CN116891847A - 一种具有皮肤屏障修复功效的脱氧核糖核苷酸锌盐的制备方法 - Google Patents

一种具有皮肤屏障修复功效的脱氧核糖核苷酸锌盐的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种具有皮肤屏障修复功效的脱氧核糖核苷酸锌盐的制备方法，该方法包括取鱼精巢，用SSC缓冲液清洗；获得的鱼白加入SSC缓冲液，破碎成为匀浆，加入SSC缓冲液进行匀浆，匀浆后离心至上清液澄清；然后在水浴锅中消化，消化后得到的上清液加入乙醇，得到PDRN钠盐；将PDRN钠水溶液加入到锌盐溶液，调节pH，搅拌，静置，离心，干燥获得PDRN锌盐。本发明在减少制备PDRN步骤的同时，控制提取过程中温度，不产生局部高温，避免影响PDRN质量。同时在锌盐溶液中通过离子交换，调节酸碱度的方法，直接转化成PDRN锌盐的沉淀。得到的PDRN锌盐应用在皮肤损伤修复上，实现皮肤损伤后的屏障修复、疤痕消除、痘印、抗衰老、祛皱、防晒及调节皮肤内部环境稳定。

Description

一种具有皮肤屏障修复功效的脱氧核糖核苷酸锌盐的制备 方法
技术领域
本发明涉及一种具有皮肤屏障修复功效的脱氧核糖核苷酸锌盐的制备方法，属于生物技术领域。
背景技术
PDRN(Polydeoxyribonucleotide)，多聚脱氧核糖核苷酸，是天然的低分子量DNA分子，与人体DNA相似度高达98％。其天然来源主要是鱼类精巢中，由50-2000个之间的碱基对结合成链状的混合物构成。PDRN自然的存在于细胞外基质(ECM)中被细胞用于新陈代谢。除了参与细胞生长，许多临床前和临床研究已经证明了PDRN可以高效激活细胞表面的A2A腺苷受体，促进血管内皮生长因子(VEGF)和胶原蛋白的产生，多种细胞的迁移，显著增强成纤维细胞增殖，降低炎症反应，激活老化或是受损细胞。
事实上，PDRN已经因其对各种伤口愈合和炎症相关疾病的治疗特性而被推向市场。PDRN在欧洲等地被许可为医药品，能够加速DNA的合成，作为皮肤天然的保护剂和修复剂，具有的防晒、消炎、促进细胞再生、组织修复、促进伤口愈合、减少疤痕生成、毛孔修复、祛皱、抵御紫外线损伤等修复功效。目前，PDRN相关美容产品主要源自意大利(MastelliPlacentexPDRN三文鱼水光针)、韩国(Dermaline德媄娜PDRN三文鱼微针导入修护精华、HPCell普丽兰婴儿针)等，深受女性喜爱。
中国专利文献CN 107287186A公开了一种PDRN的制备方法，但该方法需20h消化细胞溶解物，分离离心3-4次，步骤繁琐，耗时较长；同时需要超声波分解PDRN，在超声过程中，会使PRDN链裂解，导致美拉德反应。中国专利文献CN110747194A公开了一种PDRN制备方法，需要在90-100℃条件下裂解精巢组织，使用DNA打断仪破碎，这在大规模工业生产中不易操作，且会导致美拉德反应。因此，现有PDRN的提取技术普遍存在提取收率低，步骤繁琐，会产生局部高温，影响产品质量。
研究发现，锌是促进免疫器官发育的重要因素，对人体免疫器官胸腺的发育具有重要意义，从而有利于T淋巴细胞的分化，促进细胞免疫功能正常发挥生理作用。同时，锌也有助于皮肤伤口和创伤的愈合，补锌剂最早被应用于临床上就是用来治疗皮肤病。Zn离子参与上皮组织分化、金属硫蛋白的转运和储存、降低紫外线诱导的细胞和基因损伤、提高皮肤成纤维细胞对氧化应激反应的耐受能力，最近的研究证实，锌离子能够提高皮肤弹性，减少皱纹。
目前，公开报道的，多为多聚脱氧核糖核苷酸，由于技术的缺陷，并无PDRN锌盐的报道，同样在修复皮肤损伤方面的应用也未发现。同时发挥快速修复疤痕、痘印、抗衰老、祛皱、防晒，调节皮肤内部环境稳定的修复皮肤损伤的原料也是不多见的。
发明内容
为解决上述问题，本发明提供了一种具有皮肤屏障修复功效的脱氧核糖核苷酸锌盐的制备方法，本发明在减少制备PDRN步骤的同时，控制提取过程中温度，不产生局部高温，避免影响PDRN质量。同时，用PDRN固体粉末在锌盐溶液中通过离子交换，调节酸碱度的方法，直接转化成PDRN锌盐的沉淀。得到的PDRN锌盐应用在皮肤损伤修复上，实现皮肤损伤后的屏障修复、疤痕消除、痘印、抗衰老、祛皱、防晒及调节皮肤内部环境稳定。
