CN115074357A - 一种多聚脱氧核糖核苷酸的制备方法及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种多聚脱氧核糖核苷酸的制备方法及应用。制备方法包括使用裂解液对鱼的精细胞进行裂解；所述裂解液中包括酶和缓冲液，所述缓冲液包括：1‑20mM尿素，10‑100mM Tris‑HCl，100‑500nM NaCl，100‑500nM CaCl2，1‑10mM Na2EDTA。本发明提供的制备方法中裂解缓冲液更接近中性，便于配制，且裂解时间短，应用于实际生产时可提高效率，生产的多聚脱氧核糖核苷酸纯度高，具有较好的应用前景。

Description

一种多聚脱氧核糖核苷酸的制备方法及应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种多聚脱氧核糖核苷酸的分离方法及应用。
背景技术
多聚脱氧核糖核苷酸（PDRN，Poly Deoxy Ribo Nucleotide），是指从鲑鱼生殖细胞中提取的特定规格的DNA片段。该成分中的DNA碎片与人体构成最为接近，可促进人体细胞再生，促进伤口恢复，同时能够减少疤痕生成，也可减轻痛症。
人体胎盘中也含有少量PDRN，但由于开发受限，目前从鲑鱼中提取PDRN为最优选择。PDRN取自鲑鱼精巢，通过提纯和高温杀菌等提取工艺获得，可确保DNA含量和活性成分纯度，且不含任何药理性蛋白和多肽，从而保证了产品的高安全性。
中国专利申请CN202110391188.7公开了一种从鲑鱼精液中分离脱氧核苷酸的方法，分离步骤包括：准备新鲜或冰冻鲑鱼精液组织体，并置于玻璃匀浆器中，加入定量的细胞裂解缓冲液，并匀浆至不见组织凝结块，然后转移到离心管中并加入蛋白酶K，使其混匀，在恒温水浴锅中水浴固定的时间，并间歇振荡离心管数次初步得到混合液体。采用溶解并离心分离提纯的方式，加入定量的蛋白酶K、TE缓冲液和无水乙醇等材料，经过震荡、分离等步骤即可分离出鲑鱼精液中的脱氧核苷酸。该方法分离出的脱氧核苷酸纯度较高，且便于操作，但最终的产物得率较低。
中国专利申请CN201610497384.1公开了一种从鱼类的精液分离PDRN的方法，包括：(1)将鱼类精液进行第1次离心分离，获取包含精液细胞的沉淀物；(2)将所述沉淀物添加于细胞溶解缓冲液，制造细胞溶解物后，使所述细胞溶解物消化；(3)将步骤(2)的细胞溶解物进行第2次离心分离，获取上清液；(4)在步骤(3)获取的上清液中投入饱和氯化钠水溶液混合后，进行第3次离心分离，获取包含DNA的上清液；(5)在步骤(4)获取的上清液中投入乙醇并使DNA沉淀后，收集所述沉淀DNA并进行干燥；(6)用物理方法破碎步骤(5)获得的DNA，获取多聚脱氧核糖核苷酸。但该方法获得的产物纯度较低，实际操作时，产率也不高，有进一步的优化空间。
发明内容
为解决上述问题，本发明提供了一种多聚脱氧核糖核苷酸的制备方法，通过裂解大马哈鱼精细胞获得DNA，再对DNA进行物理破碎获得。
一方面，本发明提供了一种多聚脱氧核糖核苷酸的制备方法。
所述制备方法中包括使用裂解液对鱼的精细胞进行裂解。
所述裂解液中包括酶和缓冲液。
所述缓冲液中包括：1-20mM尿素，10-100mM Tris-HCl，100-500nM NaCl，100-500nM CaCl2，1-10mM Na2EDTA。
优选地，所述缓冲液中包括：5-15mM尿素，30-70mM Tris-HCl，200-400nM NaCl，200-400nM CaCl2，3-7mM Na2EDTA。
进一步优选地，所述缓冲液中包括：8-10mM尿素，40-60mM Tris-HCl，300nM NaCl，300nM CaCl2，4-6mM Na2EDTA。
优选地，所述酶为蛋白酶K。
优选地，所述鱼选自鲑科；更优选为大马哈鱼。
优选地，所述裂解条件为30-50℃溶解10-14小时；更优选为37℃溶解12小时。
优选地，所述制备方法包括以下步骤：收集成熟雄性大马哈鱼精液，低速离心，取沉淀加入裂解液进行裂解，裂解产物离心取上清并加入饱和氯化钠，再次离心取上清，醇沉，干燥后溶于生理盐水，超声波分解DNA，过滤后冻干。
