丽兰婴儿针的分子量为700kD，属于医疗器械级别的大分子物质，适用于皮肤再生。
鱼类的精巢是产生精子和贮存精子的器官，其中含有大量DNA，是制备 PDRN的主要原料来源。研究表明对于外用的PDRN在分子量小于10kD的 范围内有最好的透皮吸收效果。DNA限制性内切酶是能识别并切割特异的双 链DNA序列的一种内切核酸酶，DNA限制性内切酶Sau3 AI的识别位点 为
假设A、T、C、G四种剪辑在DNA中随机分布，则理论上酶44/256 个碱基就会出现一个Sau3 AI的酶切位点，因此如果酶切时间足够长，Sau3 AI在理论上能够将DNA切成完全是256bp的多聚核苷酸片段。脱氧核糖核酸酶 能够水解DNA磷酸二酯键产生单脱氧核苷酸或寡脱氧核苷酸的酶。
专利KR100986603公开了一种PDRN的制备方法，产率为7％。该 方法需要在不锈钢高压反应釜内加热至100-109℃条件高温灭菌，如此的 反应条件在工业生产过程中危险性大，设备投入大；同时在68-72℃加醋 酸/盐酸混合液对DNA进行酸解降低分子量，再用添加32％NaOH溶液 调pH至中性，在此条件下易发生美拉德反应，导致产品颜色发黄，影响 产品质量。专利CN106031709B公开了一种PDRN的制备方法，该方法 得到的产品中蛋白含量较高为2.5-5％，产品收率为3-7％，并且并未提及 DNA的分子量大小及分布区间。专利CN107287186A公开了一种PDRN 的制备方法，该方法需将鱼精液在-80℃下进行冻融，通过超声波分解仪 破碎DNA，然而超声波分解破碎DNA的方法主要适用于实验室规模， 在大规模工业生产中不易控制产品的分子量，破碎过程中产生局部高温， 易发生美拉德反应，导致产品颜色发黄，影响产品质量，影响在大规模 工业生产中的应用。专利CN110747194A公开了一种PDRN的制备方法， 需要在90-100℃条件下对精巢组织进行裂解，DNA打断仪分解仪破碎 DNA也易产热、导致美拉德反应，在大规模工业生产中不易操作。综上 所述，现有技术PDRN的提取收率低，在较高温度下使用酸降解DNA降 低分子量的过程中需高温反应条件、加碱中和、超声波分解破碎过程中 产生局部高温，易发生美拉德反应，导致产品颜色发黄，影响产品质量， 并且在降解过程中不易控制产品分子量的分布范围，大分子的PDRN不易被皮肤吸收。
发明内容
针对现有技术中的问题，本发明提供一种高效的外用PDRN的制备 方法及其应用，解决了现有PDRN的提取率低，易发生美拉德反应的问 题，利用限制性内切酶Sau3 AI和核糖核酸酶对DNA进行降解，控制反 应时间在温和的反应条件下有效的避免了美拉德反应，将PDRN限制在 小于10kD的范围内，利于皮肤吸收。
为实现以上技术目的，本发明的技术方案是：
一种高效的外用PDRN的制备方法，包括如下步骤：
步骤1，鱼精巢预处理；
步骤2，鱼精细胞收集；
步骤3，酶解鱼精细胞中的鱼精蛋白；
步骤4，SDS除鱼精蛋白，离心获得含鱼精巢DNA上清液；
步骤5，乙醇沉淀获得鱼精巢DNA；
步骤6，酶切鱼精巢DNA获取PDRN。
所述步骤2中的鱼精巢经过混合盐溶液处理，所述混合盐采用氯化 钠、柠檬酸钠、亚硫酸钠的混合盐。
所述步骤3中的酶解所用的酶是胰酶、枯草杆菌蛋白酶、木瓜蛋白 酶、风味蛋白酶、蛋白酶K中的一种。
所述步骤6中的酶切过程中的酶为限制性内切酶Sau3 AI和/或脱氧 核糖核酸酶。