术语说明：
PDRN锌盐，又称为脱氧核糖核苷酸锌盐。
一方面，本发明提供了一种具有皮肤屏障修复功效的脱氧核糖核苷酸锌盐的制备方法，包括步骤如下：
(1)取鱼精巢，预处理后，用SSC缓冲液清洗；
(2)清洗后获得的鱼白加入SSC缓冲液，破碎成为匀浆，弃上清液，取沉淀；
(3)步骤(2)的沉淀物加入SSC缓冲液进行匀浆，匀浆后离心，留沉淀，重复步骤，至上清液澄清；
(4)向步骤(3)得到的沉淀物中加入纯化水，匀浆，之后加入尿素和蛋白酶K，调节PH7.5-8，得混合物，在水浴锅中消化；
(5)消化结束后，离心，弃沉淀，留上清液；
(6)将步骤(5)得到的上清液加入乙醇，缓慢搅拌出DNA沉淀；
(7)DNA沉淀用无水乙醇清洗2-3次，收集DNA沉淀并干燥，得到PDRN钠盐；
(8)将PDRN钠水溶液加入到锌盐溶液，调节pH，搅拌，静置，离心，干燥获得PDRN锌盐。
根据本发明优选的，步骤(1)中，鱼精巢为三文鱼精巢。
根据本发明优选的，步骤(1)中，预处理为清洗去除血液，沥干水分后，去除精巢中的脂肪组织杂物。
根据本发明优选的，步骤(1)中，SSC缓冲液为NaCl溶液与柠檬酸钠溶液的混合液，混合液中NaCl浓度为0.1-0.3M，柠檬酸钠浓度为0.005-0.05M。
根据本发明优选的，步骤(2)中，SSC缓冲液的加入量为鱼白体积的1-4倍，SSC缓冲液与步骤(1)中缓冲液相同。
根据本发明优选的，步骤(2)中，破碎成为匀浆为用组织捣碎机以7000-9000rpm/min的转速捣碎组织2-6min。
根据本发明优选的，步骤(3)中，SSC缓冲液的加入量为鱼白体积的0.5-3倍，SSC缓冲液与步骤(1)中缓冲液相同。
根据本发明优选的，步骤(3)中，匀浆为用组织捣碎机以7000-9000rpm/min的转速匀浆1-4min，离心为以3000-5000rpm/min的转速离心10-20min。
根据本发明优选的，步骤(3)中，重复匀浆离心2-3次。
根据本发明优选的，步骤(4)中，纯化水的加入量为沉淀物质量的20-40倍。
根据本发明优选的，步骤(4)中，混合物中尿素浓度为8-12mM，蛋白酶K浓度为0.5-1.5％的精巢重量。
根据本发明优选的，步骤(4)中，消化温度为50-60℃，消化时间为1.5-2.5h。
根据本发明优选的，步骤(5)中，离心为离心为以7000-9000rpm/min的转速离心10-20min。
根据本发明优选的，步骤(6)中，乙醇的加入量为上清液体积的1-3倍，乙醇的浓度为70％-100％。
根据本发明优选的，步骤(8)中，PDRN钠水溶液的浓度为5-15wt％，锌盐溶液的浓度为1wt％-15wt％，锌盐溶液的用量为调节pH为5.5-6.5。
根据本发明优选的，步骤(8)中，所述锌盐为小分子无机或有机锌盐。
根据本发明优选的，步骤(8)中，所述锌盐为氯化锌、硫酸锌或硝酸锌。
根据本发明优选的，步骤(8)中，调节pH为5.5-6.5，搅拌6h，静置3h。
本发明的技术效果是：
1、PDRN是一种来自于三文鱼鱼精细胞的小分子DNA，与人类DNA序列相似性极高。其可以作用于腺苷酸A2A受体，从而促进VEGF的产生，促进细胞新生，改善肤质，提亮肤色。
2、本发明所选用的原料PDRN及锌离子是由人体必需的、对人体安全无毒副作用的、不会产生刺激性、过敏性以及耐药性，具有极高的生物安全性。
3、本发明的PDRN锌还可有效修复受损皮肤，恢复皮肤屏障功能，同时发挥疤痕消除、痘印、抗衰老、祛皱、防晒及调节皮肤内部环境稳定的功效，适用于面部或其他部位的激光、微整形和光子嫩肤等医学美容项目后皮肤的修复。
附图说明
图1为不同组方对细胞活性的影响柱状图。
具体实施方式
下面结合具体实施例和试验例对本发明的技术方案进行说明，下述说明仅是为了解释本发明，但不以任何方式对本发明加以限制。本发明所述方法如无特殊说明，均为本领域常规方法。本发明所述试剂若无特殊说明均为市售试剂。
实施例1
一种具有皮肤屏障修复功效的脱氧核糖核苷酸锌盐的制备方法，步骤如下：
(1)清洗三文鱼精巢
选择性成熟的三文鱼进行精巢收集，取100g三文鱼精巢，用纯化水浸泡解冻，清洗去除血液，沥干水分后，去除精巢中的脂肪组织等杂物，用SSC缓冲液清洗；SSC缓冲液为NaCl溶液与柠檬酸钠溶液的混合液，混合液中NaCl浓度为0.2M，柠檬酸钠浓度为0.01M；