优选地，所述低速离心的条件为3000rpm，4℃下离心20min。
优选地，所述醇沉的条件为：以体积比1：1的比例加入无水乙醇。
优选地，所述制备方法包括以下步骤：
（1）收集大马哈鱼精液
选择性成熟的雄性大马哈鱼进行精液收集，对其腹部进行按压采集精液；
（2）离心
3000rpm，4℃下离心20min，保留沉淀；
（3）细胞裂解
向步骤（2）离心得到的沉淀产物中加入裂解缓冲液，裂解缓冲液成分为：5mM尿素，10mM Tris-HCl，400nM NaCl，200nM CaCl2，2mM Na2EDTA，pH 7.5；添加量为每100mg沉淀添加12mL裂解缓冲液。之后加入1mg/mL蛋白酶K，37℃溶解12小时；
（4）离心
裂解产物14000rpm离心40min后取上清液，以体积比1：1的比例加入饱和氯化钠溶液，搅拌混合3-5min，再以14000rpm离心40min取上清；
（5）醇沉
向步骤（4）得到的上清液中以体积比1：1的比例加入纯乙醇，静置等待沉淀，收取沉淀物；
（6）干燥
对步骤（5）得到的沉淀物进行干燥；
（7）干燥物后续处理
将干燥产物（DNA）以10mg/mL的浓度溶解于生理盐水，4℃下，每5分钟打旋所述溶液，持续3小时。上述溶液在4℃下超声波分解10分钟破碎DNA。0.2μm过滤膜进行过滤，冻结干燥获得最终产物。
另一方面，本发明提供了前述制备方法制得的产物。
所述产物非单一成分，为包括多聚脱氧核糖核苷酸的混合物，按本发明方法制备的产物与现有技术有差别。
再一方面，本发明提供了前述产物在制备药品中的应用。
所述药品的适应症为现有技术中已公开的多聚脱氧核糖核苷酸针对的适应症，包括但不限于：伤口治疗、皮肤移殖修复、骨骼软组织再生。
又一方面，本发明提供了一种药品。
所述药品中包括前述产物。
所述药品的适应症为现有技术中已公开的多聚脱氧核糖核苷酸针对的适应症，包括但不限于：伤口治疗、皮肤移殖修复、骨骼软组织再生。
又一方面，本发明提供了前述产物在制备化妆品中的应用。
所述化妆品中包括前述产物及其他化妆品领域常用的辅料。
又一方面，本发明提供了一种化妆品。
所述化妆品中包括前述产物。
所述化妆品中还包括其他的本领域常用辅料，如保湿剂、美白剂、柔润剂、分散剂、增稠剂、芳香剂、乳化剂等。
本发明的有益效果：
本发明提供的制备方法在制备多聚脱氧核糖核苷酸时，裂解缓冲液更接近中性，便于配制，且裂解时间短，应用于实际生产时效率更高，生产的多聚脱氧核糖核苷酸纯度高。此外，本发明使用的蛋白酶K反应温度多选择50-55℃，但在上述裂解缓冲液条件下，37℃也有很好的酶解效果。本发明具有较好的应用前景。
附图说明
图1为实施例1-3制备的样品对HaCaT细胞抗氧化酶活性的影响。
图2为实施例1-3制备的样品对HaCaT细胞ROS水平的影响。
具体实施方式
下面结合具体实施例，对本发明作进一步详细的阐述，下述实施例不用于限制本发明，仅用于说明本发明。以下实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1 一种多聚脱氧核糖核苷酸的分离方法
本实施例选用的原料为鲑鱼科鱼类精液，具体为大马哈鱼精液。
按照以下步骤进行：
（1）收集大马哈鱼精液
选择性成熟的雄性大马哈鱼进行精液收集，对其腹部进行按压采集精液。
（2）离心
3000rpm，4℃下离心20min，保留沉淀。
（3）细胞裂解
向步骤（2）离心得到的沉淀产物中加入裂解缓冲液，裂解缓冲液成分为：20mM尿素，100mM Tris-HCl，500nM NaCl，500nM CaCl2，10mM Na2EDTA，pH 7.5；添加量为每100mg沉淀添加12mL裂解缓冲液。之后加入1mg/mL蛋白酶K（P9460；Solarbio），37℃溶解12小时。
（4）离心
裂解产物14000rpm离心40min后取上清液，以体积比1：1的比例加入饱和氯化钠溶液，搅拌混合3-5min，再以14000rpm离心40min取上清。
（5）醇沉