优选的，步骤1，鱼精巢预处理：将冷库内冷冻保存的大马哈鱼鱼精 巢取出，于室温下解冻；再用去离子水洗涤两次；最后使用粉碎机对鱼 精巢进行粉碎处理，将鱼精巢彻底粉碎成浆糊状。
步骤2，鱼精细胞收集：
(1)将步骤1得到的浆糊状处理物按照1:2(m/v)的比例加入至混合 盐溶液中，于室温搅拌5h，其中，混合盐溶液采用pH为8.0的0.15M NaCl/0.03M柠檬酸钠/0.5％NaHSO3的混合盐溶液；
(2)将混合体系以4000rpm的转速离心15-30min，弃上清，再使用 pH 8.0的0.15MNaCl/0.03M柠檬酸钠的溶液将沉淀洗涤3-5次，离心获 得含鱼精细胞的沉淀物。
步骤3，酶解鱼精细胞中的鱼精蛋白：
(1)在37℃下，将含鱼精细胞的沉淀物加入至0.15M NaCl/0.5mM EDTA的混合盐溶液中搅拌均匀，其中，沉淀物与混合盐的比例为1:25 (m/v)；
(2)按照鱼精巢原料质量与胰蛋白酶质量为250:1的比例加入至反 应体系中，并在37℃下酶解18-24h。
步骤4，SDS除鱼精蛋白，离心获得含鱼精巢DNA上清液：
在步骤3中的反应体系中加入鱼精巢原料重量8-10％的SDS、最终 浓度为1.6M的NaCl，持续搅拌3-5h后离心沉淀，收集上清液。
步骤5，乙醇沉淀获得鱼精巢DNA：
(1)将步骤4中的上清液按照2-2.5:1的体积比加入至预先冷却的无 水乙醇中搅拌，使絮状的DNA析出，并漂浮于溶液上层；
(2)将上述的DNA取出，采用75％乙醇/H2O溶液洗涤、离心3-5次， 将得到的DNA沉淀粉碎，经冻干处理得到白色固体：DNA。
步骤6，酶切鱼精巢DNA获取PDRN：
(1)鱼精巢DNA溶解：将步骤5中的DNA溶解在37℃的去离子 水中，形成10g/L的溶液；
(2)限制性内切酶Sau3 AI酶解：将限制性内切酶Sau3 Al按照 500-5000U的酶量加入至上述37℃溶液中反应16-48h；
(3)除蛋白：加入8-10％的SDS(w/v)、终浓度为1.6M的NaCl溶 液，继续搅拌3-5h后离心除沉淀，收集上清液；
(4)鱼精巢DNA提取：上清液按照体积比为2-2.5:1的比例加至预 冷的无水乙醇中搅拌0.5-1h，将溶液以6000rpm的转速离心1h，弃上清； 用75％乙醇/H2O溶液将沉淀洗涤、离心3-5次后，将得到的DNA沉淀粉 碎，进行冻干得到白色固体。
优选的，步骤6使用脱氧核糖核酸酶酶切鱼精巢DNA获取PDRN：
(1)鱼精巢DNA溶解：将步骤5中的DNA溶解在37℃的去离子 水中，形成10g/L的溶液；
(2)脱氧核糖核酸酶酶解：将脱氧核糖核酸酶加入至反应体系中形 成50-150mg/L浓度，并在37℃下反应5-10h；
(3)除蛋白：加入8-10％的SDS(w/v)、终浓度为1.6M的NaCl溶 液，继续搅拌3-5h后离心除沉淀，收集上清液；
(4)鱼精巢DNA提取：上清液按照体积比为2-2.5:1的比例加至预 冷的无水乙醇中搅拌0.5-1h，将溶液以6000rpm的转速离心1h，弃上清； 用75％乙醇/H2O溶液将沉淀洗涤、离心3-5次后，将得到的DNA沉淀粉 碎，进行冻干得到白色固体。
优选的，步骤6联合使用限制性内切酶Sau3 AI和脱氧核糖核酸酶酶 切鱼精巢DNA获取PDRN：
(1)鱼精巢DNA溶解：将步骤5中的DNA溶解在37℃的去离子 水中，形成10g/L的溶液；
(2)限制性内切酶Sau3 AI酶解：将限制性内切酶Sau3 Al按照 500-5000U的酶量加入至上述37℃溶液中反应16-48h；