(2)离心清洗
将鱼白加入2倍体积的SSC缓冲液，用组织捣碎机捣碎组织，8000rpm/min匀浆3min，使成为匀浆，倒出匀浆，匀浆物4000rpm/min离心15min，弃上清液，留取沉淀，沉淀物加入1.5倍体积的SSC缓冲液，用组织捣碎机捣碎组织，8000rpm/min匀浆3min，使成为匀浆，倒出匀浆，浆物4000rpm/min离心15min，，弃上清液，留取沉淀，重复上述步骤2次，至离心上清液澄清；
(3)细胞裂解
向步骤(2)离心得到的沉淀产物中加入3L纯化水，用组织捣碎机匀浆，加入尿素和蛋白酶K，使尿素浓度为10mM，蛋白酶K的用量为0.5％精巢重量的蛋白酶K，调节PH 7.5，在水浴锅中55℃消化1.5h。
(4)离心
裂解产物8000rpm离心15min后取上清液。
(5)醇沉
向步骤(4)得到的上清液中以体积比1:1的比例加入纯乙醇，缓慢搅拌，收取沉淀物，使用无水乙醇清洗2次；
(6)干燥
对步骤(5)得到的沉淀物进行干燥，得到PDRN钠盐。
(7)锌盐置换
将PDRN钠盐1g溶解于500mL水中，加入15％硫酸锌溶液，调节pH 5.5，搅拌6h，静置3h，8000rpm/min离心15min，干燥获得PDRN锌盐。
实施例2
一种具有皮肤屏障修复功效的脱氧核糖核苷酸锌盐的制备方法，步骤如下：
(1)清洗三文鱼精巢
选择性成熟的三文鱼进行精巢收集，取100g三文鱼精巢，用纯化水浸泡解冻，清洗去除血液，沥干水分后，去除精巢中的脂肪组织等杂物，用SSC缓冲液清洗，SSC缓冲液为NaCl溶液与柠檬酸钠溶液的混合液，混合液中NaCl浓度为0.2M，柠檬酸钠浓度为0.01M；
(2)离心清洗
将鱼白加入2倍体积的SSC缓冲液，用组织捣碎机捣碎组织，8000rpm/min匀浆3min，使成为匀浆，倒出匀浆，匀浆物4000rpm/min离心15min，弃上清液，留取沉淀。沉淀物加入1.5倍体积的SSC缓冲液，用组织捣碎机捣碎组织，8000rpm/min匀浆3min，使成为匀浆，倒出匀浆，浆物4000rpm/min离心15min，，弃上清液，留取沉淀。重复上述步骤2次，至离心上清液澄清。
(3)细胞裂解
向步骤(2)离心得到的沉淀产物中加入3L纯化水，用组织捣碎机匀浆，加入10mM尿素和1.5％精巢重量的蛋白酶K，调节PH 7.5，在水浴锅中60℃消化2h。
(4)离心
裂解产物8000rpm离心15min后取上清液。
(5)醇沉
向步骤(4)得到的上清液中以体积比1：1的比例加入纯乙醇，缓慢搅拌，收取沉淀物，使用无水乙醇清洗2次。
(6)干燥
对步骤(5)得到的沉淀物进行干燥，得到PDRN钠盐。
(7)锌盐置换
将所述干燥DNA钠盐1g溶解于500mL水中，加入15％硫酸锌溶液，调节pH 5.5，搅拌6h，静置3h，8000rpm/min离心15min，干燥获得PDRN锌盐。
对比例1
同实施例2所述的制备方法，不同之处在于：
步骤(7)采用5％硫酸锌，调节pH 5.5，其余操作步骤(1)-(6)同实施例2。
对比例2
同实施例2所述的制备方法，不同之处在于：
步骤(7)采用5％硫酸锌，调节pH 5.5，其余操作步骤(1)-(6)同实施例2。
对比例3
同实施例2所述的制备方法，不同之处在于：
步骤(7)采用10％硫酸锌溶液，调节pH 6，其余操作步骤(1)-(6)同实施例2。
对比例4
同实施例2所述的制备方法，不同之处在于：
步骤(7)采用10％硫酸锌溶液，调节pH 6，其余操作步骤(1)-(6)同实施例2。
对比例5
同实施例2所述的制备方法，不同之处在于：
步骤(7)采用15％硫酸锌溶液，调节pH 6，其余操作步骤(1)-(6)同实施例2。
对比例6
同实施例2所述的制备方法，不同之处在于：
步骤(7)采用5％硫酸锌溶液，调节pH 6.5，其余操作步骤(1)-(6)同实施例2。
对比例7
同实施例2所述的制备方法，不同之处在于：
步骤(7)采用10％硫酸锌溶液，调节pH 6.5，其余操作步骤(1)-(6)同实施例2。
对比例8
同实施例2所述的制备方法，不同之处在于：
步骤(7)采用15％硫酸锌溶液，调节pH 6.5，其余操作步骤(1)-(6)同实施例2。