向步骤（4）得到的上清液中以体积比1：1的比例加入纯乙醇，静置等待沉淀，收取沉淀物。
（6）干燥
对步骤（5）得到的沉淀物进行干燥。
（7）干燥物后续处理
将干燥产物（DNA）以10mg/mL的浓度溶解于生理盐水，4℃下，每5分钟打旋所述溶液，持续3小时。
上述溶液在4℃下超声波分解10分钟破碎DNA。
0.2μm过滤膜进行过滤，冻结干燥获得最终产物。
（8）纯度和产率计算
产率=产物重量/精液重量；
产物溶于生理盐水后使用分光光度计分别检测260nm和280nm下的吸光度，根据以下公式计算产物中多聚脱氧核糖核苷酸的纯度：
纯度=OD260/OD280。
最终得到的多聚脱氧核糖核苷酸的产率为14.2%，纯度计算为2.07。
实施例2 一种多聚脱氧核糖核苷酸的分离方法
与实施例1的差别在于，裂解缓冲液成分为：8mM尿素，40mM Tris-HCl，300nmNaCl，300nm CaCl2，4mM Na2EDTA。
最终得到的多聚脱氧核糖核苷酸的产率为16.6%，纯度计算为2.09。
实施例3 一种多聚脱氧核糖核苷酸的分离方法
与实施例1的差别在于，裂解缓冲液成分为：8mM尿素，40mM Tris-HCl，500nmNaCl，500nm CaCl2，10mM Na2EDTA。
最终得到的多聚脱氧核糖核苷酸的产率为15.9%，纯度计算为2.05。
实施例4 一种多聚脱氧核糖核苷酸的分离方法
与实施例1的差别在于，裂解缓冲液成分为：8mM尿素，100mM Tris-HCl，300nmNaCl，300nm CaCl2，10mM Na2EDTA。
最终得到的多聚脱氧核糖核苷酸的产率为14.8%，纯度计算为2.02。
实施例5一种多聚脱氧核糖核苷酸的分离方法
与实施例1的差别在于，裂解缓冲液成分为：8mM尿素，40mM Tris-HCl，300nmNaCl，300nm CaCl2，10mM Na2EDTA。
最终得到的多聚脱氧核糖核苷酸的产率为15.5%，纯度计算为2.04。
实施例6 一种多聚脱氧核糖核苷酸的分离方法
与实施例1的差别在于，裂解缓冲液成分为：20mM尿素，40mM Tris-HCl，300nmNaCl，300nm CaCl2，4mM Na2EDTA。
最终得到的多聚脱氧核糖核苷酸的产率为14.7%，纯度计算为2.04。
实施例7 一种多聚脱氧核糖核苷酸的分离方法
与实施例1的差别在于，裂解缓冲液成分为：20mM尿素，100mM Tris-HCl，300nmNaCl，300nm CaCl2，4mM Na2EDTA。
最终得到的多聚脱氧核糖核苷酸的产率为15.1%，纯度计算为2.03。
实施例8 一种多聚脱氧核糖核苷酸的分离方法
与实施例1的差别在于，裂解缓冲液成分为：20mM尿素，100mM Tris-HCl，300nmNaCl，300nm CaCl2，10mM Na2EDTA。
最终得到的多聚脱氧核糖核苷酸的产率为15.2%，纯度计算为2.04。
实验例1
对实施例1-3的样品进行效果验证。
实验对象为HaCaT细胞（尚恩生物，SNL-163）；
基础培养基为DMEM，并加入10％胎牛血清、100U/mL青霉素、100U/mL链霉素。
培养条件为37℃、5％CO2。
分组如下：
对照组：无特殊处理；
H2O2组：培养基加入150mM H2O2；
样品组1：培养基加入150mM H2O2；样品5μg/mL；
样品组2：培养基加入150mM H2O2；样品50μg/mL；
样品组3：培养基加入150mM H2O2；样品500μg/mL；
样品组4：培养基加入150mM H2O2；样品5mg/mL；
样品组5：培养基加入150mM H2O2；样品50mg/mL。
培养12小时后，试剂盒检测细胞抗氧化酶活性和ROS水平。
抗氧化酶活性检测结果如图1所示；ROS水平检测结果如图2所示。
结果表明，本发明实施例1-3制备得到的产物能够增强HaCaT细胞抗氧化酶活性，抑制ROS生成。
实验例2
对斑马鱼进行麻醉后距鱼鳃5mm处破损鱼表皮，将斑马鱼按以下分组放入不同的鱼缸中：
对照组：无特殊处理；
样品组：加入质量浓度0.01%的实施例1样品。
观察斑马鱼伤口变化，并记录伤口痊愈时间。