(3)脱氧核糖核酸酶酶解：将脱氧核糖核酸酶加入至反应体系中形 成1-30mg/L浓度，并在37℃下反应0.5-2h；
(4)除蛋白：加入8-10％的SDS(w/v)、终浓度为1.6M的NaCl溶 液，继续搅拌3-5h后离心除沉淀，收集上清液；
(5)鱼精巢DNA提取：上清液按照体积比为2-2.5:1的比例加至预 冷的无水乙醇中搅拌0.5-1h，将溶液以6000rpm的转速离心1h，弃上清； 用75％乙醇/H2O溶液将沉淀洗涤、离心3-5次后，将得到的DNA沉淀粉 碎，进行冻干得到白色固体。
所述PDRN可用于外用美容产品和整形医美产品。
本发明具有以下有益效果：
1.本发明解决了现有PDRN的提取率低，已发生美拉德反应的问题， 利用限制性内切酶Sau3 AI和核糖核酸酶对DNA进行降解，控制反应时 间在温和的反应条件下有效的避免了美拉德反应，将PDRN限制在小于 10kD的范围内。
2.本发明制备的产品为白色粉末，不发黄，蛋白含量低，提高了产品 附加值。
3.本发明提供的制备方法收率提高了3.5-4倍，大幅度降低生产成本， 大大提高了经济效益。
附图说明
图1是本发明实施例9中的毛孔收缩实验疗效的比对图；
图2是本发明实施例10中的临床疤痕修复试验效果的比对图。
具体实施方式
结合图1和图2，详细说明本发明的具体实施例，但不对本发明的权 利要求做任何限定。
实施例1
一种外用PDRN的制备方法，，按照如下步骤：
步骤1，鱼精巢预处理：将冷库内冷冻保存的大马哈鱼鱼精巢500g 取出，于室温下解冻；再用去离子水洗涤两次；最后使用粉碎机对鱼精 巢进行粉碎处理，将鱼精巢彻底粉碎成浆糊状。
步骤2，鱼精细胞收集：
(1)将步骤1得到的浆糊状处理物按照1:2(m/v)的比例加入至混合 盐溶液中，于室温搅拌5h，其中，混合盐溶液采用pH为8.0的0.15M NaCl/0.03M柠檬酸钠/0.5％NaHSO3的混合盐溶液；
(2)将混合体系以4000rpm的转速离心15min，弃上清，在使用pH 8.0的0.15MNaCl/0.03M柠檬酸钠的溶液将沉淀洗涤3次，离心获得含 鱼精细胞的沉淀物。
步骤3，酶解鱼精细胞中的鱼精蛋白：
(1)在37℃下，将含鱼精细胞的沉淀物加入至0.15M NaCl/0.5mM EDTA的混合盐溶液中搅拌均匀，其中，沉淀物与混合盐的比例为1:25 (m/v)；
(2)按照鱼精巢原料质量与胰蛋白酶质量为250:1的比例加入至反 应体系中，并在37℃下酶解20h。
步骤4，SDS除鱼精蛋白，离心获得含鱼精巢DNA上清液：
在步骤3中的反应体系中加入鱼精巢原料重量8-10％的SDS、最终 浓度为1.6M的NaCl，持续搅拌3h后离心沉淀，收集上清液。
步骤5，乙醇沉淀获得鱼精巢DNA：
(1)将步骤4中的上清液按照2:1的体积比加入至预先冷却的无水 乙醇中搅拌，使絮状的DNA析出，并漂浮于溶液上层；
(2)将上述的DNA取出，采用75％乙醇/H2O溶液洗涤、离心3次， 将得到的DNA沉淀粉碎，经冻干处理得到白色固体：DNA。
步骤6，酶切鱼精巢DNA获取PDRN：
(1)鱼精巢DNA溶解：将步骤5中的DNA溶解在37℃的去离子 水中，形成10g/L的溶液；
(2)限制性内切酶Sau3 AI酶解：将限制性内切酶Sau3 Al按照1000 U的酶量加入至上述37℃溶液中反应30h；
(3)除蛋白：加入8％的SDS(w/v)、终浓度为1.6M的NaCl溶液， 继续搅拌3h后离心除沉淀，收集上清液；