试验例1：纯度检测计算
产物溶于纯水后使用分光光度计分别检测260nm和280nm下的吸光度，根据以下公式计算产物中多聚脱氧核糖核苷酸的纯度：
纯度＝OD260/OD280。
实施例1最终得到的多聚脱氧核糖核苷酸的纯度计算为1.72，实施例1最终得到的多聚脱氧核糖核苷酸的纯度计算为1.92。蛋白质与PDRN不能充分分离，PDRN的纯度降低，蛋白质含量升高。
试验例2：锌含量的测定
在本发明中，所得到的高分子量透明质酸锌的锌含量的测定方法为火焰原子吸收法。具体测定方法如下。
标准曲线制备：
精密称取锌单元素溶液标准物质(1000μg/mL)1mL至100mL容量瓶中，用1％硝酸定容，得标准贮备液(10μg/mL)。分别量取标准贮备液0、0.2、0.4、0.8、1.6mL于5个洁净的容量瓶中，用1％硝酸定容。得锌浓度分别为0、0.2、0.4、0.8、1.6μg/mL的锌标准溶液。
供试品溶液：精密称取供试品50mg至100mL容量瓶中，加入硝酸1mL，水浴加热至完全浴解，用水定容，取上述溶液1mL至50mL容量瓶中，用1％硝酸定容，即得。
测定：用空白溶液调零后，取各溶液适量，以火焰原子吸收法测定，检测波长为213.9nm，测定吸光度。以测试溶液吸光度(Y)对锌的浓度(X，μg/mL)进行线性回归，绘制标准曲线，采用下式计算供试液中锌浓度。
式中，Ci—供试液中锌浓度，μg/mL；
W—供试品称样量，mg；
h％—供试品干燥失重。
以下结合试验例来说明其效果。
表1各实施例样品锌含量(％)
实施例2按照既定的制备参数进行，在本发明的PDRN锌的制备中，通过调节pH、锌盐溶液浓度等制备条件，所得PDRN锌的锌含量大于6.0％。
实施例1与实施例2对比，PDRN纯度越高，锌含量越高。实施例2与对比例1、2相比，采用较高的锌离子浓度进行置换，所得PDRN锌的锌含量随之增大。
实施例2与对比例3、6相比，均有进行不同程度pH条件的改变，pH的改变增加了产品的不稳定性，导致产品的分子量大幅度降解，降低了最终产品的分子量，导致所得锌离子含量低于7.0％。
实验例3：促成纤维细胞增殖试验
为验证本发明所述组合物具有促成纤维细胞生长的功效，对实施例1-2及对比例1-8的原液进行促成纤维细胞增殖评价试验。
采用MTT细胞增殖评价方法，实验细胞选用CTCC-197-Hum成纤维细胞，实验培养液选择10％胎牛血清培养液，实验设置样品组、阳性对照组、阴性对照组、调零组。
具体实验步骤如下：
1、将成纤维细胞用含10％胎牛血清的细胞培养液制备成2×104个/mL的细胞悬液备用；
2、将2×104个/mL细胞悬液接种于96孔细胞培养板(200μL/孔)，置于37℃、5％CO2培养箱中孵育培养；
3、待孔板中细胞贴壁，且铺板率达到30％时，进行分组给药，每组设5个复孔(200μL/孔)：
(1)样品组，共10组，分别加入含实施例1、实施例2、对比例1、对比例2、对比例3、对比例4、对比例5、对比例6、对比例7、对比例8原液的细胞培养液，受测原液添加量为1g/mL；
(2)阳性对照组，共1组，加入含TGF-β1蛋白的细胞培养液，TGF-β1蛋白的添加量为100ng/mL；
(3)阴性对照对，共1组，加入细胞培养液；
(4)调零组，共1组，均为无接种细胞孔，加入细胞培养液。
给药完成后，将孔板置于37℃、5％CO2培养箱中培养48h。
4、孵育培养完成后，弃掉上层清液，将20μL MTT溶液加入到每孔中，而后在37℃、5％CO2培养箱中继续孵育4h。弃去MTT溶液，每孔加入150μL DMSO溶液，震荡平板，置于微孔滴定板光度计上测定490nm处的吸光度，根据下式计算细胞增殖率(RGR，％)。
培养48h后的细胞增殖率如表1所示
表1细胞增殖率(％)变化：
组别 细胞增殖率％
实施例1 187.56±2.83
实施例2 240.18±3.61
对比例1 225.61±3.13
对比例2 212.29±3.01
对比例3 199.73±2.97
对比例4 191.34±2.42
对比例5 183.48±2.67
对比例6 174.74±2.76
对比例7 156.81±2.37
对比例8 149.76±2.59
阴性对照组 108.25±2.13