样品组的斑马鱼在第13天开始出现伤口痊愈个体，在第15天时，全部痊愈；对照组第18天开始出现伤口痊愈个体，第19天时全部痊愈。结果表明，本发明制备的多聚脱氧核糖核苷酸产物具有较好的皮肤修复能力。
对比例1-11
参照实施例1的方法设置对比例，具体如下：
对比例 与实施例1的差别
对比例1 裂解缓冲液中不添加NaCl和CaCl<sub>2</sub>
对比例2 裂解缓冲液中不添加NaCl和尿素
对比例3 裂解缓冲液中不添加CaCl<sub>2</sub>和尿素
对比例4 裂解缓冲液pH为7
对比例5 裂解缓冲液pH为9
对比例6 800nm NaCl，100nm CaCl<sub>2</sub>
对比例7 100nm NaCl，800nm CaCl<sub>2</sub>
对比例8 50nm NaCl，50nm CaCl<sub>2</sub>
对比例9 800nm NaCl，800nm CaCl<sub>2</sub>
对比例10 蛋白酶K孵育温度50℃
对比例11 蛋白酶K孵育时间8h
对比例产率和纯度计算结果如下：
对比例 得率% 纯度
对比例1 11.7 1.85
对比例2 10.3 1.84
对比例3 9.5 1.88
对比例4 13.2 1.65
对比例5 14.4 1.68
对比例6 12.8 1.89
对比例7 12.6 1.87
对比例8 11.8 1.81
对比例9 13.5 1.84
对比例10 15.2 2.03
对比例11 6.4 1.82

Claims (14)

1.一种多聚脱氧核糖核苷酸的制备方法，包括使用裂解液对鱼的精细胞进行裂解，其特征在于，所述裂解液中包括酶和缓冲液，所述缓冲液中包括：1-20mM尿素，10-100mMTris-HCl，100-500nM NaCl，100-500nM CaCl2，1-10mM Na2EDTA。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述缓冲液中包括：5-15mM尿素，30-70mM Tris-HCl，200-400nM NaCl，200-400nM CaCl2，3-7mM Na2EDTA。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述缓冲液中包括：8-10mM尿素，40-60mM Tris-HCl，300nM NaCl，300nM CaCl2，4-6mM Na2EDTA。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述裂解液中的酶为蛋白酶K。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述鱼选自鲑科。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述鱼为大马哈鱼。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：收集成熟雄性大马哈鱼精液，低速离心，取沉淀加入裂解液进行裂解，裂解产物离心取上清并加入饱和氯化钠，再次离心取上清，醇沉，干燥后溶于生理盐水，超声波分解DNA，过滤后冻干。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述低速离心的条件为3000rpm，4℃下离心20min。
9.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述醇沉的条件为以体积比1：1的比例加入纯乙醇。
10.权利要求1-9任一项所述的制备方法制得的产物。
11.权利要求10所述的产物在制备药品中的应用。
12.根据权利要求11所述的应用，其特征在于，所述药品用于伤口治疗、皮肤移殖修复、骨骼软组织再生。
13.权利要求10所述的产物在制备化妆品中的应用。
14.一种化妆品，其特征在于，包括权利要求10所述的产物。
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