(4)鱼精巢DNA提取：上清液按照体积比为2:1的比例加至预冷的 无水乙醇中搅拌0.5h，将溶液以6000rpm的转速离心1h，弃上清；用75％ 乙醇/H2O溶液将沉淀洗涤、离心3次后，将得到的DNA沉淀粉碎，进行 冻干得到白色固体。
本实施例的收率为15.6％，产品的碱基长度为100-400bp，其中 200-300bp的片段占比超过90％。
实施例2
一种外用PDRN的制备方法，按照如下步骤：
步骤1，鱼精巢预处理：将冷库内冷冻保存的大马哈鱼鱼精巢500g 取出，于室温下解冻；再用去离子水洗涤两次；最后使用粉碎机对鱼精 巢进行粉碎处理，将鱼精巢彻底粉碎成浆糊状。
步骤2，鱼精细胞收集：
(1)将步骤1得到的浆糊状处理物按照1:2(m/v)的比例加入至混合 盐溶液中，于室温搅拌5h，其中，混合盐溶液采用pH为8.0的0.15M NaCl/0.03M柠檬酸钠/0.5％NaHSO3的混合盐溶液；
(2)将混合体系以4000rpm的转速离心30min，弃上清，在使用pH 8.0的0.15MNaCl/0.03M柠檬酸钠的溶液将沉淀洗涤5次，离心获得含 鱼精细胞的沉淀物。
步骤3，酶解鱼精细胞中的鱼精蛋白：
(1)在37℃下，将含鱼精细胞的沉淀物加入至0.15M NaCl/0.5mM EDTA的混合盐溶液中搅拌均匀，其中，沉淀物与混合盐的比例为1:25 (m/v)；
(2)按照鱼精巢原料质量与胰蛋白酶质量为250:1的比例加入至反 应体系中，并在37℃下酶解20h。
步骤4，SDS除鱼精蛋白，离心获得含鱼精巢DNA上清液：
在步骤3中的反应体系中加入鱼精巢原料重量10％的SDS、最终浓 度为1.6M的NaCl，持续搅拌5h后离心沉淀，收集上清液。
步骤5，乙醇沉淀获得鱼精巢DNA：
(1)将步骤4中的上清液按照2.5:1的体积比加入至预先冷却的无 水乙醇中搅拌，使絮状的DNA析出，并漂浮于溶液上层；
(2)将上述的DNA取出，采用75％乙醇/H2O溶液洗涤、离心5次， 将得到的DNA沉淀粉碎，经冻干处理得到白色固体：DNA。
步骤6，酶切鱼精巢DNA获取PDRN：
(1)鱼精巢DNA溶解：将步骤5中的DNA溶解在37℃的去离子 水中，形成10g/L的溶液；
(2)脱氧核糖核酸酶酶解：将脱氧核糖核酸酶加入至反应体系中形 成100mg/L浓度，并在37℃下次序反应6h；
(3)除蛋白：加入10％的SDS(w/v)、终浓度为1.6M的NaCl溶液， 继续搅拌5h后离心除沉淀，收集上清液；
(4)鱼精巢DNA提取：上清液按照体积比为2-2.5:1的比例加至预 冷的无水乙醇中搅拌1h，将溶液以6000rpm的转速离心1h，弃上清；用 75％乙醇/H2O溶液将沉淀洗涤、离心5次后，将得到的DNA沉淀粉碎， 进行冻干得到白色固体。
本实施例的产品收率为13.2％，产品的碱基长度为小于400bp，其中 50-200bp的片段占比超过90％。
实施例3
一种外用PDRN的制备方法，按照如下步骤：
步骤1，鱼精巢预处理：将冷库内冷冻保存的大马哈鱼鱼500g取出， 于室温下解冻；再用去离子水洗涤两次；最后使用粉碎机对鱼精巢进行 粉碎处理，将鱼精巢彻底粉碎成浆糊状。
步骤2，鱼精细胞收集：
(1)将步骤1得到的浆糊状处理物按照1:2(m/v)的比例加入至混合 盐溶液中，于室温搅拌5h，其中，混合盐溶液采用pH为8.0的0.15M NaCl/0.03M柠檬酸钠/0.5％NaHSO3的混合盐溶液；