阳性对照组 297.64±3.42
与阴性对照组相比，阳性对照组细胞增殖率显著升高，说明本发明的促成纤维细胞增殖评价试验体系有效，可以验证本发明实施例原液是否具备促成纤维细胞增殖的作用。
与阴性对照组相比，实施例1-2和对比例1-8组在48h均具有明显促进成纤维细胞增殖的作用，并且，锌含量越高，细胞增殖效果越明显。本发明实施例中制备的PDRN锌盐显著的促成纤维细胞增殖作用。
实验例4：氧化应激试验
培养人表皮细胞(HaCaT)，分为正常组、模型组、实验组1-10(分别为实施例1、实施例2、对比例1、对比例2、对比例3、对比例4、对比例5、对比例6、对比例7、对比例8共11组，除正常组外，其它各组均加入150nM H2O2造成氧化应激损伤，然后分别加入上述备好的样本溶液，使之最终浓度为100μg/mL，置于37℃5％CO2环境下培养48h，用MTT法测定各组细胞的活性。不同组方对细胞活性的影响见图1。
由图1所示，氧化应激能明显降低HaCaT细胞的活性，给予不同组方后细胞活性显著提高，由图谱可见锌含量增加细胞活性提高，降低氧化应激的损伤。大量研究表明PDRN具有增加细胞增长因子、提高胶原/非胶原蛋白合成，诱导细胞再生，促进伤口愈合的作用；Zn离子参与上皮组织分化，降低紫外线诱导的细胞和基因损伤，提高皮肤成纤维细胞对氧化应激反应的耐受能力。本研究显示实施例2的组方在降低氧化应激损伤，提高细胞活性表达方面具有最佳的效果。

Claims (10)

1.一种具有皮肤屏障修复功效的脱氧核糖核苷酸锌盐的制备方法，包括步骤如下：
(1)取鱼精巢，预处理后，用SSC缓冲液清洗；
(2)清洗后获得的鱼白加入SSC缓冲液，破碎成为匀浆，弃上清液，取沉淀；
(3)步骤(2)的沉淀物加入SSC缓冲液进行匀浆，匀浆后离心，留沉淀，重复步骤，至上清液澄清；
(4)向步骤(3)得到的沉淀物中加入纯化水，匀浆，之后加入尿素和蛋白酶K，调节PH7.5-8，得混合物，在水浴锅中消化；
(5)消化结束后，离心，弃沉淀，留上清液；
(6)将步骤(5)得到的上清液加入乙醇，缓慢搅拌出DNA沉淀；
(7)DNA沉淀用无水乙醇清洗2-3次，收集DNA沉淀并干燥，得到PDRN钠盐；
(8)将PDRN钠水溶液加入到锌盐溶液，调节pH，搅拌，静置，离心，干燥获得PDRN锌盐。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，鱼精巢为三文鱼精巢，预处理为清洗去除血液，沥干水分后，去除精巢中的脂肪组织杂物，SSC缓冲液为NaCl溶液与柠檬酸钠溶液的混合液，混合液中NaCl浓度为0.1-0.3M，柠檬酸钠浓度为0.005-0.05M。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，SSC缓冲液的加入量为鱼白体积的1-4倍，SSC缓冲液与步骤(1)中缓冲液相同，破碎成为匀浆为用组织捣碎机以7000-9000rpm/min的转速捣碎组织2-6min。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，SSC缓冲液的加入量为鱼白体积的0.5-3倍，SSC缓冲液与步骤(1)中缓冲液相同。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，匀浆为用组织捣碎机以7000-9000rpm/min的转速匀浆1-4min，离心为以3000-5000rpm/min的转速离心10-20min，重复匀浆离心2-3次。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(4)中，纯化水的加入量为沉淀物质量的20-40倍。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(4)中，混合物中尿素浓度为8-12mM，蛋白酶K浓度为0.5-1.5％的精巢重量，消化温度为50-60℃，消化时间为1.5-2.5h。
8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(5)中，离心为离心为以7000-9000rpm/min的转速离心10-20min，步骤(6)中，乙醇的加入量为上清液体积的1-3倍，乙醇的浓度为70％-100％。