(2)将混合体系以4000rpm的转速离心15min，弃上清，在使用pH 8.0的0.15MNaCl/0.03M柠檬酸钠的溶液将沉淀洗涤5次，离心获得含 鱼精细胞的沉淀物。
步骤3，酶解鱼精细胞中的鱼精蛋白：
(1)在37℃下，将含鱼精细胞的沉淀物加入至0.15M NaCl/0.5mM EDTA的混合盐溶液中搅拌均匀，其中，沉淀物与混合盐的比例为1:25 (m/v)；
(2)按照鱼精巢原料质量与胰蛋白酶质量为250:1的比例加入至反 应体系中，并在37℃下酶解20h。
步骤4，SDS除鱼精蛋白，离心获得含鱼精巢DNA上清液：
在步骤3中的反应体系中加入鱼精巢原料重量9％的SDS、最终浓度 为1.6M的NaCl，持续搅拌3-5h后离心沉淀，收集上清液。
步骤5，乙醇沉淀获得鱼精巢DNA：
(1)将步骤4中的上清液按照2-2.5:1的体积比加入至预先冷却的无 水乙醇中搅拌，使絮状的DNA析出，并漂浮于溶液上层；
(2)将上述的DNA取出，采用75％乙醇/H2O溶液洗涤、离心3-5次， 将得到的DNA沉淀粉碎，经冻干处理得到白色固体：DNA。
步骤6，酶切鱼精巢DNA获取PDRN：
(1)鱼精巢DNA溶解：将步骤5中的DNA溶解在37℃的去离子 水中，形成10g/L的溶液；
(2)限制性内切酶Sau3 AI酶解：将限制性内切酶Sau3 Al按照1000 U的酶量加入至上述37℃溶液中反应16h；
(3)脱氧核糖核酸酶酶解：将脱氧核糖核酸酶加入至反应体系中形 成3mg/L浓度，并在37℃下次序反应1h；
(4)除蛋白：加入9％的SDS(w/v)、终浓度为1.6M的NaCl溶液， 继续搅拌4h后离心除沉淀，收集上清液；
(5)鱼精巢DNA提取：上清液按照体积比为2:1的比例加至预冷的 无水乙醇中搅拌0.5h，将溶液以6000rpm的转速离心1h，弃上清；用75％ 乙醇/H2O溶液将沉淀洗涤、离心4次后，将得到的DNA沉淀粉碎，进行 冻干得到白色固体。
本实施例的产品收率为15.1％，产品的碱基长度为小于200bp，其中 50-150bp的片段占比超过95％。
对比例
对比例1采用背景技术中的CN110747194A的方法；
对比例2采用背景技术中的CN107287186A的方法。
对比例1和对比例2的产品均为浅黄色粉末，90％的碱基长度小于 200bp，但是样品中杂质较多。
实施例与对比例的检测比对如下：
实施例4
配制毛孔收缩精华液。
毛孔收缩精华液的质量配方如下：
| 组分 | 比重(％) |
| PDRN | 0.3-1 |
| 透明质酸钠 | 0.05-0.4 |
| 乙酰化透明质酸 | 0.05-0.4 |
| 小核菌胶 | 0.3-0.6 |
| 氯苯甘醚 | 0.05-0.1 |
| 苯氧乙醇 | 0.5-0.8 |
| 海藻糖 | 0.4-2 |
| 烟酰胺 | 0.3-1 |
| 传明酸 | 0.3-1 |
| 无菌水 | 余量 |
利用无菌水分散卡波姆后，采用三乙醇胺调节至pH在5.5至7之间， 依次加入剩余原料，搅拌均匀得到毛孔收缩精华液。
按照上述方法，以如下比例配制得到精华液：
| 组分 | 比重(％) |
| PDRN(实施例3) | 0.5 |
| 透明质酸钠 | 0.2 |
| 乙酰化透明质酸 | 0.2 |
| 小核菌胶 | 0.4 |
| 氯苯甘醚 | 0.05 |
| 苯氧乙醇 | 0.7 |
| 海藻糖 | 1.2 |
| 烟酰胺 | 0.7 |