9.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(8)中，PDRN钠水溶液的浓度为5-15wt％，锌盐溶液的浓度为1wt％-15wt％，锌盐溶液的用量为调节pH为5.5-6.5。
10.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(8)中，所述锌盐为小分子无机或有机锌盐，所述锌盐为氯化锌、硫酸锌或硝酸锌，调节pH为5.5-6.5，搅拌6h，静置3h。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN118421615A (zh) * 2024-04-23 2024-08-02 山东丰金美业科技有限公司 一种hek293细胞来源的pdrn及其制备方法

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111647100A (zh) * 2020-07-14 2020-09-11 山东华熙海御生物医药有限公司 一种高分子量透明质酸锌的制备方法
CN112315836A (zh) * 2020-10-30 2021-02-05 润辉生物技术（威海）有限公司 一种高效的外用pdrn的制备方法及其应用
KR20210115240A (ko) * 2020-03-12 2021-09-27 김정진 PDRN과 N-Acetylglucosamin을 유효성분으로 하는 미네랄의 흡수를 증가시키는 조성물의 제조 방법과 그 용도
KR102346895B1 (ko) * 2021-05-28 2022-01-04 주식회사 노아바이오텍 Pdrn추출방법
CN115074357A (zh) * 2022-08-22 2022-09-20 瑞吉明(山东)生物科技有限公司 一种多聚脱氧核糖核苷酸的制备方法及应用
CN116239668A (zh) * 2023-05-10 2023-06-09 瑞吉明(山东)生物科技有限公司 一种hCGβ亚基突变体及其在PDRN提取中的应用

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20210115240A (ko) * 2020-03-12 2021-09-27 김정진 PDRN과 N-Acetylglucosamin을 유효성분으로 하는 미네랄의 흡수를 증가시키는 조성물의 제조 방법과 그 용도
CN111647100A (zh) * 2020-07-14 2020-09-11 山东华熙海御生物医药有限公司 一种高分子量透明质酸锌的制备方法
CN112315836A (zh) * 2020-10-30 2021-02-05 润辉生物技术（威海）有限公司 一种高效的外用pdrn的制备方法及其应用
KR102346895B1 (ko) * 2021-05-28 2022-01-04 주식회사 노아바이오텍 Pdrn추출방법
CN115074357A (zh) * 2022-08-22 2022-09-20 瑞吉明(山东)生物科技有限公司 一种多聚脱氧核糖核苷酸的制备方法及应用
CN116239668A (zh) * 2023-05-10 2023-06-09 瑞吉明(山东)生物科技有限公司 一种hCGβ亚基突变体及其在PDRN提取中的应用

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
杨桂兰等: "透明质酸锌的制备方法和用途", 《食品与药品》, vol. 10, no. 11, pages 63 - 65 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN118421615A (zh) * 2024-04-23 2024-08-02 山东丰金美业科技有限公司 一种hek293细胞来源的pdrn及其制备方法

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