| 传明酸 | 0.7 |
| 无菌水 | 余量 |
实施例5
配制疤痕修复凝胶。
疤痕修复凝胶的质量配方如下：
| 组分 | 比重(％) |
| PDRN | 0.3-1 |
| 透明质酸钠 | 0.05-0.4 |
| 乙酰化透明质酸 | 0.05-0.4 |
| 卡波姆 | 0.5-1 |
| 氯苯甘醚 | 0.05-0.1 |
| 苯氧乙醇 | 0.5-0.8 |
| 三乙醇胺 | 0.4-1 |
| 肌肽 | 0.002-0.02 |
| 棕榈酰五肽-4 | 0.002-0.02 |
| 寡肽-1 | 0.002-0.02 |
| 甜菜碱 | 3-6 |
| 无菌水 | 余量 |
利用无菌水分散卡波姆后，采用三乙醇胺调节至pH在5.5至7之间， 依次加入剩余原料，搅拌均匀得到疤痕修复凝胶。
按照上述方法，以如下比例配制得到凝胶1：
| 组分 | 比重(％) |
| PDRN(实施例3) | 0.7 |
| 透明质酸钠 | 0.25 |
| 乙酰化透明质酸 | 0.05 |
| 卡波姆 | 1 |
| 氯苯甘醚 | 0.1 |
| 苯氧乙醇 | 0.5 |
| 三乙醇胺 | 0.4 |
| 肌肽 | 0.014 |
| 棕榈酰五肽-4 | 0.012 |
| 寡肽-1 | 0.01 |
| 甜菜碱 | 6 |
| 无菌水 | 余量 |
实施例6
按照实施例5的方法，以如下比例配制得到凝胶2。
| 组分 | 比重(％) |
| PDRN(实施例2) | 0.7 |
| 透明质酸钠 | 0.2 |
| 乙酰化透明质酸 | 0.3 |
| 卡波姆 | 0.8 |
| 氯苯甘醚 | 0.08 |
| 苯氧乙醇 | 0.6 |
| 三乙醇胺 | 0.7 |
| 肌肽 | 0.01 |
| 棕榈酰五肽-4 | 0.01 |
| 寡肽-1 | 0.01 |
| 甜菜碱 | 4 |
| 无菌水 | 余量 |
实施例7
伤口愈合实验
选取体重为250±25g的SD大鼠20只，雌性10只、雄性10只，随机 分为两组(每组雌性5只、雄性5只，共10只)，一组为空白对照组、 一组为使用是实施例6的凝胶2的实验组，腹腔注射2.5％的戊巴比妥钠(30mg/kg)对其进行麻醉、背部脱毛，并在鼠背部制造一个直径为2cm 的皮肤缺损至筋膜层的圆形创面。从第3d开始，分别于每天上午8时、 下午6时将本发明的组合物均匀涂布于试验组的皮肤受损区域，并覆盖 纱布、用胶带固定；空白对照组只用生理盐水处理，记录创面愈合时间 和愈后疤痕面积，试验组的伤口愈合时间为12.1±1.5d，而空白对照组的 伤口愈合时间为20.4±1.6d；试验组的平均疤痕面积为35.3±3.4mm2，而 空白对照组的平均疤痕面积为44.7±1.7mm2。该结果表明本发明产品能 显著的促进皮肤生长、加速伤口愈合。
实施例8
疤痕修复试验
选取20只体重为2.5±0.1kg的健康新西兰兔，其中雌性20只、雄性 20只，随机分为2组(每组雌性10只、雄性10只，共20只)，一组为 空白对照组、一组为使用实施例5的凝胶1的实验组。使用2.5％戊巴比 妥钠(1.5mg/kg)麻醉后，在兔耳腹面切除皮肤并去软骨膜制造6个1 cm*1cm的创面，待其创面自然愈合形成疤痕。28d后试验组每天早8时、 晚6时分别涂抹本发明产品于创面疤痕处，连续使用30d。30d后，切片 取样于显微镜下测量瘢痕增生指数为1.57±0.34mm2，而空白对照组为 4.15±0.37mm2。30d后，使用本发明产品疤痕之地柔软、平均疤痕硬度 为0.17N/mm2；而空白对照组疤痕硬化，平均疤痕硬度为0.55N/mm2。30d后，使用本发明产品平均疤痕厚度为0.63mm；而空白对照组疤痕硬 化，疤痕平均硬度为1.45mm。
实施例9
毛孔收缩试验
选取20名健康女性志愿者(年龄为25-40岁，随机分为两组，一组 为空白对照组，一组为使用实施例4的精华液的试验组)为试验对象进 行测试，于每天早8时、晚8时各使用本发明组合物，在使用4周后通 过VISIA皮肤检测仪对毛孔(大于0.25mm)收缩试验效果进行测定。结 果如图1所示，与空白对照组相比，使用本发明产品的志愿者皮肤毛孔 明显收缩，而空白对照组志愿者基本无变化。
实施例10
疤痕修复试验
选取30位(男性29例、女性11例，年龄在19-40岁，平均年龄为 31岁)某医院于2019.5-2020.01收治的体表外伤生成疤痕的病例志愿者， 随机分为3组，一组为空白对照组，试验组1为使用本发明实施例5产 品的试验组，试验组2为使用本发明实施例6产品的试验组。试验组分 别于早8时、下午2时、晚8时分别使用本发明的产品，空白对照组不 做任何处理。按照下列的评价指标对使用效果进行判断。
临床疤痕修复试验评价标准如下：
结果如图2所示，试验组1有85％的志愿者达到治愈+显效的疗效， 试验组2有75％的志愿者达到治愈+显效的疗效，而空白对照组仅有7例 患者达到好转。
综上所述，本发明具有以下优点：
1.本发明解决了现有PDRN的提取率低，已发生美拉德反应的问题， 利用限制性内切酶Sau3 AI和核糖核酸酶对DNA进行降解，控制反应时 间在温和的反应条件下有效的避免了美拉德反应，将PDRN限制在小于 10kD的范围内。
2.本发明制备的产品为白色粉末，不发黄，蛋白含量低，提高了产品 附加值。
3.本发明提供的制备方法收率提高了3.5-4倍，大幅度降低生产成本， 大大提高了经济效益。
可以理解的是，以上关于本发明的具体描述，仅用于说明本发明而 并非受限于本发明实施例所描述的技术方案。本领域的普通技术人员应 当理解，仍然可以对本发明进行修改或等同替换，以达到相同的技术效 果；只要满足使用需要，都在本发明的保护范围之内。
Claims (5)
1.一种高效的外用PDRN的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：
步骤1，鱼精巢预处理；
步骤2，鱼精细胞收集；
步骤3，酶解鱼精细胞中的鱼精蛋白；
步骤4，SDS除鱼精蛋白，离心获得含鱼精巢DNA上清液；
步骤5，乙醇沉淀获得鱼精巢DNA；
步骤6，酶切鱼精巢DNA获取PDRN。
2.根据权利要求1所述的高效的外用PDRN的制备方法，其特征在于：所述步骤2中的鱼精巢经过混合盐溶液处理，所述混合盐采用氯化钠、柠檬酸钠、亚硫酸钠的混合盐。
3.根据权利要求1所述的高效的外用PDRN的制备方法，其特征在于：所述步骤3中的酶解所用的酶是胰酶、枯草杆菌蛋白酶、木瓜蛋白酶、风味蛋白酶、蛋白酶K中的一种。
4.根据权利要求1所述的高效的外用PDRN的制备方法，其特征在于：所述步骤6中的酶切过程中的酶为限制性内切酶Sau3 AI和/或脱氧核糖核酸酶。
5.一种外用PDRN的应用，其特征在于：权利要求1-4任意一项所述的PDRN用于外用美容产品和整形医美产品。
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